RU2777947C1 - Liquid in vivo bioreactor for growing bone tissue - Google Patents
Liquid in vivo bioreactor for growing bone tissue Download PDFInfo
- Publication number
- RU2777947C1 RU2777947C1 RU2021107282A RU2021107282A RU2777947C1 RU 2777947 C1 RU2777947 C1 RU 2777947C1 RU 2021107282 A RU2021107282 A RU 2021107282A RU 2021107282 A RU2021107282 A RU 2021107282A RU 2777947 C1 RU2777947 C1 RU 2777947C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bone
- bioreactor
- pipe
- vivo
- silicone rubber
- Prior art date
Links
- 210000000988 Bone and Bones Anatomy 0.000 title claims abstract description 251
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 44
- 239000002609 media Substances 0.000 claims abstract description 40
- 239000004945 silicone rubber Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000002639 bone cement Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 15
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 15
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229920000126 Latex Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229920002529 medical grade silicone Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 12
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000011164 ossification Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000001681 protective Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 10
- 210000001772 Blood Platelets Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 9
- OFPTZWGZSRJCOT-MSPNRCMCSA-M potassium;2-[(1S,2S,3R,4S,5S,6R)-3-(diaminomethylideneamino)-4-[(2R,3R,4R,5S)-3-[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy-2,5,6-trihydroxycyclohexyl]guanidine;(2S,5R,6R)-3,3-d Chemical compound [K+].N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O OFPTZWGZSRJCOT-MSPNRCMCSA-M 0.000 claims abstract description 9
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims abstract description 8
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-2-propenoic acid methyl ester Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 7
- 101000554198 VEGFA Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000002349 favourable Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 7
- 102000029880 human VEGFA protein Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims abstract description 5
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000010936 titanium Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 claims description 14
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 claims description 12
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 claims description 12
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 claims description 12
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 claims description 12
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 claims description 12
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 claims description 12
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 12
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 claims description 12
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 claims description 12
- 230000001172 regenerating Effects 0.000 abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 50
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 50
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 44
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 31
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 21
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 20
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 19
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 19
- 200000000019 wound Diseases 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 13
- 230000001002 morphogenetic Effects 0.000 description 13
- 230000002188 osteogenic Effects 0.000 description 11
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 11
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 10
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 8
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 8
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 8
- 206010022114 Injury Diseases 0.000 description 7
- 210000003460 Periosteum Anatomy 0.000 description 7
- 210000002303 Tibia Anatomy 0.000 description 7
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 7
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 7
- 210000004207 Dermis Anatomy 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 6
- 102000008131 Bone Morphogenetic Protein 7 Human genes 0.000 description 5
- 108010049870 Bone Morphogenetic Protein 7 Proteins 0.000 description 5
- 229940112869 Bone morphogenetic proteins Drugs 0.000 description 5
- 210000002808 Connective Tissue Anatomy 0.000 description 5
- 101710021413 ORF VII Proteins 0.000 description 5
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 5
- 230000002757 inflammatory Effects 0.000 description 5
- 230000000399 orthopedic Effects 0.000 description 5
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 5
- 238000011099 tissue engineering Methods 0.000 description 5
- 210000004204 Blood Vessels Anatomy 0.000 description 4
- 210000003275 Diaphyses Anatomy 0.000 description 4
- 206010061363 Skeletal injury Diseases 0.000 description 4
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 4
- 230000000844 anti-bacterial Effects 0.000 description 4
- 229960000074 biopharmaceuticals Drugs 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 4
- 230000001582 osteoblastic Effects 0.000 description 4
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000000472 traumatic Effects 0.000 description 4
- 210000002615 Epidermis Anatomy 0.000 description 3
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 3
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Vitamin C Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 3
- 239000000515 collagen sponge Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 3
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 3
- 230000000926 neurological Effects 0.000 description 3
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 3
- 230000000241 respiratory Effects 0.000 description 3
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous Effects 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- 230000000989 vascularization Effects 0.000 description 3
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N β-glycerophosphoric acid Chemical compound OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-DUZGATOHSA-N (+)-Ascorbic acid Natural products OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-DUZGATOHSA-N 0.000 description 2
- ZGLHBRQAEXKACO-XJRQOBMKSA-N 1α,25-dihydroxyvitamin D2 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](\C=C\[C@H](C)C(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C ZGLHBRQAEXKACO-XJRQOBMKSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 101700000123 BMP2 Proteins 0.000 description 2
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 Bone Marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000000845 Cartilage Anatomy 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N Dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 229960003957 Dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- YMDXZJFXQJVXBF-STHAYSLISA-N FOSFOMYCIN Chemical compound C[C@@H]1O[C@@H]1P(O)(O)=O YMDXZJFXQJVXBF-STHAYSLISA-N 0.000 description 2
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 2
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 210000002220 Organoids Anatomy 0.000 description 2
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 2
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive Effects 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 239000012237 artificial material Substances 0.000 description 2
- 238000011087 biopharmaceutical technology Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000002520 cambial Effects 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 2
- 229960004729 colecalciferol Drugs 0.000 description 2
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 230000035510 distribution Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229960000308 fosfomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 102000034377 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006008 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 2
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 2
- QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N vitamin D3 Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-YRZJJWOYSA-N 0.000 description 2
- 229940021056 vitamin D3 Drugs 0.000 description 2
- 235000005282 vitamin D3 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011647 vitamin D3 Substances 0.000 description 2
- 108060005409 12 Proteins 0.000 description 1
- GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N AMCHA Chemical compound NCC1CCC(C(O)=O)CC1 GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940064004 Antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 230000037227 Blood Loss Effects 0.000 description 1
- 208000010392 Bone Fractures Diseases 0.000 description 1
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 1
- SXVBHNXTPNLOKR-FCLWLKJISA-L Calcium alginate Chemical compound [Ca+2].O1[C@@H](C([O-])=O)[C@@H](OC)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C([O-])=O)O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O SXVBHNXTPNLOKR-FCLWLKJISA-L 0.000 description 1
- 102000003712 Complement Factor B Human genes 0.000 description 1
- 108090000056 Complement Factor B Proteins 0.000 description 1
- 210000001608 Connective Tissue Cells Anatomy 0.000 description 1
- 108009000074 Endochondral Ossification Proteins 0.000 description 1
- 210000002889 Endothelial Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000003414 Extremities Anatomy 0.000 description 1
- 206010018852 Haematoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003958 Hematopoietic Stem Cells Anatomy 0.000 description 1
- 229960002897 Heparin Drugs 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N Heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 206010020718 Hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 210000003141 Lower Extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000002901 Mesenchymal Stem Cells Anatomy 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004126 Nerve Fibers Anatomy 0.000 description 1
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 1
- 241000283898 Ovis Species 0.000 description 1
- -1 Polymethylmetacrylat Polymers 0.000 description 1
- 208000002607 Pseudarthrosis Diseases 0.000 description 1
- NZCRJKRKKOLAOJ-XRCRFVBUSA-N RIFAXIMIN Chemical compound OC1=C(C(O)=C2C)C3=C4N=C5C=C(C)C=CN5C4=C1NC(=O)\C(C)=C/C=C/[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@@H](OC)\C=C\O[C@@]1(C)OC2=C3C1=O NZCRJKRKKOLAOJ-XRCRFVBUSA-N 0.000 description 1
- 206010039580 Scar Diseases 0.000 description 1
- 210000002356 Skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 210000002536 Stromal Cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- DZGUJOWBVDZNNF-UHFFFAOYSA-N azanium;2-methylprop-2-enoate Chemical compound [NH4+].CC(=C)C([O-])=O DZGUJOWBVDZNNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 230000014461 bone development Effects 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 239000000316 bone substitute Substances 0.000 description 1
- 229960002681 calcium alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010410 calcium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000648 calcium alginate Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001054 cortical Effects 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000013080 embryo development ending in birth or egg hatching Effects 0.000 description 1
- 230000013144 embryo development ending in seed dormancy Effects 0.000 description 1
- 230000035194 endochondral ossification Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- 210000001699 lower leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002406 microsurgery Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000000790 osteoblast Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229960003040 rifaximin Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 230000012488 skeletal system development Effects 0.000 description 1
- 238000005476 soldering Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000002407 tissue scaffold Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретение.The field of technology to which the invention belongs.
Изобретение относится к области медицины и медицинской технике, а именно к экспериментальной травматологии и ортопедии, регенеративной медицине. Изобретение может быть использовано в травматологии и ортопедии для восстановления целостности поврежденных трубчатых костей после утраты костной ткани (посттравматические дефекты кости, превышающие критический размер), изобретение позволяет тестировать лекарственные средства, исследовать длительное влияние растворов биофармацевтических препаратов на костную регенерацию.The invention relates to medicine and medical technology, namely to experimental traumatology and orthopedics, regenerative medicine. The invention can be used in traumatology and orthopedics to restore the integrity of damaged tubular bones after loss of bone tissue (post-traumatic bone defects exceeding the critical size), the invention allows testing drugs, investigating the long-term effect of biopharmaceutical solutions on bone regeneration.
Предпосылки создания изобретения.Background of the invention.
Заполнение травматического дефекта кости костным регенератом в идеале является сочетанием совокупности сложноорганизованных, скоординированных в пространстве и времени морфогенетических процессов и многокомпонентного физиологического ответа организма на травму, включает в себя накопление в области дефекта необходимого для реализации костного сращения количества клеток-предшественников остеогенеза и их потомков, а также эндотелиальных клеток и клеток-потомков гемопоэтических стволовых клеток, являющихся эффекторами регенерации, а также сопутствующих регенераций нервов и сосудов, являющихся неотъемлемой и необходимой составляющей регенерации кости. В процесс вовлекаются несколько молекулярных сигнальных путей, ряд цитокинов и активируется экспрессия сотен генов, работающих над восстановлением структурной целостности кости без образования рубцов, в ходе регенерации взаимоотношения между регенерирующей костью и организмом меняются в динамике.Filling a traumatic bone defect with a bone regenerate is ideally a combination of complexly organized, coordinated in space and time morphogenetic processes and a multicomponent physiological response of the body to injury, includes the accumulation in the area of the defect of the number of osteogenesis precursor cells and their descendants necessary for the implementation of bone fusion, and as well as endothelial cells and descendant cells of hematopoietic stem cells, which are effectors of regeneration, as well as concomitant regeneration of nerves and blood vessels, which are an integral and necessary component of bone regeneration. The process involves several molecular signaling pathways, a number of cytokines, and activates the expression of hundreds of genes that work to restore the structural integrity of the bone without scarring. In the course of regeneration, the relationship between the regenerating bone and the body changes in dynamics.
Клеточные и молекулярные события строго регулируются во время этапов (фаз) регенерации кости спонтанно. Этапы включают в себя начальную воспалительную фазу, образование гематомы и миграцию клеток-предшественников, формирование промежуточного каллуса, созревание каллуса и окончательную реконструкцию костного каллуса с восстановлением первоначальной структуры и формы кости (репаративное, адаптивное или функциональное ремоделирование кости). Согласованное действие клеток строго регулируется критическим взаимодействием биохимических, физических и механических факторов, что в совокупности воспроизводит феноменологически непрямой остеогенез - эндохондральное окостенение - развитие костей во время эмбриогенеза. В результате многие из гомеотических генов и первичных морфогенетических путей, которые активны во время развития скелета, также играют определенную роль и во время восстановления целостности кости при посттравматической регенерации. В идеальном случае регенерация кости должна развертываться так, чтобы регенерат догонял в своем развитии и прочностных характеристиках сам орган и оставался его полноценной составной частью.Cellular and molecular events are tightly regulated during spontaneous bone regeneration stages (phases). The steps include the initial inflammatory phase, hematoma formation and progenitor cell migration, intermediate callus formation, callus maturation, and final remodeling of the osseous callus to restore the original structure and shape of the bone (reparative, adaptive, or functional bone remodeling). The coordinated action of cells is strictly regulated by the critical interaction of biochemical, physical and mechanical factors, which together reproduces phenomenologically indirect osteogenesis - endochondral ossification - bone development during embryogenesis. As a result, many of the homeotic genes and primary morphogenetic pathways that are active during skeletal development also play a role during post-traumatic regeneration of bone integrity. Ideally, bone regeneration should unfold in such a way that the regenerate catches up with the organ itself in its development and strength characteristics and remains its full-fledged component.
Лечение крупных посттравматических костных дефектов представляет собой серьезную и нерешенную проблему, так как регенерация костной ткани может потребоваться в большем количестве, превышающим пределы естественной ограниченной способности организма к генерации костной массы при костном заживлении, важно понимать, что отсутствуют механизмы репаративной регенерации для спонтанного восстановления костей при крупных дефектах.The treatment of large post-traumatic bone defects is a serious and unresolved problem, since bone regeneration may be required in greater amounts than the limits of the body's natural limited ability to generate bone mass in bone healing, it is important to understand that there are no reparative regeneration mechanisms for spontaneous bone repair in bone healing. large defects.
Количественным показателем предела регенерационной способности кости, как органа, является величина дефекта критического размера - это костный дефект минимальной длины, который не может быть спонтанно в течение жизни индивида замещен костным регенератом, объединяющим костные отломки в единую кость. Недостаточные размеры костных регенератов (костных мозолей на краях отломков), растущих от костных отломков к центру крупного дефекта, не позволяют им объединиться и восстановить целостность кости. Очевидно, при несоответствии размеров мозолей от двух противоположно расположенных отломков размеру костного дефекта сращения фрагментов кости не происходит, а открытый костномозговой канал в таких случаях закрывается замыкательной костной пластинкой, возможно образование ложного сустава. Параметры дефектов критического размера свои для каждой кости, и зависят от особенностей травмы, формы дефекта, возраста, пола и т.д.A quantitative indicator of the limit of the regenerative capacity of a bone as an organ is the size of a defect of a critical size - this is a bone defect of the minimum length that cannot be spontaneously replaced during the life of an individual by a bone regenerate that combines bone fragments into a single bone. Insufficient sizes of bone regenerates (bone calluses at the edges of fragments) growing from bone fragments to the center of a large defect do not allow them to unite and restore the integrity of the bone. Obviously, if the size of the calluses from two oppositely located fragments does not correspond to the size of the bone defect, the fusion of bone fragments does not occur, and the open medullary canal in such cases is closed by the end bone plate, the formation of a false joint is possible. The parameters of critical size defects are different for each bone, and depend on the characteristics of the injury, the shape of the defect, age, gender, etc.
При заполнении костных дефектов аутологичная кость считается золотым стандартом в травматологии и ортопедии благодаря ее способности успешно интегрироваться в собственный организм, и отсутствию осложнений, связанных с иммунологическими реакциями реципиента на чужеродный материал. Тем не менее, использование аутологичной кости затрудняется из-за дефицита собственной костной ткани пациента, доступной для безопасного для здоровья пациента забора. Хирургическая операция по забору аутологичной кости, например, костной ткани из гребня подвздошной кости или иной части скелета, является травматичной, после такой операции возникает болевой синдром и долговременный дискомфорт в месте забора, остаются рубцы на коже, а крыло подвздошной кости останется изувеченным. Следовательно, увеличение искусственным путем доступной для пересадок живой аутологичной костной ткани для удовлетворения клинических потребностей травматологии и ортопедии побуждает исследователей к поиску альтернатив. Даже пересадка собственного аутологичного костного трансплантата не всегда приводит к восстановлению анатомической целостности костей, крайне важна разработка способов повышения эффективности костной пластики.When filling bone defects, autologous bone is considered the gold standard in traumatology and orthopedics due to its ability to successfully integrate into its own body, and the absence of complications associated with the recipient's immunological reactions to foreign material. However, the use of autologous bone is hampered by the scarcity of the patient's own bone tissue available for safe harvesting. Surgical harvesting of autologous bone, for example, bone tissue from the iliac crest or another part of the skeleton, is traumatic, after such an operation pain syndrome and long-term discomfort occur at the sampling site, scars remain on the skin, and the iliac wing remains mutilated. Therefore, the artificial increase in live autologous bone tissue available for transplantation to meet the clinical needs of traumatology and orthopedics encourages researchers to look for alternatives. Even transplantation of one's own autologous bone graft does not always lead to the restoration of the anatomical integrity of the bones; it is extremely important to develop ways to increase the efficiency of bone grafting.
Чтобы эффективно залечить посттравматические дефекты костей у животных, необходимо применять мембраны в сочетании с аутогенным костным трансплантатом и/или подходящим заменителем кости (Gugala Z, Gogolewski S. Regeneration of segmental diaphyseal defects in sheep tibiae using resorbable polymeric membranes: a preliminary study. J Orthop Trauma. 1999; 13:187-195. doi: 10.1097/00005131-199903000-00006).To effectively heal post-traumatic bone defects in animals, membranes must be used in combination with autologous bone graft and/or a suitable bone substitute (Gugala Z, Gogolewski S. Regeneration of segmental diaphyseal defects in sheep tibiae using resorbable polymeric membranes: a preliminary study. J Orthop Trauma 1999; 13:187-195 doi: 10.1097/00005131-199903000-00006).
В условиях исключения врастания в костный регенерат конкурирующих за пространство регенератов соединительной ткани, окружающей кость, за счет мембран, не происходит экспоненциального снижения скорости образования и распространения регенератов костной ткани в выделенном пространстве. Изоляция костного регенерата от окружающих ткани может осуществляться с применением мембран либо непроницаемых, либо полупроницаемых для растворенных веществ. Такой метод стимуляции восстановительных процессов получил собственное название - направленная костная регенерация. Исключение негативного влияния неостеогенных тканей на регенерацию кости является ключевым принципом направленной костной регенерации. Сама мембрана, является главным компонентом лечения. Использованы различные материалы и их модификации для их создания. К желательным характеристикам мембраны относятся биосовместимость, доступность для клеточной адгезии, способность к интеграции с тканями реципиента, клиническая управляемость, способность создавать защищенное пространство для костной регенерации и адекватные механические и физические свойства. Использование мембран для укрытия костного дефекта вместе с костными трансплантатами и материалами-заменителями для заполнения дефекта усиливают регенеративный потенциал тканей реципиента. Таким образом, использование мембран повышает эффективность одного из известных способов регенерации кости - трансплантационной регенерации или же регенерации костной ткани по каркасу или трансплантату, заполняющим пустоту на месте удаленного фрагмента кости. Трансплантат стимулирует регенерационный процесс и обеспечивает возможность восстановления целостности кости путем постепенного замещения трансплантата собственным костным регенератом реципиента. Трансплантат или любой разрешенный к клиническому применению костнопластический материал в дальнейшем подвергаются разрушению и рассасыванию, но создают временную модель (каркас), которая позволяет местным тканям осуществлять регенерацию и заместить трансплантат костным регенератом, полноценно интегрированным в организм и обладающим всеми прочностными характеристиками здоровой кости.Under conditions of exclusion of ingrowth into the bone regenerate of the connective tissue regenerates competing for space, surrounding the bone, due to membranes, there is no exponential decrease in the rate of formation and spread of bone tissue regenerates in the allocated space. The isolation of the bone regenerate from the surrounding tissues can be carried out using membranes that are either impermeable or semi-permeable to dissolved substances. This method of stimulation of regenerative processes has received its own name - directed bone regeneration. Elimination of the negative impact of non-osteogenic tissues on bone regeneration is a key principle of guided bone regeneration. The membrane itself is the main component of the treatment. Various materials and their modifications were used to create them. Desirable characteristics of a membrane include biocompatibility, availability for cell adhesion, ability to integrate with recipient tissues, clinical handling, the ability to create a protected space for bone regeneration, and adequate mechanical and physical properties. The use of membranes to cover a bone defect together with bone grafts and substitute materials to fill the defect enhances the regenerative potential of the recipient's tissues. Thus, the use of membranes increases the efficiency of one of the known methods of bone regeneration - transplantation regeneration or regeneration of bone tissue along a scaffold or graft that fills the void at the site of the removed bone fragment. The graft stimulates the regeneration process and provides the possibility of restoring the integrity of the bone by gradually replacing the graft with the recipient's own bone regenerate. The graft or any osteoplastic material approved for clinical use is further subjected to destruction and resorption, but creates a temporary model (framework) that allows local tissues to regenerate and replace the graft with a bone regenerate that is fully integrated into the body and has all the strength characteristics of a healthy bone.
Известна мембрана RegeneCure (RegeneCure's regenerative АМСА membrane Implant), улучшающая естественное заживление костей благодаря катионным свойствам мембраны привлекающих стволовые клетки, способствуя их адгезии, усиливающей их пролиферации для более быстрого образования новой костной ткани. Мембрана является полностью синтетической, что устраняет риск заражения патогенами, присутствующими в мембранах из животных тканей. Она также достаточно прочна, и медленно разлагается с течением времени, благодаря чему у естественной кости остается больше времени для полноценной регенерации. Кроме того, новая мембрана сокращает время регенерации, способствуя клеточной адгезии, распространению и распределению стволовых клеток в костной ткани, при этом также предотвращается проникновение соединительной ткани в зону дефекта. Мембрана представляет собой каркас из микропористого полимера (сополимер метакрилата аммиака типа А) и пластификатора. Кроме того, этот имплант-мембрана, по мнению авторов, позволяет концентрировать факторы роста, цитокины и мезенхимальные стволовые клетки там, где это необходимо, действуя в качестве барьера для предотвращения диффузии в соседние мягкие ткани, что способствует более быстрому заживлению кости за счет управляемой регенерации кости (Kirmayer D. et al. Guided Bone Regeneration with Ammoniomethac-rylate-Based Barrier Membranes in a Radial Defect Model. Biomed Res Int. 2020 Oct 13; 2020:5905740. doi: 10.1155/2020/5905740. eCollection 2020). Несмотря на свойство такой мембраны накапливать на своей поверхности остеогенные клетки, добиться костной регенерации без костной трансплантации или использования костнопластических материалов сложно.Known membrane RegeneCure (RegeneCure's regenerative AMCA membrane Implant), which improves the natural healing of bones due to the cationic properties of the membrane attracting stem cells, promoting their adhesion, enhancing their proliferation for faster formation of new bone tissue. The membrane is fully synthetic, which eliminates the risk of infection by pathogens present in membranes from animal tissues. It is also strong enough to degrade slowly over time, allowing natural bone more time to fully regenerate. In addition, the new membrane reduces regeneration time by promoting cell adhesion, proliferation and distribution of stem cells in the bone tissue, while also preventing the penetration of connective tissue into the defect area. The membrane is a frame made of a microporous polymer (ammonia methacrylate type A copolymer) and a plasticizer. In addition, this implant-membrane, according to the authors, allows the concentration of growth factors, cytokines and mesenchymal stem cells where necessary, acting as a barrier to prevent diffusion into adjacent soft tissues, which contributes to faster bone healing due to controlled regeneration. bones (Kirmayer D. et al. Guided Bone Regeneration with Ammoniomethac-rylate-Based Barrier Membranes in a Radial Defect Model. Biomed Res Int. 2020 Oct 13; 2020:5905740. doi: 10.1155/2020/5905740. eCollection 2020). Despite the ability of such a membrane to accumulate osteogenic cells on its surface, it is difficult to achieve bone regeneration without bone transplantation or the use of osteoplastic materials.
Известна техника индуцированной мембраны (Masquelet's induced membrane technique), которая приобрела популярность для лечения дефектов костей критического размера и псевдоартрозов. Двухэтапная процедура основана на формировании псевдосиновиальной мембраны - соединительнотканного регенерата, образование которого в организме индуцируется временно устанавливаемым полнотелым полиметилметакрилатным спейсе-ром (изготовленного из полиметилметакрилатного костного цемента), помещенным в костный дефект. Псевдомембрана (псевдосиновиальная мембрана) по сути является аутологичной мембраной инородного тела, создается на первом этапе выполнения техники реакцией иммунной системы на спейсер из полиметилметакрилатного костного цемента, имеет решающее значение для поддержки морселизированного костного трансплантата, трансплантируемого на втором этапе лечения. Псевдомембрана окружает спейсер и секре-тирует ряд цитокинов, в том числе, сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), трансформирующий фактор роста-В (TGF-B) и костный морфогенетический белок (ВМР-2). Максимальная продукция ВМР-2 у животных моделей была зарегистрирована через 4 недели после имплантации спейсера. Принцип концепции индуцированной мембраны А. Маскелета заключается в создании путем индукции псевдосиновиальной мембраны, основные свойства которой - действовать в качестве биологической камеры, которая предотвращает резорбцию костного трансплантата и секретирует факторы роста, поддерживающие репаративный остеогенез. В совокупности это позволяет повысить эффективность восстановления костного дефекта диафизов длинных трубчатых костей за счет костной трансплантации (Morelli I., Drago L., George D.A., Gallazzi Е., Scarponi Sio, Romano C.L. Masquelet technique: myth or reality? A systematic review and meta-analysis. Injury. 2016 Dec;47 Suppl6: S68-S76. doi: 10.1016/S0020-1383(16)30842-7).Known technique induced membrane (Masquelet's induced membrane technique), which has gained popularity for the treatment of bone defects of critical size and pseudarthrosis. The two-stage procedure is based on the formation of a pseudo-synovial membrane - a connective tissue regenerate, the formation of which in the body is induced by a temporarily installed full-bodied polymethyl methacrylate spacer (made of polymethyl methacrylate bone cement) placed in a bone defect. Pseudomembrane (pseudo-synovial membrane) is essentially an autologous foreign body membrane, created at the first stage of the technique by the reaction of the immune system to the spacer made of polymethyl methacrylate bone cement, is crucial for supporting the morcelized bone graft transplanted at the second stage of treatment. The pseudomembrane surrounds the spacer and secretes a number of cytokines, including vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor-B (TGF-B), and bone morphogenetic protein (BMP-2). The maximum production of BMP-2 in animal models was registered 4 weeks after the implantation of the spacer. The principle of the concept of A. Maskelet's induced membrane is to create a pseudo-synovial membrane by induction, the main properties of which are to act as a biological chamber that prevents bone graft resorption and secretes growth factors that support reparative osteogenesis. Together, this makes it possible to increase the efficiency of restoring a bone defect in the diaphysis of long bones due to bone transplantation (Morelli I., Drago L., George D.A., Gallazzi E., Scarponi Sio, Romano C.L. Masquelet technique: myth or reality? A systematic review and meta -analysis Injury 2016 Dec;47 Suppl6: S68-S76 doi: 10.1016/S0020-1383(16)30842-7).
Метод применения индуцированных мембран (Masquelet technique) имеет ряд преимуществ, и его часто предпочитают васкуляризированному костному лоскуту или методу Илизарова. Однако, недостаточные показатели успешности метода, необходимость улучшения техники и отбора пациентов стали серьезной проблемой и препятствием более широкому внедрению этой технологии (Alford A.I., Nicolaou D., Hake M., McBride-Gagyi S. Masquelet's induced membrane technique: Review of current concepts and future directions. J Or-thopRes. 2020 Dec 31. doi: 10.1002/jor.24978).The induced membrane technique (Masquelet technique) has a number of advantages and is often preferred over a vascularized bone flap or the Ilizarov technique. However, the insufficient success rates of the method, the need to improve the technique and the selection of patients have become a serious problem and an obstacle to the wider implementation of this technology (Alford A.I., Nicolaou D., Hake M., McBride-Gagyi S. Masquelet's induced membrane technique: Review of current concepts and future directions J Or-thopRes 2020 Dec 31 doi: 10.1002/jor.24978).
Известна «алмазная концепция» лечения повреждений костей, иначе называемая концепцией политерапии сложных случаев травматических повреждений костей. В рамках этой концепции сформулировано представление о биологической камере, основанное на необходимости длительного воздействия на область регенерации: любое биологическое усиление, которое может быть помещено в место несращения костных отломков, должно удерживаться локально и длительно, чтобы проявился эффект и можно было достичь его максимальных проявлений (Giannoudis PV, Einhorn Т.А., Marsh D. Fracture healing: the diamond concept. Injury 2007;38(Suppl. 4): S3-6).Known "diamond concept" treatment of bone injuries, otherwise called the concept of polytherapy of complex cases of traumatic bone injuries. Within the framework of this concept, the concept of a biological chamber is formulated, based on the need for a long-term effect on the area of regeneration: any biological enhancement that can be placed in the place of non-union of bone fragments must be kept locally and for a long time in order for the effect to manifest itself and its maximum manifestations to be achieved ( Giannoudis P.V., Einhorn T.A., Marsh D. Fracture healing: the diamond concept Injury 2007;38(Suppl. 4): S3-6).
Ин виво биореактор. Концептуально биореактор in vivo возник из-за отсутствия универсальных эффективных методов костной пластики для восстановления сложных переломов костей с крупными дефектами костной ткани, лечения утраты костной массы, в том числе, вследствие инфекционных процессов, некрозов и удаления опухолей. Традиционные стратегии костной пластики требуют свежей аутологичной кости, взятой из гребня подвздошной кости; это место сбора ограничено количеством кости, которое можно безопасно удалить, а также связанной с этим болью и болезненностью. Аутотрансгшантаты считаются золотым стандартом, поскольку они могут сохранять кровеносные сосуды и нервные волокна и могут обеспечивать надлежащие остеогенные сигналы, направляющие рост новой кости. Аутотрансплантаты содержат смесь факторов роста и остеогенных клеток, необходимых для регенерации костей. Однако использование аутотрансплантатов имеет известные недостатки, такие как риск возникновения боли в донорском участке, повышенная кро-вопотеря, инфекция донорского участка и, главное, ограниченное количество трансплантата, доступного от одного пациента.In vivo bioreactor. Conceptually, the in vivo bioreactor arose due to the lack of universal effective methods of bone grafting for the restoration of complex bone fractures with large bone defects, the treatment of bone loss, including due to infectious processes, necrosis and removal of tumors. Traditional bone grafting strategies require fresh autologous bone taken from the iliac crest; this collection site is limited by the amount of bone that can be safely removed and the associated pain and tenderness. Autotransplants are considered the gold standard because they can preserve blood vessels and nerve fibers and can provide the proper osteogenic signals to guide new bone growth. Autografts contain a mixture of growth factors and osteogenic cells needed for bone regeneration. However, the use of autografts has known disadvantages, such as the risk of pain at the donor site, increased blood loss, infection of the donor site, and, most importantly, the limited number of graft available from one patient.
Другие методы включают трупные аллотрансплантаты и синтетические варианты (часто сделанные из гидроксиапатита), которые стали доступны в последние годы, имеют известные недостатки. Большинство доступных костных биоматериалов часто не вызывают достаточного образования кровеносных сосудов и нервов в костных регенератах. Отчасти это связано со сложностью интеграции и регулирования нескольких типов тканей в искусственных материалах, что вызывает разрыв между интактной частью кости и менее полноценным регенератом, что часто не позволяет эффективно вылечить пациента.Other methods include cadaveric allografts and synthetic variants (often made from hydroxyapatite) that have become available in recent years have known disadvantages. Most of the available bone biomaterials often do not induce sufficient formation of blood vessels and nerves in bone regenerates. This is partly due to the difficulty of integrating and regulating multiple tissue types in artificial materials, which causes a gap between the intact part of the bone and the less complete regenerate, which often prevents the patient from being treated effectively.
Концепция таких биореакторов основана на манипулировании искусственно созданным пространством внутри тела реципиента таким образом, что само тело служит «биореактором in vivo», в таких устройствах конструирование и выращивание новой ткани в пространстве биореактора не имеющего ограничительных стенок искусственного происхождения (чужеродного материала, инородного тела) и внутри привнесенной (имплантируемой) конструкции. Внутрь пространства могут быть помещены плюрипотентные или специализированные стволовые клетки, тканевые каркасы и ключевые биомолекулы, используемые в тканевой инженерии кости, необходимые для формирования и роста биоискусственных тканей. Одна из особенностей применения ин виво биореактора - формирование новых тканей часто идет параллельно с их интеграцией в организм-носитель биореактора.The concept of such bioreactors is based on the manipulation of an artificially created space inside the recipient's body in such a way that the body itself serves as an "in vivo bioreactor", in such devices the construction and cultivation of new tissue in the space of a bioreactor that does not have restrictive walls of artificial origin (foreign material, foreign body) and inside the introduced (implanted) structure. Pluripotent or specialized stem cells, tissue scaffolds and key biomolecules used in bone tissue engineering, necessary for the formation and growth of bioartificial tissues, can be placed inside the space. One of the features of the in vivo use of a bioreactor is that the formation of new tissues often goes hand in hand with their integration into the host organism of the bioreactor.
Есть три главных подхода к созданию ин виво биореакторов. Первый подход основан на хирургическом доступе внутрь тела, раздвижении анатомических структур, между которыми искусственно создается свободное пространство, вокруг которого роль биореактора выполняют прилежащие собственные ткани. Например, известен способ создания свободного пространства между поверхностью длинной кости и надкостницей. С помощью способа гидравлического подъема надкостница приподнимается над костью водным раствором или гелем, вводимыми под нее через прокол надкостницы с помощью иглы. Так можно создать лишь небольшое внутреннее пространство объемом до 200 мм3, заполненное кальциево-альгинатным гелем. В таком биореакторе роль стенок устройства выполняют собственные же ткани, причем в своей наружной стенке - надкостнице с внутренней стороны расположен камбий, такой биореактор обеспечен собственными необходимыми для остеогенеза биомолекулярными сигналами, все необходимое для формирования кости может быть получено локально и не требует дополнительных внешних воздействий (Stevens М. М. et al. In vivo engineering of organs: The bone bioreactor PNAS August 9,2005 102 (32) 11450-11455; https://doi.org/10.1073/pnas.0504705102).There are three main approaches to the creation of in vivo bioreactors. The first approach is based on surgical access into the body, expansion of the anatomical structures, between which a free space is artificially created, around which the adjacent own tissues act as a bioreactor. For example, a method is known to create a free space between the surface of a long bone and the periosteum. Using the hydraulic lifting method, the periosteum is lifted above the bone with an aqueous solution or gel injected under it through a puncture of the periosteum with a needle. So it is possible to create only a small internal space up to 200 mm 3 filled with calcium-alginate gel. In such a bioreactor, the role of the walls of the device is performed by its own tissues, and in its outer wall - the periosteum, the cambium is located on the inside, such a bioreactor is provided with its own biomolecular signals necessary for osteogenesis, everything necessary for bone formation can be obtained locally and does not require additional external influences ( Stevens M. M. et al., In vivo engineering of organs: The bone bioreactor PNAS August 9,2005 102 (32) 11450-11455; https://doi.org/10.1073/pnas.0504705102).
Второй подход связан, с так называемыми, перфузионными биореакторами для лечения ран - медицинскими устройствами для современных методов местной терапии ран отрицательным давлением, которые были отнесены рядом авторов к ин виво биореакторам. Эти устройства располагаются вне тела - на поверхности кожи над раной.The second approach is associated with the so-called perfusion bioreactors for wound treatment - medical devices for modern methods of local therapy of wounds with negative pressure, which were attributed by a number of authors to in vivo bioreactors. These devices are located outside the body - on the surface of the skin above the wound.
Третий подход связан с разработкой камер для васкуляризированной тканевой инженерии. Эти камеры берут свое начало от хирургических концепций формирования трансплантатов на сосудистой ножке, применяемых в микрохирургии при проведении пластических операций. Камера служит биореактором in vivo в форме закрытого, защищенного пространства. Хирургическим путем создается пространство в теле между здоровыми тканями вокруг кровеносных сосудов, на сосуд устанавливаются камеры. Это создает между сосудом и стенкой камеры высоко ангиогенную среду, которая облегчает приживление и выживание внутри камеры трансплантированных клеток и тканеинженерных конструкций. Известно, что васкуляризация является ключом к разработке больших трансплантируемых тканевых конструкций, способных обеспечить терапевтический эффект (Polykandriotis Е. et al. Bio-reaktoren in der Regenerativen Medizin - Vom technischen Apparat zur rekonstruktiven Alternative? Handchir Mikrochir Plast Chir 2012; 44: 198-203, DOI http://dx.doi.org/10.1055/s-0032-1321838). Поскольку в зоне посттравматического костного дефекта отсутствуют сосуды, ортотопически ин виво биореакторы такого типа для восстановления костей не устанавливаются.The third approach is related to the development of chambers for vascularized tissue engineering. These chambers originate from the surgical concepts of vascular pedicle grafting used in microsurgery for plastic surgery. The chamber serves as an in vivo bioreactor in the form of a closed, protected space. Surgically, a space is created in the body between healthy tissues around the blood vessels, cameras are installed on the vessel. This creates a highly angiogenic environment between the vessel and the chamber wall, which facilitates engraftment and survival of transplanted cells and tissue-engineered constructs inside the chamber. It is known that vascularization is the key to the development of large transplantable tissue constructs capable of providing a therapeutic effect (Polykandriotis E. et al. , DOI http://dx.doi.org/10.1055/s-0032-1321838). Since there are no vessels in the area of a post-traumatic bone defect, orthotopically in vivo bioreactors of this type for bone restoration are not installed.
Следует отметить, что в настоящее время преобладает подход, согласно которому адекватное эктопическое расположение ин виво биореактора в теле более предпочтительно, поскольку может обеспечить лучшие условия для клеточной колонизации тканеинженерных матриц, их васкуляризации, удобнее проводить механическую стимуляцию тканеинженерных конструкций, а выращенная новая ткань может быть легко доступна для несложных хирургических манипуляций по переносу в ортотопическое положение. Важно разработать ин виво биореактор, обеспечивающий ортотопическую сборку костей, которые позволяют восстанавливать дефект кости в нужном месте без необходимости вторичной операции по пересадке созданного искусственным путем костного трансплантата на новое место. Крайне важно, что одновременно с построением новой ткани идет врастание в нее сосудов и нервов из отломков костей. Основные препятствия для создания таких устройств связаны с тем, что во многих случаях участок костного дефекта не может обеспечить приемлемую локальную регенеративную микросреду для выращивания новых тканей из-за инфекции, недостаточного кровоснабжения, трофики, последствий лучевого лечения или чрезмерной дегенерации окружающих тканей. Суть изобретения.It should be noted that at present the prevailing approach is that an adequate ectopic location of the bioreactor in vivo in the body is more preferable, since it can provide better conditions for cell colonization of tissue-engineered matrices and their vascularization, it is more convenient to mechanically stimulate tissue-engineered structures, and the grown new tissue can be easily accessible for simple surgical manipulations to transfer to an orthotopic position. It is important to develop an in vivo bioreactor that provides orthotopic assembly of bones, which allows the restoration of a bone defect in the right place without the need for a secondary operation to transplant the artificially created bone graft to a new location. It is extremely important that, simultaneously with the construction of a new tissue, vessels and nerves grow into it from bone fragments. The main obstacles to the creation of such devices are related to the fact that in many cases the site of a bone defect cannot provide an acceptable local regenerative microenvironment for growing new tissues due to infection, insufficient blood supply, trophism, the consequences of radiation treatment, or excessive degeneration of surrounding tissues. essence of the invention.
Задача настоящего изобретения состоит в повышении эффективности выращивания костной ткани методом ин виво биореактора за счет выращивания костных структур в благоприятной жидкой среде с питательными веществами и биостимуляторами на обычном для кости месте (ортотопически), а также расширении показаний к применению ортотопически расположенных ин виво биореакторов.The objective of the present invention is to increase the efficiency of growing bone tissue using the in vivo bioreactor method by growing bone structures in a favorable liquid medium with nutrients and biostimulants in the usual place for the bone (orthotopically), as well as expanding the indications for the use of orthotopically located in vivo bioreactors.
Расширение показаний к применению за счет возможности использовать биореактор для активного промывного дренирования тканей, расположенных в его внутреннем пространстве, что позволяет оздоровить ткани, ликвидировать микробное загрязнение и создать благоприятную локальную среду для регенерации, для разработки новых технологий тканевой инженерии и регенеративной медицины, направленных на стимуляцию роста новой костной ткани, за счет применения новой жидкой композиции стимулирующей рост костной мозоли, врастающей в полость ин виво биореактора и объединяющейся с костной мозолью другого конца отломка, а также обеспечении быстрого доступа к области дефекта в любое удобное время в течение всего периода восстановления дефекта кости водорастворимых биологически активных веществ. Стенки биореактора могут быть импрегнированы антибиотиками по аналогии с антибактериальным спейсером. Полиметилметакрилат (из которого состоит ин виво биореактор), пропитывается антибиотиками, и может быть успешно применен для лечения инфекционных процессов. Костный цемент (метилметакрилата) в составе биоректора обеспечивает локальную концентрацию высоких доз антибиотиков, биореактор заполняет пространство, предотвращая инволюцию окружающих мягких тканей и доставляет соответствующие антибиотики вокруг себя. Технический результат данного изобретения заключается в разработке нового устройстваExpansion of indications for use due to the ability to use a bioreactor for active flushing drainage of tissues located in its internal space, which makes it possible to heal tissues, eliminate microbial contamination and create a favorable local environment for regeneration, to develop new technologies of tissue engineering and regenerative medicine aimed at stimulation growth of new bone tissue, due to the use of a new liquid composition stimulating the growth of callus growing into the cavity of the in vivo bioreactor and uniting with the callus of the other end of the fragment, as well as providing quick access to the defect area at any convenient time during the entire period of restoration of the bone defect water-soluble biologically active substances. The walls of the bioreactor can be impregnated with antibiotics, similar to an antibacterial spacer. Polymethyl methacrylate (of which the in vivo bioreactor is composed) is impregnated with antibiotics and can be successfully used to treat infectious processes. Bone cement (methyl methacrylate) as part of the bioreactor provides a local concentration of high doses of antibiotics, the bioreactor fills the space, preventing the involution of the surrounding soft tissues and delivers the appropriate antibiotics around itself. The technical result of this invention is to develop a new device
- ин виво биореактора для создания контролируемого внутреннего пространства, которое может быть заполнено жидкой средой - композицией, применяемой по новому назначению- in vivo bioreactor to create a controlled internal space that can be filled with a liquid medium - a composition used for a new purpose
- для стимуляции репаративной регенерации кости, благоприятной для костной регенерации, в которой выращивается новая кость (на месте костного дефекта критического размера) в обычном для данной ткани или органа опорно-двигательного аппарата (кости) месте. Вокруг ин виво биореактора, как реакция организма на инородное тело из метилметакрилата, формируется естественным путем псевдосиновиальная мембрана, которая продуцирует цитокины, стимулирующие костную регенерацию. При удалении ин виво биореактора из организма эта мембрана продуцирует морфогенетические белки и факторы роста сосудов, которые способствуют ремоделированию регенерата костной ткани и повышают эффективность лечения. Использование новых устройства, композиции и способа выращивания костной ткани внутри этого устройства позволит получить эффективный и постоянный доступ к области костной регенерации для ее подпитки растворами, стимулирующими костную регенерацию с целью восстановления (заживления) костного дефекта, превышающего критический размер (критический костный дефект). Устройство позволяет использовать костные морфогенетические белки в физиологических дозах длительное время, добиваясь повышение эффективности применения этих биофармацевтических препаратов, причем действие этих препаратов будет преимущественно местным, распространение путем диффузии вокруг ин виво биореактора, ограничено стенками биореактора. Крайне важным результатом является возможность использования ин виво реактора для проведения активного антибактериального дренирования тканей внутри его пространства по показаниям. Подача физиологического раствора натрия хлорида и его одновременное извлечение из полости биореактора позволяет промыть и очистить тканевые поверхности внутри пространства этого биореактора, в том числе и от микробного загрязнения, с раствором могут подаваться антимикробные средства в концентрациях в сотни раз превышающие допустимые дозы при их парентеральном введении, также возможно введение невсасывающиеся антибактериальных препаратов, например, рифаксимина. Это существенно расширяет применимость изобретения в клинической практике. Способ выращивания костной ткани в биореакторе по изобретению основан на применении устройства и композиции в определенных режимах и временной последовательности заполнения пространства биореактора композициями разного состава.- to stimulate reparative bone regeneration, favorable for bone regeneration, in which a new bone is grown (at the site of a bone defect of a critical size) in a place usual for a given tissue or organ of the musculoskeletal system (bone). Around the in vivo bioreactor, as a reaction of the body to a foreign body from methyl methacrylate, a pseudo-synovial membrane is naturally formed, which produces cytokines that stimulate bone regeneration. When the bioreactor is removed from the body in vivo, this membrane produces morphogenetic proteins and vascular growth factors that promote remodeling of bone tissue regenerate and increase the effectiveness of treatment. The use of new devices, compositions and methods for growing bone tissue inside this device will provide effective and permanent access to the area of bone regeneration for its replenishment with solutions that stimulate bone regeneration in order to restore (heal) a bone defect that exceeds a critical size (critical bone defect). The device allows the use of bone morphogenetic proteins in physiological doses for a long time, achieving an increase in the efficiency of the use of these biopharmaceuticals, and the action of these drugs will be mainly local, distribution by diffusion around the bioreactor in vivo, limited by the walls of the bioreactor. An extremely important result is the possibility of using the reactor in vivo for active antibacterial drainage of tissues inside its space according to indications. The supply of physiological sodium chloride solution and its simultaneous extraction from the cavity of the bioreactor makes it possible to wash and clean the tissue surfaces inside the space of this bioreactor, including from microbial contamination; it is also possible to administer non-absorbable antibacterial drugs, for example, rifaximin. This significantly expands the applicability of the invention in clinical practice. The method of growing bone tissue in a bioreactor according to the invention is based on the use of a device and a composition in certain modes and time sequence of filling the bioreactor space with compositions of different compositions.
Технический результат и техническая задача обеспечиваются за счет того, что предлагаемое устройство жидкостный ин виво биореактор для выращивания новой костной ткани на месте костного дефекта выполнено в виде полой круглой трубы, стенки которой ограничивают внутреннее пространство ин виво биореактора, труба выполнена из костного цемента (метилметакрилата), имеет утолщения по краям обоих отверстий трубы из этого же цемента, размеры трубы и ее отверстий позволяют ввести внутрь через отверстия края отломков или опилов костей, труба устанавливается на место костного дефекта, уплотнение контакта трубы и костных краев, а также ее удержание опосредовано и обеспечивается двумя воронками в виде усеченного полого конуса из биоинертного натурального латекса, на концах полых конусов воронок расположены две манжеты воронки, выполненные из того же биоинертного натурального латекса, воронки расположены на обоих концах трубки ин виво биореактора, во внутренней части стенки трубки ин виво биореактора имеется два дополнительных отверстия, расположенных друг напротив друга, в которые открываются просвет одной из гибких, тонких трубок из медицинской силиконовой резины и металлического штуцера, выполненного из титана. Ввинчивающийся штуцер для силиконовой трубки соединен с концом одной из гибких, тонких трубок из медицинской силиконовой резины, со свободного внешнего конца у двух трубок из силиконовой резины имеется соединение типа Луер или Луер-Лок с защитным колпачком. Причем через любую из гибких, тонких трубок из силиконовой резины можно как подавать, так и извлекать жидкость из пространства ин виво биореактора, так и подавать туда, часть одной из силиконовых трубок находиться внутри стенки трубы из метилметакрилата ин виво биореактора и идет к противоположному дополнительному внутреннему отверстию в стенке трубы ин виво биореактора.The technical result and the technical problem are ensured due to the fact that the proposed device, a liquid in vivo bioreactor for growing new bone tissue at the site of a bone defect, is made in the form of a hollow round pipe, the walls of which limit the internal space of the in vivo bioreactor, the pipe is made of bone cement (methyl methacrylate) , has thickenings along the edges of both holes of the pipe from the same cement, the dimensions of the pipe and its holes allow you to insert the edges of bone fragments or sawdust through the holes, the pipe is installed in place of the bone defect, the sealing of the contact between the pipe and the bone edges, as well as its retention is indirect and provided two funnels in the form of a truncated hollow cone made of bioinert natural latex, at the ends of the hollow cones of the funnels there are two funnel cuffs made of the same bioinert natural latex, the funnels are located at both ends of the tube of the in vivo bioreactor, in the inner part of the wall of the tube of the in vivo bioreactor and there are two additional holes located opposite each other, into which the lumen of one of the flexible, thin tubes made of medical silicone rubber and a metal fitting made of titanium opens. A screw-in fitting for silicone tubing is connected to the end of one of the flexible, thin medical silicone rubber tubing, at the free outer end of the two silicone rubber tubings there is a Luer or Luer-Lock type connection with a protective cap. Moreover, through any of the flexible, thin tubes made of silicone rubber, you can both supply and extract liquid from the space of the in vivo bioreactor, and supply it there, part of one of the silicone tubes is located inside the wall of the pipe made of methyl methacrylate in vivo bioreactor and goes to the opposite additional internal hole in the tube wall of the in vivo bioreactor.
В частных вариантах воплощения изобретения внешняя поверхность круглой трубы, образующей емкость биореактора может быть импрегнирована антибиотиками.In particular embodiments of the invention, the outer surface of the round tube forming the bioreactor vessel can be impregnated with antibiotics.
В частных вариантах воплощения изобретения вся поверхность трубы, образующей емкость биореактора может быть импрегнирована антибиотиками.In particular embodiments of the invention, the entire surface of the pipe forming the capacity of the bioreactor can be impregnated with antibiotics.
В частных вариантах могут использоваться фосфомицин, гентамицин, винкомицин или иной антибиотик с учетом верифицированной патогенной микрофлоры.In private options, fosfomycin, gentamicin, vincomycin, or another antibiotic can be used, taking into account the verified pathogenic microflora.
В частных вариантах воплощения изобретения трубки из силиконовой резины могут быть подключены к промывной системе и биореактор может быть использован для активного промывного дренирования тканей, расположенных в его пространстве.In particular embodiments of the invention, silicone rubber tubes can be connected to the flushing system and the bioreactor can be used for active flushing of the tissues located in its space.
Технический результат и техническая задача обеспечиваются за счет того, что использовалась известной композиции культуральной питательной среды, а именно среды ДМЕМ с глутамином (ПанЭко, РФ), с добавлением пенициллин-стрептомициновой смеси, с добавлением 10% лизата кроличьих тромбоцитов, полученных известным способом для местной стимуляции роста костной мозоли в полости ин виво биореактора. Применение известных веществ по новому назначению позволило добиться неожиданного результата - выраженного регенеративного роста костной мозоли в пространстве ин виво биореактора без применения костных трансплантатов, тканеинженерных конструкций, остеогенных клеток, костнопластических материалов. Костные мозоли с противоположных отломков костей сливались в единый регенерат, в ходе ремоделирования восстанавливалась полноценная кость. Это позволяет расширить области применения культуральных питательных сред.The technical result and the technical task are achieved due to the fact that a well-known composition of the cultural nutrient medium was used, namely the DMEM medium with glutamine (PanEco, RF), with the addition of a penicillin-streptomycin mixture, with the addition of 10% rabbit platelet lysate, obtained by a known method for local stimulation of callus growth in the in vivo bioreactor cavity. The use of known substances for a new purpose made it possible to achieve an unexpected result - a pronounced regenerative growth of callus in the space of an in vivo bioreactor without the use of bone grafts, tissue engineering structures, osteogenic cells, osteoplastic materials. Bone calluses from opposite bone fragments were merged into a single regenerate, during remodeling a full-fledged bone was restored. This allows you to expand the scope of cultural nutrient media.
В частных вариантах воплощения изобретения в культуральную среду добавляется костный морфогенетический белок ВМР-2 в концентрации 25 нанограммов на миллилитр (рекомби-нантный человеческий морфогенетический белок-2 (rhBMP-2).In particular embodiments of the invention, bone morphogenetic protein BMP-2 is added to the culture medium at a concentration of 25 nanograms per milliliter (recombinant human morphogenetic protein-2 (rhBMP-2).
В частных вариантах воплощения изобретения в культуральную среду добавляется костный морфогенетический белок ВМР-7 в концентрации 25 нанограммов на миллилитр (рекомби-нантный человеческий морфогенетический белок-7 (rhBMP-7).In particular embodiments of the invention, bone morphogenetic protein BMP-7 is added to the culture medium at a concentration of 25 nanograms per milliliter (recombinant human morphogenetic protein-7 (rhBMP-7).
В частных вариантах воплощения изобретения в культуральную среду добавляются остео-генные добавки 50 мг/л L-аскорбиновой кислоты (Sigma,repMaHHfl), 10 мМ/л β-глицерофосфата натрия (Sigma, Германия) и 100 нМ дексаметазона (KRKA, Словения) или 10 нМ 1α,25- дигидроксикальциферола (витамин D3) (Roshe, Швейцария).In particular embodiments of the invention, osteogenic additives of 50 mg/l L-ascorbic acid (Sigma, repMaHHfl), 10 mM/l sodium β-glycerophosphate (Sigma, Germany) and 100 nM dexamethasone (KRKA, Slovenia) or 10 nM 1α,25-dihydroxycalciferol (vitamin D3) (Roshe, Switzerland).
Известно, что для стимуляции костного сращения в место костного дефекта помещают кол-лагеновую губку, содержащую в одном миллилитре объема 1,5 миллиграмма рекомбинантного ВМР-2 (Infuse™ Bone Graft). Меньшие дозы малоэффективны. Однако в столь высокой дозировке ВМР-2 часто приводит к развитию серьезных неврологических, дыхательных и воспалительных побочных эффектов, что ограничивает применение костных морфо-генетических белков.It is known that to stimulate bone union, a collagen sponge containing 1.5 milligrams of recombinant BMP-2 (Infuse™ Bone Graft) is placed at the site of the bone defect. Smaller doses are ineffective. However, at such a high dosage, BMP-2 often leads to the development of serious neurological, respiratory and inflammatory side effects, which limits the use of bone morphogenetic proteins.
Технический результат и техническая задача обеспечиваются за счет того, что предлагаемый способ выращивания костной ткани в пространстве ин виво биореактора для восстановления костных дефектов включает следующие этапы:The technical result and the technical problem are ensured due to the fact that the proposed method for growing bone tissue in the space of an in vivo bioreactor for restoring bone defects includes the following steps:
- подготавливается операционное поле и выполняется хирургический доступ к большебер-цовой кости кролика, иссекается участок диафиза большеберцовой кости длиной 3 см в его нижней трети, с формированием посттравматического дефекта (операционная травма в эксперименте),- the operating field is prepared and a surgical approach to the tibia of the rabbit is performed, a 3 cm long section of the tibial shaft in its lower third is excised, with the formation of a post-traumatic defect (surgical trauma in the experiment),
- с краев опилов костей снимается надкостница лоскутом циркулярно шириной 0,5 см,- the periosteum is removed from the edges of the sawdust of the bones with a circular flap 0.5 cm wide,
- на полую трубку ин виво биореактора с двух сторон надеваются воронки в виде усеченного полого конуса из биоинертного натурального латекса,- funnels in the form of a truncated hollow cone made of bioinert natural latex are put on the hollow tube of the in vivo bioreactor from both sides,
- в отверстие трубки ин виво биореактора вставляется сначала опил дистальной части кости, затем проксимальной части кости, манжеты воронки должны плотно прилегать к наружным поверхностям фрагментов кости по всей длине их окружности, - для трубок из силиконовой резины делаются два отдельных раневых канала по которым их свободные концы от трубы биореактора идут к поверхности кожи, причем для прохождения через дерму кожи делается прокол кожи с наружной стороны через слой эпидермиса и с помощью прямого зажима типа москит трубка через отверстие в дерме вытягивается наружу,- first sawdust of the distal part of the bone, then the proximal part of the bone is inserted into the opening of the tube of the in vivo bioreactor, the cuffs of the funnel should fit snugly against the outer surfaces of the bone fragments along their entire circumference, the ends from the bioreactor tube go to the skin surface, and to pass through the skin dermis, the skin is punctured from the outside through the epidermis layer and, using a direct mosquito-type clamp, the tube is pulled out through the hole in the dermis,
- свободные концы трубок крепятся через штуцер к разъему типа "Луер-Лок" с защитным колпачком,- the free ends of the tubes are attached through a fitting to a Luer-Lock type connector with a protective cap,
-производится стабилизация костных отломков с помощью аппарата внешней фиксации для чрескостного остеосинтеза,- bone fragments are stabilized using an external fixation device for transosseous osteosynthesis,
- ушивание операционный раны с наложением асептической повязки,- suturing the surgical wound with the imposition of an aseptic bandage,
- животное укладывается на бок,- the animal is laid on its side,
- трубки из силиконовой резины с металлическим штекер / соединительным разъемом для шприца типа "Луер-Лок" с защитным колпачком переводятся в вертикальное положение, колпачки открываются,- tubes made of silicone rubber with a metal plug / connector for a Luer-Lock type syringe with a protective cap are moved to a vertical position, the caps open,
- через силиконовую трубку с зеленым маркером вводиться композиция, заполнение ин виво биореактора контролируется по уровню жидкости в другой трубке,- the composition is introduced through a silicone tube with a green marker, the filling of the in vivo bioreactor is controlled by the level of liquid in the other tube,
- смена раствора в первые 2 суток от момента операции проводится 2 раза в сутки, в качестве раствора используется среда ДМЕМ или F12 с добавлением пенициллин-стрептомициновой смеси и Фактор роста эндотелия сосудов- А человека, изоформа 165, рекомбинантный (rhVEGF-A165) в количестве 0,25 нг на 1 мл композиции, после слива раствора ин виво биореактор промывается стерильным изотоническим раствором натрия хлорида,- solution change in the first 2 days from the moment of operation is carried out 2 times a day, DMEM or F12 medium is used as a solution with the addition of a penicillin-streptomycin mixture and human vascular endothelial growth factor-A, isoform 165, recombinant (rhVEGF-A165) in an amount 0.25 ng per 1 ml of the composition, after draining the solution in vivo, the bioreactor is washed with a sterile isotonic sodium chloride solution,
- далее 1 раз в сутки в течение 8 дней пространство ин виво биореактора заполняется средой ДМЕМ с глутамином (ПанЭко, РФ), с добавлением пенициллин-стрептомициновой смеси, с добавлением 10% лизата кроличьих тромбоцитов, с добавлением фактор роста эндотелия сосудов- А человека, изоформа 165, рекомбинантный (rhVEGF-A165) в количестве 0,25 нг на 1 мл среды, после слива композиции ин виво биореактор промывается стерильным изотоническим раствором натрия хлорида,- then, once a day for 8 days, the in vivo space of the bioreactor is filled with DMEM medium with glutamine (PanEco, RF), with the addition of a penicillin-streptomycin mixture, with the addition of 10% rabbit platelet lysate, with the addition of human vascular endothelial growth factor-A, isoform 165, recombinant (rhVEGF-A165) in the amount of 0.25 ng per 1 ml of medium, after draining the composition in vivo, the bioreactor is washed with a sterile isotonic sodium chloride solution,
- далее 1 раз в сутки в течение 15 дней пространство ин виво биореактора заполняется средой F12 с добавлением ВМР-7 (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-7 (rhBMP-7) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр среды по четным дням, средой F12 с добавлением ВМР-2 (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-2 (rhBMP-2) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр по нечетным дням,- then, once a day for 15 days, the in vivo space of the bioreactor is filled with F12 medium with the addition of BMP-7 (recombinant human morphogenetic protein-7 (rhBMP-7) at a concentration of 25 nanograms per milliliter of medium on even days, F12 medium with the addition of BMP -2 (recombinant human morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) at a concentration of 25 nanograms per milliliter on odd days,
- через 25-30 суток проводится хирургическая операция по извлечению ин виво биореактора, доступ через шов от операции по установке биореактора, со стороны трубок из силиконовой резины обнажается стенка ин виво биореактора, трубки из силиконовой резины отсекаются у места вхождения трубки в стенку трубы, металлический штуцер выкручивается, с обоих концов трубы ин виво биореактора стягиваются воронки, кусачками рассекаются стенки воронки по всей длине, кусачками раскалывается стенка трубы ин виво биореактора вдоль, удаляются осколки костного цемента из раны,- after 25-30 days, a surgical operation is performed to remove the in vivo bioreactor, access through the suture from the operation to install the bioreactor, the wall of the in vivo bioreactor is exposed from the side of the silicone rubber tubes, the silicone rubber tubes are cut off at the point where the tube enters the pipe wall, metal the fitting is unscrewed, funnels are pulled together from both ends of the tube of the in vivo bioreactor, the walls of the funnel are cut along the entire length with wire cutters, the wall of the pipe of the in vivo bioreactor is split lengthwise with wire cutters, fragments of bone cement are removed from the wound,
- труба ин виво биореактора проворачивается вокруг своей оси и кусачками раскалывается вдоль, образуются две части трубы, которые ротационными движениями извлекаются из тканей,- the tube of the in vivo bioreactor is rotated around its axis and split lengthwise with wire cutters, two parts of the tube are formed, which are removed from the tissues by rotational movements,
- трубки из силиконовой резины полностью удаляются, для этого их вытягивают зажимом за концы торчащие из поверхности кожи,- silicone rubber tubes are completely removed, for this they are pulled out with a clamp by the ends protruding from the surface of the skin,
- проводиться послойное ушивание раны,- layer-by-layer suturing of the wound,
- аппарат Илизарова демонтируют после минерализации костного регенерата, не позже, чем через 5 месяцев.- the Ilizarov apparatus is dismantled after the mineralization of the bone regenerate, no later than 5 months later.
Способ по изобретению основан на том, что в области травматического дефекта по краю отломка или опила кости всегда формируется костная мозоль -костный регенерат, который под действием композиции более выраженно, чем в контрольной группе прорастает в пространство ин виво биореактора, развитие двух костных мозолей с двух сторон костного дефекта позволяет им сомкнуться внутри пространства ин виво биореактора, что обеспечивает соединение костных фрагментов между собой и при последующем регенерационном и адаптивном ремоделировании костного регенерата обеспечивает эффективное восстановление целостности кости. Источником костеобразования в этом случае являются недифференцированные соединительнотканные клетки, располагающиеся в костномозговой полости, в межбалочных пространствах губчатого вещества и в сосудистых каналах коркового вещества, а также в меньшей степени расположенных вокруг кости (камбиальный слой надкостницы). Стенки биореактора препятствуют негативному влиянию параоссальных тканей на костную регенерацию, а композиция обеспечивает зону костной регенерации питательными и биологически активными веществами.The method according to the invention is based on the fact that in the area of a traumatic defect along the edge of a bone fragment or sawdust, a callus is always formed - a bone regenerate, which, under the action of the composition, grows into the space of the in vivo bioreactor more pronouncedly than in the control group, the development of two calluses from two sides of the bone defect allows them to close inside the in vivo space of the bioreactor, which ensures the connection of bone fragments with each other and, during subsequent regenerative and adaptive remodeling of the bone regenerate, ensures effective restoration of bone integrity. The source of bone formation in this case is undifferentiated connective tissue cells located in the bone marrow cavity, in the inter-beam spaces of the spongy substance and in the vascular channels of the cortical substance, and also to a lesser extent located around the bone (the cambial layer of the periosteum). The walls of the bioreactor prevent the negative effect of paraosseous tissues on bone regeneration, and the composition provides the zone of bone regeneration with nutrients and biologically active substances.
Устройство, композиция и способ, согласно настоящему изобретению, позволяют эффективно стимулировать рост костных регенератов внутри пространства биореактора для слияния между собой и объединения отломков кости, для этого не требуются дополнительно ни костные трансплантаты, ни костнопластические материалы, ни биомедицинские клеточные продукты. А костная мозоль состоит преимущественно не из хрящевой ткани, а из костных балок с хорошей сопутствующей васкуляризацией. Хорошая изоляция от пара-оссальных тканей и водонепроницаемый корпус биореактора позволяют обеспечить прицельную стимуляцию цитокинами только нужных тканей и добиться выраженного эффекта от цитокинов при существенно меньшей их концентрации, в отличие от существующих сегодня способов их применения, для которых характерен целый ряд осложнений. Известно, что для стимуляции костного сращения в место костного дефекта помещают коллагеновую губку, содержащую в одном миллилитре объема 1,5 миллиграмма рекомбинантного ВМР-2 (Infuse™ Bone Graft). Меньшие дозы малоэффективны. Однако в столь высокой дозировке ВМР-2 часто приводит к развитию серьезных неврологических, дыхательных и воспалительных побочных эффектов, что ограничивает применение костных морфогенетиче-ских белков. Материал, из которого изготовлен ин виво биореактор (из полиметилметакрилатного костного цемента) вызывает образование вокруг себя псевдосиновиальной мембраны, которая продуцирует целый ряд цитокинов, в том числе костные морфогенетические белки, которые усиливают репаративный остеогенез. Корпус ин виво биореактора (труба из костного цемента) в частных вариантах может быть импрегнирован антибиотиками, а само устройство может быть подключено к системе активного промывного дренирования, в пространство ин виво биореактора могут вводиться антибиотики в концентрациях существенно выше, чем при парентеральном ведении тех же препаратов. Все в совокупности позволяет использовать такой биореактор и при открытых костных повреждениях, с возможным микробным обсеменением. Краткое описание чертежейThe device, composition and method according to the present invention make it possible to effectively stimulate the growth of bone regenerates inside the space of the bioreactor for fusion with each other and the union of bone fragments, this does not require additional bone grafts, or osteoplastic materials, or biomedical cell products. And the callus consists mainly not of cartilaginous tissue, but of bone beams with good concomitant vascularization. Good isolation from paraosseous tissues and a waterproof body of the bioreactor make it possible to provide targeted stimulation of only the necessary tissues with cytokines and to achieve a pronounced effect from cytokines at a significantly lower concentration, in contrast to the current methods of their use, which are characterized by a number of complications. It is known that to stimulate bone union, a collagen sponge containing 1.5 milligrams of recombinant BMP-2 (Infuse™ Bone Graft) is placed at the site of the bone defect. Smaller doses are ineffective. However, at such a high dosage, BMP-2 often leads to the development of serious neurological, respiratory and inflammatory side effects, which limits the use of bone morphogenetic proteins. The material from which the in vivo bioreactor is made (from polymethyl methacrylate bone cement) causes the formation of a pseudo-synovial membrane around itself, which produces a number of cytokines, including bone morphogenetic proteins that enhance reparative osteogenesis. The body of the in vivo bioreactor (pipe made of bone cement) in particular cases can be impregnated with antibiotics, and the device itself can be connected to an active flushing drainage system; . Taken together, this bioreactor can also be used for open bone injuries with possible microbial contamination. Brief description of the drawings
Прилагаемый чертеж, который включен в состав настоящего описания и является его частью, иллюстрирует варианты осуществления изобретения и совместно с вышеприведенным общим описанием изобретения и нижеприведенным подробным описанием вариантов осуществления служат для пояснения принципов настоящего изобретения.The accompanying drawing, which is incorporated in and forms part of this specification, illustrates embodiments of the invention and, together with the above general description of the invention and the following detailed description of embodiments, serve to explain the principles of the present invention.
На фиг. 1 показана принципиальная схема жидкостного ин виво биореактора для выращивания костной ткани.In FIG. 1 shows a schematic diagram of a fluid-based in vivo bioreactor for bone tissue growth.
На фиг. 1 цифрами обозначены следующие позиции. 1 - труба ин виво биореактора.In FIG. 1, the numbers indicate the following positions. 1 - pipe in vivo bioreactor.
2 - утолщения по краям обоих отверстий трубы ин виво биореактора.2 - thickenings along the edges of both openings of the pipe of the in vivo bioreactor.
3 - воронка в виде усеченного полого конуса из биоинертного натурального латекса.3 - funnel in the form of a truncated hollow cone made of bioinert natural latex.
4 - манжета воронки из биоинертного натурального латекса.4 - funnel cuff made of bioinert natural latex.
5 - гибкая, тонкая трубка из силиконовой резины.5 - flexible, thin silicone rubber tube.
6 - соединительный разъем/металлический штекер для шприца типа "Луер-Лок" с защитным колпачком.6 - connector / metal plug for a Luer-Lock type syringe with a protective cap.
7 - ввинчивающийся металлический штуцер для силиконовой трубки.7 - screw-in metal fitting for silicone tube.
8 - тонкая трубка из силиконовой резины внутри стенки трубы ин виво биореактора.8 - thin silicone rubber tube inside the tube wall of the in vivo bioreactor.
9 - диафиз длинной трубчатой кости.9 - diaphysis of a long tubular bone.
10 - спицы аппарата внешней фиксации.10 - spokes of the external fixation apparatus.
11 - костный мозг.11 - bone marrow.
12 - отверстие трубы ин виво биореактора.12 - pipe opening of the in vivo bioreactor.
Термины и определенияTerms and Definitions
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения. Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.For a better understanding of the present invention, below are some of the terms used in the present description of the invention. Unless otherwise defined, the technical and scientific terms in this application have the standard meanings generally accepted in the scientific and technical literature.
8 настоящем описании и в формуле изобретения термины «включает», «включающий» и «включает в себя», «имеющий», «снабженный», «содержащий» и другие их грамматические формы не предназначены для истолкования в исключительном смысле, а, напротив, используются в неисключительном смысле (т.е., в смысле «имеющий в своем составе»). В качестве исчерпывающего перечня следует рассматривать только выражения типа «состоящий из».8 of the present description and in the claims, the terms "comprises", "comprising" and "includes", "having", "provided", "comprising" and their other grammatical forms are not intended to be construed in an exclusive sense, but, on the contrary, are used in a non-exclusive sense (i.e., in the sense of "having in its composition"). As an exhaustive list, only expressions like "consisting of" should be considered.
В материалах настоящей заявки под термином «костный регенерат», «регенерат» понимают. 1 - совокупность незрелых пролиферирующих клеток в зоне повреждения - заново образованную в результате регенерации ткань, в данном случае костную.In the materials of this application, the term "bone regenerate", "regenerate" is understood. 1 - a set of immature proliferating cells in the area of damage - a tissue newly formed as a result of regeneration, in this case, bone.
В материалах настоящей заявки под термином «активное дренирование» понимают метод принудительного удаления содержимого из раневой полости в случаях обширных повреждений со сложной конфигурацией раневого канала и при наличии в нем замкнутых карманов. Среди таких методов выделяют аспирационное дренирование (через введение в полость раны трубки и создание внутри низкого давления), промывное дренирование (механический удаление раневого содержимого путем промывания) и т.п. Считается, что длительное капельное промывание и аспирация являются одним из самых перспективных методов дренирования гнойных ран.In the materials of this application, the term "active drainage" is understood as a method of forced removal of contents from the wound cavity in cases of extensive damage with a complex configuration of the wound channel and in the presence of closed pockets in it. Among these methods, aspiration drainage is distinguished (through the introduction of a tube into the wound cavity and the creation of low pressure inside), flushing drainage (mechanical removal of wound contents by washing), etc. It is believed that prolonged drip irrigation and aspiration are one of the most promising methods for draining purulent wounds.
В материалах настоящей заявки под термином «биореактор» понимают любое устройство, которое способно динамически поддерживать биологические и/или биохимические процессы в точно контролируемых и контролируемых экспериментальных и рабочих условиях (например, рН, температура, механические воздействия, время, подача питательных веществ и удаление отходов). Биореактор может быть определен как динамическая платформа для трехмерного культивирования клеток для различных биомедицинских применений, таких как: расширение различных типов клеток, включая PSC, генерация трехмерных органоидов из PSC и тканеспецифической дифференциации органоидов, полученных из стволовых клеток.In the materials of this application, the term "bioreactor" refers to any device that is capable of dynamically maintaining biological and/or biochemical processes under precisely controlled and controlled experimental and operating conditions (for example, pH, temperature, mechanical influences, time, nutrient supply and waste disposal ). A bioreactor can be defined as a dynamic 3D cell culture platform for various biomedical applications such as: expansion of various cell types including PSCs, generation of 3D organoids from PSCs, and tissue-specific differentiation of stem cell-derived organoids.
В материалах настоящей заявки под термином «ин виво биореактор» понимают тканеинженерный биореактор, который имплантируется в организм, использует и усиливает естественную регенеративную способность организма генерировать новую ткань для наращивания новообразованной ткани внутри своего пространства. В пространстве ин виво биоректора могут быть размещены скаффолды, живые клетки и костнопластические материалы.In the materials of this application, the term "in vivo bioreactor" means a tissue-engineered bioreactor that is implanted in the body, uses and enhances the body's natural regenerative ability to generate new tissue to build up the newly formed tissue within its space. Scaffolds, living cells and osteoplastic materials can be placed in the space of the in vivo bioreactor.
В материалах настоящей заявки под термином «костный морфогенетический белок (ВМР)» понимают группу факторов роста (цитокины), которые были первоначально открыты благодаря их способности воздействовать на формирование кости и хряща, являются одной из основных групп морфогенетических сигнальных белков, которые организуют построение тканей в теле.In the materials of this application, the term "bone morphogenetic protein (BMP)" means a group of growth factors (cytokines), which were originally discovered due to their ability to influence the formation of bone and cartilage, are one of the main groups of morphogenetic signaling proteins that organize the construction of tissues in body.
В материалах настоящей заявки под термином «медицинский костный цемент» понимают специальный искусственный материал (полиметилметакрилат, Polymethylmetacrylat, РММА). В состав которого входит, как минимум, два компонента: порошковый (полимер) и жидкий (мономер) в соотношении 2:1 или 3:1.In the materials of this application, the term "medical bone cement" means a special artificial material (polymethyl methacrylate, Polymethylmetacrylat, PMMA). The composition of which includes at least two components: powder (polymer) and liquid (monomer) in a ratio of 2:1 or 3:1.
В материалах настоящей заявки под термином «направленная регенерация кости (Guided bone regeneration))) понимают хирургическую процедуру, включающую установку физического барьера, закрывающего клетки, между соединительной параоссальной тканью и дефектом кости, обеспечивает с помощью барьерных мембран защищенное пространство для роста новой кости.In the materials of this application, the term “Guided bone regeneration))) is understood as a surgical procedure, including the installation of a physical barrier that closes the cells between the connective paraosseous tissue and the bone defect, provides a protected space for new bone growth using barrier membranes.
Управляемая регенерация кости (GBR) - это метод регенерации кости, который возник на основе управляемой регенерации ткани (GTR).Guided Bone Regeneration (GBR) is a bone regeneration technique that evolved from Guided Tissue Regeneration (GTR).
В материалах настоящей заявки под термином «органотипическая регенерация или полная (реституция)» понимают замещение дефекта идентичными погибшим структурами. Органотипическая регенерация делится на интраморфоз- гиперплазия клеток структурно-функциональной единицы, без увеличения их количества; интерморфоз - образование новых структурно-функциональных единиц.In the materials of this application, the term "organotypic regeneration or complete (restitution)" means the replacement of a defect with identical dead structures. Organotypic regeneration is divided into intramorphosis - hyperplasia of cells of a structural and functional unit, without increasing their number; intermorphosis - the formation of new structural and functional units.
Регенерат (лат.re- повторное действие: genero, generaturn - порождать, производить): 1 - совокупность незрелых пролиферирующих клеток в зоне повреждения; 2 - заново образованная в результате регенерации ткань.Regenerate (lat. re- repeated action: genero, generaturn - to generate, produce): 1 - a set of immature proliferating cells in the area of damage; 2 - tissue newly formed as a result of regeneration.
В материалах настоящей заявки под термином «спейсер» понимают специальное приспособление, изготовленное в форме какой-нибудь части тела для замены утраченной природной («временный» имгшантат), может быть изготовленного из костного цемента на основе полиметилметакрилата, импрегнированного антибиотиками, обеспечивающего их высвобождение в течение длительного периода времени порядка 2-3 месяцев (антибактериальный спейсер).In the materials of this application, the term "spacer" means a special device made in the form of some part of the body to replace the lost natural ("temporary" implant), can be made of bone cement based on polymethyl methacrylate impregnated with antibiotics, ensuring their release within a long period of time of the order of 2-3 months (antibacterial spacer).
В материалах настоящей заявки под термином «биофармацевтический препарат» понимают лекарство, в котором активное вещество производится или извлекается из материалов биологического происхождения (живых клеток или тканей). Примерами биофармацевтических препаратов являются вакцины, сыворотки и инсулин.In the materials of this application, the term "biopharmaceutical product" means a drug in which the active substance is produced or extracted from materials of biological origin (living cells or tissues). Examples of biopharmaceuticals are vaccines, serums and insulin.
В материалах настоящей заявки под термином «трансплантационная регенерация» понимают регенерацию костной ткани по трансплантату, стимуляцию регенерацион-ного процесса или обеспечения самой возможности восстановления путем трансплантации тканей в дефект, которые в дальнейшем подвергаются разрушению и рассасыванию, создают модель (каркас), которая позволяет местным тканям осуществлять органотипичную регенерацию. Метод трансплантации используют для стимуляции регенерационного процесса или обеспечения самой возможности восстановления.In the materials of this application, the term "transplant regeneration" means regeneration of bone tissue along the graft, stimulation of the regeneration process or providing the very possibility of recovery by transplanting tissues into a defect, which are further subjected to destruction and resorption, create a model (framework) that allows local tissues to carry out organotypic regeneration. The transplantation method is used to stimulate the regeneration process or to ensure the very possibility of recovery.
В материалах настоящей заявки под термином «дефекты кости критического размера» понимают наименьший костный дефект в конкретной кости и видах животных, который не заживает самопроизвольно в течение жизни животного. Эти крупные дефекты кости представляют собой серьезную ортопедическую проблему, поскольку такие дефекты костей оказывают негативное влияние на качество жизни пациентов из-за сложности заживления и вынужденных последовательных повторных операций, и длительных госпитализаций.In the materials of this application, the term "critical bone defects" refers to the smallest bone defect in a particular bone and animal species that does not heal spontaneously during the life of the animal. These large bone defects represent a serious orthopedic problem, as such bone defects have a negative impact on the quality of life of patients due to the difficulty of healing and forced successive reoperations, and long hospitalizations.
Спонтанный -возникающий вследствие внутренних причин, без непосредственного воздействия извне.Spontaneous - arising from internal causes, without direct external influence.
Спонтанность - самопроизвольность; характеристика процессов, вызванных не внешними влияниями, а внутренними причинами; самодеятельность, способность активно действовать под влиянием внутренних побуждений.Spontaneity - spontaneity; characterization of processes caused not by external influences, but by internal causes; self-activity, the ability to act actively under the influence of internal impulses.
Цитокины - большое семейство небольших молекул сигнальных белков, которые сек-ретируются клетками для передачи сигналов и межклеточной коммуникации.Cytokines are a large family of small signaling protein molecules that are secreted by cells for signaling and cell-to-cell communication.
В материалах настоящей заявки термины «остеогенные структуры», «остеогенные клетки» являются синонимами, представляют собой следующие за стволовыми стро-мальными клетками клетки этапа остеобластической дифференцировки, являются частично коммитированными, камбиальными в остеобластическом клеточном диффе-роне.In the materials of this application, the terms "osteogenic structures", "osteogenic cells" are synonymous, they are the cells of the stage of osteoblastic differentiation following the stem stromal cells, they are partially committed, cambial in the osteoblastic cell differon.
В материалах настоящей заявки под термином «костная мозоль (каллус, callus)» понимают структуру, образующуюся в ходе регенерации костной ткани после нарушения целостности кости при нормальном течении процесса заживления; обеспечивает спаяние рядом расположенных костных фрагментов, представляет собой соединительную ткань, образующуюся в месте перелома. Вначале образуется соединительнотканная провизорная мозоль, к концу 1-й недели образуется остеоидная ткань, которая превращается либо непосредственно в костную, либо вначале в хрящевую, а затем в костную.In the materials of this application, the term "bone callus (callus, callus)" means the structure formed during the regeneration of bone tissue after violation of the integrity of the bone during the normal course of the healing process; provides soldering of adjacent bone fragments, is a connective tissue formed at the fracture site. Initially, a connective tissue provisional callus is formed, by the end of the 1st week, osteoid tissue is formed, which turns either directly into bone, or first into cartilage, and then into bone.
В материалах настоящей заявки под терминами «индукторы остеогенеза», «факторы или индукторы костной дифференцировки», «остеоиндукторы» понимают вещество, которое может стимулировать дифференцировку стволовых клеток и клеток предшественников в направлении остеобластического дифферона - остеобластов, образования костной ткани.In the materials of this application, the terms "inducers of osteogenesis", "factors or inducers of bone differentiation", "osteoinductors" mean a substance that can stimulate the differentiation of stem cells and progenitor cells in the direction of osteoblastic differon - osteoblasts, bone formation.
В материалах настоящей заявки под термином «индуктор дифференцировки» понимают вещество, которое может стимулировать дифференцировку стволовых клеток и клеток предшественников в определенном направлении.In the materials of the present application, the term "differentiation inducer" means a substance that can stimulate the differentiation of stem cells and progenitor cells in a certain direction.
В материалах настоящей заявки под термином «остеогенная среда для костной регенерации» понимают локальную искусственно поддерживаемую тканевую среду для направленной дифференцировки стволовых и прогениторных клеток в направлении остеобластической линии дифференцировки, благоприятную для костной регенерации, содержащую индукторы костной регенерации, в том числе 0,1 мкМ дексамета-зона, 0,05 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ глицерол-2-фосфата.In the materials of this application, the term "osteogenic medium for bone regeneration" means a local artificially maintained tissue medium for directed differentiation of stem and progenitor cells in the direction of the osteoblastic line of differentiation, favorable for bone regeneration, containing inducers of bone regeneration, including 0.1 μM dexamet -zone, 0.05 mM ascorbic acid, 10 mM glycerol-2-phosphate.
В материалах настоящей заявки под термином «питательные вещества» (в контексте клеточных технологий) понимают все вещества в легко усваиваемом виде, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей живых клеток вне организма.In the materials of this application, the term "nutrients" (in the context of cellular technologies) means all substances in an easily digestible form necessary to meet the nutritional and energy needs of living cells outside the body.
Используемый в данной заявке термин «питательная среда» - это смесь неорганических солей и других питательных соединений, предназначенная для обеспечения выживания, поддержания роста и/или пролиферации клеток за пределами организма в искусственных условиях, обычно используется основная среда с добавками, например сывороткой или факторами роста.As used in this application, the term "nutrient medium" is a mixture of inorganic salts and other nutrient compounds intended to ensure the survival, maintenance of growth and/or proliferation of cells outside the body under artificial conditions, usually a basic medium with additives, such as serum or growth factors .
Термин «соединенный» означает функционально соединенный, при этом может быть использовано любое количество или комбинация промежуточных элементов между соединяемыми компонентами (включая отсутствие промежуточных элементов). Кроме того, термины «первый», «второй», «третий» и т.д. используются просто как условные маркеры, не накладывая каких-либо численных или иных ограничений на перечисляемые объекты.The term "connected" means functionally connected, and any number or combination of intermediate elements between connected components (including the absence of intermediate elements) can be used. In addition, the terms "first", "second", "third", etc. are used simply as conditional markers, without imposing any numerical or other restrictions on enumerable objects.
Подробное описание изобретения.Detailed description of the invention.
В целом настоящее изобретение относится к жидкостному ин виво биореактору, композиции для стимуляции костного регенерата и способу выращивания костной ткани в пространстве этого биореактора. Часто ин виво биореакторы заполняются гелями или твердым веществом, термин жидкостный делает акцент на длительном погружении регенерата в жидкую среду поддерживающую продукцию новой костной массы.In general, the present invention relates to a liquid in vivo bioreactor, a composition for stimulating bone regenerate and a method for growing bone tissue in the space of this bioreactor. Often in vivo bioreactors are filled with gels or solids, the term liquid focuses on the long-term immersion of the regenerate in a liquid medium that supports the production of new bone mass.
Жидкостный ин виво биореактор для выращивания новой костной ткани на месте костного посттравматического дефекта изготавливается в виде полой круглой трубы из полиметилметакрилатного костного цемента, стенки которой ограничивают внутреннее пространство ин виво биореактора, труба имеет утолщения по краям обоих отверстий трубы, выполненные сразу при заливке формы трубы вместе с наружными утолщениями на краях полиметилметакрилатным костным цементом, размеры трубы и ее отверстий позволяют ввести внутрь через отверстия края отломков или опилов костей, труба устанавливается на место костного дефекта, уплотнение контакта трубы и костных краев травмированной кости, а также удержание жидкостного ин виво биореактора в нужном положении опосредовано и обеспечивается двумя воронками в виде усеченного полого конуса, выполненных из биоинертного натурального латекса, на концах полых конусов воронок расположены неразрывно спаянные с усеченным конусом две манжеты воронки, выполненные из того же биоинертного натурального латекса, воронки расположены на обоих концах трубки ин виво биореактора, биоинертный натуральный латекс биоинертен и не вызывает заметных реакций иммунной системы, во внутренней части стенки трубки ин виво биореактора имеется два дополнительных отверстия, расположенных друг напротив друга, в которые открываются просвет одной из гибких, тонких трубок из медицинской силиконовой резины и металлического штуцера, выполненного из титана. Ввинчивающийся штуцер для силиконовой трубки соединен с концом одной из гибких, тонких трубок из медицинской силиконовой резины, со свободного внешнего конца две трубки из биоинертной силиконовой резины через металлический штуцер соединены с адаптером инфузионным с прямоточным каналом для герметичного соединения типа Люэр Лок (соединитель с наружной резьбой, с одной стороны), выполненного из прозрачного поликарбоната с защитным колпачком. Причем через любую из гибких, тонких трубок из силиконовой резины можно как подавать, так и извлекать жидкость из пространства ин виво биореактора, часть одной трубок из силиконовой резины находиться внутри стенки трубы из метилметакрилата ин виво биореактора и идет к противоположному дополнительному внутреннему отверстию в стенке трубы ин виво биореактора. Размещение трубки внутри стенки круглой трубы ин виво биореактораA liquid in vivo bioreactor for growing new bone tissue at the site of a post-traumatic bone defect is made in the form of a hollow round pipe made of polymethyl methacrylate bone cement, the walls of which limit the internal space of the in vivo bioreactor, the pipe has thickenings along the edges of both pipe holes, made immediately when the pipe mold is poured together with external thickenings at the edges with polymethyl methacrylate bone cement, the dimensions of the tube and its holes allow the edges of bone fragments or sawdust to be inserted through the holes, the tube is installed in the place of the bone defect, sealing the contact between the tube and the bone edges of the injured bone, and also keeping the liquid in vivo bioreactor in the desired position is mediated and provided by two funnels in the form of a truncated hollow cone made of bioinert natural latex; of natural latex, funnels are located at both ends of the in vivo bioreactor tube, bioinert natural latex is bioinert and does not cause noticeable reactions of the immune system, in the inner part of the tube wall of the in vivo bioreactor there are two additional holes located opposite each other, into which the lumen of one of the flexible, thin tubes made of medical silicone rubber and a metal fitting made of titanium. A screw-in fitting for a silicone tube is connected to the end of one of the flexible, thin tubes made of medical silicone rubber; from the free outer end, two tubes of bioinert silicone rubber are connected through a metal fitting to an infusion adapter with a direct-flow channel for a hermetic connection of the Luer Lock type (connector with an external thread , on one side), made of transparent polycarbonate with a protective cap. Moreover, through any of the flexible, thin tubes made of silicone rubber, it is possible to both supply and extract liquid from the space of the in vivo bioreactor, part of one silicone rubber tube is located inside the wall of the pipe made of methyl methacrylate in vivo bioreactor and goes to the opposite additional internal hole in the pipe wall in vivo bioreactor. Placement of the tube inside the wall of the round tube of the in vivo bioreactor
В частных вариантах воплощения изобретения внешняя поверхность круглой трубы, образующей емкость биореактора может быть импрегнирована антибиотиками.In particular embodiments of the invention, the outer surface of the round tube forming the bioreactor vessel can be impregnated with antibiotics.
В частных вариантах воплощения изобретения вся поверхность трубы, образующей емкость биореактора может быть импрегнирована антибиотиками.In particular embodiments of the invention, the entire surface of the pipe forming the capacity of the bioreactor can be impregnated with antibiotics.
В частных вариантах могут использоваться фосфомицин, гентамицин, винкомицин или иной антибиотик с учетом верифицированной патогенной микрофлоры.In private options, fosfomycin, gentamicin, vincomycin, or another antibiotic can be used, taking into account the verified pathogenic microflora.
В частных вариантах воплощения изобретения трубки из силиконовой резины могут быть подключены к промывной системе и биореактор может быть использован для активного промывного дренирования тканей, расположенных в его пространстве.In particular embodiments of the invention, silicone rubber tubes can be connected to the flushing system and the bioreactor can be used for active flushing of the tissues located in its space.
В изобретении используется известная композиции культуральной питательной среды, а именно среды ДМЕМ с глутамином (ПанЭко, РФ), с добавлением пенициллин-стрептоми-циновой смеси, с добавлением 10% лизата кроличьих тромбоцитов, полученных известным способом (Mohamed Н. Е., et al. Human platelet lysate efficiency, stability, and optimal heparin concentration required in culture of mammalian cells// Blood Res. 2020 Mar; 55(1): 35-43. Published online 2020 Mar 30. doi: 10.5045/br.2020.55.1.35) для заполнения пространства жидкостного ин виво биореактора и локальной местной стимуляции роста костной мозоли на костном опиле, введенном в полость ин виво биореактора. Применение известных веществ по новому назначению позволило добиться неожиданного результата - выраженного регенеративного роста костной мозоли в пространство ин виво биореактора без применения костных трансплантатов, тканеинженерных конструкций, остеогенных клеток, костнопластических материалов. Костные мозоли с противоположных отломков костей сливались в единый регенерат, в ходе репаративного и регенерационного ремоделирования восстанавливалась полноценная кость. Это позволяет расширить области применения культуральных питательных сред и повысить эффективность лечения травм костей, с формированием костных дефектов. В культуральную среду могут добавляться костные морфогенетические белки ВМР-2 в концентрации 25 нанограммов на миллилитр (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-2 (rhBMP-2) и ВМР-7 в концентрации 25 нанограммов на миллилитр (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-7 (rhBMP-7), которые проявляют высокую активность при столь малых концентрациях. В частных вариантах воплощения изобретения в культуральную среду добавляются остеогенные добавки 50 мг/л L-аскорбиновой кислоты (SigmaJepMamw), 10 мМ/л β-глицерофосфата натрия (Sigma, Германия) и 100 нМ дексаметазона (KRKA, Словения) или 10 нМ 1α,25- дигидроксикальциферола (витамин D3) (Roshe, Швейцария). Известно, что для стимуляции костного сращения в место костного дефекта помещают коллагеновую губку, содержащую в одном миллилитре объема 1,5 миллиграмма рекомбинантного ВМР-2 (Infuse™ Bone Graft). Меньшие дозы малоэффективны. Однако в столь высокой дозировке ВМР-2 часто приводит к развитию серьезных неврологических, дыхательных и воспалительных побочных эффектов, что ограничивает применение костных морфогенетических белков. Ин виво биореактор позволяет повысить эффективность этих биофармацевтических средств и снизить риски развития осложнений.The invention uses a well-known composition of the cultural nutrient medium, namely the DMEM medium with glutamine (PanEco, RF), with the addition of a penicillin-streptomycin mixture, with the addition of 10% rabbit platelet lysate, obtained by a known method (Mohamed N. E., et al Human platelet lysate efficiency, stability, and optimal heparin concentration required in culture of mammalian cells// Blood Res. 2020 Mar;55(1): 35-43.Published online 2020 Mar 30. doi: 10.5045/br.2020.55.1.35 ) for filling the space of the liquid in vivo bioreactor and local local stimulation of the growth of callus on bone sawdust introduced into the cavity of the in vivo bioreactor. The use of known substances for a new purpose made it possible to achieve an unexpected result - a pronounced regenerative growth of callus into the in vivo space of a bioreactor without the use of bone grafts, tissue engineering structures, osteogenic cells, osteoplastic materials. Bone calluses from opposite bone fragments were merged into a single regenerate, and a full-fledged bone was restored during reparative and regenerative remodeling. This allows you to expand the scope of cultural nutrient media and increase the effectiveness of the treatment of bone injuries, with the formation of bone defects. The bone morphogenetic proteins BMP-2 at a concentration of 25 nanograms per milliliter (recombinant human morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) and BMP-7 at a concentration of 25 nanograms per milliliter (recombinant human morphogenetic protein-7 (rhBMP-7) ), which exhibit high activity at such low concentrations.In particular embodiments of the invention, osteogenic additives of 50 mg/l L-ascorbic acid (SigmaJepMamw), 10 mM/l sodium β-glycerophosphate (Sigma, Germany) and 100 nM dexamethasone (KRKA, Slovenia) or 10 nM 1α,25-dihydroxycalciferol (vitamin D3) (Roshe, Switzerland).It is known that to stimulate bone fusion, a collagen sponge containing 1.5 milligrams of recombinant BMP per milliliter is placed in the site of a bone defect. -2 (Infuse™ Bone Graft) Smaller doses are ineffective, however BMP-2 at this high dosage often results in serious neurological, respiratory problems. inflammatory and inflammatory side effects, which limits the use of bone morphogenetic proteins. The in vivo bioreactor improves the efficacy of these biopharmaceuticals and reduces the risk of complications.
Способ выращивания костной ткани в пространстве ин виво биореактора для восстановления костных дефектов включает следующие этапы:A method for growing bone tissue in the in vivo space of a bioreactor for restoring bone defects includes the following steps:
- подготавливается операционное поле и выполняется хирургический доступ к болыпебер-цовой кости кролика, иссекается участок диафиза болыпеберцовой кости длиной 3 см в его нижней трети, с формированием посттравматического дефекта (операционная травма в эксперименте),- the operating field is prepared and a surgical approach to the tibia of the rabbit is performed, a 3 cm long section of the tibia diaphysis in its lower third is excised, with the formation of a post-traumatic defect (surgical trauma in the experiment),
-с краев опилов костей снимается надкостница лоскутом циркулярно шириной 0,5 см,- from the edges of the sawdust of the bones, the periosteum is removed with a circular flap 0.5 cm wide,
- на полую трубку ин виво биореактора с двух сторон надеваются воронки в виде усеченного полого конуса из биоинертного натурального латекса,- funnels in the form of a truncated hollow cone made of bioinert natural latex are put on the hollow tube of the in vivo bioreactor from both sides,
- в отверстие трубки ин виво биореактора вставляется сначала опил дистальной части кости, затем проксимальной части кости, манжеты воронки должны плотно прилегать к наружным поверхностям фрагментов кости по всей длине их окружности,- first sawdust of the distal part of the bone, then the proximal part of the bone is inserted into the opening of the tube of the in vivo bioreactor, the cuffs of the funnel should fit snugly against the outer surfaces of the bone fragments along the entire length of their circumference,
- для трубок из силиконовой резины делаются два отдельных раневых канала по которым их свободные концы от трубы биореактора идут к поверхности кожи, причем для прохождения через дерму кожи делается прокол кожи с наружной стороны через слой эпидермиса и с помощью прямого зажима типа москит трубка через отверстие в дерме вытягивается наружу,- for silicone rubber tubes, two separate wound channels are made through which their free ends from the bioreactor tube go to the skin surface, and in order to pass through the skin dermis, the skin is punctured from the outside through the epidermis layer and using a direct clamp such as a mosquito tube through a hole in the dermis pulls out
- свободные концы трубок крепятся через штуцер к разъему типа "Луер-Лок" с защитным колпачком,- the free ends of the tubes are attached through a fitting to a Luer-Lock connector with a protective cap,
-производится стабилизация костных отломков с помощью аппарата внешней фиксации для чрескостного остеосинтеза,- bone fragments are stabilized using an external fixation device for transosseous osteosynthesis,
- ушивание операционный раны с наложением асептической повязки,- suturing the surgical wound with the imposition of an aseptic bandage,
- животное укладывается на бок,- the animal is laid on its side,
- трубки из силиконовой резины с металлическим штекер / соединительным разъемом для шприца типа "Луер-Лок" с защитным колпачком переводятся в вертикальное положение, колпачки открываются,- tubes made of silicone rubber with a metal plug / connector for a Luer-Lock type syringe with a protective cap are moved to a vertical position, the caps open,
- через силиконовую трубку с зеленым маркером вводиться композиция, заполнение ин виво биореактора контролируется по уровню жидкости в другой трубке,- the composition is introduced through a silicone tube with a green marker, the filling of the in vivo bioreactor is controlled by the level of liquid in the other tube,
- смена раствора в первые 2 суток от момента операции проводится 2 раза в сутки, в качестве раствора используется среда ДМЕМ или F12 с добавлением пенициллин-стрептомициновой смеси и Фактор роста эндотелия сосудов- А человека, изоформа 165, рекомбинантный (rhVEGF-A165) в количестве 0,25 нг на 1 мл композиции, после слива раствора ин виво биореактор промывается стерильным изотоническим раствором натрия хлорида,- solution change in the first 2 days from the moment of operation is carried out 2 times a day, DMEM or F12 medium is used as a solution with the addition of a penicillin-streptomycin mixture and human vascular endothelial growth factor-A, isoform 165, recombinant (rhVEGF-A165) in an amount 0.25 ng per 1 ml of the composition, after draining the solution in vivo, the bioreactor is washed with a sterile isotonic sodium chloride solution,
- далее 1 раз в сутки в течение 8 дней пространство ин виво биореактора заполняется средой ДМЕМ с глутамином (ПанЭко, РФ), с добавлением пеш1циллин-стрептомициновой смеси, с добавлением 10% лизата кроличьих тромбоцитов, с добавлением фактор роста эндотелия сосудов- А человека, изоформа 165, рекомбинантный (rhVEGF-A165) в количестве 0,25 нг на 1 мл среды, после слива композиции ин виво биореактор промывается стерильным изотоническим раствором натрия хлорида,- then, once a day for 8 days, the in vivo space of the bioreactor is filled with DMEM medium with glutamine (PanEco, RF), with the addition of a peshcillin-streptomycin mixture, with the addition of 10% rabbit platelet lysate, with the addition of human vascular endothelial growth factor-A, isoform 165, recombinant (rhVEGF-A165) in the amount of 0.25 ng per 1 ml of medium, after draining the composition in vivo, the bioreactor is washed with a sterile isotonic sodium chloride solution,
- далее 1 раз в сутки в течение 15 дней пространство ин виво биореактора заполняется средой F12 с добавлением ВМР-7 (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-7 (rhBMP-7) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр среды по четным дням, средой F12 с добавлением ВМР-2 (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-2 (rhBMP-2) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр по нечетным дням,- then, once a day for 15 days, the in vivo space of the bioreactor is filled with F12 medium with the addition of BMP-7 (recombinant human morphogenetic protein-7 (rhBMP-7) at a concentration of 25 nanograms per milliliter of medium on even days, F12 medium with the addition of BMP -2 (recombinant human morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) at a concentration of 25 nanograms per milliliter on odd days,
- через 25-30 суток проводится хирургическая операция по извлечению ин виво биореактора, доступ через шов от операции по установке биореактора, со стороны трубок из силиконовой резины обнажается стенка ин виво биореактора, трубки из силиконовой резины отсекаются у места вхождения трубки в стенку трубы, металлический штуцер выкручивается, с обоих концов трубы ин виво биореактора стягиваются воронки, кусачками рассекаются стенки воронки по всей длине, кусачками раскалывается стенка трубы ин виво биореактора вдоль, удаляются осколки костного цемента из раны,- after 25-30 days, a surgical operation is performed to remove the in vivo bioreactor, access through the suture from the operation to install the bioreactor, the wall of the in vivo bioreactor is exposed from the side of the silicone rubber tubes, the silicone rubber tubes are cut off at the point where the tube enters the pipe wall, metal the fitting is unscrewed, funnels are pulled together from both ends of the tube of the in vivo bioreactor, the walls of the funnel are cut along the entire length with wire cutters, the wall of the pipe of the in vivo bioreactor is split lengthwise with wire cutters, fragments of bone cement are removed from the wound,
-труба ин виво биореактора проворачивается вокруг своей оси и кусачками раскалывается вдоль, образуются две части трубы, которые ротационными движениями извлекаются из тканей,- the pipe of the in vivo bioreactor is rotated around its axis and split along its length with wire cutters, two parts of the pipe are formed, which are removed from the tissues by rotational movements,
-трубки из силиконовой резины полностью удаляются, для этого их вытягивают зажимом за концы торчащие из поверхности кожи,- silicone rubber tubes are completely removed, for this they are pulled out with a clamp by the ends protruding from the surface of the skin,
-проводиться послойное ушивание раны,- layer-by-layer suturing of the wound,
- аппарат Илизарова демонтируют после минерализации костного регенерата, не позже, чем через 5 месяцев, под контролем методов медицинской визуализации.- the Ilizarov apparatus is dismantled after the mineralization of the bone regenerate, no later than 5 months, under the control of medical imaging methods.
Пример осуществления способа по изобретению.An example of the implementation of the method according to the invention.
В условиях операционной подопытное животное - кролик вводится в состояние наркоза. Подготавливается операционное поле, удаляется шерсть с бедра и голени задней конечности животного, производится обработка операционного поля антисептиками. Выполняется чрезкожный хирургический доступ к болынеберцовой кости кролика с латеральной стороны и продольным кости разрезом кожи, с помощью иглы Джигли выпиливается участок диафиза болынеберцовой кости длиной 3 см в его нижней трети, формируется послеоперационный асептический дефект болынеберцовой кости. Концы опилов костей на 1-2 см выдвигаются из окружающих мягких тканей. Далее приступаем к сборке и креплению стерильного ин виво биореактора. Для это на полую трубу ин виво биореактора с двух сторон надеваются воронки в виде усеченного полого конуса из биоинертного натурального латекса, больший диаметр воронки натягивается на трубу биореактора, манжета воронки должна плотно прилежать к наружной поверхности трубы. Утолщение на трубе препятствует смещению воронки и разрушению конструкции. Далее аккуратно растягивается менее широкое отверстие воронки и в него вставляется сначала опил дистального фрагмента травмированной кости, а затем проксимальной части кости, для облегчения задачи костные отломки могут аккуратно отодвигаться, манжеты воронки должны плотно прилегать к наружным поверхностям фрагментов кости по всей длине их окружности. Для трубок из силиконовой медицинской резины делаются два отдельных раневых канала в мягких тканях по которым их свободные концы от трубы биореактора идут к поверхности кожи, причем для прохождения через дерму кожи делается прокол кожи с наружной стороны через слой эпидермиса и с помощью прямого зажима типа москит трубка через отверстие в дерме вытягивается наружу, трубки должны быть плотно окружены кожей, важно, чтобы трубки шли отдельно от накладываемых на рану швов при послойном ушивании операционной раны. Выведенные наружу свободные концы трубок крепятся через штуцер к разъему типа "Луер-Лок" и этот адаптер остается закрытым защитным колпачком, до ушивания раны проводиться стабилизация костных отломков с помощью аппарата внешней фиксации для чрескостного остеосинтеза (Накладывается аппарат внешней фиксации Илизарова, «Комплект аппаратов спице-стержневых для чрескостного остеосинтеза длинных и коротких трубчатых костей АСС-ЧК-ТЭП ЦИТО" с набором инструментов для их установки (по типу ГА. Илизарова) ("Аппарат Илизарова"). После установки аппарата Илизарова костные отломки должны быть направлены открытыми костномозговыми каналами друг напротив друга. Далее проводится послойное ушивание операционный раны с наложением асептической повязки. Сразу производится заполнение пространства ин виво биореактора растворами, сначала удаляется кровь, для этого с помощью шприца вводится изотонический раствор натрия хлорида. Перед заполнением животное укладывается на бок со стороны неповрежденной конечности, трубки из силиконовой резины с металлическим штекер / соединительным разъемом для шприца типа "Луер-Лок" с защитным колпачком переводятся в вертикальное положение, колпачки открываются, через силиконовую трубку вводиться раствор, заполнение ин виво биореактора контролируется по уровню жидкости в другой открытой трубке, промывают до почти прозрачного раствора. Далее заполняется биореактор композицией, причем смена раствора в первые 2 суток от момента операции проводится 2 раза в сутки, в качестве раствора используется среда ДМЕМ с добавлением пенициллин-стрептомициновой смеси, с добавлением 10% лизата аллогенных кроличьих тромбоцитов, с добавлением фактора роста эндотелия сосудов- А, изоформа 165, рекомби-нантного (rhVEGF-A165) в количестве 0,25 нг на 1 мл композиции.In the conditions of the operating room, the experimental animal - the rabbit is introduced into a state of anesthesia. The surgical field is prepared, hair is removed from the thigh and lower leg of the hind limb of the animal, the surgical field is treated with antiseptics. A percutaneous surgical approach is performed to the rabbit tibia from the lateral side and the longitudinal bone through a skin incision, a 3 cm long section of the tibia diaphysis in its lower third is cut with a Gigli needle, and a postoperative aseptic defect of the tibia is formed. The ends of the sawdust of the bones protrude 1-2 cm from the surrounding soft tissues. Next, we proceed to the assembly and fastening of the sterile in vivo bioreactor. To do this, funnels in the form of a truncated hollow cone made of bioinert natural latex are put on the hollow tube of the in vivo bioreactor from both sides, the larger diameter of the funnel is pulled over the bioreactor tube, the funnel cuff should be tightly adjacent to the outer surface of the tube. The thickening on the pipe prevents the funnel from moving and destroying the structure. Next, a less wide opening of the funnel is gently stretched and first sawdust of the distal fragment of the injured bone is inserted into it, and then the proximal part of the bone, to facilitate the task, the bone fragments can be gently moved away, the cuffs of the funnel should fit snugly against the outer surfaces of the bone fragments along the entire length of their circumference. For silicone medical rubber tubes, two separate wound channels are made in soft tissues through which their free ends from the bioreactor tube go to the skin surface, and to pass through the skin dermis, the skin is punctured from the outside through the epidermis layer and using a direct clip such as a mosquito tube it is pulled out through the hole in the dermis, the tubes should be tightly surrounded by the skin, it is important that the tubes go separately from the sutures applied to the wound during layer-by-layer suturing of the surgical wound. The free ends of the tubes brought out are fastened through a fitting to the "Luer-Lock" type connector and this adapter remains closed with a protective cap, until the wound is sutured, the bone fragments are stabilized using an external fixation device for transosseous osteosynthesis (Ilizarov's external fixation device is applied, "Set of needle devices - rods for transosseous osteosynthesis of long and short tubular bones ASS-CHK-TEP CITO "with a set of tools for their installation (according to the GA. Ilizarov type) ("Ilizarov apparatus"). After installing the Ilizarov apparatus, bone fragments should be directed by open medullary canals to each other next, layer-by-layer suturing of the surgical wound is carried out with the application of an aseptic dressing.The space of the in vivo bioreactor is immediately filled with solutions, first the blood is removed, for this, isotonic sodium chloride solution is injected with a syringe.Before filling, the animal is placed on its side from the side of the intact limb and, silicone rubber tubes with a metal plug/connector for a Luer-Lock type syringe with a protective cap are moved to a vertical position, the caps are opened, the solution is injected through the silicone tube, the in vivo filling of the bioreactor is controlled by the liquid level in the other open tube, washed to an almost clear solution. Next, the bioreactor is filled with the composition, and the solution is changed in the first 2 days from the moment of the
При смене раствора ин виво биореактор промывается 1 раз стерильным изотоническим раствором натрия хлорида. Далее 1 раз в сутки на протяжении 8 дней пространство ин виво биореактора заполняется средой ДМЕМ с глутамином (ПанЭко, РФ), с добавлением пенициллин-стрептомициновой смеси, с добавлением 10% лизата кроличьих тромбоцитов, с добавлением фактор роста эндотелия сосудов- А человека, изоформа 165, рекомбинантный (rhVEGF-A165) в количестве 0,25 нг на 1 мл среды, после слива композиции ин виво биореактор промывается стерильным изотоническим раствором натрия хлорида. По мере заполнения пространства ин виво биореактора костным регенератом количество вводимого раствора уменьшается. Через десять дней с момента операции 1 раз в сутки в течение 15 дней пространство ин виво биореактора заполняется средой F12 с добавлением ВМР-7 (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-7 (rhBMP-7) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр среды по четным дням, средой F12 с добавлением ВМР-2 (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-2 (rhBMP-2) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр по нечетным дням. Через 25-30 суток с момента начала эксперимента проводится хирургическая операция по извлечению ин виво биореактора, доступ осуществляется тем же путем через шов от операции по установке биореактора, со стороны трубок из силиконовой резины обнажается стенка ин виво биореактора, трубки из силиконовой резины отсекаются у места вхождения трубки в стенку трубы из костного цемента, металлический штуцер выкручивается, с обоих концов трубы ин виво биореактора стягиваются воронки, кусачками рассекаются стенки воронки по всей длине, кусачками раскалывается стенка трубы ин виво биореактора вдоль, удаляются осколки костного цемента из раны, труба ин виво биореактора проворачивается вокруг своей оси и кусачками раскалывается вдоль, образуются две части трубы, которые ротационными движениями извлекаются из тканей, аккуратно, чтобы не повредить костный регенерат. Трубки из медицинской силиконовой резины полностью удаляются, для этого их вытягивают зажимом за концы торчащие на поверхности кожи, проводится гемостаз и послойное ушивание раны.When changing the solution in vivo, the bioreactor is washed 1 time with a sterile isotonic sodium chloride solution. Then, once a day for 8 days, the in vivo space of the bioreactor is filled with DMEM medium with glutamine (PanEco, RF), with the addition of a penicillin-streptomycin mixture, with the addition of 10% rabbit platelet lysate, with the addition of vascular endothelial growth factor-A, human isoform 165, recombinant (rhVEGF-A165) in the amount of 0.25 ng per 1 ml of medium, after draining the composition in vivo, the bioreactor is washed with a sterile isotonic sodium chloride solution. As the space in the in vivo bioreactor is filled with bone regenerate, the amount of the injected solution decreases. Ten days after the operation, once a day for 15 days, the in vivo space of the bioreactor is filled with F12 medium with the addition of BMP-7 (recombinant human morphogenetic protein-7 (rhBMP-7) at a concentration of 25 nanograms per milliliter of medium on even days, medium F12 supplemented with BMP-2 (recombinant human morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) at a concentration of 25 nanograms per milliliter on odd days. After 25-30 days from the start of the experiment, a surgical operation is performed to remove the in vivo bioreactor, access is provided by the same through the suture from the operation to install the bioreactor, the wall of the in vivo bioreactor is exposed from the side of the silicone rubber tubes, the silicone rubber tubes are cut off at the point where the tube enters the wall of the bone cement tube, the metal fitting is unscrewed, funnels are pulled together from both ends of the tube of the in vivo bioreactor , the walls of the funnel are cut with wire cutters along the entire length, the wall of the pipe is split with wire cutters and along the bioreactor in vivo, fragments of bone cement are removed from the wound, the in vivo bioreactor tube is rotated around its axis and split lengthwise with wire cutters, two parts of the tube are formed, which are removed from the tissues with rotational movements, carefully so as not to damage the bone regenerate. Tubes made of medical silicone rubber are completely removed, for this they are pulled out with a clamp by the ends sticking out on the skin surface, hemostasis is performed and the wound is sutured in layers.
Аппарат Илизарова демонтируют после минерализации костного регенерата, не позже, чем через 4 месяца с момента установки. За состоянием кости необходим контроль с помощью рентгеноскопических методов исследования.The Ilizarov apparatus is dismantled after the mineralization of the bone regenerate, no later than 4 months from the date of installation. The state of the bone requires monitoring using fluoroscopic methods of research.
Изобретение позволяет добиться эффективного сращения кости и быстрой реабилитации животного.EFFECT: invention makes it possible to achieve effective bone fusion and rapid rehabilitation of the animal.
Таким образом, предложенные согласно настоящему изобретению жидкостный ин виво биореактор, композиция, используемая для заполнения внутреннего пространства этого устройства и способ выращивания костной ткани в нем позволяет использовать иные протоколы введения композиций, биофармацевтических и лекарственных средств, за счет непроницаемости корпуса, эффективно поддерживать режим ин виво биореактора с подачей цитокинов, поддерживающих костную регенерацию. При этом жидкостный ин виво биореактор и способ выращивания костной ткани позволяют осуществлять все манипуляции безболезненно, не требует дополнительного наркоза и местной анестезии при терапии костных повреждений.Thus, the liquid in vivo bioreactor proposed according to the present invention, the composition used to fill the internal space of this device, and the method for growing bone tissue in it allow the use of other protocols for the administration of compositions, biopharmaceuticals and drugs, due to the impermeability of the body, to effectively maintain the in vivo mode. bioreactor with the supply of cytokines that support bone regeneration. At the same time, the liquid in vivo bioreactor and the method of growing bone tissue make it possible to carry out all manipulations painlessly, do not require additional anesthesia and local anesthesia in the treatment of bone damage.
Хотя настоящая патентная заявка относится к определенному в прилагаемой ниже в формуле изобретения, важно отметить, что настоящая заявка на патент содержит основание для формулировки других изобретений, которые могут, например, быть заявлены как объект уточненной формулы изобретения настоящей заявки или как объект формулы изобретения в выделенной и/или продолжающей заявке. Такой объект может быть охарактеризован любым признаком или комбинацией признаков, описанных в настоящем документе.Although the present patent application refers to what is defined in the appended claims below, it is important to note that this patent application contains the basis for the formulation of other inventions, which may, for example, be claimed as the subject of the amended claims of the present application or as the subject of claims in the emphasis. and/or a continuation application. Such an object may be characterized by any feature or combination of features described herein.
Claims (3)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2777947C1 true RU2777947C1 (en) | 2022-08-12 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2071737C1 (en) * | 1993-07-13 | 1997-01-20 | Московский областной научно-исследовательский клинический институт | Method for stimulating bone tissue repair |
| RU2090609C1 (en) * | 1995-07-27 | 1997-09-20 | Культин Алексей Юрьевич | Flow-type biological reactor |
| RU2297217C2 (en) * | 2005-06-20 | 2007-04-20 | ФГУ Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии (ФГУ ННИТО Росздрава) | Method for optimizing bone reparative regeneration |
| RU2696232C1 (en) * | 2018-06-26 | 2019-07-31 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of treating a bone defect experimentally |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2071737C1 (en) * | 1993-07-13 | 1997-01-20 | Московский областной научно-исследовательский клинический институт | Method for stimulating bone tissue repair |
| RU2090609C1 (en) * | 1995-07-27 | 1997-09-20 | Культин Алексей Юрьевич | Flow-type biological reactor |
| RU2297217C2 (en) * | 2005-06-20 | 2007-04-20 | ФГУ Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии (ФГУ ННИТО Росздрава) | Method for optimizing bone reparative regeneration |
| RU2696232C1 (en) * | 2018-06-26 | 2019-07-31 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of treating a bone defect experimentally |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Stevens М. М. et al. In vivo engineering of organs: The bone bioreactor PNAS August 9,2005 102 (32). * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8540978B2 (en) | Treatment composition comprising physically disrupted tooth pulp and non-cultured stem cells in a matrix | |
| ES2546734T3 (en) | Rapid preparation and use of tissues and structures obtained by tissue engineering as individual implants | |
| CN112220802A (en) | Process for preparing wound repair agent composition, tube and device | |
| KR20090101273A (en) | In situ system for intra-articular chondral and osseous tissue repair | |
| EP2384199B1 (en) | Enhanced medical implant | |
| KR100702250B1 (en) | Osteoblast composition of semi-solidified mixed fibrin for bone fracture agglutination and its manufacturing method | |
| RU2777947C1 (en) | Liquid in vivo bioreactor for growing bone tissue | |
| Kharkova et al. | Three-dimensional TCP scaffolds enriched with Erythropoietin for stimulation of vascularization and bone formation. | |
| RU2757157C1 (en) | Restoration of the diaphysis of long bones by cellular technology applying a method for autotransplantation of a vessel | |
| EP0049341B1 (en) | Process for conditioning alloplastic implantations and transplantations | |
| RU2284158C1 (en) | Method for surgical treatment of chronic destructive auris media | |
| RU2645963C2 (en) | Method of increasing the volume of bone tissue of the crest of alveolar process of the jaw | |
| RU2375981C1 (en) | Method of treating slowly healing fractures by transplantation of autologic mesenchymal stem cells | |
| JP2006116212A (en) | Regeneration inductive sheet for mesenchymal tissue and production process thereof | |
| RU2748544C1 (en) | Method for targeted minimally invasive access for cell transplantation into bone regenerate | |
| RU2741206C1 (en) | Device, kit and method for transplant introduction into bone regenerate | |
| RU2570034C1 (en) | Method for bone augmentation within alveolar process defect | |
| RU2461621C1 (en) | Method for stimulating formation of fibrocartilagenous regenerated clavus in mammals | |
| RU2744756C1 (en) | Method of transplanting biocomposite spheroids to ensure the possibility of restoring the integrity of the bone in case of defects that exceed the critical size | |
| RU2336841C2 (en) | Method for osteoplasty in experiment | |
| Sterodimas | Tissue engineering with adipose derived stem cells (ADSCs) in plastic & reconstructive surgery: current and future applications | |
| RU2784952C2 (en) | In vivo bioreactor for restoration of integrity of spinal cord pathways after anatomical break and stimulation of neuro-regeneration in traumatic spinal cord disease | |
| RU2750021C1 (en) | Method for restoration of diaphysis of long tubular bones using cellular technologies | |
| RU2778615C1 (en) | Graft, a method for bone marrow autotransplantation to stimulate reparative bone regeneration and a device for carrying out transplantation | |
| RU129793U1 (en) | IMPLANT FOR TREATMENT OF HEMATOGENOUS SPINE OSTEOMYELITIS |