RU2777257C1 - Method for determining the viability of cells in biomedical cell products in the process of regeneration - Google Patents
Method for determining the viability of cells in biomedical cell products in the process of regeneration Download PDFInfo
- Publication number
- RU2777257C1 RU2777257C1 RU2021108641A RU2021108641A RU2777257C1 RU 2777257 C1 RU2777257 C1 RU 2777257C1 RU 2021108641 A RU2021108641 A RU 2021108641A RU 2021108641 A RU2021108641 A RU 2021108641A RU 2777257 C1 RU2777257 C1 RU 2777257C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bmcp
- cells
- stem cells
- mesenchymal stem
- viability
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 230000035899 viability Effects 0.000 title abstract description 16
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims abstract description 63
- 210000002901 Mesenchymal Stem Cells Anatomy 0.000 claims abstract description 47
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims abstract description 7
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 239000001963 growth media Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000700 tracer Substances 0.000 claims description 15
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 abstract description 12
- 230000001172 regenerating Effects 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 9
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 abstract description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000001747 exhibiting Effects 0.000 abstract 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 11
- WLXGQMVCYPUOLM-UHFFFAOYSA-M 1-hydroxyethanesulfonate Chemical compound CC(O)S([O-])(=O)=O WLXGQMVCYPUOLM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 210000000988 Bone and Bones Anatomy 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 210000004271 bone marrow stromal cells Anatomy 0.000 description 3
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 3
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 3
- 238000011099 tissue engineering Methods 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001959 BMCP Anatomy 0.000 description 2
- 101700070083 Bmcp Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 2
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary Effects 0.000 description 2
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 210000003074 Dental Pulp Anatomy 0.000 description 1
- 210000002615 Epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000001808 Exosomes Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 Extracellular Matrix Anatomy 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 210000002540 Macrophages Anatomy 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N N'-amino-N-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 210000000440 Neutrophils Anatomy 0.000 description 1
- 210000000578 Peripheral Nerves Anatomy 0.000 description 1
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 1
- 206010072736 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004304 Subcutaneous Tissue Anatomy 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 1
- 239000000515 collagen sponge Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture media Substances 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic Effects 0.000 description 1
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 1
- 230000000955 neuroendocrine Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000268 renotropic Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical class 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000001228 trophic Effects 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000000989 vascularization Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Предполагаемое изобретение относится к биомедицине, медицине, биотехнологии, регенеративной медицине, в частности к способам определения жизнеспособности стволовых клеток в биомедицинских клеточных продуктах в процессе регенерации раневого дефекта и может быть использовано в экспериментальных исследованиях.The alleged invention relates to biomedicine, medicine, biotechnology, regenerative medicine, in particular to methods for determining the viability of stem cells in biomedical cell products in the process of wound defect regeneration and can be used in experimental studies.
Развитие регенеративной медицины неразрывно связано с созданием клеточных биомедицинских клеточных продуктов (БМКП) - представленных матрицей / скаффолдом-носителем содержащим клетки. Наиболее распространённым типом клеток, вводимых в состав БМКП, являются мезенхимальные стволовые клетки (МСК). Эти клетки привлекают все большее внимание из-за их модулирующих свойств и паракринной активности, которые могут быть использованы в регенеративной медицине. Многочисленные исследования последних лет сосредоточены на создании БМКП (тканеинженерных продуктов), предназначенных для закрытия различных раневых дефектов кожи (S. Roux, G. Bodivit, W. Bartis, A. Lebouvier, N. Chevallier, A. Fialaire-Legendre, P. Bierling, H. Rouard. In vitro characterization of patches of human mesenchymal stromal cells // Tissue Eng Part A 2015; 21(3-4): 417-25. doi: 10.1089/ten.TEA.2013.0615), восстановления или замены поврежденных участков кости (A. Kurzyk, 
В работе A.M. Altman et al. показано, что жизнеспособные МСК в составе БМКП с ацеллюлярной дермальной матрицей-носителем имплантированные в дефект мягких тканей сформированный у мышей, значительно улучшали заживление ран, усиливали регенерацию мягких тканей и способствовали развитию неоваскулярной сети (A.M. Altman, N. Matthias, Y. Yan, Y.-H. Song, X. Bai, E.S. Chiu, D.P. Slakey, E.U. Dermal matrix as a carrier for in vivo delivery of human adipose-derived stem cells // Alt Biomaterials, 2008; 29(10): 1431-42. doi: 10.1016/j.biomaterials. 2007.11.026). В работе T. Yoshikawa et al. рассматриваются клинические случаи применения МСК с использованием в качестве скаффолда-носителя, обеспечивающего поддержание жизнеспособности МСК, коллагеновой губки. МСК на носителе применялись у пациентов с тяжелыми ожогами или трудноизлечимыми дерматопатиями, которые не реагировали на стандартную терапию в течение 3 и более месяцев. У всех пациентов была показана терапевтическая эффективность трансплантации жизнеспособных мезенхимальных клеток, наблюдалась регенерация подкожной клетчатки, формирование эпидермиса и васкуляризация при заживлении ран (T. Yoshikawa, H. Mitsuno, I. Nonaka, Y. Sen, K. Kawanishi, Y. Inada, Y. Takakura, K. Okuchi, A. Nonomura. Wound therapy by marrow mesenchymal cell transplantation // Plast Reconstr Surg, 2008; 121(3): 860-77 doi: 10.1097/01.prs.0000299922.96006.24). Таким образом, необходимым условием для успешного протекания регенеративного процесса при применении БМКП является сохранение жизнеспособности клеток в процессе регенерации. Это позволяет клеткам осуществлять свою паракринную функцию и поддерживать регенеративный процесс, на протяжении длительного времени пролонгировано синтезируя и высвобождая биологически активные вещества.In the work of A.M. Altman et al. It has been shown that viable MSCs as part of BMCP with an acellular dermal carrier matrix implanted in a soft tissue defect formed in mice significantly improved wound healing, enhanced soft tissue regeneration and promoted the development of a neovascular network (A.M. Altman, N. Matthias, Y. Yan, Y .-H. Song, X. Bai, E. S. Chiu, D. P. Slakey, E. U. Dermal matrix as a carrier for in vivo delivery of human adipose-derived stem cells // Alt Biomaterials, 2008; 29(10): 1431-42. doi : 10.1016/j.biomaterials.2007.11.026). T. Yoshikawa et al. clinical cases of using MSCs with the use of a collagen sponge as a carrier scaffold that maintains the viability of MSCs are considered. Carrier-based MSCs have been used in patients with severe burns or intractable dermatopathies who have not responded to standard therapy for 3 or more months. In all patients, the therapeutic efficacy of transplantation of viable mesenchymal cells was shown, regeneration of the subcutaneous tissue, formation of the epidermis and vascularization during wound healing were observed (T. Yoshikawa, H. Mitsuno, I. Nonaka, Y. Sen, K. Kawanishi, Y. Inada, Y Takakura, K. Okuchi, A. Nonomura Wound therapy by marrow mesenchymal cell transplantation // Plast Reconstr Surg, 2008; 121(3): 860-77 doi: 10.1097/01.prs.0000299922.96006.24). Thus, a necessary condition for the successful course of the regenerative process in the application of BMCP is the preservation of cell viability in the process of regeneration. This allows the cells to carry out their paracrine function and maintain the regenerative process, synthesizing and releasing biologically active substances for a long time.
Оценка жизнеспособности стволовых клеток в БМКП в процессе регенерации раневого дефекта является одним из важнейших показателей, который может служить критерием качества БМКП, так как только живые клетки могут обеспечить пролонгированный паракринный эффект, обеспечивая восстановление поврежденной ткани.The assessment of the viability of stem cells in BMCP during the regeneration of a wound defect is one of the most important indicators that can serve as a criterion for the quality of BMCP, since only living cells can provide a prolonged paracrine effect, ensuring the restoration of damaged tissue.
Существует несколько способов оценки жизнеспособности клеток культивируемых в трехмерных носителях в составе БМКП in vitro. Колориметрические и флуориметрические методы широко используются в различных приложениях тканевой инженерии. Анализ метаболического красителя на основе 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) является одним из самых известных анализов такого рода, в котором растворимая соль тетразолия превращается в нерастворимые синие кристаллы формазана, за счет восстановительных реакций в клетках. МТТ-анализ использовался для оценки жизнеспособности клеток в трехмерных тканевых конструкциях. Однако сообщалось, что МТТ может изменять форму клеток и, следовательно, физиологию ткани. Он может повредить клетки, “прокалывая” их мембрану во время экзоцитоза. Крайне важно, что данные методы исследования не применимы для оценки жизнеспособности клеток в процессе регенерации. Осуществить их можно только in vitro до имплантации БМКП, они не позволяют оценить жизнеспособность клеток после имплантации БМКП на живой модели.There are several ways to assess the viability of cells cultured in three-dimensional carriers as part of BMCP in vitro. Colorimetric and fluorimetric methods are widely used in various tissue engineering applications. The 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) metabolic dye assay is one of the best-known assays of its kind, in which a soluble tetrazolium salt is converted to insoluble blue formazan crystals by recovery reactions in cells. MTT assay was used to assess cell viability in 3D tissue constructs. However, it has been reported that MTT can change the shape of cells and hence tissue physiology. It can damage cells by “piercing” their membrane during exocytosis. It is extremely important that these research methods are not applicable for assessing the viability of cells in the process of regeneration. They can only be performed in vitro before BMCP implantation; they do not allow assessing cell viability after BMCP implantation in a living model.
Способы оценки жизнеспособности клеток, основанные на использовании резазурина (например, Alamar Blue™ и Presto Blue™), так же используются в лабораторной практике для контроля и оптимизации процесса культивирования тканей и БМКП. Так была продемонстрирована возможность использования методов на основе резазурина для мониторинга жизнеспособности клеток в рецеллюляризованных матрицах-носителях легких. Ацеллюлярные каркасы легких рецеллюляризировали, а затем в течение 5 дней контролировали жизнеспособность клеток (S.H. Mahfouzi, G. Amoabediny, A. Doryab, S.H. Safiabadi-Tali, M. Ghanei. Noninvasive Real-Time Assessment of Cell Viability in a Three-Dimensional Tissue // Tissue Eng Part C Methods. 2018; 24(4): 197-204. doi: 10.1089/ten.TEC.2017.0371). Метод с использованием резазурина был применен к БМКП с культурой почек и тканеинженерной костной ткани (M. Caralt, J.S. Uzarski, S. Iacob, K.P. Obergfell, N. Berg, B.M. Bijonowski. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation // Am J Transplant 2015; 15(1): 64-75. doi: 10.1111/ajt.12999; R. Owen, C. Sherborne, T. Paterson, N.H. Green, G.C. Reilly, F. Claeyssens. Emulsion templated scaffolds with tunable mechanical properties for bone tissue engineering // J Mech Behav Biomed Mater 2016; 54: 159-72. doi: 10.1016/j.jmbbm.2015.09.019). Тем не менее, известно, что красители на основе резазурина проявляют цитотоксическое действие при длительном воздействии на клетки. Так же не встречается исследований по применению методов с использованием резазурина для оценки жизнеспособности клеток в БМКП в процессе регенерации после имплантации в ткани.Resazurin-based cell viability methods (eg, Alamar Blue™ and Presto Blue™) are also used in laboratory practice to control and optimize tissue culture and BMCP. Thus, the possibility of using resazurin-based methods for monitoring cell viability in recellularized lung carrier matrices was demonstrated. Acellular lung scaffolds were recellularized and then cell viability was monitored for 5 days (S.H. Mahfouzi, G. Amoabediny, A. Doryab, S.H. Safiabadi-Tali, M. Ghanei. Noninvasive Real-Time Assessment of Cell Viability in a Three-Dimensional Tissue / / Tissue Eng Part C Methods 2018; 24(4): 197-204 doi: 10.1089/ten.TEC.2017.0371). The method using resazurin was applied to BMCP with a culture of kidneys and tissue-engineered bone tissue (M. Caralt, J.S. Uzarski, S. Iacob, K.P. Obergfell, N. Berg, B.M. Bijonowski. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation, Am J Transplant 2015, 15(1): 64-75, doi: 10.1111/ajt.12999, R. Owen, C. Sherborne, T. Paterson, N.H. Green, G.C. Reilly, F. Claeyssens, Emulsion templated scaffolds with tunable mechanical properties for bone tissue engineering, J Mech Behav Biomed Mater 2016;54: 159-72 doi: 10.1016/j.jmbbm.2015.09.019). However, resazurin-based dyes are known to exhibit cytotoxic effects upon prolonged exposure to cells. There are also no studies on the use of methods using resazurin to assess the viability of cells in BMCP during regeneration after implantation in tissues.
Методы исследования in vitro широко применимы и очень популярны, они позволяют проводить видоспецифичный, простой, удобный и подробный анализ, однако показатели жизнеспособности клеток, полученные вне организма данными методами, не всегда соответствуют реальной картине внутри живой системы, так как в условиях in vitro клетки могут функционировать иначе, чем в ткани. При имплантации резко меняются условия, в которые попадает БМКП. Может наблюдаться воспалительный процесс, затрагивающий мягкие и твердые ткани, окружающие БМКП. При воспалительном процессе в тканях повышается уровень эндотоксинов, индукторов воспалительной реакции, активируются клетки-мишени (макрофаги и нейтрофилы). Высвобождающиеся свободные цитокины активируют клетки различных тканей и органов, индуцируя метаболические, гормональные и нейроэндокринные изменения в организме. Все это может оказывать непосредственное влияние на жизнеспособность клеток имплантированного БМКП. Таким образом, жизнеспособности клеточного компонента БМКП, оцененная в условиях in vitro, не может быть экстраполирована на условия in vivo. Поэтому разработка методов, позволяющих провести оценку жизнеспособности клеток в БМКП после имплантации в процессе регенерации тканей, является актуальной задачей.In vitro research methods are widely applicable and very popular, they allow for species-specific, simple, convenient and detailed analysis, however, cell viability indicators obtained outside the body by these methods do not always correspond to the real picture inside a living system, since under in vitro conditions cells can function differently than in tissue. Implantation dramatically changes the conditions in which BMCP falls. There may be an inflammatory process affecting the soft and hard tissues surrounding the BMCP. During the inflammatory process in the tissues, the level of endotoxins, inducers of the inflammatory reaction, increases, target cells (macrophages and neutrophils) are activated. The released free cytokines activate the cells of various tissues and organs, inducing metabolic, hormonal and neuroendocrine changes in the body. All this can have a direct impact on the viability of the cells of the implanted BMCP. Thus, the viability of the cellular component of BMCP, assessed in vitro, cannot be extrapolated to in vivo conditions. Therefore, the development of methods to assess the viability of cells in BMCP after implantation in the process of tissue regeneration is an urgent task.
В качестве прототипа выбран способ, применяемый для определения жизнеспособности клеток в процессе регенерации в БМКП представленном гидрогелем с инкапсулированными МСК имплантируемом в ткани экспериментального животного (X. Ding, G. Yang, W. Zhang, G. Li, S. Lin, D.L Kaplan, X. Jiang. Increased stem cells delivered using a silk gel/scaffold complex for enhanced bone regeneration. // Sci Rep. 2017. 7(1): 2175. doi: 10.1038/s41598-017-02053-z2017) включающий окрашивание специфическим трассирующим флуоресцентным красителем (например, CellTrackerTM CM-Dil, Invitrogen, USA) МСК до формирования БМКП, инкапсуляцию окрашенных клеток в скаффолд-носитель, культивирование сформированного БМКП in vitro с последующей имплантацией в дефекты тканей лабораторных животных (крыс), эвтаназию экспериментальных животных в контрольные сроки, выделение области дефекта (вырезание), куда был имплантирован БМКП, фиксацию полученных образцов в 10%-ном буферном растворе формальдегида, их дегидратацию в градиенте от 75% до абсолютного этанола и заключаются в блок полиметилметакрилата (ПММА), затем образцы разрезаются на секции толщиной 150 мкм с помощью микротома Leica SP1600 (Leica, Германия) и отполировываются до конечной толщины 40 мкм, в полученных срезах с помощью флуоресцентного стереомикроскопа (например, Leica, Wetzlar, Германия) визуализируются клетки, окрашенные трассирующим флуоресцентным красителем. As a prototype, the method used to determine cell viability during regeneration in BMCP represented by a hydrogel with encapsulated MSCs implanted in the tissues of an experimental animal (X. Ding, G. Yang, W. Zhang, G. Li, S. Lin, D.L Kaplan, X. Jiang, Increased stem cells delivered using a silk gel/scaffold complex for enhanced bone regeneration // Sci Rep. 2017. 7(1): 2175. doi: 10.1038/s41598-017-02053-z2017) including specific tracer staining fluorescent dye (e.g. CellTrackerTM CM-Dil, Invitrogen, USA) MSCs before BMCD formation, encapsulation of stained cells in a carrier scaffold, cultivation of the formed BMCP in vitro with subsequent implantation into tissue defects of laboratory animals (rats), euthanasia of experimental animals at control times, isolation of the defect area (cutting out) where the BMCP was implanted, fixation samples obtained in a 10% formaldehyde buffer solution, their dehydration in a gradient from 75% to absolute ethanol and placed in a block of polymethyl methacrylate (PMMA), then the samples are cut into sections 150 μm thick using a Leica SP1600 microtome (Leica, Germany) and polished to a final thickness of 40 µm, cells stained with a trace fluorescent dye are visualized in the resulting sections using a fluorescent stereomicroscope (for example, Leica, Wetzlar, Germany).
Существенным недостатком способа, представленного в прототипе, является длительность и трудоемкость. Осуществление данного способа требует больших затрат временного ресурса, он включает следующие этапы пробоподготовки образцов выделенных из области имплантации БМКП: фиксацию образцов в формальдегиде, которая может занимать от 6 до 24 часов; обезвоживание образцов в градиенте от 75% до абсолютного этанола, которое может длиться от 24 до 36 часов; изготовление блока, когда кусок материала помещается в форму с расплавленным ПММА и охлаждается, данный этап выполняется вручную длится 12 часов, и его сложно ускорить и; затем материал выдерживают при комнатной температуре в течение 24 часов и, наконец, изготавливают срезы с использованием специального инструмента - микротома. Таким образом, данная процедура даже по самым оптимистичным прогнозам требует 3-4 дня для получения среза. К существенным недостаткам метода можно отнести то, что для получения достаточно тонких (10-30 нм) срезов изучаемых объектов, требуются высокие специальные навыки и умения персонала, осуществляющего данный процесс, наличие специализированного дорогостоящего оборудования (например, микротом Leica SP1600 (Leica, Германия)), с помощью которого получают срезы и отполировывают их до необходимой толщины. Неправильная пробоподготовка может повлечь невозможность получения данных или высокую степень погрешности. Так, например, при большой толщине среза изображение одних структур может как бы «накладываться» на изображение других и их исследование представленным методом становится невозможным. A significant disadvantage of the method presented in the prototype is the duration and complexity. The implementation of this method requires a lot of time resources, it includes the following stages of sample preparation of samples isolated from the BMCP implantation area: fixing the samples in formaldehyde, which can take from 6 to 24 hours; dehydration of samples in a gradient from 75% to absolute ethanol, which can last from 24 to 36 hours; block manufacturing, when a piece of material is placed in a mold with molten PMMA and cooled, this stage is manually performed for 12 hours, and it is difficult to speed up and; then the material is kept at room temperature for 24 hours and, finally, sections are made using a special tool - a microtome. Thus, this procedure, even according to the most optimistic forecasts, requires 3-4 days to obtain a cut. Significant disadvantages of the method include the fact that in order to obtain sufficiently thin (10-30 nm) sections of the studied objects, high special skills and abilities of the personnel carrying out this process are required, the availability of specialized expensive equipment (for example, a Leica SP1600 microtome (Leica, Germany) ), with which sections are obtained and polished to the required thickness. Incorrect sample preparation can result in failure to obtain data or a high degree of error. So, for example, at a large slice thickness, the image of some structures can, as it were, “superimpose” on the image of others, and their study by the presented method becomes impossible.
Необходимо отметить, что используемый для реализации способа прототипа трассирующий флуоресцентный краситель (CellTrackerTM CM-Dil, Invitrogen, USA) является цитоплазматическим и согласно спецификации производителя предназначен для отслеживания клеток в течение 72 часов после окрашивания. В тоже время, исследования, связанные с реализацией регенеративного потенциала БМКП, требуют значительно больше времени. Так, в описанном прототипе на культивирование БМКП после окрашивания отводилось 7 суток и 8 недель непосредственно на экспериментальное исследование с животными. Таким образом, с момента окрашивания клеток до момента визуализации клеток прошло 9 недель. Этот срок значительно превышает 72 часа, что может повлечь большие погрешности при оценке результатов, связанных с выцветанием с течением времени флуоресцентного красителя, перераспределением его при делении клеток (чем дольше период времени, тем больше циклов деления может пройти клетка, и тем меньшее количество красителя будет содержаться в дочерних клетках, соответственно, при длительном эксперименте количество красителя может быть настолько мало, что он не будет детектироваться).It should be noted that the trace fluorescent dye used to implement the prototype method (CellTrackerTM CM-Dil, Invitrogen, USA) is cytoplasmic and, according to the manufacturer's specification, is designed to track cells within 72 hours after staining. At the same time, studies related to the realization of the regenerative potential of BMCP require much more time. So, in the described prototype for the cultivation of BMCP after staining, 7 days and 8 weeks were allotted directly to the experimental study with animals. Thus, 9 weeks passed from the moment of cell staining to the moment of cell visualization. This period significantly exceeds 72 hours, which can lead to large errors in assessing the results associated with the fading of the fluorescent dye over time, its redistribution during cell division (the longer the period of time, the more division cycles a cell can go through, and the less the amount of dye will be contained in daughter cells; accordingly, in a long-term experiment, the amount of the dye may be so small that it will not be detected).
Задача предполагаемого изобретения - усовершенствование способа.The objective of the proposed invention is to improve the method.
Технический результат - уменьшение трудоемкости, затрат времени при оценке жизнеспособности клеток БМПК в процессе регенерации; повышение точности анализа.The technical result is a reduction in labor intensity, time costs in assessing the viability of BMPK cells in the process of regeneration; improving the accuracy of the analysis.
Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем окрашивание трассирующим флуоресцентным красителем мезенхимальные стволовые клетки до формирования биомедицинских клеточных продуктов (БМКП), включение клеток в состав БМКП, культивирование in vitro сформированного БМКП, имплантацию БМКП в ткани экспериментального животного, эвтаназию животного в контрольные сроки, выделение тканей из места имплантации БМКП, визуализацию клеток, окрашенных трассирующим флуоресцентным красителем, окрашивание мезенхимальных стволовых клеток до формирования БМКП осуществляют мембранным трассирующим флуоресцентным красителем, выделенные из места имплантации БМКП ткани распределяют по дну пластиковой чашки Петри, содержащей 1 мл культуральной среды, ex-tempore, без проведения дополнительной пробоподготовки перед визуализацией, проводят исследование не менее чем в 10 полях зрения с использованием широкопольной флуоресцентной микроскопии с прижизненной визуализацией и фотофиксацией жизнеспособных клеток, окрашенных мембранным трассирующим флуоресцентным красителем и обладающих характерным флуоресцентным свечением и морфологическими характеристиками, соответствующими мезенхимальным стволовым клеткам.The technical result is achieved due to the fact that in the method, including staining with a tracer fluorescent dye, mesenchymal stem cells before the formation of biomedical cell products (BMCP), the inclusion of cells in the BMCP, in vitro cultivation of the formed BMCP, implantation of the BMCP into the tissues of an experimental animal, euthanasia of the animal in control periods, isolation of tissues from the site of BMCP implantation, visualization of cells stained with a tracer fluorescent dye, staining of mesenchymal stem cells before the formation of BMCP is carried out with a membrane tracer fluorescent dye, tissues isolated from the site of implantation of BMCP are distributed over the bottom of a plastic Petri dish containing 1 ml of culture medium, ex-tempore, without additional sample preparation before visualization, a study is carried out in at least 10 fields of view using wide-field fluorescence microscopy with intravital visualization and photofixation of life incapable cells stained with a membrane tracing fluorescent dye and having a characteristic fluorescent glow and morphological characteristics corresponding to mesenchymal stem cells.
Способ определения жизнеспособности клеток в биомедицинских клеточных продуктах в процессе регенерации осуществляют следующим образом:The method for determining cell viability in biomedical cell products during regeneration is carried out as follows:
1. Проводят окрашивание мезенхимальных стволовых клеток (МСК) мембранным трассирующим красителем (например, Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate), для этого:1. Mesenchymal stem cells (MSCs) are stained with a membrane tracer dye (for example, Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate), for this:
a) Готовят исходный раствор мембранного трассирующего красителя в растворе диметилсульфоксида (ДМСО) и этанола в соотношении 7:3 в соответствии с протоколом производителя. Используют стоковые растворы красителя 1:10000. Для приготовления 10 мл рабочего окрашивающего раствора на 10 мл полной питательной среды для МСК (например, ДМЕМ/F12 или α-МЕМ) добавляют 2 мкл стокового раствора мембранного трассирующего красителя.a) Prepare a stock solution of membrane tracer in a 7:3 solution of dimethyl sulfoxide (DMSO) and ethanol according to the manufacturer's protocol. Use stock dye solutions 1:10000. To prepare 10 ml working stain solution per 10 ml complete MSC culture medium (eg DMEM/F12 or α-MEM), add 2 µl membrane tracer stock solution.
b) Удалив кондиционную среду из флакона с растущими в виде субконфлюэнтного монослоя МСК, проводят окрашивание клеток. Для этого во флакон с МСК добавляют окрашивающую среду с мембранным трассирующим красителем (например, Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate). Флакон помещают в СО2-инкубатор и выдерживают 30-40 минут при 37°С, 5% СО2 и абсолютной влажности. Затем окрашенные клетки открепляют от пластика с использованием специальных растворов (например, трипсина и Версена), переводя их в суспензию, которую используют для формирования БМКП. b) After removing the conditioned medium from the flask with MSCs growing in the form of a subconfluent monolayer, the cells are stained. To do this, a staining medium with a membrane tracer dye (for example, Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate) is added to the vial with MSCs. The bottle is placed in CO 2 -incubator and incubated for 30-40 minutes at 37°C, 5% CO 2 and absolute humidity. Then the stained cells are detached from the plastic using special solutions (for example, trypsin and Versene), transferring them into a suspension, which is used to form BMCP.
1. Формируют БМКП (например, гидрогелевый биополимерный скаффолд-носитель) с инкапсулированными МСК, окрашенными по п. 1.1. Form a BMCP (for example, a hydrogel biopolymer scaffold carrier) with encapsulated MSCs stained according to claim 1.
2. Проводят имплантацию БМКП в дефект ткани экспериментального животного.2. BMCP is implanted into the tissue defect of the experimental animal.
3. В контрольные сроки животное подвергают эвтаназии. Затем осуществляют забор тканей из области имплантации БМКП.3. During the control periods, the animal is subjected to euthanasia. Then, tissues are taken from the BMCP implantation area.
4. Образец тканей, выделенный из области имплантации БМКП, распределяют по дну предварительно подготовленной пластиковой чашки Петри, содержащей 1 мл культуральной среды для МСК (например, ДМЕМ/F12 или α-МЕМ), с целью предотвращения его пересыхания.4. A tissue sample isolated from the BMCP implantation area is spread over the bottom of a pre-prepared plastic Petri dish containing 1 ml of MSC culture medium (eg, DMEM/F12 or α-MEM) to prevent it from drying out.
5. Проводят визуализацию и фотофиксацию жизнеспособных клеток, окрашенных мембранным специфическим трассирующим флуоресцентным красителем (например, Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate). Для этого ex-tempore, в течение 1 часа после выделения образцов, чашку с образцом тканей переносят на оборудование, позволяющее проводить широкопольную флуоресцентную микроскопию (например, имиджер Cytationᵀᴹ 5), используя канал для регистрации соответствующий рекомендациям спецификации мембранного трассирующего красителя, которым окрашивали МСК по п. 1. Например, GFP канал для регистрации «зеленого» сигнала (длина волны возбуждения - 477 нμ, длина волны эмиссии - 525 нμ). Не менее чем в 10 произвольно выбранных полях зрения проводят визуализацию клеток окрашенных мембранным специфическим трассирующим флуоресцентным красителем. Для этого в поле зрения, меняя фокусное расстояние на фиксированную глубину до 500 μm от дна чашки Петри, «проходят» вдоль оси Z в толщу образца ткани визуализируя объекты с характерным флуоресцентным свечением. Для визуализации и фотофиксации используют объективы с 10-кратным или 20-кратным увеличением. При выявлении объектов с характерным флуоресцентным свечением их фотофиксируют. При характеристике выявленных объектов учитывают их морфологию и ее соответствие морфологическим характеристикам МСК. Объекты, имеющие характерное флуоресцентное свечение и морфологические характеристики, соответствующие МСК (звезчатую или веретеновидную форму, отростки, ядро овальной или круглой формы) оценивают как жизнеспособные МСК.5. Visualization and photofixation of viable cells stained with a membrane specific tracer fluorescent dye (eg, Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate) is carried out. To do this, ex-tempore, within 1 hour after the selection of samples, the dish with a tissue sample is transferred to equipment that allows wide-field fluorescence microscopy (for example, Cytationᵀᴹ 5 imager), using a registration channel corresponding to the recommendations of the specification of the membrane tracer dye, which stained MSCs according to item 1. For example, a GFP channel for registering a "green" signal (excitation wavelength - 477 nμ, emission wavelength - 525 nμ). At least 10 randomly selected fields of view are used to visualize cells stained with a membrane specific tracer fluorescent dye. To do this, in the field of view, changing the focal length to a fixed depth of up to 500 μm from the bottom of the Petri dish, they “pass” along the Z axis into the thickness of the tissue sample, visualizing objects with a characteristic fluorescent glow. For visualization and photo fixation, lenses with 10x or 20x magnification are used. When objects with a characteristic fluorescent glow are detected, they are photographed. When characterizing the identified objects, their morphology and its correspondence to the morphological characteristics of MSCs are taken into account. Objects that have a characteristic fluorescent glow and morphological characteristics corresponding to MSCs (star or fusiform shape, processes, oval or round nucleus) are evaluated as viable MSCs.
Способ определения жизнеспособности клеток в биомедицинских клеточных продуктах в процессе регенерации поясняется фигурами, приложенными к данному описанию.The method for determining cell viability in biomedical cell products during regeneration is illustrated by the figures attached to this description.
На Фиг. 1 представлен пример микрофотоснимка полученного при реализации описанного способа. На снимке хорошо визуализируются МСК (отмечены стрелочкой) с характерным флуоресцентным свечением и морфологическими признаками - множественными отростками и ядром овальной формы. Изображение получено на 7 сутки развития регенеративного процесса после имплантации БМКП в ткани с использованием объектива с 20-кратным увеличением.On FIG. 1 shows an example of a microphotograph obtained by implementing the described method. MSCs are well visualized in the picture (marked with an arrow) with a characteristic fluorescent glow and morphological features - multiple processes and an oval-shaped nucleus. The image was obtained on the 7th day of the development of the regenerative process after BMCP implantation in tissues using a lens with a 20x magnification.
На Фиг. 2 представлен пример микрофотоснимка полученного при реализации описанного способа. На снимке визуализируются МСК с характерным флуоресцентным свечением и морфологическими признаками - веретеновидная или звездчатая форма клеток, наличие отростков, ядро овальной формы (объекты А). Визуализируются объекты с характерным флуоресцентным свечением, но не имеющие характерных морфологических признаков МСК (объекты В). Изображение получено на 14 сутки развития регенеративного процесса после имплантации БМКП в ткани с использованием объектива с 10-кратным увеличением.On FIG. 2 shows an example of a microphotograph obtained by implementing the described method. The picture shows MSCs with a characteristic fluorescent glow and morphological features - spindle-shaped or stellate cells, the presence of processes, an oval-shaped nucleus (objects A). Objects are visualized with a characteristic fluorescent glow, but without characteristic morphological features of MSCs (objects B). The image was obtained on the 14th day of the development of the regenerative process after BMCP implantation in tissues using a lens with a 10x magnification.
Пример 1Example 1
Для определения жизнеспособности клеток в биомедицинских клеточных продуктах в процессе регенерации было проведено окрашивание мезенхимальных стволовых клеток мембранным трассирующим красителем (Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate) согласно представленному способу (п. 1). Далее согласно п. 2-3 способа окрашенные клетки инкапсулировали в БМКП (на основе гидрогелевого биополимерного скаффолда-носителя) и имплантировали в ткани экспериментального животного - крысы. Для этого у крысы формировали дефект ткани - полнослойную скальпированную рану в области спины, в сформированный тканевой дефект имплантировали БМКП. На 7 сутки животное подвергли эвтаназии и осуществили забор образца тканей, выделенный из области имплантации БМКП согласно представленному способу (п. 4-5). Затем проводили визуализацию жизнеспособных клеток, окрашенных мембранным специфическим трассирующим флуоресцентным красителем (Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate), используя GFP канал для регистрации «зеленого» сигнала (длина волны возбуждения - 477 нμ, длина волны эмиссии - 525 нμ) согласно пункту 6, представленного способа. В результате, в 10 полях зрения с использованием объектива с 20-кратным увеличением проводили визуализацию объектов с характерным флуоресцентным свечением, перемещаясь вдоль оси Z на фиксированную глубину 500 μm от дна чашки Петри. При выявлении объектов с характерным флуоресцентным свечением их фотофиксировали. Все внешние характеристики выявленных объектов с характерным флуоресцентным свечением клеток соответствовали морфологическим характеристикам МСК (Фиг. 1). Клетки с характерным флуоресцентным свечением были достаточно крупные, имели отростки. В них хорошо просматривалось ядро овальной формы. Клетки, окрашенные трассирующим флуоресцентным мембранным красителем, имеющие зеленое флуоресцентное свечение и характерную морфологию - соответствующий размер от 20 до 300 мкм, отростки, ядро овальной формы, являются живыми. Таким образом, на 7 сутки после имплантации БМКП в процессе регенерации определялись жизнеспособные мезенхимальные стволовые клетки. Это позволяет сделать заключение, что в имплантированном БМКП МСК сохраняют жизнеспособность в течении 7 суток в процессе регенерации.To determine the viability of cells in biomedical cell products during regeneration, mesenchymal stem cells were stained with a membrane tracer dye (Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate) according to the presented method (p. 1). Further, according to paragraph 2-3 of the method, the stained cells were encapsulated in BMCP (based on a hydrogel biopolymer scaffold-carrier) and implanted in the tissues of an experimental animal - a rat. To do this, a tissue defect was formed in a rat - a full-thickness scalped wound in the back area, and a BMCP was implanted into the formed tissue defect. On day 7, the animal was euthanized and a tissue sample was taken, isolated from the BMCP implantation area according to the presented method (p. 4-5). Then visualization of viable cells stained with a membrane-specific tracing fluorescent dye (Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate) was performed using the GFP channel to register a "green" signal (excitation wavelength - 477 nμ, emission wavelength - 525 nμ) according to paragraph 6 of the presented method. As a result, objects with a characteristic fluorescent glow were visualized in 10 fields of view using a lens with a 20x magnification, moving along the Z axis to a fixed depth of 500 μm from the bottom of the Petri dish. When objects with a characteristic fluorescent glow were detected, they were photographed. All external characteristics of the identified objects with a characteristic fluorescent glow of cells corresponded to the morphological characteristics of MSCs (Fig. 1). Cells with a characteristic fluorescent glow were quite large and had processes. An oval-shaped core was clearly visible in them. Cells stained with a trace fluorescent membrane dye, having a green fluorescent glow and a characteristic morphology - the corresponding size is from 20 to 300 microns, processes, an oval-shaped nucleus, are alive. Thus, on the 7th day after BMCP implantation, viable mesenchymal stem cells were determined in the process of regeneration. This allows us to conclude that in the implanted BMCP, MSCs remain viable for 7 days during the regeneration process.
Пример 2Example 2
Для определения жизнеспособности клеток в биомедицинском клеточном продукте в процессе регенерации было проведено окрашивание мезенхимальных стволовых клеток мембранным трассирующим красителем (Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate) согласно представленному способу (п. 1), которые инкапсулировали в БМКП (на основе скаффолда-носителя из криопреципитата плазмы крови и коллагена) и имплантировали в ткани экспериментального животного. На 14 сутки животное подвергали эвтаназии и осуществили забор образца тканей, выделенный из области имплантации БМКП согласно представленному способу (п. 4-5). Затем проводили визуализацию жизнеспособных клеток, окрашенных мембранным специфическим трассирующим флуоресцентным красителем (Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate), используя GFP канал для регистрации «зеленого» сигнала (длина волны возбуждения - 477 нμ, длина волны эмиссии - 525 нμ) в 10 полях зрения с использованием объектива с 10-кратным увеличением. Для этого в поле зрения, меняя фокусное расстояние на фиксированную глубину до 500 μm от дна чашки Петри, «проходили» вдоль оси Z в толщу образца ткани визуализируя объекты с характерным флуоресцентным свечением согласно пункту 6, представленного способа. To determine the viability of cells in a biomedical cell product during regeneration, mesenchymal stem cells were stained with a membrane trace dye (Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate) according to the presented method (p. 1), which were encapsulated in BMCP (based on a carrier scaffold from cryoprecipitate of blood plasma and collagen) and implanted into the tissues of an experimental animal. On the 14th day, the animal was euthanized and a tissue sample was taken, isolated from the BMCP implantation area according to the presented method (p. 4-5). Then visualization of viable cells stained with a membrane-specific tracing fluorescent dye (Lipophilic Tracers-DiO DiOC14(3) Hydroxyethanesulfonate) was performed using the GFP channel to register a "green" signal (excitation wavelength - 477 nμ, emission wavelength - 525 nμ) at 10 fields of view using a 10x objective lens. To do this, in the field of view, changing the focal length to a fixed depth of up to 500 μm from the bottom of the Petri dish, “passed” along the Z axis into the thickness of the tissue sample, visualizing objects with a characteristic fluorescent glow according to paragraph 6 of the presented method.
При визуализации был выявлен ряд объектов с характерным флуоресцентным свечением и морфологией характерной для МСК (Фиг. 2, объекты А). Клетки были достаточно крупные, веретенообразной и звездчатой формы, с выраженными отростками и хорошо визуализирующимся ядром. Так же визуализировались объекты имеющие характерное флуоресцентное свечение, но не имеющие характерной для МСК морфологи, а именно объекты округлой или овальной формы, без отростков, у которых ядро не визуализируется (Фиг. 2, объекты В). Таким образом, в процессе регенерации на 14 сутки имплантации БМКП сохранялись жизнеспособные МСК. На данном примере хорошо видно, как минимизируется погрешность оценки жизнеспособности МСК, если при анализе учитывается не только характерное флуоресцентное свечение, но и соответствие объекта морфологическим характеристикам клеток. Последнее позволяет отсечь посторонние объекты, которые могут быть представлены различными артефактами или погибшими ошарившимися и элиминирующимися МСК.Visualization revealed a number of objects with a characteristic fluorescent glow and morphology characteristic of MSCs (Fig. 2, objects A). The cells were quite large, fusiform and star-shaped, with pronounced processes and a well-visualized nucleus. Objects with a characteristic fluorescent glow, but not having a morphology characteristic of MSCs, namely, objects of a round or oval shape, without processes, in which the nucleus is not visualized, were also visualized (Fig. 2, objects B). Thus, during the regeneration process on the 14th day of BMCP implantation, viable MSCs were preserved. This example clearly shows how the error in assessing the viability of MSCs is minimized if the analysis takes into account not only the characteristic fluorescent glow, but also the correspondence of the object to the morphological characteristics of the cells. The latter makes it possible to cut off foreign objects, which can be represented by various artifacts or dead MSCs that have gone astray and are being eliminated.
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2777257C1 true RU2777257C1 (en) | 2022-08-01 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA72110U (en) * | 2012-01-05 | 2012-08-10 | Институт Проблем Криобиологии И Криомедицины Национальной Академии Наук Украины | Method for determination of viability of microbial cells immobilized on carriers |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA72110U (en) * | 2012-01-05 | 2012-08-10 | Институт Проблем Криобиологии И Криомедицины Национальной Академии Наук Украины | Method for determination of viability of microbial cells immobilized on carriers |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Толковый словарь Ушакова. Д.Н. Ушаков. 1935-1940. Толковый словарь русского языка", совместно с Н. Ю. Шведовой. 1992. X. Ding et al. Increased stem cells delivered using a silk gel/scaffold complex for enhanced bone regeneration. // Sci Rep. 2017. 7(1): 2175, р. 1-10. Д.Я. Алейник и др. Подход к выбору методов оценки качества биомедицинских клеточных продуктов, предназначенных для замещения дефектов кожи. Современные технологии в медицине. Том 11, номер 4 (2019), с. 34-43. Хесуани Ю. Д. Моделирование функциональной тканеинженерной конструкции щитовидной железы с использованием технологии 3D-биопринтинга. Диссер. к.м.н. Москва, 2020, 186 с. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lesman et al. | Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs | |
| US8222031B2 (en) | Three-dimensional skin model | |
| Hu et al. | Compressed collagen gel as the scaffold for skin engineering | |
| CN105392506B (en) | Implant and manufacture the method for implant by making tissue decellularization under negative pressure | |
| Logeart-Avramoglou et al. | In vitro and in vivo bioluminescent quantification of viable stem cells in engineered constructs | |
| CN107849530A (en) | Blood vessel tissue, skin or mucous membrane equivalent | |
| CN105749350B (en) | A kind of cardiac muscle sticking patch and preparation method thereof | |
| Polonchuk et al. | Towards engineering heart tissues from bioprinted cardiac spheroids | |
| CN105985529A (en) | Sericin-alginate compounded hydrogel and preparation method thereof | |
| Choi et al. | Adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells on 3D silk scaffolds | |
| CN104755611A (en) | Method for producing retinal pigment epithelial cell sheet | |
| CN104399125B (en) | The method that epidermal stem cells breaks up to sweat gland sample epithelial cell | |
| Permlid et al. | Unique animal friendly 3D culturing of human cancer and normal cells | |
| Guo et al. | Vascularization of pancreatic decellularized scaffold with endothelial progenitor cells | |
| JPWO2005014774A1 (en) | Animal cell culture carrier, animal cell culture method and transplantation method using the culture carrier | |
| CN104800886A (en) | Gelatin hydrogel myocardium bionic scaffold and preparation method thereof | |
| CN107446885A (en) | A kind of timbering material of derived mesenchymal stem cells in vitro Osteoinductive differentiation and its application | |
| JP6923204B2 (en) | A method for producing a laminated cell sheet composition, a laminated cell sheet composition produced thereby, and an apparatus for producing the same. | |
| CN114042191A (en) | Cell-printed osteogenic functional scaffold and preparation method and application thereof | |
| Belay et al. | Optical projection tomography imaging of single cells in 3D gellan gum hydrogel | |
| CN102697581B (en) | Method for constructing tissue engineering blood vessel | |
| RU2777257C1 (en) | Method for determining the viability of cells in biomedical cell products in the process of regeneration | |
| WO2021100718A1 (en) | Cell aggregate, production method for cell aggregate, production kit for cell aggregate, and chemical compound evaluation method using cell aggregate | |
| Gea et al. | Study of bacterial cellulose as scaffold on cartilage tissue engineering | |
| Hung et al. | Assessing the ability of zebrafish scales to contribute to the short-term homeostatic regulation of [Ca 2+] in the extracellular fluid during calcemic challenges |