RU2774962C1 - Purple non-sulfur bacterium cereibacter sphaeroides: a producer of bacteriochlorophyll a - Google Patents
Purple non-sulfur bacterium cereibacter sphaeroides: a producer of bacteriochlorophyll a Download PDFInfo
- Publication number
- RU2774962C1 RU2774962C1 RU2021125165A RU2021125165A RU2774962C1 RU 2774962 C1 RU2774962 C1 RU 2774962C1 RU 2021125165 A RU2021125165 A RU 2021125165A RU 2021125165 A RU2021125165 A RU 2021125165A RU 2774962 C1 RU2774962 C1 RU 2774962C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cultivation
- cereibacter
- sphaeroides
- medium
- culture
- Prior art date
Links
- 241001603743 Cereibacter Species 0.000 title claims abstract description 38
- 108010070075 Bacteriochlorophyll A Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- ZSERVQBSOBTXFV-DHHJBRQQSA-M Bacteriochlorophyll A Chemical compound C1([C@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC([C@@H](CC)[C@@H]3C)=[N+]4C3=CC3=C(C(C)=O)C(C)=C5N3[Mg]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ZSERVQBSOBTXFV-DHHJBRQQSA-M 0.000 title claims abstract description 9
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 7
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 title description 7
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 title description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 53
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 abstract description 22
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 abstract description 17
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 abstract description 17
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 abstract description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 12
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000002609 media Substances 0.000 description 44
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 32
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 23
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 21
- 241000191023 Rhodobacter capsulatus Species 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 17
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 17
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 241000192142 Proteobacteria Species 0.000 description 12
- 239000000306 component Substances 0.000 description 12
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 9
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 9
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N Fructose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001243 acetic acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 230000000737 periodic Effects 0.000 description 6
- 230000000243 photosynthetic Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 229940086735 succinate Drugs 0.000 description 6
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 5
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 4
- 241000190984 Rhodospirillum rubrum Species 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 241000131970 Rhodospirillaceae Species 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 for example Substances 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 3
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 3
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-L malate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C(O)CC([O-])=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001478305 Rhodovulum Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L mgso4 Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N nicotinic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-Benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 2qpq Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 241001142109 Chloroflexi Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 210000003495 Flagella Anatomy 0.000 description 1
- 229960002442 Glucosamine Drugs 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-XIXRPRMCSA-N Mesotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-XIXRPRMCSA-N 0.000 description 1
- 229910015621 MoO Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001397 Poly-beta-hydroxybutyrate Polymers 0.000 description 1
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 description 1
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 1
- 229940076788 Pyruvate Drugs 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003254 anti-foaming Effects 0.000 description 1
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M caproate Chemical compound CCCCCC([O-])=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003653 coastal water Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N fumaric acid Chemical compound OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-M isobutyrate Chemical compound CC(C)C([O-])=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-J lipid A(4-) Chemical group O1[C@H](CO)[C@@H](OP([O-])([O-])=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP([O-])([O-])=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-J 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 load Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-M nonanoate Chemical compound CCCCCCCCC([O-])=O FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000002428 photodynamic therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 1
- 230000000754 repressing Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory Effects 0.000 description 1
- 230000035806 respiratory chain Effects 0.000 description 1
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001340 slower Effects 0.000 description 1
- 235000012247 sodium ferrocyanide Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- FJOCMTHZSURUFA-AXYGSFPTSA-N spheroidene Chemical class COC(C)(C)C\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C FJOCMTHZSURUFA-AXYGSFPTSA-N 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic Effects 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 235000019529 tetraterpenoid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-M valerate Chemical compound CCCCC([O-])=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940070710 valerate Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техники.The field of technology.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложенный штамм и способ его культивирования могут применяться в промышленности для выращивания бактерий с целью получения бактериохлорофилла а.The invention relates to biotechnology and microbiology. The proposed strain and method of its cultivation can be used in industry for growing bacteria in order to obtain bacteriochlorophyll a.
Уровень техники.The level of technology.
Бактериохлорофилл а (Бхл а) является основой для синтеза фотосенсибилизаторов для терапии рака, поэтому его получение важно для фотодинамической терапии. Его использование обусловлено тем, что он поглощает свет в ближней ИК области, обеспечивая наиболее глубокое проникновение возбуждающего света в ткани. В природе Бхл а встречается у пурпурных бактерий, эритробактерий и у отдельных представителей филы Chloroflexi, причем пурпурные бактерии синтезируют его в больших количествах. Пурпурные бактерии разделяются на серные и несерные бактерии. Пурпурные несерные бактерии обладают удивительной подвижностью метаболизма и способны расти в фотогетеротрофных, фотоавтотрофных анаэробных условиях, хемогетеротрофных и хемоавтотрофных аэробных условиях в широком диапазоне концентраций растворенного кислорода, а также в хемогетеротрофных анаэробных условиях за счет брожения. При этом многие их представители способны расти с одинаковой скоростью роста как на свету, так и в темновых аэробных условиях. Именно поэтому пурпурные несерные бактерии являются наиболее предпочтительными продуцентами Бхл а.Bacteriochlorophyll a (BChl a) is the basis for the synthesis of photosensitizers for cancer therapy, so its production is important for photodynamic therapy. Its use is due to the fact that it absorbs light in the near infrared region, providing the deepest penetration of excitation light into tissues. In nature, BChl a occurs in purple bacteria, erythrobacteria, and in individual representatives of the phylum Chloroflexi, with purple bacteria synthesizing it in large quantities. Purple bacteria are divided into sulfur and non-sulfur bacteria. Purple non-sulfur bacteria have amazing metabolic mobility and are able to grow in photoheterotrophic, photoautotrophic anaerobic conditions, chemoheterotrophic and chemoautotrophic aerobic conditions in a wide range of dissolved oxygen concentrations, as well as in chemoheterotrophic anaerobic conditions due to fermentation. At the same time, many of their representatives are able to grow at the same growth rate both in the light and in the dark under aerobic conditions. That is why purple nonsulfur bacteria are the most preferable BChl a producers.
У пурпурных бактерий Бхл а является важным компонентом фотосинтетического аппарата и входит в состав как реакционных центров, так и светособирающего аппарата (антенн). Максимальное содержание Бхл а в клетках пурпурных бактерий наблюдается в фототрофных анаэробных условиях при лимитировании роста светом. К сожалению, вследствие особенностей распространения света в поглощающих средах, интенсивное выращивание пурпурных бактерий на свету приводит лишь к концентрациям клеток до 3,5 г сухой биомассы в литре [1]. Поэтому интерес представляет хемогетеротрофное аэробное культивирование пурпурных бактерий.In purple bacteria, BChl a is an important component of the photosynthetic apparatus and is part of both the reaction centers and the light-harvesting apparatus (antennae). The maximum content of Bchl a in the cells of purple bacteria is observed under phototrophic anaerobic conditions when growth is limited by light. Unfortunately, due to the peculiarities of light propagation in absorbing media, intensive cultivation of purple bacteria in the light leads only to cell concentrations up to 3.5 g of dry biomass per liter [1]. Therefore, chemoheterotrophic aerobic cultivation of purple bacteria is of interest.
Кислород подавляет синтез Бхл а. При выращивании в аэробных хемогетеротрофных условиях содержание Бхл а зависит от парциального давления растворенного кислорода (pO2) в среде. Со снижением рО2 содержание Бхл а в биомассе растет. Например, клетки Rhodobacter capsulatus содержали максимальное количество Бхл а при лимитировании роста концентрацией кислорода [1]. Таким образом, интенсивное выращивание пурпурных бактерий для получения Бхл а в хемогетеротрофных условиях возможно, но требуется лимитирование культуры в процессе выращивания концентрацией кислорода.Oxygen inhibits the synthesis of Bchl a. When grown under aerobic chemoheterotrophic conditions, the BChl a content depends on the partial pressure of dissolved oxygen (pO2) in the medium. With a decrease in pO2, the content of Bchl a in the biomass increases. For example, Rhodobacter capsulatus cells contained the maximum amount of BChl a when growth was limited by oxygen concentration [1]. Thus, intensive cultivation of purple bacteria for the production of BChl a under chemoheterotrophic conditions is possible, but it is necessary to limit the culture during cultivation by the oxygen concentration.
Для промышленного производства Бхл а важно подобрать штамм с высокой скоростью роста и подобрать условия культивирования, позволяющие синтезировать высокие концентрации Бхл а.For the industrial production of BChl a, it is important to choose a strain with a high growth rate and choose cultivation conditions that allow the synthesis of high concentrations of BChl a.
Известен способ получения Бхл а, основанный на выращивании пурпурной несерной бактерии Rhodobacter capsulatus в хемогетеротрофных условиях в режиме хемостата с лимитированием концентрацией кислорода с использованием ацетата или лактата [1]. При этом равновесная концентрация биомассы достигала при использовании ацетата 3 г на литр, а лактата - 22 г на литр, т.е. лактат является более предпочтительным субстратом для указанной бактерии. К сожалению, непрерывное культивирование микроорганизмов требует высочайшей квалификации обслуживающего персонала и в производстве практически не используется.A known method for producing Bchl a, based on the cultivation of purple non-sulfur bacterium Rhodobacter capsulatus in chemoheterotrophic conditions in a chemostat mode with limited oxygen concentration using acetate or lactate [1]. At the same time, the equilibrium concentration of biomass reached 3 g per liter of acetate, and 22 g per liter of lactate, i.e. lactate is the preferred substrate for said bacterium. Unfortunately, the continuous cultivation of microorganisms requires the highest qualification of service personnel and is practically not used in production.
Известен способ получения фотосинтетических биомембран и Бхл а, основанный на периодическом культивировании Rhodospirillum rubrum [2]. Культуры указанной пурпурной бактерии выращивали в периодическом режиме при постоянной подаче небольшого количества воздуха и неизменном перемешивании. При этом использовали смесь органических соединений (фруктоза и сукцинат), пропорции которых подобраны таким образом, чтобы рН среды практически не изменялся при культивировании. В процессе культивирования рО2 снижалось и достигало почти нулевых значений. В конце культивирования биомасса составляла 9,1 г сырой биомассы на 1 л среды при высоком содержании фотосинтетических мембран и Бхл а. Однако это значение биомассы соответствует примерно 2 г сухой биомассы в 1 л среды, что ниже, чем описано для фотогетеротрофно выросших культур Rhodobacter capsulatus [1].A known method for obtaining photosynthetic biomembranes and BChl a, based on the periodic cultivation of Rhodospirillum rubrum [2]. Cultures of this purple bacterium were grown in a batch mode with a constant supply of a small amount of air and constant stirring. In this case, a mixture of organic compounds (fructose and succinate) was used, the proportions of which were chosen in such a way that the pH of the medium did not practically change during cultivation. In the process of cultivation, pO2 decreased and reached almost zero values. At the end of cultivation, the biomass was 9.1 g of wet biomass per 1 liter of medium with a high content of photosynthetic membranes and Bchl a. However, this biomass value corresponds to approximately 2 g of dry biomass per 1 L of medium, which is lower than that described for photoheterotrophically grown cultures of Rhodobacter capsulatus [1].
Известен также способ интенсификации хемогетеротрофного роста Rhodospirillum rubrum, основанный на продленном периодическом культивировании [3]. При этом способе культивирования в растущую культуру подавали концентрированную среду со скоростью, определяемой в соответствии с параметрами разработанной модели. Рост культур происходил в 4 фазы. В первой фазе (40 часов) культура росла в периодическом режиме без добавок среды. На второй фазе включали подачу субстратов со скоростью в соответствии с моделью. К 67-71 часу ручное определение содержания сукцината и фруктозы показало, что их содержание в биореакторе превышало допустимую концентрацию, и культуру переводили в третью фазу с коррекцией в подаваемой среде концентрации сукцината и фруктозы. Дополнительно было скорректировано содержание сульфата магния. Четвертая фаза отличалась от третьей фазы измененным рН подаваемой среды, а также наряду с подачей углеродных субстратов дополнительно вводили источник азота и фосфора. На протяжении всего культивирования поддерживали рО2 равное 5%. Через 107 часов культивирования содержание биомассы составляло 59 г сухой биомассы в литре. К сожалению, содержание Бхл а и фотосинтетических мембран было очень низким. Кроме того, в конце культивирования, судя по содержанию белка в среде, значительное число клеток было лизированным. Таким образом, описанный способ интенсивного культивирования пурпурных бактерий имеет низкий выход Бхл а. К недостаткам также следует отнести то, что в процессе выращивания необходимо постоянно измерять содержание основных компонентов и производить корректировку подаваемой среды вручную.There is also known a method of intensifying the chemoheterotrophic growth of Rhodospirillum rubrum, based on prolonged periodic cultivation [3]. With this method of cultivation, a concentrated medium was fed into the growing culture at a rate determined in accordance with the parameters of the developed model. The growth of cultures occurred in 4 phases. In the first phase (40 hours), the culture grew in batch mode without medium additions. The second phase included the supply of substrates at a rate in accordance with the model. By 67-71 hours, manual determination of the content of succinate and fructose showed that their content in the bioreactor exceeded the allowable concentration, and the culture was transferred to the third phase with correction of the concentration of succinate and fructose in the supplied medium. Additionally, the content of magnesium sulfate was adjusted. The fourth phase differed from the third phase in the changed pH of the supplied medium, and along with the supply of carbon substrates, a source of nitrogen and phosphorus was additionally introduced. Throughout the cultivation maintained pO 2 equal to 5%. After 107 hours of cultivation, the biomass content was 59 g dry biomass per liter. Unfortunately, the content of Bchl a and photosynthetic membranes was very low. In addition, at the end of cultivation, judging by the protein content in the medium, a significant number of cells were lysed. Thus, the described method for intensive cultivation of purple bacteria has a low yield of BChl a. The disadvantages also include the fact that during the growing process it is necessary to constantly measure the content of the main components and manually adjust the supplied medium.
Наиболее близким к предполагаемому по достигаемому эффекту и совокупности существенных признаков является способ, описанный в патенте РФ №RU2671158 (17.04.2017) [4]. Согласно этому способу используется пурпурная несерная бактерия Rhodovulum sulfidofilum, у которой синтез Бхл а незначительно зависит от концентрации кислорода, и клетки производят этот пигмент при рО2 в среде до 10% от насыщения воздухом. Бактерия выращивается в продленном периодическом режиме, причем используется неорганическая форма азота, а в качестве органических соединений используются сахара и/или органические кислоты (малат, сукцинат в виде кислоты и соли, глицерин, лимонная кислота и любая их комбинация). Культивирование начинают при невысоком содержании всех компонентов. В процессе роста в реактор подаются из отдельных сосудов органическое соединение, неорганическая форма азота, раствор фосфатов, пеногаситель, титрант, что требует подсоединения к реактору 5 дополнительных сосудов (для органического соединения, неорганической формы азота, раствора фосфатов, щелочи и пеногасителя) и насосов для их подачи. Подача осуществляется вручную в соответствии с результатами измерений остаточных концентраций в ростовой среде сукцината, аммония и фосфатов. Таким образом, проведение культивирования требует не только сложного приготовления нескольких растворов, но и постоянного измерения содержания различных компонентов с участием высококвалифицированного персонала и высокотехнологичного оборудования. В случае неожиданного исчерпания какого-то компонента на период от его окончания до его подачи в реактор культура останавливается в развитии, что замедляет процесс выращивания. Кроме того, периодическая подача приводит к тому, что концентрации веществ в реакторе изменяются от очень низкого до очень высокого уровня, что также может приводить к замедлению роста продуцента вследствие ингибирования роста каким-то компонентом. При выращивании в продленном периодическом режиме авторам удавалось получать до 600 мг Бхл а в литре суспензии. Однако вследствие невысокой скорости роста штамма-продуцента (Rhodovulum sulfidofilum) для достижения указанной концентрации Бхл а в среде необходимо было проводить культивирование более 100 часов.The method described in RF patent No. RU2671158 (04.17.2017) [4] is the closest to the expected one in terms of the effect achieved and the set of essential features. According to this method, the purple non-sulfur bacterium Rhodovulum sulfidofilum is used, in which the synthesis of Bchl a slightly depends on the oxygen concentration, and the cells produce this pigment at pO 2 in the medium up to 10% of air saturation. The bacterium is grown in extended batch mode, using an inorganic form of nitrogen, and as organic compounds using sugars and/or organic acids (malate, succinate in the form of an acid and salt, glycerol, citric acid, and any combination thereof). Cultivation begins with a low content of all components. In the process of growth, an organic compound, an inorganic form of nitrogen, a phosphate solution, a defoamer, a titrant are fed into the reactor from separate vessels, which requires 5 additional vessels to be connected to the reactor (for an organic compound, an inorganic form of nitrogen, a solution of phosphates, an alkali and a defoamer) and pumps for their submissions. Feeding is carried out manually in accordance with the results of measurements of residual concentrations in the growth medium of succinate, ammonium and phosphates. Thus, carrying out cultivation requires not only the complex preparation of several solutions, but also the constant measurement of the content of various components with the participation of highly qualified personnel and high-tech equipment. In the event of an unexpected depletion of some component for the period from its completion to its supply to the reactor, the culture stops in development, which slows down the growing process. In addition, intermittent feeding causes the concentrations of substances in the reactor to change from a very low to a very high level, which can also lead to a slowdown in the growth of the producer due to growth inhibition by some component. When grown in an extended batch mode, the authors managed to obtain up to 600 mg of BChl a per liter of suspension. However, due to the low growth rate of the producer strain (Rhodovulum sulfidofilum), in order to achieve the indicated concentration of Bchl a in the medium, it was necessary to cultivate for more than 100 hours.
Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в получении нового высокоактивного штамма-продуцента для промышленного производства Бхл а. Другой задачей является повышение выхода Бхл а в условиях культивирования, позволяющих синтезировать высокие концентрации Бхл а.The task to be solved by the claimed invention is to obtain a new highly active producer strain for the industrial production of Bchl a. Another task is to increase the yield of Bchl a under cultivation conditions that allow the synthesis of high concentrations of Bchl a.
Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении высокого уровня активности нового штамма Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D, обладающего повышенной скоростью роста и способного расти в широком диапазоне концентраций компонентов среды, в том числе: молочной кислоты, уксусной кислоты, аммония, фосфатов и их смесей, в количестве, которое является эффективным, при производстве Бхл а в промышленных условиях, и повышении выхода Бхл а в усовершенствованном способе культивирования.The technical result that can be obtained by implementing the invention is to provide a high level of activity of the new strain Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D, which has an increased growth rate and is able to grow in a wide range of concentrations of medium components, including: lactic acid, acetic acid, ammonium, phosphates and mixtures thereof, in an amount that is effective in the production of BChl a under industrial conditions, and increasing the yield of BChl a in an improved cultivation method.
Перечень фигурList of figures
Фиг. 1. Графики роста Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D (фиг. А) в присутствии разных концентраций молочной и уксусной кислот по сравнению с типовым штаммом Rhodobacter capsulatus В10 (фиг. Б).Fig. 1. Graphs of the growth of Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D (Fig. A) in the presence of different concentrations of lactic and acetic acids compared with the type strain Rhodobacter capsulatus B10 (Fig. B).
Фиг. 2. Конечная оптическая плотность культур Cereibacter sphaeroides ВКМ В-3534D в присутствии разных концентраций аммония по сравнению с типовым штаммом Rhodobacter capsulatus B10.Fig. Fig. 2. Final optical density of cultures of Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D in the presence of different concentrations of ammonium compared to the type strain Rhodobacter capsulatus B10.
Фиг. 3. Кривая роста Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D при аэробном темновом культивировании в полулогарифмических координатах.Fig. Fig. 3. Growth curve of Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D during aerobic dark cultivation in semilogarithmic coordinates.
Фиг. 4. Рост Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D в трехстадийном режиме при продленно-периодическом культивировании.Fig. Fig. 4. Growth of Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D in a three-stage mode with extended-batch cultivation.
Описание изобретенияDescription of the invention
При совершенствовании промышленной технологии получения бактериохлорофилла а технические задачи решались в области повышения эффективности способа продленного периодического культивирования на основе нового штамма-продуцента.With the improvement of the industrial technology for obtaining bacteriochlorophyll a, technical problems were solved in the field of increasing the efficiency of the method of prolonged periodic cultivation based on a new producer strain.
Штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D был получен из пробы воды, отобранной из прибрежных вод Желтого моря, на юго-восточном побережье полуострова Шаньдун в районе горы Лаошань, Китай.The Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D strain was obtained from a water sample taken from the coastal waters of the Yellow Sea, on the southeast coast of the Shandong Peninsula near Mount Laoshan, China.
Штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D обладает повышенной скоростью роста и способен расти в широком диапазоне концентраций компонентов среды, в том числе: молочной кислоты, уксусной кислоты, аммония, фосфатов и их смесей, в количестве, которое является эффективным. Штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ В-3534D депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН под регистрационным номером ВКМ B-3534D.The strain Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D has an increased growth rate and is able to grow in a wide range of concentrations of medium components, including: lactic acid, acetic acid, ammonium, phosphates and mixtures thereof, in an effective amount. The strain Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D was deposited in the All-Russian Collection of Microorganisms of the Institute of Biochemical Physics of the Russian Academy of Sciences under the registration number VKM B-3534D.
Условия хранения: штамм может храниться при температуре -80°С в 30% глицерине с периодом обновления 1 раз в год.Storage conditions: the strain can be stored at -80°C in 30% glycerol with a renewal period of 1 time per year.
Штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D имеет следующие характеристики.The strain Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D has the following characteristics.
Культурально-морфологические признакиCultural and morphological features
При анаэробном росте на свету - цвет культуры может варьироваться от зеленовато-коричневого до темно-коричневого. При росте в присутствии кислорода, цвет культуры - красный. При росте на агаризованной среде YPS, культура образует красные колонии. Края колоний ровные, рост обильный.When grown anaerobically in the light, the color of the culture can vary from greenish brown to dark brown. When grown in the presence of oxygen, the color of the culture is red. When grown on YPS agar medium, the culture forms red colonies. The edges of the colonies are smooth, growth is plentiful.
Клетки грамотрицательные, сферические с тенденцией к овалу 2,0-2,5 мкм. Клетки могут образовывать короткие цепочки. Клетки подвижные с полярным жгутиком.Cells are gram-negative, spherical with a tendency to an oval of 2.0-2.5 µm. Cells can form short chains. Cells are motile with a polar flagellum.
Физиологические и биохимические характеристикиPhysiological and biochemical characteristics
Растет как анаэробно на свету, так и микроаэробно и аэробно в темноте при температуре - 30-34°С, рН - 7,0.It grows both anaerobically in the light, and microaerobically and aerobically in the dark at a temperature of -30-34°C, pH - 7.0.
Может использовать в качестве доноров электронов и источников углерода ацетат, пропионат, бутират, изо-бутират, валерат, капроат, каприлат, пеларгонат, лактат, пируват, малат, сукцинат, фумарат, цитрат, тартрат, глутамат, глюконат, фруктозу, глюкозу, маннозу, маннитол, сорбитол, глицерин, этанол, водород, сульфид. Ассимилирует сульфат. Способен к азотфиксации. Для роста необходимы тиамин, биотин и никотиновая кислота в качестве ростовых факторов.Can use acetate, propionate, butyrate, isobutyrate, valerate, caproate, caprylate, pelargonate, lactate, pyruvate, malate, succinate, fumarate, citrate, tartrate, glutamate, gluconate, fructose, glucose, mannose as electron donors and carbon sources , mannitol, sorbitol, glycerin, ethanol, hydrogen, sulfide. Assimilate sulfate. Capable of nitrogen fixation. Growth requires thiamine, biotin, and nicotinic acid as growth factors.
Хемотаксономические характеристикиChemotaxonomic characteristics
Фотосинтетическими пигментами бактерии являются Бхл а и каротиноиды сфероиденового ряда. В качестве главного хинона - убихинон 10 (Q-10). Главным образом присутствуют насыщенные жирные кислоты С16 и С18, а также мононенасыщенные кислоты С18:1. В качестве запасных веществ - полисахариды, поли-β-гидроксибутират и полифосфаты. Липополисахариды содержат глюкозамин в качестве единственного аминосахара в своих липидных А-фрагментах, имеют фосфатное, амидное связывание 3-ОН-14:0 и/или 3-оксо-14:0 и сложноэфирное связывание 3-ОН-10:0.The photosynthetic pigments of the bacteria are BChl a and carotenoids of the spheroidene series. As the main quinone - ubiquinone 10 (Q-10). Saturated fatty acids C16 and C18 are mainly present, as well as monounsaturated acids C18:1. As reserve substances - polysaccharides, poly-β-hydroxybutyrate and polyphosphates. Lipopolysaccharides contain glucosamine as the only amino sugar in their lipid A fragments, have 3-OH-14:0 and/or 3-oxo-14:0 phosphate, amide binding, and 3-OH-10:0 ester binding.
Выращивание штаммаGrowing the strain
Штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D культивируют в фотогетеротрофных анаэробных условиях при температуре 30°С на питательной среде Ормеруда, содержащей на 1 л: 1,25 г (NH4)2SO4; 900 мг K2HPO4; 600 мг KH2PO4; 200 мг MgSO4 ⋅ 7 H2O; 11,8 мг FeSO4 ⋅ 7 H2O; 7,5 мг CaCl2; 20 мг ЭДТА; 2,8 мг H3BO3; 0,75 мг Na2MoO4 ⋅ 2 H2O; 2,1 мг MnSO4 ⋅ 4 H2O; 0,24 мг ZnSO4 ⋅ 7 H2O; 0,04 мг CuSO4 ⋅ 5 H2O; 4-6 г лактата или малата; 100 мг дрожжевого экстракта. Фосфаты стерилизовать отдельно, рН перед посевом 6,7-7,0.The strain of Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D is cultivated under photoheterotrophic anaerobic conditions at a temperature of 30°C on a nutrient medium Ormerud containing 1 l: 1.25 g (NH 4 ) 2 SO 4 ; 900 mg K 2 HPO 4 ; 600 mg KH 2 PO 4 ; 200 mg MgSO 4 ⋅ 7 H 2 O; 11.8 mg FeSO 4 ⋅ 7 H 2 O; 7.5 mg CaCl 2 ; 20 mg EDTA; 2.8 mg H 3 BO 3 ; 0.75 mg Na 2 MoO 4 ⋅ 2 H 2 O; 2.1 mg MnSO 4 ⋅ 4 H 2 O; 0.24 mg ZnSO 4 ⋅ 7 H 2 O; 0.04 mg CuSO 4 ⋅ 5 H 2 O; 4-6 g lactate or malate; 100 mg yeast extract. Phosphates should be sterilized separately, pH before sowing 6.7-7.0.
Срок культивирования активной культуры - 1-3 дня в зависимости от интенсивности света и толщины слоя культуры в сосуде.The term for cultivating an active culture is 1-3 days, depending on the light intensity and the thickness of the culture layer in the vessel.
Способ получения Бхл а с помощью штамма бактерии Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D включает подготовку инокулята, стерилизацию реактора с установленными датчиками рН, температуры, pO2 и датчика пены, приготовление стартового питательного раствора, среды-титранта, щелочи, раствора пеногасителя, а также бутыли для приема продукта культивирования с последующей стерилизацией, подсоединение к реактору стерильных растворов среды-титранта, стартового питательного раствора, щелочи и раствора пеногасителя, а также бутыли для приема продукта культивирования, загрузку реактора стартовым питательным раствором, подсоединение к реактору газовой линии для подачи стерильного воздуха, установление необходимых температуры и рН стартового питательного раствора в реакторе, калибровке датчика pO2, засеве инокулята в реактор и последующем культивировании.The method for obtaining Bchl a using the strain of the bacterium Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D includes preparing an inoculum, sterilizing a reactor with installed sensors for pH, temperature, pO 2 and a foam sensor, preparing a starting nutrient solution, a titrant medium, an alkali, a defoamer solution, and a bottle for receiving the culture product with subsequent sterilization, connecting sterile solutions of the titrant medium, starting nutrient solution, alkali and defoamer solution to the reactor, as well as a bottle for receiving the culture product, loading the reactor with the starting nutrient solution, connecting a gas line to the reactor for supplying sterile air, establishing the required temperature and pH of the starting nutrient solution in the reactor, calibrating the pO 2 sensor, seeding the inoculum into the reactor, and subsequent cultivation.
При этом:Wherein:
- в качестве продуцента Бхл а используют штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ В-3534D, обладающий высокой скоростью роста (время удвоения составляет от 2,7 до 2,9 часа в хемогетеротрофных условиях) с использованием дешевых органических субстратов (молочная и уксусная кислоты), способный расти в широком диапазоне концентраций компонентов среды, в том числе: молочной кислоты, уксусной кислоты, аммония, фосфатов и их смесей, в количестве, которое является эффективным.- as a producer of BChl a, a strain of Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D is used, which has a high growth rate (doubling time is from 2.7 to 2.9 hours under chemoheterotrophic conditions) using cheap organic substrates (lactic and acetic acids), capable of growing in a wide range of concentrations of medium components, including: lactic acid, acetic acid, ammonium, phosphates and mixtures thereof, in an effective amount.
- для выращивания бактерии в качестве стартовой используют синтетическую питательную среду Ормеруда [5], а культивирование проводят в продленном периодическом режиме, причем в качестве подаваемой среды используют один концентрированный раствор (титрант), сбалансированный по всем компонентам и имеющий низкое значение рН (не более 4,5);- for growing bacteria, Ormerud synthetic nutrient medium [5] is used as a starting medium, and cultivation is carried out in an extended periodic mode, and one concentrated solution (titrant) is used as a feed medium, balanced in all components and having a low pH value (no more than 4 ,5);
- в качестве косвенного показателя остаточной концентрации органических соединений используют значение рН внутри реактора, с увеличением которого происходит автоматическая подача питательного раствора. Причем для повышения точности регулирования и удешевления производства Бхл а, в качестве источников углерода и энергии используют органические кислоты и их соли, например, молочную кислоту, уксусную кислоту и их смеси;- as an indirect indicator of the residual concentration of organic compounds, the pH value inside the reactor is used, with an increase in which the nutrient solution is automatically supplied. Moreover, to improve the accuracy of regulation and reduce the cost of Bchl a production, organic acids and their salts, for example, lactic acid, acetic acid, and mixtures thereof, are used as carbon and energy sources;
- продленное периодическое культивирование проводят в три стадии: на первой стадии происходит адаптация культуры к условиям внутри реактора с понижением pO2 до уровня 5-20% от насыщения воздухом, при этом поддерживают минимальную скорость вращения перемешивающего устройства и минимальную скорость подачи воздуха; при достижении уровня pO2 5-20% от насыщения воздухом осуществляют переход на вторую стадию, в которой за счет автоматического изменения скорости подачи воздуха и скорости вращения перемешивающего устройства осуществляют поддержание уровня pO2 в пределах от 5 до 20% для наращивания биомассы бактерий, и дополнительно контролируют значение концентрации биомассы; при достижении значений концентрации биомассы 15-50% от желаемой конечной концентрации, культуру переводят в третью стадию, в которой проводят доращивание биомассы при лимитировании концентрацией кислорода в пределах от 0,01 до 0,5% от насыщения воздухом, что приводит к синтезированию основного количества Бхл а.- prolonged periodic cultivation is carried out in three stages: at the first stage, the culture adapts to the conditions inside the reactor with a decrease in pO 2 to a level of 5-20% of air saturation, while maintaining the minimum rotation speed of the agitator and the minimum air supply rate; when the pO 2 level reaches 5-20% of air saturation, a transition is made to the second stage, in which, by automatically changing the air supply rate and the speed of rotation of the agitator, the pO 2 level is maintained in the range from 5 to 20% to increase the bacterial biomass, and additionally control the value of the biomass concentration; upon reaching biomass concentration values of 15-50% of the desired final concentration, the culture is transferred to the third stage, in which the biomass is grown with oxygen concentration limited in the range from 0.01 to 0.5% of air saturation, which leads to the synthesis of the main amount Bhl a.
При составлении питательной среды, используемой в виде титранта, учитывают потребление основных минеральных компонентов пурпурной бактерией и составляют среду в виде одного общего раствора, сбалансированного по всем компонентам, чтобы избежать лимитирования или ингибирования роста культуры вследствие исчерпания или накопления какого-то компонента. Для того, чтобы в этом растворе не происходило выпадения осадков, и чтобы его добавление приводило к понижению рН культуральной жидкости, рН поддерживают кислым.When compiling the nutrient medium used as a titrant, the consumption of the main mineral components by the purple bacterium is taken into account and the medium is composed in the form of one common solution balanced in all components in order to avoid limiting or inhibiting the growth of the culture due to the depletion or accumulation of some component. In order to avoid precipitation in this solution, and so that its addition leads to a decrease in the pH of the culture liquid, the pH is maintained acidic.
Известно, что поддержание уровня pO2 в среде от 5 до 20% при продленном периодическом культивировании приводит к получению большого количества биомассы. Однако эта биомасса будет содержать очень мало Бхл а вследствие репрессии синтеза Бхл а кислородом. Для получения большого количества Бхл а культивирование проводят при продленном периодическом режиме в три стадии.It is known that maintaining the level of pO 2 in the medium from 5 to 20% with prolonged periodic cultivation leads to a large amount of biomass. However, this biomass will contain very little BChl a due to the repression of BChl a synthesis by oxygen. To obtain a large amount of Bchl a, cultivation is carried out at an extended periodical regime in three stages.
На первой стадии происходит адаптация культуры к условиям внутри реактора с понижением pO2 до 5-20% от насыщения воздухом за счет потребления кислорода размножающимися бактериями. При этом поддерживают минимальную скорость вращения перемешивающего устройства и минимальную скорость подачи воздуха.At the first stage, the culture adapts to the conditions inside the reactor with a decrease in pO 2 to 5-20% of air saturation due to oxygen consumption by multiplying bacteria. At the same time, the minimum speed of rotation of the mixing device and the minimum speed of air supply are maintained.
При достижении уровня pO2 5-20% от насыщения воздухом осуществляют переход на вторую стадию, в которой за счет автоматического изменения скорости подачи воздуха и скорости вращения перемешивающего устройства осуществляют поддержание уровня pO2 в пределах от 5 до 20% для наращивания биомассы бактерий, и дополнительно контролируют значение концентрации биомассыWhen the pO 2 level reaches 5-20% of air saturation, a transition is made to the second stage, in which, by automatically changing the air supply rate and the rotation speed of the agitator, the pO 2 level is maintained in the range from 5 to 20% to increase the bacterial biomass, and additionally control the value of biomass concentration
При достижении значений концентрации биомассы 15-50% от желаемой конечной концентрации, культуру переводят в третью стадию, в которой проводят доращивание биомассы при лимитировании концентрацией кислорода в пределах от 0,01 до 0,5% от насыщения воздухом, что приводит к синтезированию основного количества Бхл а. Для этого в третьей стадии выключают автоматическое регулирование концентрации кислорода и фиксируют количество оборотов перемешивающего устройства в минуту и скорость подачи воздуха на тех уровнях, которые были достигнуты к этому моменту выращивания. За счет активного роста бактерий их биомасса (и скорость потребления кислорода) возрастает. Поскольку pO2 определяется динамической разницей между скоростью поступления кислорода (определяемой скоростью перемешивания и скоростью подачи воздуха в реактор) и скоростью его потребления, такая фиксация приводит к снижению pO2 в среде вплоть до лимитирующих концентраций.Upon reaching biomass concentration values of 15-50% of the desired final concentration, the culture is transferred to the third stage, in which the biomass is grown with oxygen concentration limited in the range from 0.01 to 0.5% of air saturation, which leads to the synthesis of the main amount Bhl a. To do this, in the third stage, the automatic regulation of the oxygen concentration is turned off and the number of revolutions of the agitator per minute and the air supply rate are recorded at the levels that have been achieved by this moment of cultivation. Due to the active growth of bacteria, their biomass (and the rate of oxygen consumption) increases. Since pO 2 is determined by the dynamic difference between the rate of oxygen supply (determined by the rate of stirring and the rate of air supply to the reactor) and the rate of its consumption, such fixation leads to a decrease in pO 2 in the medium up to limiting concentrations.
При этом стремятся к поддержанию максимально возможной скорости роста культуры при лимитирующей концентрации кислорода, поскольку содержание Бхл а в биомассе определяется не только концентрацией кислорода, но и скоростью потока электронов по электронтранспортной дыхательной цепи, которая выше при большей скорости роста [6]. Это достигается тем, что переход в третью стадию осуществляют при концентрации биомассы в реакторе, равной от 15 до 50% от желаемой.At the same time, they strive to maintain the maximum possible growth rate of the culture at a limiting oxygen concentration, since the BChl a content in the biomass is determined not only by the oxygen concentration, but also by the electron flow rate along the electron transport respiratory chain, which is higher at a higher growth rate [6]. This is achieved by the fact that the transition to the third stage is carried out at a concentration of biomass in the reactor, equal to from 15 to 50% of the desired.
При использовании известных штаммов пурпурных бактерий в зависимости от состояния инокулята может меняться скорость роста культуры в начальный момент, включая и возможный несбалансированный рост. Вследствие этой неопределенности возможны колебания в составе биомассы пурпурных бактерий и, как результат, накопление различных компонентов среды к концу культивирования. Эти компоненты могут ингибировать рост пурпурной бактерии. Чтобы избежать этого, в новом способе культивирования используют штамм пурпурной несерной бактерии Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D, способный расти в широком диапазоне концентраций компонентов среды, в том числе: молочной кислоты, уксусной кислоты, аммония, фосфатов и их смесей, в количестве, которое является эффективным.When using known strains of purple bacteria, depending on the state of the inoculum, the growth rate of the culture at the initial moment may change, including possible unbalanced growth. Due to this uncertainty, fluctuations in the composition of the biomass of purple bacteria and, as a result, the accumulation of various components of the medium by the end of cultivation are possible. These components can inhibit the growth of the purple bacterium. To avoid this, the new cultivation method uses a strain of purple non-sulfur bacterium Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D, capable of growing in a wide range of concentrations of medium components, including: lactic acid, acetic acid, ammonium, phosphates and their mixtures, in an amount that is efficient.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.The implementation of the invention is confirmed by the following examples.
Пример 1. Устойчивость Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D к высоким концентрациям различных соединений и определение его скорости роста.Example 1. Resistance of Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D to high concentrations of various compounds and determination of its growth rate.
А. Рост Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D в присутствии разных концентраций молочной и уксусной кислот и сравнение с типовым штаммом Rhodobacter capsulatus B10.A. Growth of Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D in the presence of various concentrations of lactic and acetic acids and comparison with the type strain Rhodobacter capsulatus B10.
Для выращивания инокулята использовали питательную среду Ормеруда [5], так как известно, что пурпурные несерные бактерии хорошо растут на этой среде как в фотогетеротрофных анаэробных, так и хемогетеротрофных аэробных условиях [7].The inoculum was grown using the Ormerud nutrient medium [5], since purple nonsulfur bacteria are known to grow well on this medium under both photoheterotrophic anaerobic and chemoheterotrophic aerobic conditions [7].
В полученный раствор добавляли 2 г на литр уксусной и 2 г на литр молочной кислоты, доводили рН до 6,7 и стерилизовали при 1 атм (121°С) в течение 20 мин.2 g per liter of acetic acid and 2 g per liter of lactic acid were added to the resulting solution, the pH was adjusted to 6.7 and sterilized at 1 atm (121°C) for 20 minutes.
Стерильную среду добавляли в стерильный прозрачный сосуд объемом 75 мл, и добавляли Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D или Rhodobacter capsulatus В10 в количестве 1%. Сосуд заполняли полностью, герметично закрывали и устанавливали в люминостат при температуре 30°С и освещении лампами накаливания (100 Вт на м2). Через 36-48 часов полученную культуру использовали для инокуляции экспериментальных сосудов, в качестве которых использовались пробирки диаметром 13 мм с завинчивающейся крышкой (Bellco Glass SKU: 2012-01310).Sterile medium was added to a sterile transparent vessel with a volume of 75 ml, and Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D or Rhodobacter capsulatus B10 was added in an amount of 1%. The vessel was filled completely, hermetically sealed and installed in a luminostat at a temperature of 30°C and illuminated by incandescent lamps (100 W per m 2 ). After 36-48 hours, the resulting culture was used to inoculate experimental vessels, which were 13 mm diameter screw cap tubes (Bellco Glass SKU: 2012-01310).
Питательную среду для экспериментов готовили как указано выше, но концентрацию уксусной и молочной кислоты варьировали в диапазоне от 20 мМ молочной кислоты с 20 мМ уксусной кислоты до 60 мМ молочной кислоты с 60 мМ уксусной кислоты. В среду добавляли 1% Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D или Rhodobacter capsulatus В10, разливали по пробиркам. Пробирки устанавливали в люминостат при температуре 30°С и освещении лампами накаливания (100 Вт на м2). В процессе роста культур при разных концентрациях молочной и уксусной кислот периодически измеряли оптическую плотность суспензии при длине волны 650 нм на спектрофотометре. Полученные данные представлены на фиг. 1.The culture medium for the experiments was prepared as above, but the concentration of acetic and lactic acid was varied from 20 mM lactic acid with 20 mM acetic acid to 60 mM lactic acid with 60 mM acetic acid. 1% Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D or Rhodobacter capsulatus B10 was added to the medium and poured into test tubes. The tubes were placed in a luminostat at a temperature of 30°C and illuminated with incandescent lamps (100 W per m2 ). During the growth of cultures at different concentrations of lactic and acetic acids, the optical density of the suspension was periodically measured at a wavelength of 650 nm on a spectrophotometer. The data obtained is shown in Fig. one.
Из фиг. 1 следует, что при содержании в среде 20 мМ молочной кислоты и 20 мМ уксусной кислоты обе культуры развивались без лаг-периода и достигали одинаковой конечной плотности. Однако, при 40 мМ молочной кислоты и 40 мМ уксусной кислоты в среде оба штамма имели лаг-период около 1 суток, хотя достигали близких конечных значений оптической плотности. При 50 мМ молочной кислоты и 50 мМ уксусной кислоты культура Rhodobacter capsulatus В10 уже не росла, тогда как Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D была способна расти и при 60 мМ молочной кислоты и 60 мМ уксусной кислоты, хотя рост начинался после лаг-периода. Таким образом, Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D способен выдерживать более высокие концентрации уксусной и молочной кислот.From FIG. It follows from Table 1 that when the medium contained 20 mM lactic acid and 20 mM acetic acid, both cultures developed without a lag period and reached the same final density. However, at 40 mM lactic acid and 40 mM acetic acid in the medium, both strains had a lag period of about 1 day, although they reached close final optical density values. At 50 mM lactic acid and 50 mM acetic acid, the culture of Rhodobacter capsulatus B10 no longer grew, while Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D was able to grow even at 60 mM lactic acid and 60 mM acetic acid, although growth began after a lag period. Thus, Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D is able to withstand higher concentrations of acetic and lactic acids.
Б. Рост Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D в присутствии разных концентраций аммония по сравнению с типовым штаммом Rhodobacter capsulatus В10.B. Growth of Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D in the presence of different concentrations of ammonium compared to the type strain Rhodobacter capsulatus B10.
Инокулят для экспериментов выращивали как описано в примере 1А. Питательную среду для экспериментов готовили как в примере 1А, но использовали 20 мМ молочной кислоты с 20 мМ уксусной кислоты, а концентрацию сульфата аммония варьировали от 10 мМ до 130 мМ (от 20 до 260 мМ NH4 +). В среду добавляли 1% Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D или Rhodobacter capsulatus В10, разливали по пробиркам. Пробирки устанавливали в люминостат при температуре 30°С и освещении лампами накаливания (100 Вт на м2). Измеряли конечную оптическую плотность суспензии с разными концентрациями сульфата аммония при длине волны 650 нм на спектрофотометре. На фиг. 2 приведены эти данные, выраженные в единицах оптической плотности. Типовой штамм Rhodobacter capsulatus В10 не способен к росту уже при концентрации аммония 60 мМ, тогда как штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D способен расти и в присутствии 260 мМ ионов аммония. Таким образом, Cereibacter sphaeroides ВКМ В-3534D значительно устойчивее типового штамма по отношению к ионам аммония в среде.The inoculum for the experiments was grown as described in example 1A. Nutrient medium for experiments was prepared as in example 1A, but used 20 mm lactic acid with 20 mm acetic acid, and the concentration of ammonium sulfate varied from 10 mm to 130 mm (from 20 to 260 mm NH 4 + ). 1% Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D or Rhodobacter capsulatus B10 was added to the medium and poured into test tubes. The tubes were placed in a luminostat at a temperature of 30°C and illuminated with incandescent lamps (100 W per m2 ). Measured the final optical density of the suspension with different concentrations of ammonium sulfate at a wavelength of 650 nm on a spectrophotometer. In FIG. 2 shows these data, expressed in units of optical density. The type strain Rhodobacter capsulatus B10 is unable to grow already at an ammonium concentration of 60 mM, while the strain Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D is able to grow even in the presence of 260 mM ammonium ions. Thus, Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D is much more resistant to ammonium ions in the medium than the type strain.
В. Рост Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D в присутствии разных концентраций фосфатов по сравнению с типовым штаммом Rhodobacter capsulatus В10.B. Growth of Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D in the presence of different phosphate concentrations compared to the type strain Rhodobacter capsulatus B10.
Инокулят для экспериментов выращивали как описано в примере 1 А. Питательную среду для экспериментов готовили как в примере 1А, но использовали 20 мМ молочной кислоты с 20 мМ уксусной кислоты, а концентрацию фосфатов в среде варьировали от 1,2 до 27 г на литр. В среду добавляли 1% Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D или Rhodobacter capsulatus В10, разливали по пробиркам. Пробирки устанавливали в люминостат при температуре 30°С и освещении лампами накаливания (100 Вт на м2). Проводили качественную оценку роста культур с разными концентрациями фосфатов. Данные представлены в таблице 3. Типовой штамм Rhodobacter capsulatus В10 не способен к росту при концентрации фосфатов 27 г на литр, тогда как штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D способен расти в присутствии такого количества фосфатов. Таким образом, Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D устойчивее, чем типовой штамм по отношению к высоким концентрациям фосфатов в среде.The experimental inoculum was grown as described in Example 1A. The experimental culture medium was prepared as in Example 1A, but using 20 mM lactic acid with 20 mM acetic acid, and the concentration of phosphates in the medium varied from 1.2 to 27 g per liter. 1% Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D or Rhodobacter capsulatus B10 was added to the medium and poured into test tubes. The tubes were placed in a luminostat at a temperature of 30°C and illuminated with incandescent lamps (100 W per m2 ). Conducted a qualitative assessment of the growth of cultures with different concentrations of phosphates. The data are presented in Table 3. The type strain Rhodobacter capsulatus B10 is not able to grow at a concentration of phosphates of 27 g per liter, while the strain Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D is able to grow in the presence of this amount of phosphates. Thus, Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D is more resistant than the type strain to high concentrations of phosphates in the medium.
Г. Определение скорости роста Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D и сравнение со скоростью роста Rhodobacter capsulatus В10.D. Determination of the growth rate of Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D and comparison with the growth rate of Rhodobacter capsulatus B10.
Инокулят для эксперимента выращивали как описано в примере 1 А.The inoculum for the experiment was grown as described in Example 1A.
Было проведено аэробное культивирование штамма Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D при температуре 30°С и рН, равном 7,0, с измерением оптической плотности культуры при длине волны 650 нм каждые 15 мин. На фиг. 3 приведен график полученной кривой роста культуры в полулогарифмических координатах. Скорость роста считают по линейному участку в полулогарифмических координатах. В данном случае линейный участок начинается с 9 часов и заканчивается в 13,75 часа. Этим временам соответствуют следующие значения оптической плотности при длине волны 650 нм - 0,0177 и 0,0565. Скорость роста можно рассчитать по следующей формуле:An aerobic cultivation of the Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D strain was carried out at a temperature of 30°C and a pH of 7.0, with the measurement of the optical density of the culture at a wavelength of 650 nm every 15 minutes. In FIG. 3 shows a graph of the resulting culture growth curve in semi-logarithmic coordinates. The growth rate is calculated along a linear section in semi-logarithmic coordinates. In this case, the linear section starts at 9:00 and ends at 13.75. These times correspond to the following values of optical density at a wavelength of 650 nm - 0.0177 and 0.0565. The growth rate can be calculated using the following formula:
где μ - скорость роста культуры,where μ is the culture growth rate,
X1 и Х0 - оптическая плотность культуры при длине волны 650 нм в момент времени T1 и Т0 соответственно,X 1 and X 0 - the optical density of the culture at a wavelength of 650 nm at time T 1 and T 0 , respectively,
T1 - Т0 - время роста культуры.T 1 - T 0 - culture growth time.
При подставлении в формулу имеющихся данных, скорость роста культуры Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D получается равной 0,244 в час.When substituting the available data into the formula, the growth rate of the culture of Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D is equal to 0.244 per hour.
На основании литературных данных можно видеть, что скорость роста типового штамма пурпурной несерной бактерии Rhodobacter capsulatus В10 составляет 0,226 в час [8].Based on the literature data, it can be seen that the growth rate of the type strain of the purple nonsulfur bacterium Rhodobacter capsulatus B10 is 0.226 per hour [8].
Перевести скорость роста штаммов во времена удвоения культуры можно по следующей формуле:The growth rate of strains can be converted to culture doubling times using the following formula:
где Тудв - время удвоения культуры,where T doubling - culture doubling time,
μ - скорость роста культуры.μ - culture growth rate.
Время удвоения культуры Rhodobacter capsulatus В10 составляет 3,07 ч, в то время как у Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D этот показатель равен 2,84 ч. Таким образом, штамм Cereibacter sphaeroides имеет более высокую скорость роста.The doubling time of the Rhodobacter capsulatus B10 culture is 3.07 h, while that of Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D is 2.84 h. Thus, the Cereibacter sphaeroides strain has a higher growth rate.
Пример 2. Рост Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D при продленном периодическом культивировании в реакторе.Example 2 Growth of Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D during extended batch culture in a reactor.
Инокулят для эксперимента выращивали как описано в примере 1А, но использовали стерильный сосуд объемом 250 мл.The inoculum for the experiment was grown as described in example 1A, but a sterile 250 ml vial was used.
В собранный реактор объемом 3 л устанавливали предварительно откалиброванные датчики рН, температуры, а также датчики pO2 и уровня пены. После проверки герметичности реактора, его стерилизовали в автоклаве в течение 20 минут при 120°С.Pre-calibrated pH and temperature sensors, as well as pO 2 and foam level sensors were installed in the assembled 3 L reactor. After checking the tightness of the reactor, it was sterilized in an autoclave for 20 minutes at 120°C.
Состав стартовой среды приведен в Таблице 1 и Таблице 2, причем в нее добавляли 15 мМ молочной и 15 мМ уксусной кислот в качестве источников углерода, а рН доводили до 6,8. Состав среды-титранта для подпитки культуры приведен в Таблице 4.The composition of the starting environment is shown in Table 1 and Table 2, and it was added 15 mm lactic and 15 mm acetic acids as carbon sources, and the pH was adjusted to 6.8. The composition of the culture feed titrant medium is shown in Table 4.
Также готовили 2М раствор NaOH.A 2M NaOH solution was also prepared.
Готовили раствор пеногасителя путем растворения 7 г пеногасителя (Silicone anti-foaming emulsion 30, Carl Roth) в 693 мл дистиллированной воды. Готовили бутыль для приема продукта культивирования.An antifoam solution was prepared by dissolving 7 g of antifoam (
Стерилизация стартовой среды, бутыли для приема продукта культивирования, щелочи и раствора пеногасителя происходила в автоклаве в течение 20 минут при 120°С.Sterilization of the starting medium, bottles for receiving the culture product, alkali and defoamer solution took place in an autoclave for 20 minutes at 120°C.
Среду-титрант стерилизовали отдельно в автоклаве в течение 20 минут при 120°С.The titrant medium was sterilized separately in an autoclave for 20 minutes at 120°C.
После стерилизации подсоединяли бутыль для приема продукта культивирования, бутыли со стартовой средой, со средой-титрантом, с щелочью и с раствором пеногасителя. Затем в реактор заливали стартовую среду (1 л), подсоединяли газовую линию для подачи стерильного воздуха, проверяли рН и доводили его до 7,0, доводили температуру до 31°С, калибровали датчик pO2 при максимальном количестве оборотов перемешивающего устройства в минуту и максимальном расходе воздуха. После этого засевали в реактор инокулят (0,25 л на реактор). В реакторе поддерживалась температура равная 31°С и рН, равное 7,0.After sterilization, a bottle was connected to receive the culture product, a bottle with a starting medium, a titrant medium, an alkali, and a defoamer solution. Then the starting medium (1 L) was poured into the reactor, the gas line was connected to supply sterile air, the pH was checked and brought to 7.0, the temperature was adjusted to 31°C, the pO 2 sensor was calibrated at the maximum number of revolutions per minute of the stirrer and air consumption. The inoculum was then seeded into the reactor (0.25 L per reactor). The reactor was maintained at a temperature of 31° C. and a pH of 7.0.
В процессе культивирования объем суспензии в реакторе постоянно возрастал за счет добавления среды-титранта. Культивирование проводили до практически полного заполнения реактора. В конце процесса отбирали конечную точку, в которой измеряли оптическую плотность, вес высушенных клеток и содержание Бхл а.During cultivation, the volume of the suspension in the reactor was constantly increased by adding a titrant medium. Cultivation was carried out until the reactor was almost completely filled. At the end of the process, an endpoint was selected, at which the optical density, weight of dried cells, and Bchl a content were measured.
Культивирование проводили в три стадии (фиг. 4). На первой стадии происходит адаптация культуры к условиям внутри реактора с понижением pO2 до уровня 5-20% от насыщения воздухом. На этой стадии поддерживают минимальную скорость вращения перемешивающего устройства в пределах от 90 до 110 оборотов в минуту и минимальную скорость подачи воздуха в реактор в пределах от 0,25 до 0,35 л в минуту для 3 литрового реактора.Cultivation was carried out in three stages (Fig. 4). At the first stage, the culture adapts to the conditions inside the reactor with a decrease in pO 2 to a level of 5-20% of air saturation. At this stage, the minimum rotation speed of the agitator is maintained in the range of 90 to 110 rpm and the minimum air supply rate to the reactor is in the range of 0.25 to 0.35 l per minute for a 3 liter reactor.
После того как pO2 снижается до уровня 5 - 20% от насыщения воздухом (обычно от 2 до 8 часов после начала культивирования) осуществляют переход на вторую стадию для наращивания биомассы бактерий. В этой стадии за счет автоматического изменения скорости подачи воздуха и скорости вращения перемешивающего устройства осуществляют поддержание уровня pO2 в пределах от 5 до 20%. При этом дополнительно контролируют значение концентрации биомассы. Эта стадия длится обычно до 22-28 часов от начала культивирования.After the pO 2 is reduced to a level of 5 - 20% of air saturation (usually from 2 to 8 hours after the start of cultivation) carry out the transition to the second stage to increase the biomass of bacteria. In this stage, by automatically changing the air supply rate and the speed of rotation of the agitator, the pO 2 level is maintained in the range from 5 to 20%. At the same time, the biomass concentration value is additionally controlled. This stage usually lasts up to 22-28 hours from the start of cultivation.
При достижении значений концентрации биомассы от 15 до 50% от желаемой конечной концентрации культуру переводят в третью стадию, в которой проводят доращивание биомассы при лимитировании концентрацией кислорода в пределах от 0,01 до 0,5% от насыщения воздухом, что приводит к синтезированию основного количества Бхл а. Для этого выключают автоматическое регулирование pO2 в среде и оставляют ту скорость вращения перемешивающего устройства и скорость подачи воздуха, которые к этому моменту были установлены системой автоматического регулирования. Культивирование прекращают, когда реактор практически полностью заполнялся культуральной суспензией. Обычно это составляло от 45 до 50 часов от начала культивирования. В примере 2 приведен эксперимент, в котором культивирование остановили на 47 часу (фиг. 4). В этом примере концентрация биомассы в реакторе составляла 49,5 г сухой биомассы в литре (201 единица оптической плотности при длине волны 650 нм), содержание Бхл а было 424 мг в литре культуры. В различных экспериментах содержание Бхл а варьировалось от 400 до 450 мг на литр.Upon reaching biomass concentration values from 15 to 50% of the desired final concentration, the culture is transferred to the third stage, in which biomass is grown with oxygen concentration limited in the range from 0.01 to 0.5% of air saturation, which leads to the synthesis of the main amount Bhl a. To do this, turn off the automatic control of pO 2 in the environment and leave the speed of rotation of the mixing device and the air supply rate, which by this time have been set by the automatic control system. Cultivation is stopped when the reactor is almost completely filled with culture suspension. Typically, this was 45 to 50 hours from the start of cultivation. Example 2 shows an experiment in which the cultivation was stopped at 47 hours (FIG. 4). In this example, the biomass concentration in the reactor was 49.5 g dry biomass per liter (201 absorbance units at a wavelength of 650 nm), the Bchl a content was 424 mg per liter of culture. In various experiments, the content of Bchl a varied from 400 to 450 mg per liter.
Таким образом, за 47 часов средняя скорость производства Бхл а составляла 9,0 мг на литр в час, что выше чем описано у патента-прототипа (отношение 600 мг к 120 часам составляет 5,0 мг на литр в час).Thus, over 47 hours, the average Bchl a production rate was 9.0 mg per liter per hour, which is higher than described in the prototype patent (the ratio of 600 mg to 120 hours is 5.0 mg per liter per hour).
Культуральную суспензию центрифугировали, сливали супернатант и концентрированную биомассу в виде пасты замораживали до использования (-20°С).The culture suspension was centrifuged, the supernatant was discarded and the concentrated paste biomass was frozen until use (-20°C).
Бхл а можно выделять любым способом, например, описанным в патентах РФ №RU2671158 [4], РФ №RU2144085 [9].Bchl a can be isolated by any method, for example, described in RF patents No. RU2671158 [4], RF No. RU2144085 [9].
Для проверки возможности масштабируемости процесса получения Бхл а описанным способом проводили выращивание в 15 л реакторе. Через 48-60 часов культивирования содержание Бхл а в реакторе составляло от 300 до 350 мг в литре культуры при концентрации сухой биомассы от 48 до 52 г на литр.To test the feasibility of the scalability of the process for obtaining Bchl a by the described method, growth was carried out in a 15 L reactor. After 48-60 hours of cultivation, the content of Bchl a in the reactor ranged from 300 to 350 mg per liter of culture at a dry biomass concentration of 48 to 52 g per liter.
Промышленная применимостьIndustrial Applicability
В настоящем изобретении описан новый способ получения бактериохлорофилла а, в котором с целью увеличения выхода целевого продукта используют новый штамм Cereibacter sphaeroides ВКМ B-3534D, обладающий повышенной скоростью роста и способный расти в широком диапазоне концентраций компонентов среды, в том числе: молочной кислоты, уксусной кислоты, аммония, фосфатов и их смесей, в количестве, которое является эффективным. Применение нового штамма Cereibacter sphaeroides в усовершенствованном способе культивирования позволяет добиться синергетического эффекта от применения нового штамма и усовершенствованного способа культивирования продуцента Бхл а.The present invention describes a new method for producing bacteriochlorophyll a, in which, in order to increase the yield of the target product, a new strain of Cereibacter sphaeroides VKM B-3534D is used, which has an increased growth rate and is capable of growing in a wide range of concentrations of medium components, including: lactic acid, acetic acids, ammonium, phosphates and mixtures thereof, in an effective amount. The use of a new strain of Cereibacter sphaeroides in an improved method of cultivation makes it possible to achieve a synergistic effect from the use of a new strain and an improved method of cultivation of the Bchl a producer.
Список использованной литературыList of used literature
1. Патрушева Е.В. Синтез бактериохлорофилла а пурпурной несерной бактерией Rhodobacter capsulatus/ Е.В. Патрушева, А.А. Цыганков, В.Ю. Белера, А.С.Федоров // Микробиология. - 2007. - Т. 43 - С.208-212.1. Patrusheva E.V. Synthesis of bacteriochlorophyll a by the purple non-sulfur bacterium Rhodobacter capsulatus / E.V. Patrusheva, A.A. Tsygankov, V.Yu. Belera, A.S. Fedorov // Microbiology. - 2007. - T. 43 - S.208-212.
2. Ghosh, R. Optimization of the Sistrom Culture Medium for Large-Scale Batch Cultivation of Rhodospirillum rubrum under Semiaerobic Conditions with Maximal Yield of Photosynthetic Membranes/ R. Ghosh, A. Hardmeyer, I. Thoenen, R. Bachofen// Applied And Environmental Microbiology. - 1994. - Vol.60 - P. 1698-1700.2. Ghosh, R. Optimization of the Sistrom Culture Medium for Large-Scale Batch Cultivation of Rhodospirillum rubrum under Semiaerobic Conditions with Maximal Yield of Photosynthetic Membranes/ R. Ghosh, A. Hardmeyer, I. Thoenen, R. Bachofen// Applied And environmental microbiology. - 1994. - Vol.60 - P. 1698-1700.
3. Zeiger, L. Model-based high cell density cultivation of Rhodospirillum rubrum under respiratory dark conditions/ L. Zeiger, H. Grammel// Biotechnology and Bioengineering. - 2010. -Vol.105-P. 729-739.3. Zeiger, L. Model-based high cell density cultivation of Rhodospirillum rubrum under respiratory dark conditions/ L. Zeiger, H. Grammel// Biotechnology and Bioengineering. - 2010. -Vol.105-P. 729-739.
4. Ерен Д., Мазор H., СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛА А. Патент РФ №RU2671158 (17.04.2017).4. Eren D., Mazor H., METHOD OF OBTAINING BACTERIOCHLOROPHYL A. Patent RF No. RU2671158 (17.04.2017).
5. Ormerod G.J. Light-dependent utilization of organic compounds and photoproduciton of molecular hydrogen by photosynthetic bacteria: Relationships with nitrogen metabolism/ J. G.5. Ormerod G.J. Light-dependent utilization of organic compounds and photoproduciton of molecular hydrogen by photosynthetic bacteria: Relationships with nitrogen metabolism/ J. G.
Ormerod, S. К. Ormerod, H. Gest // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 1961. - Vol.64 - P. 449-463.Ormerod, S. K. Ormerod, H. Gest // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 1961. - Vol.64 - P. 449-463.
6. Dierstein, R. Nitrogen-limited continuous culture of Rhodopseudomonas capsulata growing photosynthetically or heterotrophically under low oxygen tensions/ R. Dierstein, G. Drews // Archives of Microbiology. - 1974. - Vol.99. - P. 117-128.6. Dierstein, R. Nitrogen-limited continuous culture of Rhodopseudomonas capsulata growing photosynthetically or heterotrophically under low oxygen tensions/ R. Dierstein, G. Drews // Archives of Microbiology. - 1974. - Vol.99. - P. 117-128.
7. Кондратьева E.H. Автотрофные прокариоты, Издательство МГУ, Москва, 1996, стр. 16-74.7. Kondratieva E.H. Autotrophic prokaryotes, Moscow State University Publishing House, Moscow, 1996, pp. 16-74.
8. Цыганков, А. А. Получение биомассы пурпурных бактерий/ А.А. Цыганков, И.Н. Гоготов // Прикладная Биохимия и Микробиология. - 1990. - Т. 26. - С.819-824.8. Tsygankov, A.A. Obtaining the biomass of purple bacteria / A.A. Tsygankov, I.N. Gogotov // Applied Biochemistry and Microbiology. - 1990. - T. 26. - S.819-824.
9. Миронов А.Ф., Ефремов А.В. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛА А, Патент РФ №RU2144085 (10.01.2000).9. Mironov A.F., Efremov A.V. METHOD FOR OBTAINING BACTERIOCHLOROPHYL A, RF Patent No. RU2144085 (10.01.2000).
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2774962C1 true RU2774962C1 (en) | 2022-06-24 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2671158C2 (en) * | 2013-03-11 | 2018-10-29 | Тукад Ип Сарл | Method for producing bacteriochlorophyll a |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2671158C2 (en) * | 2013-03-11 | 2018-10-29 | Тукад Ип Сарл | Method for producing bacteriochlorophyll a |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ORMEROD G.J., et al, Light-dependent utilization of organic compounds and photoproduciton of molecular hydrogen by photosynthetic bacteria: Relationships with nitrogen metabolism, J Archives of Biochemistry and Biophysics, 1961, vol.64, p. 449-463. DIERSTEIN, R., Nitrogen-limited continuous culture of Rhodopseudomonas capsulata growing photosynthetically or heterotrophically under low oxygen tensions, Archives of Microbiology, 1974, vol.99, p. 117-128. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101577820B1 (en) | Novel culture process for a heterotrophic microalga | |
| Deamici et al. | Static magnetic fields in culture of Chlorella fusca: Bioeffects on growth and biomass composition | |
| US20050250190A1 (en) | Crypthecodinium cohnii biomass cultured to synthesize docosahexaenoic acid | |
| CN107287252B (en) | Omega-7 fatty acid composition, method for culturing chrysophyceae to produce composition and application | |
| CN102168115A (en) | Industrialized production method of coenzyme Q10 | |
| ES2755736T3 (en) | Improved fermentation process for a higher coefficient of lipase inhibitor compared to consumed fatty acid | |
| CN1837352A (en) | Method for culturing heterotrophic chlorella with high density | |
| CN117229982B (en) | Application of N- (1, 3-dimethylbutyl) -N' -phenyl p-phenylenediamine-quinone in culture of synechocystis | |
| WO2015085631A1 (en) | Method for culturing botryococcus spp. with high yield | |
| RU2774962C1 (en) | Purple non-sulfur bacterium cereibacter sphaeroides: a producer of bacteriochlorophyll a | |
| RU2774963C1 (en) | Method for cultivation of purple non-sulfur bacteria with a high content of bacteriochlorophyll a | |
| CN111164197B (en) | Methods and systems for heterotrophic and mixotrophic culture of microalgae | |
| CN100371437C (en) | Process for preparing lichem bacillus strain for producing composite amino acid and culture amino acid liquid fertilizer | |
| CN108517338B (en) | Method for producing arachidonic acid oil by fermenting mortierella alpina based on active oxygen regulation | |
| RU2553562C1 (en) | Method of production of xanthan-containing cultural liquid | |
| CN113136321A (en) | Method and system for heterotrophic-autotrophic co-culture of photosynthetic microorganisms and method for production of biomass and bioenergy | |
| SU1731809A1 (en) | Method of preparing protein-vitamin food products | |
| RU2111246C1 (en) | Method of aerobic growing microorganisms biomass preparing | |
| KR900005771B1 (en) | Process for the preparation of glutamic acid | |
| RU2743396C1 (en) | Method for obtaining enterobacterium escherichia coli or salmonella biomass in production bioreactors | |
| RU2708029C1 (en) | Nutrient medium for cultivation of yersinia pestis ev | |
| CN108823132B (en) | Method for prolonging preservation time of liquid photosynthetic bacteria product | |
| CN107604009A (en) | A kind of technique of biofermentation production lycopene | |
| CN101748092B (en) | Method for efficiently culturing photosynthetic bacteria by utilizing molasses | |
| RU2051967C1 (en) | METHOD OF PREPARING β-HYDROXYBUTYRIC ACID POLYMER |