RU2773940C2 - Промотор, специфический в отношении клеток пигментного эпителия сетчатки приматов - Google Patents
Промотор, специфический в отношении клеток пигментного эпителия сетчатки приматов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2773940C2 RU2773940C2 RU2020119176A RU2020119176A RU2773940C2 RU 2773940 C2 RU2773940 C2 RU 2773940C2 RU 2020119176 A RU2020119176 A RU 2020119176A RU 2020119176 A RU2020119176 A RU 2020119176A RU 2773940 C2 RU2773940 C2 RU 2773940C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nucleic acid
- retinal pigment
- acid molecule
- isolated nucleic
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 210000003583 Retinal Pigment Epithelium Anatomy 0.000 title claims abstract description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 120
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 claims abstract description 78
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 57
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 239000000790 retinal pigment Substances 0.000 claims abstract description 9
- 206010064930 Age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000002780 Macular Degeneration Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims description 25
- 230000003612 virological Effects 0.000 claims description 17
- 108010050754 Halorhodopsins Proteins 0.000 claims description 12
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004330 Rhodopsin Human genes 0.000 claims description 9
- 208000007014 Retinitis Pigmentosa Diseases 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 230000002207 retinal Effects 0.000 abstract description 13
- 235000020945 retinal Nutrition 0.000 abstract description 13
- 229930002945 all-trans-retinaldehyde Natural products 0.000 abstract description 11
- 239000011604 retinal Substances 0.000 abstract description 11
- 230000003902 lesions Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 67
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 23
- 210000001525 Retina Anatomy 0.000 description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 17
- 229920000023 polynucleotide Polymers 0.000 description 14
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 14
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 13
- 210000000844 retinal pigment epithelial cell Anatomy 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 6
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 210000000225 Synapses Anatomy 0.000 description 5
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 5
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 5
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 5
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- -1 silencers Substances 0.000 description 5
- 102000003995 transcription factors Human genes 0.000 description 5
- 108090000464 transcription factors Proteins 0.000 description 5
- 230000003363 transsynaptic Effects 0.000 description 5
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 4
- 229920002676 Complementary DNA Polymers 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000001809 detectable Effects 0.000 description 4
- 108091005938 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002873 global sequence alignment Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 4
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 4
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 description 3
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 3
- 108010035848 Channelrhodopsins Proteins 0.000 description 3
- 210000000981 Epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 210000001508 Eye Anatomy 0.000 description 3
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 3
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 3
- 210000000554 Iris Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 Messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 3
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229920002106 messenger RNA Polymers 0.000 description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 3
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 3
- 230000001323 posttranslational Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 3
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000411 Amacrine Cells Anatomy 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 108010082845 Bacteriorhodopsins Proteins 0.000 description 2
- 210000002459 Blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 2
- 210000000234 Capsid Anatomy 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 210000001161 Embryo, Mammalian Anatomy 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241001074968 Halobacteria Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N Lactose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)O[C@@H]1CO)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-UUNJERMWSA-N 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 102000010175 Opsin Human genes 0.000 description 2
- 108020000793 RHO Proteins 0.000 description 2
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- 210000000582 Semen Anatomy 0.000 description 2
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000010291 electrical method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000001537 neural Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 108091008017 photoreceptors Proteins 0.000 description 2
- 230000001402 polyadenylating Effects 0.000 description 2
- 230000001242 postsynaptic Effects 0.000 description 2
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002335 preservative Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000003518 presynaptic Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108091005946 yellow fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloro-1,1,2,2-tetrafluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(F)Cl DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 description 1
- VUKAUDKDFVSVFT-UHFFFAOYSA-N 2-[6-[4,5-bis(2-hydroxypropoxy)-2-(2-hydroxypropoxymethyl)-6-methoxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)-5-methoxyoxane-3,4-diol Chemical compound COC1C(OC)C(OC2C(C(O)C(OC)C(CO)O2)O)C(COC)OC1OC1C(COCC(C)O)OC(OC)C(OCC(C)O)C1OCC(C)O VUKAUDKDFVSVFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-M 5-oxo-L-prolinate Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-M 0.000 description 1
- 102100011550 ACTB Human genes 0.000 description 1
- 101700033661 ACTB Proteins 0.000 description 1
- 101710032514 ACTI Proteins 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 241000243290 Aequorea Species 0.000 description 1
- 241000426851 Aequorea aequorea Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012112 Alexa Fluor 633 Substances 0.000 description 1
- 235000019489 Almond oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M CHEMBL593252 Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229960004424 Carbon Dioxide Drugs 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N Carboxyglutamic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 description 1
- 210000003161 Choroid Anatomy 0.000 description 1
- 210000003483 Chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 210000004240 Ciliary Body Anatomy 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 229960000633 Dextran Sulfate Drugs 0.000 description 1
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N Dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004338 Dichlorodifluoromethane Substances 0.000 description 1
- 229940087091 Dichlorotetrafluoroethane Drugs 0.000 description 1
- 108020004461 Double-Stranded RNA Proteins 0.000 description 1
- 101710038747 EEF1A1 Proteins 0.000 description 1
- 101710038764 EEF1A1P5 Proteins 0.000 description 1
- 101710038745 EEF1A2 Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 229920000665 Exon Polymers 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102200079162 GFRA1 F64L Human genes 0.000 description 1
- 102200079155 GFRA1 S65T Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 101710007246 H3-3A Proteins 0.000 description 1
- 101700009603 HIS3 Proteins 0.000 description 1
- 241000204946 Halobacterium salinarum Species 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 229960002897 Heparin Drugs 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N Heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 238000010867 Hoechst staining Methods 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 210000000987 Immune System Anatomy 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KMPDEGCQSA-N Inosine Natural products O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KMPDEGCQSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 210000001153 Interneurons Anatomy 0.000 description 1
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 description 1
- 108020004391 Introns Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229940067606 Lecithin Drugs 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Chemical group CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000204971 Natronomonas pharaonis Species 0.000 description 1
- 208000009025 Nervous System Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010053643 Neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 206010029305 Neurological disorder Diseases 0.000 description 1
- 210000001331 Nose Anatomy 0.000 description 1
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 1
- 210000001623 Nucleosomes Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N Propylparaben Chemical class CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 229940043131 Pyroglutamate Drugs 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000242743 Renilla reniformis Species 0.000 description 1
- 210000001116 Retinal Neurons Anatomy 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N Rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- 210000003786 Sclera Anatomy 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 229940075582 Sorbic Acid Drugs 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229940032147 Starch Drugs 0.000 description 1
- 241000168914 Strepsirrhini Species 0.000 description 1
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 1
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 101710005270 TEF1 Proteins 0.000 description 1
- 210000000538 Tail Anatomy 0.000 description 1
- 229920001949 Transfer RNA Polymers 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N Trichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)(Cl)Cl CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102400000757 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 101700051338 VSP1 Proteins 0.000 description 1
- 210000002845 Virion Anatomy 0.000 description 1
- 241000195615 Volvox Species 0.000 description 1
- 229920002533 WHP Posttrascriptional Response Element Polymers 0.000 description 1
- 241001492404 Woodchuck hepatitis virus Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- NCYCYZXNIZJOKI-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinaldehyde Chemical compound O=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- 239000008168 almond oil Substances 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering Effects 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L calcium hydrogenphosphate Chemical compound [Ca+2].OP([O-])([O-])=O FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 108091006028 chimera Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001886 ciliary Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000019700 dicalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940042935 dichlorodifluoromethane Drugs 0.000 description 1
- 235000019404 dichlorodifluoromethane Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structures Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 150000002194 fatty esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 108091006031 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034387 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000010855 food raising agent Nutrition 0.000 description 1
- CGSVFONSTIDSOF-UHFFFAOYSA-N formamide;lead Chemical compound [Pb].NC=O CGSVFONSTIDSOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 230000004545 gene duplication Effects 0.000 description 1
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000003899 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical group 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 230000000640 hydroxylating Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002406 microsurgery Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 1
- SCKXCAADGDQQCS-UHFFFAOYSA-N performic acid Chemical compound OOC=O SCKXCAADGDQQCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutic aid Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative Effects 0.000 description 1
- 230000029264 phototaxis Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional Effects 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 1
- 230000000754 repressing Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000004286 retinal pathology Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory Effects 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- BZKBCQXYZZXSCO-UHFFFAOYSA-N sodium hydride Inorganic materials [H-].[Na+] BZKBCQXYZZXSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940079832 sodium starch glycolate Drugs 0.000 description 1
- 229920003109 sodium starch glycolate Polymers 0.000 description 1
- 239000008109 sodium starch glycolate Substances 0.000 description 1
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 1
- WSWCOQWTEOXDQX-UHFFFAOYSA-N sorbic acid Chemical compound CC=CC=CC(O)=O WSWCOQWTEOXDQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000003595 spectral Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003860 topical agent Substances 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 229940029284 trichlorofluoromethane Drugs 0.000 description 1
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 1
- 150000002266 vitamin A derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии, в частности к применению выделенной молекулы нуклеиновой кислоты для экспрессии экзогенного гена в клетке пигментного эпителия сетчатки примата и для лечения заболевания, ассоциированного с пигментным эпителием сетчатки. Осуществляют доставку выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 1 или состоящей из нее, в клетки пигментного эпителия сетчатки примата, причем указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей экзогенный ген. Изобретение обеспечивает специфическую экспрессию экзогенного гена в клетках пигментного эпителия сетчатки приматов и может быть применимо для направления и нацеливания экспрессии гена в клетки пигментного эпителия сетчатки при поражениях сетчатки, например, у пациентов с возрастной макулярной дегенерацией, пигментной дистрофией сетчатки, диабетической ретинопатией или гипертрофией пигментного эпителия сетчатки. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, приводящей к специфической экспрессии гена в клетках пигментного эпителия сетчатки (RPE).
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для целей экспрессии рекомбинантные гены обычно трансфицируют в целевые клетки, популяции клеток или ткани в виде конструкций кДНК в составе активной кассеты экспрессии для обеспечения транскрипции гетерологичного гена. Конструкция ДНК распознается клеточной системой транскрипции в процессе, в который вовлечена активность множества действующих в транс-положении транскрипционных факторов (TF) в регуляторных элементах, действующих в цис-положении, включая энхансеры, сайленсеры, инсуляторы и промоторы (в данном документе называемых в совокупности "промоторами").
Промотор гена вовлечен во все из этих уровней регуляции, выступая в роли детерминанты в транскрипции гена за счет интеграции влияний последовательности ДНК, связывания транскрипционных факторов и эпигенетических свойств. Они определяют силу, например, экспрессии трансгена, который кодируется плазмидным вектором, а также то, в каком типе или типах клеток указанный трансген будет экспрессироваться.
Наиболее распространенные промоторы, применяемые для управления экспрессией гетерологичных генов в клетках млекопитающих, представляют собой промоторы основного немедленно-раннего гена цитомегаловирусов (CMV) человека и мыши. Они обеспечивают сильную экспрессию и доказали надежность в нескольких типах клеток. Другие вирусные промоторы, такие как промотор немедленно-раннего гена SV40 и промотор гена длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса (RSV), также часто применяются в кассетах экспрессии.
Вместо вирусных промоторов также можно применять клеточные промоторы. К известным промоторам относятся промоторы генов "домашнего хозяйства", кодирующих интенсивно транскрибируемые клеточные транскрипты, таких как ген бета-актина, ген фактора элонгации 1-альфа (EF-l-альфа) или ген убиквитина. По сравнению с вирусными промоторами экспрессия эукариотических генов является более сложной и требует точной координации многих различных факторов.
Одним из аспектов, касающихся применения эндогенных регуляторных элементов для экспрессии трансгена, является образование стабильной мРНК, и данная экспрессия может происходить в нативном окружении клетки-хозяина, в котором соответственно обеспечиваются действующие в транс-положении транскрипционные факторы. Поскольку экспрессия эукариотических генов контролируется сложной системой действующих в цис- и транс-положении регуляторных элементов, для большинства клеточных промоторов отсутствует подробная функциональная характеристика. Части эукариотического промотора обычно расположены непосредственно выше своей транскрибируемой последовательности и служат в качестве точки инициации транскрипции. Сайт начала транскрипции (TSS) непосредственно окружен коровым промотором, который является достаточным для распознавания системой транскрипции. Проксимальный промотор предусматривает область выше корового промотора и содержит TSS, а также другие элементы последовательности, необходимые для регуляции транскрипции. Транскрипционные факторы действуют специфически в отношении последовательности путем связывания с регуляторными мотивами в промоторной и энхансерной последовательности, за счет чего обеспечивается активация ферментов, модифицирующих хроматин и гистоны, что изменяет структуру нуклеосом и их положение, что, в конечном итоге, обеспечивает инициацию транскрипции. Идентификация функционального промотора в основном зависит от присутствия ассоциированных энхансерных элементов, расположенных выше или ниже.
Другим критически важным аспектом, касающимся применения эндогенных регуляторных элементов для экспрессии трансгенов, является то, что некоторые промоторы могут действовать специфически в отношении клеток, и это будет приводить к экспрессии трансгена в клетках специфического типа или, в зависимости от промотора, в клетках конкретной подгруппы.
Следовательно, одна из целей настоящего изобретения заключается в получении новых последовательностей, подходящих для экспрессии рекомбинантных генов в клетках сетчатки млекопитающего при высоких уровнях экспрессии и специфически в отношении типа клеток.
Такая последовательность удовлетворит существующую в данной области техники потребность в промоторе, специфическом в отношении клеток сетчатки, который требуется для разработки систем исследования нейродегенеративных нарушений, восстановления зрения, разработки лекарственных средств, видов терапии опухолей и диагностики нарушений.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данной ситуации авторы настоящего изобретения по счастливой случайности обнаружили, что искусственный промотор, который, как было известно, управляет специфической экспрессией гена в амакриновых клетках сетчатки на мышиной модели, описанной в WO 2015/118507, неожиданно и нетипично характеризуется совершенно иной специфичностью у приматов. У приматов данный промотор управляет специфической экспрессией гена в клетках пигментного эпителия сетчатки (RPE). Данная специфичность особенно применима для направления и нацеливания экспрессии гена в клетки пигментного эпителия сетчатки при поражениях сетчатки, например, у пациентов с возрастной макулярной дегенерацией, пигментной дистрофией сетчатки, диабетической ретинопатией или гипертрофией пигментного эпителия сетчатки.
Последовательность нуклеиновой кислоты данного промотора представляет собой: TCAAGCCTCCTACCGCCTTTGTTATGCAAACATATCAAACGCCCTCCTTTGTTATGCAAAAGGGCTGGAACGGGGCCTTTGTTATGCAAATCGCCCTCCCCGATCCCTTTGTTATGCAAATTTGACGAATTCCCACCTTTGTTATGCAAACAAATCTCCTACCCTCCTTTGTTATGCAAAGTGAGAGGGGCTGCACCTTTGTTATGCAAAATGCGGCCCCTGAGACCTTTGTTATGCAAAAACCATGTACGCTTGCCTTTGTTATGCAAACCGCCTGTTGCTTGGCCTTTGTTATGCAAAGCCACGCGATTGGCGCCTTTGTTATGCAAAGCTCGGTTATGTACACCTTTGTTATGCAAAGCTACTTTAAACTTGCCTTTGTTATGCAAATCACGACCTGACCGTCCTTTGTTATGCAAAAACGGTTGAAATAGTCCTTTGTTATGCAAAATGATATTGAATAGTCCTTTGTTATGCAAAAATTTAGATGCCGACCCTTTGTTATGCAAAGGAATGGGCGTGCTGCCTTTGTTATGCAAATTTTCGCTGCGACAGCCTTTGTTATGCAAACATGCTCGCCACTCACCTTTGTTATGCAAAGGTCTAACAATGACCCCTTTGTTATGCAAACTACGTGGAATAGATCCTTTGTTATGCAAACCCCGAGTTTTTGAACCTTTGTTATGCAAAATCAGTAACTTCATTCCTTTGTTATGCAAAATGTGACTTAACCTCCCTTTGTTATGCAAA (SEQ ID NO:1).
Следовательно, в настоящем изобретении предусмотрен способ специфической экспрессии экзогенного гена в клетках пигментного эпителия сетчатки примата, причем указанный способ включает стадию доставки выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1 или состоящий из нее, или состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты из по меньшей мере 400 п. о., характеризующейся по меньшей мере 80% общей идентичностью с указанной последовательностью под SEQ ID NO:1, в клетки пигментного эпителия сетчатки указанного примата, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты приводит к специфической экспрессии экзогенного гена в клетках пигментного эпителия сетчатки приматов, если последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный экзогенный ген, функционально связана с указанной выделенной молекулой нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать минимальный промотор, например, минимальный промотор под SEQ ID NO:2, функционально связанный с указанной выделенной молекулой нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты может быть частью кассеты экспрессии, которая в свою очередь может быть частью вектора, например, вирусного вектора.
В настоящем изобретении также предусмотрено применение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1 или состоящей из нее, или состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты из по меньшей мере 400 п. о., характеризующейся по меньшей мере 80% общей идентичностью с указанной последовательностью под SEQ ID NO:1, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты приводит к специфической экспрессии экзогенного гена в клетках пигментного эпителия сетчатки приматов, если последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный экзогенный ген, функционально связана с указанной выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, для специфической экспрессии экзогенного гена в клетках пигментного эпителия сетчатки примата. В случае данного применения выделенная молекула нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать минимальный промотор, например, минимальный промотор под SEQ ID NO:2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты может быть частью кассеты экспрессии, которая может быть частью вектора, например, вирусного вектора.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1 или состоящая из нее, или состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты из по меньшей мере 400 п. о., характеризующейся по меньшей мере 80% общей идентичностью с указанной последовательностью под SEQ ID NO:1, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты приводит к специфической экспрессии экзогенного гена в клетках пигментного эпителия сетчатки приматов, если последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный экзогенный ген, функционально связана с указанной выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, для применения при лечении заболевания, ассоциированного с пигментным эпителием сетчатки. Заболевание, ассоциированное с пигментным эпителием сетчатки, может быть выбрано из группы, состоящей из возрастной макулярной дегенерации, пигментной дистрофии сетчатки, диабетической ретинопатии и гипертрофии пигментного эпителия сетчатки.
Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1 или состоящая из нее или последовательности нуклеиновой кислоты из по меньшей мере 400 п. о., характеризующейся по меньшей мере 80% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты приводит к специфической экспрессии в клетках пигментного эпителия сетчатки приматов гена, функционально связанного с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный ген, может состоять из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 750 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 85% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 90% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 95% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 96% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 97% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 98% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 99% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется 100% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1.
Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может содержать минимальный промотор, например, минимальный промотор SV40, например, минимальный промотор SV40 gctcgagatctgcgatctgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatcgctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaa (SEQ ID NO:2), предпочтительно функционально связанный с указанной выделенной молекулой нуклеиновой кислоты.
Типичный ген, который может быть функционально связан с промотором по настоящему изобретению, представляет собой ген, кодирующий фоторецептор. Например, это может быть фоточувствительная молекула, такая как канальный родопсин или галородопсин.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фигура 1. Целенаправленная экспрессия в клетках пигментного эпителия сетчатки в сетчатке примата за счет промотора, содержащего SEQ ID NO:1. Полученные с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа фотографии экспрессии EGFP за счет промотора, содержащего SEQ ID NO:1, через 3 месяца после субретинальной инъекции AAV-synP12-ChR2-EGFP в глаза взрослого макака (Macaca mulatta). Можно наблюдать индуцированную экспрессию в клетках пигментного эпителия сетчатки. Зеленый=EGFP, управляемый SEQ ID NO:3. Белый=краситель Hoechst.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данной ситуации авторы настоящего изобретения по счастливой случайности обнаружили, что искусственный промотор, который, как было известно, управляет специфической экспрессией гена в амакриновых клетках сетчатки на мышиной модели, описанной в WO 2015/118507, неожиданно и нетипично характеризуется совершенно иной специфичностью у приматов. У приматов данный промотор управляет специфической экспрессией гена в клетках пигментного эпителия сетчатки. Данная специфичность особенно применима для направления и нацеливания экспрессии гена в клетки пигментного эпителия сетчатки при поражениях сетчатки, например, у пациентов с возрастной макулярной дегенерацией, пигментной дистрофией сетчатки, диабетической ретинопатией или гипертрофией пигментного эпителия сетчатки.
Последовательность нуклеиновой кислоты данного промотора представляет собой: TCAAGCCTCCTACCGCCTTTGTTATGCAAACATATCAAACGCCCTCCTTTGTTATGCAAAAGGGCTGGAACGGGGCCTTTGTTATGCAAATCGCCCTCCCCGATCCCTTTGTTATGCAAATTTGACGAATTCCCACCTTTGTTATGCAAACAAATCTCCTACCCTCCTTTGTTATGCAAAGTGAGAGGGGCTGCACCTTTGTTATGCAAAATGCGGCCCCTGAGACCTTTGTTATGCAAAAACCATGTACGCTTGCCTTTGTTATGCAAACCGCCTGTTGCTTGGCCTTTGTTATGCAAAGCCACGCGATTGGCGCCTTTGTTATGCAAAGCTCGGTTATGTACACCTTTGTTATGCAAAGCTACTTTAAACTTGCCTTTGTTATGCAAATCACGACCTGACCGTCCTTTGTTATGCAAAAACGGTTGAAATAGTCCTTTGTTATGCAAAATGATATTGAATAGTCCTTTGTTATGCAAAAATTTAGATGCCGACCCTTTGTTATGCAAAGGAATGGGCGTGCTGCCTTTGTTATGCAAATTTTCGCTGCGACAGCCTTTGTTATGCAAACATGCTCGCCACTCACCTTTGTTATGCAAAGGTCTAACAATGACCCCTTTGTTATGCAAACTACGTGGAATAGATCCTTTGTTATGCAAACCCCGAGTTTTTGAACCTTTGTTATGCAAAATCAGTAACTTCATTCCTTTGTTATGCAAAATGTGACTTAACCTCCCTTTGTTATGCAAA (SEQ ID NO:1).
Следовательно, в настоящем изобретении предусмотрен способ специфической экспрессии экзогенного гена в клетках пигментного эпителия сетчатки примата, причем указанный способ включает стадию доставки выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1 или состоящий из нее, или состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты из по меньшей мере 400 п. о., характеризующейся по меньшей мере 80% общей идентичностью с указанной последовательностью под SEQ ID NO:1, в клетки пигментного эпителия сетчатки указанного примата, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты приводит к специфической экспрессии экзогенного гена в клетках пигментного эпителия сетчатки приматов, если последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный экзогенный ген, функционально связана с указанной выделенной молекулой нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать минимальный промотор, например, минимальный промотор под SEQ ID NO:2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты может быть частью кассеты экспрессии, которая в свою очередь может быть частью вектора, например, вирусного вектора.
В настоящем изобретении также предусмотрено применение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1 или состоящей из нее, или состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты из по меньшей мере 400 п. о., характеризующейся по меньшей мере 80% общей идентичностью с указанной последовательностью под SEQ ID NO:1, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты приводит к специфической экспрессии экзогенного гена в клетках пигментного эпителия сетчатки приматов, если последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный экзогенный ген, функционально связана с указанной выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, для специфической экспрессии экзогенного гена в клетках пигментного эпителия сетчатки примата. В случае данного применения выделенная молекула нуклеиновой кислоты может дополнительно содержать минимальный промотор, например, минимальный промотор под SEQ ID NO:2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты может быть частью кассеты экспрессии, которая может быть частью вектора, например, вирусного вектора.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1 или состоящая из нее, или состоящая из последовательности нуклеиновой кислоты из по меньшей мере 400 п. о., характеризующейся по меньшей мере 80% общей идентичностью с указанной последовательностью под SEQ ID NO:1, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты приводит к специфической экспрессии экзогенного гена в клетках пигментного эпителия сетчатки приматов, если последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный экзогенный ген, функционально связана с указанной выделенной молекулой нуклеиновой кислоты, для применения при лечении заболевания, ассоциированного с пигментным эпителием сетчатки. Заболевание, ассоциированное с пигментным эпителием сетчатки, может быть выбрано из группы, состоящей из возрастной макулярной дегенерации, пигментной дистрофии сетчатки, диабетической ретинопатии и гипертрофии пигментного эпителия сетчатки.
Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1 или состоящая из нее или последовательности нуклеиновой кислоты из по меньшей мере 400 п. о., характеризующейся по меньшей мере 80% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты приводит к специфической экспрессии в клетках пигментного эпителия сетчатки приматов гена, функционально связанного с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный ген, может состоять из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 750 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 85% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 90% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 95% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 96% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 97% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 98% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется по меньшей мере 99% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты состоит из по меньшей мере 400 п. о., по меньшей мере 500 п. о., по меньшей мере 600 п. о., по меньшей мере 700 п. о., по меньшей мере 800 п. о., по меньшей мере 900 п. о., по меньшей мере 1000 п. о., по меньшей мере 1100 п. о., по меньшей мере 1200 п. о., по меньшей мере 1300 п. о., по меньшей мере 1400 п. о., по меньшей мере 1500 п. о., по меньшей мере 1600 п. о., по меньшей мере 1700 п. о., по меньшей мере 1800 п. о., по меньшей мере 1900 п. о. или по меньшей мере 2000 п. о. и характеризуется 100% общей идентичностью с указанной последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:1.
Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может содержать минимальный промотор, например, минимальный промотор SV40, например, минимальный промотор SV40 gctcgagatctgcgatctgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatcgctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaa (SEQ ID NO:2).
Типичный ген, который может быть функционально связан с промотором по настоящему изобретению, представляет собой ген, кодирующий фоторецептор. Например, это может быть фоточувствительная молекула, такая как канальный родопсин или галородопсин.
Экспрессию экзогенных генов с применением промотора по настоящему изобретению можно осуществлять in vitro, in vivo или ex vivo.
Применяемый в данном документе термин "промотор" относится к любым действующим в цис-положении регуляторным элементам, в том числе энхансерам, сайленсерам, инсуляторам и промоторам. Промотор представляет собой область ДНК, которая обычно расположена выше (в направлении области 5'-конца) гена, который необходимо транскрибировать. Промотор обеспечивает надлежащую активацию или репрессию гена, который находится под его контролем. В контексте настоящего изобретения промоторы приводят к специфической экспрессии генов, функционально связанных с ними в промежуточных нейронах. "Специфическая экспрессия", также называемая "экспрессией только в определенном типе клеток", означает, что по меньшей мере более 75% клеток, экспрессирующих представляющий интерес ген, относятся к указанному типу, т. е. в данном случае представляют собой клетки пигментного эпителия сетчатки (RPE).
Пигментный слой сетчатки или пигментный эпителий сетчатки (RPE), также известный как pigmentum nigrum, представляет собой слой пигментированных клеток, находящийся в непосредственной близости от нейросенсорной сетчатки, который питает светочувствительные клетки сетчатки и прочно прикреплен к нижележащей сосудистой оболочке и вышележащим светочувствительным клеткам сетчатки. RPE состоит из одного слоя гексагональных клеток, которые плотно заполнены пигментными гранулами. В зубчатом крае RPE продолжается в виде мембраны, проходящей через цилиарное тело и продолжающейся как задняя поверхность радужки. Он образует волокна мышцы-расширителя. Непосредственно под данным эпителием находится нейроэпителий (т. е. палочки и колбочки), который проходит в тесной связи с RPE. Согласно представлениям оба в совокупности представляют собой цилиарный эпителий эмбриона. Продолжением переднего конца сетчатки является задний эпителий радужки, который приобретает пигмент при входе в радужку. При взгляде с наружной поверхности эти клетки являются гладкими и имеют гексагональную форму. При рассмотрении в разрезе каждая клетка состоит из наружной непигментированной части, содержащей крупное овальное ядро, и внутренней пигментированной части, которая выступает в виде ряда прямых нитевидных отростков между палочками, особенно в случае, когда глаз подвергается воздействию света. RPE выполняет несколько функций, а именно: поглощение света, эпителиальный транспорт, пространственную буферизацию ионов, зрительный цикл, фагоцитоз, секрецию и иммуномодуляцию.
Как правило, кассеты экспрессии вводят в вектор, который облегчает введение кассеты экспрессии в клетку-хозяина и поддержание кассеты экспрессии в клетке-хозяине. Такие векторы являются общеупотребительными и хорошо известны специалистам в данной области техники. Многие такие векторы являются коммерчески доступными, например, от Invitrogen, Stratagene, Clontech и т. д., и описаны во многих руководствах, таких как Ausubel, Guthrie, Strathem или Berger, все из которых приведены выше. Как правило, такие векторы содержат промоторы, сигналы полиаденилирования и т. д., в сочетании с несколькими сайтами клонирования, а также дополнительные элементы, такие как точки начала репликации, гены селектируемых маркеров (например, LEU2, URA3, TRP1, HIS3, GFP), центромерные последовательности и т. д.
Вирусные векторы, например, AAV, PRV или лентивирус, подходят для нацеливания и доставки генов в клетки пигментного эпителия сетчатки с применением промотора по настоящему изобретению.
Выход клеток сетчатки можно измерять с применением электрического способа, такого как мультиэлектродная матрица или пэтч-кламп, или с применением визуального способа, такого как обнаружение флуоресценции.
Способы с применением последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению можно применять для идентификации терапевтических средств для лечения неврологического нарушения или патологии сетчатки, с вовлечением клеток RPE, причем указанный способ включает стадии приведения тестируемого соединения в контакт с клетками пигментного эпителия сетчатки, экспрессирующими один или несколько трансгенов под контролем промотора по настоящему изобретению, и сравнения по меньшей мере одного выхода клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных в присутствии указанного тестируемого соединения, с таким же выходом, полученным в отсутствие указанного тестируемого соединения.
Более того, способы с применением промоторов по настоящему изобретению можно также применять для in vitro тестирования восстановления зрения, причем указанный способ включает стадии приведения клеток пигментного эпителия сетчатки, экспрессирующих один или несколько трансгенов под контролем промотора по настоящему изобретению, в контакт со средством и сравнения по меньшей мере одного выхода, полученного после контакта с указанным средством, с тем же выходом, полученным перед указанным контактом с указанным средством.
Канальные родопсины представляют собой подсемейство белков опсинов, которые функционируют в качестве регулируемых светом ионных каналов. Они служат в качестве сенсорных фоторецепторов у одноклеточных зеленых водорослей, контролируя фототаксис, т. е. движение в ответ на свет. При экспрессии в клетках других организмов они способны использовать свет для контроля внутриклеточной кислотности, поступления кальция, электрической возбудимости и других клеточных процессов. В настоящее время известны по меньшей мере три "природных" канальных родопсина: канальный родопсин 1 (ChR1), канальный родопсин 2 (ChR2) и канальный родопсин вольвокса (VChR1). Более того, также существуют некоторые модифицированные/улучшенные варианты этих белков. Все известные канальные родопсины представляют собой неспецифические катионные каналы, проводящие ионы H+, Na+, K+ и Ca2+.
Галородопсин представляет собой управляемый светом ионный насос, специфический в отношении ионов хлора, и встречается у филогенетически древних "бактерий" (архей), известных как галобактерии. Он представляет собой белок с семью трансмембранными фрагментами из семейства ретинилиденовых белков, гомологичный управляемому светом протонному насосу бактериородопсину и схожий по третичной структуре (но не по первичной структуре последовательности) c родопсинами позвоночных, пигментами, которые воспринимают свет в сетчатке. Галородопсин также характеризуется сходством последовательности с канальным родопсином, управляемым светом ионным каналом. Галородопсин содержит полностью транс-ретиналь, наиболее важное изомеризующееся на свету производное витамина А. Галородопсин является одним из небольшого числа мембранных белков, кристаллическая структура которых известна. Изоформы галородопсина могут встречаться у многих видов галобактерий, включая H. salinarum и N. pharaonis. Во многих продолжающихся исследованиях изучаются эти различия и их применение для тщательного анализа фотоциклических и насосных свойств. По видимому, галородопсин является наиболее изученным опсином I типа (микробным) после бактериородопсина. Максимальное поглощение галородопсинового комплекса в сетчатке составляет приблизительно 570 нм. В последнее время галородопсин стал инструментом в оптогенетике. Подобно тому, как обнаружилось, что активируемый синим светом ионный канал, канальный родопсин 2, способен активировать возбудимые клетки (такие как нейроны, мышечные клетки, клетки поджелудочной железы и клетки иммунной системы) под действием коротких импульсов синего света, обнаружилось, что галородопсин способен подавлять возбудимые клетки под действием коротких импульсов желтого света. Таким образом, галородопсин и канальный родопсин вместе обеспечивают многоцветную оптическую активацию, подавление и десинхронизацию активности нейронов, создавая высокоэффективный инструментарий для нейроинженерии.
В некоторых вариантах осуществления промотор является частью вектора, нацеленного на сетчатку, причем указанный вектор экспрессирует по меньшей мере один репортерный ген, который можно обнаруживать в живых клетках пигментного эпителия сетчатки. Такие репортерные гены могут указывать на функционирующую нейронную сеть. Примерами таких векторов являются сенсоры активности или радужные вирусы (Nature Methods 6, 127-130 (2009)). Примерами таких вирусов являются ретроградные транссинаптические вирусы псевдобешенства (PRV) с генетически закодированными сенсорами активности, которые оптическим образом сообщают об активности связанных нейронов среди пространственно сплетенных нейронов в головном мозге. Такой сенсор активности может представлять собой выделенный транссинаптический вирус, экспрессирующий экзогенный флуоресцентный сенсор активности. Транссинаптический вирус может представлять собой рабдовирус, например, вирус бешенства, или герпесвирус, например, альфагерпесвирус, например, вирус псевдобешенства.
Флуоресцентный экзогенный сенсор активности может представлять собой флуоресцентный белковый сенсор Ca2+, например, желтый камелеон, камгару, G-CaMP/перикам или TN-L15, или флуоресцентный белковый сенсор напряжения, например, FlaSh, SPARC или VSP, предпочтительно VSP1.
Подходящие для настоящего изобретения вирусные векторы широко известны в данной области техники. Например AAV, PRV или лентивирус подходят для нацеливания и доставки генов в клетки пигментного эпителия сетчатки.
При работе с изолированной сетчаткой оптимальной вирусной доставки в фоторецепторы можно достичь при ее прикреплении стороной с ганглионарными клетками вниз так, чтобы фоторецепторная сторона сетчатки была обнажена и, за счет чего, могла лучше подвергать трансфекции. Другой методикой является разрезание, например, с помощью лезвия бритвы, внутренней пограничной мембраны сетчатки, вследствие чего доставляемые вирусы могут проникать через внутренние мембраны. Дополнительный способ представляет собой заключение сетчатки в агар, разрезание указанной сетчатки и нанесение вирусов для доставки со стороны разреза.
Выход трансфицированных клеток можно измерять с применением широко известных способов, например, с применением электрического способа, такого как мультиэлектродная матрица или пэтч-кламп, или с применением визуального способа, такого как обнаружение флуоресценции. В некоторых случаях внутреннюю пограничную мембрану удаляют с помощью микрохирургии внутренней пограничной мембраны. В других случаях регистрацию осуществляют через разрезы, выполняемые во внутренней пограничной мембране.
Источником клеток сетчатки для применения в настоящем изобретении является примат. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки сетчатки получены из сетчатки человека или находятся в ней. В других вариантах осуществления сетчатка принадлежит другому примату из любой из двух различных линий: полуобезьян и обезьян. Сетчатку человека можно легко получать из банков роговицы, где указанные образцы сетчатки обычно выбрасывают после препарирования роговицы. Сетчатка взрослого человека имеет большую поверхность (приблизительно 1100 мм2) и, следовательно, легко может быть разделена на целый ряд экспериментальных подобластей. Кроме того, образцы сетчатки также можно применять в качестве превосходной модели синаптической передачи, поскольку сетчатка имеет синапсы, которые идентичны синапсам в остальной части головного мозга.
Применяемый в данном документе термин "животное" применяется в данном документе для охвата всех животных. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, является позвоночным животным. Примерами животных являются человек, мыши, крысы, коровы, свиньи, лошади, куры, утки, гуси, кошки, собаки и т. д. Термин "животное" также включает отдельное животное на всех стадиях развития, включая стадии эмбриона и плода. "Генетически модифицированное животное" представляет собой любое животное, содержащее одну или несколько клеток, несущих генетическую информацию, измененную или полученную, напрямую или опосредованно, посредством преднамеренной генетической манипуляции на субклеточном уровне, например, посредством целенаправленной рекомбинации, микроинъекции или инфицирования рекомбинантным вирусом. Считается, что термин "генетически модифицированное животное" не включает классическое скрещивание или оплодотворение in vitro, а подразумевает охват животных, у которых одна или несколько клеток изменены с помощью рекомбинантной молекулы ДНК или получают ее. Рекомбинантная молекула ДНК может специфически нацеливаться в определенный генетический локус, может случайно интегрироваться в хромосому, или она может представлять собой внехромосомно реплицируемую ДНК. Термин "животное с генетически модифицированной зародышевой линией" относится к генетически модифицированному животному, у которого генетическое изменение или генетическая информация были введены в клетки зародышевой линии, за счет чего обеспечивается способность передавать генетическую информацию его потомству. Если такое потомство действительно обладает частью такого изменения или генетической информации или ими всеми, то они также являются генетически модифицированными животными.
Изменение или генетическая информация могут быть чужеродными для вида животного, к которому принадлежит реципиент, или чужеродными только для конкретного отдельного реципиента, или могут представлять собой генетическую информацию, которой реципиент уже обладает. В последнем случае измененный или введенный ген может экспрессироваться иным образом, чем нативный ген, или может не экспрессироваться вообще.
Гены, применяемые для изменения целевого гена, можно получать с помощью самых разнообразных методик, которые включают без ограничения выделение из геномных источников, получение кДНК из выделенных матриц мРНК, прямой синтез или их комбинацию.
Одним типом целевых клеток для введения трансгенов являются ES-клетки. ES-клетки можно получать из предимплантационных эмбрионов, культивируемых in vitro, и сливать с эмбрионами (Evans et al. (1981), Nature 292:154-156; Bradley et al. (1984), Nature 309:255-258; Gossler et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065-9069; Robertson et al. (1986), Nature 322:445-448; Wood et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4582- 4584). Трансгены можно эффективно вводить в ES-клетки посредством стандартных методик, таких как трансфекция ДНК с применением электропорации или опосредованная ретровирусами трансдукция. Затем полученные трансформированные ES-клетки можно объединять с морулами посредством агрегации или инъецировать в бластоцисты от отличного от человека животного. После этого введенные ES-клетки колонизируют эмбрион и участвуют в образовании зародышевой линии полученного химерного животного (Jaenisch (1988), Science 240:1468-1474). Применение ES-клеток, подвергнутых целенаправленному изменению гена, для получения генетически модифицированных мышей с целенаправленным изменением гена было описано в 1987 году (Thomas et al. (1987), Cell 51:503-512) и обзор этого приведен в других работах (Frohman et al. (1989), Cell 56:145-147; Capecchi (1989), Trends in Genet. 5:70-76; Baribault et al. (1989), Mol. Biol. Med. 6:481-492; Wagner (1990), EMBO J. 9:3025-3032; Bradley et al. (1992), Bio/Technology 10:534-539).
Доступны методики инактивации любой генетического области или ее изменения с получением любой необходимой мутации с применением нацеленной гомологической рекомбинации для введения специфических изменений в аллели хромосом.
Применяемый в данном документе термин "подвергнутый целенаправленному изменению ген" представляет собой последовательность ДНК, введенную в зародышевую линию отличного от человека животного посредством вмешательства человека, включая без ограничения способы, описанные в данном документе. Подвергнутые целенаправленному изменению гены по настоящему изобретению включают последовательности ДНК, которые разработаны для специфического изменения когнатных эндогенных аллелей.
В настоящем изобретении "выделенный" относится к материалу, извлеченному из своего исходного окружения (например, естественного окружения, если он встречается в природе) и, таким образом, измененному "в результате воздействия человека" по сравнению со своим естественным состоянием. Например, выделенный полинуклеотид может являться частью вектора или композиции, или может содержаться в клетке и по-прежнему быть "выделенным", поскольку этот вектор, композиция или конкретная клетка не представляют собой исходное окружение полинуклеотида. Термин "выделенный" не относится к геномным библиотекам или библиотекам кДНК, общим препаратам цельных клеток или препаратам мРНК, препаратам геномной ДНК (включая препараты, разделенные с помощью электрофореза и перенесенные на мембраны для блоттинга), препаратам геномной ДНК цельных клеток, фрагментированной в результате гидродинамического сдвига, или другим композициям, где в соответствии с данной областью техники не показаны отличительные признаки полинуклеотида/последовательностей по настоящему изобретению. Дополнительные примеры выделенных молекул ДНК включают рекомбинантные молекулы ДНК, поддерживаемые в гетерологичных клетках-хозяевах, или очищенные (частично или практически полностью) молекулы ДНК в растворе. Выделенные молекулы РНК включают in vivo или in vitro РНК-транскрипты молекул ДНК по настоящему изобретению. Однако нуклеиновая кислота, содержащаяся в клоне, который является членом библиотеки (например, библиотеки геномной ДНК или кДНК), который не был отделен от других членов библиотеки (например, в форме гомогенного раствора, содержащего клон и другие члены библиотеки), или хромосома, извлеченная из клетки или клеточного лизата (например, "хромосомный препарат", как в кариотипе), или препарат случайным образом фрагментированной в результате гидродинамического сдвига геномной ДНК, или препарат геномной ДНК, разрезанной с помощью одного или нескольких рестрикционных ферментов, не являются "выделенными" для целей настоящего изобретения. Как обсуждается далее в данном документе, выделенные молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены естественным путем, рекомбинантным путем или синтетическим путем.
"Полинуклеотиды" могут состоять из одно- или двухнитевой ДНК, ДНК, которая представляет собой смесь одно и двухнитевых областей, одно- и двухнитевой РНК и РНК, которая представляет собой смесь одно- и двухнитевых областей, гибридных молекул, содержащих ДНК и РНК, которые могут быть однонитевыми или, что более типично, двухнитевыми, или смесью однонитевых и двухнитевых областей. Кроме того, полинуклеотиды могут состоять из трехнитевых областей, содержащих РНК или ДНК, или как РНК, так и ДНК. Полинуклеотиды могут также содержать одно или несколько модифицированных оснований или остовы ДНК или РНК, модифицированные для повышения стабильности или по другим причинам. "Модифицированные" основания включают, например, тритилированные основания и нестандартные основания, такие как инозин. Множество модификаций можно осуществлять в отношении ДНК и РНК; таким образом, термин "полинуклеотид" включает формы, модифицированные химическим путем, ферментативным путем или метаболическим путем.
Выражение "полинуклеотид, кодирующий полипептид" охватывает полинуклеотид, который содержит только кодирующую последовательность полипептида, а также полинуклеотид, который содержит дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность.
"Жесткие условия гибридизации" относится к инкубации в течение ночи при 42 градусах C в растворе, содержащем 50% формамида, 5x SSC (750 мM NaCl, 75 мM трехзамещенного цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (pH 7,6), 5x раствор Денхардта, 10% сульфата декстрана и 20 мкг/мл денатурированной, фрагментированной в результате гидродинамического сдвига ДНК из спермы лосося, с последующим промыванием фильтров в 0,1x SSC при приблизительно 50 градусах C. Изменения условий жесткости гибридизации и обнаружения сигнала в основном осуществляют посредством манипуляции с концентрацией формамида (более низкие значения процента формамида приводят к сниженной жесткости); солевыми условиями или температурой. Например, условия умеренно высокой жесткости включают инкубацию в течение ночи при 37 градусах C в растворе, содержащем 6X SSPE (20X SSPE=3 M NaCl; 0,2 M NaH2PO4; 0,02 M EDTA, pH 7,4), 0,5% SDS, 30% формамида, 100 мкг/мл блокирующей ДНК из спермы лосося; с последующими промываниями при 50 градусах C с помощью 1XSSPE, 0,1% SDS. Кроме того, для обеспечения еще более низкой жесткости промывания, осуществляемые после жесткой гибридизации, можно осуществлять при более высоких концентрациях солей (например, 5X SSC). Изменения приведенных выше условий можно осуществлять посредством включения альтернативных блокирующих реагентов, применяемых для подавления фона в экспериментах по гибридизации, и/или замены на них. Типичные блокирующие реагенты включают раствор Денхардта, BLOTTO, гепарин, денатурированную ДНК из спермы лосося и коммерчески доступные запатентованные составы. Включение специфических блокирующих реагентов может потребовать модификации условий гибридизации, описанных выше, из-за проблем с совместимостью.
Термины "фрагмент", "производное" и "аналог" в отношении полипептидов означают полипептиды, которые сохраняют практически такую же биологическую функцию или такую же активность, что и данные полипептиды. Аналог включает пробелок, который может быть активирован за счет отщепления части пробелка с образованием активного зрелого полипептида.
Термин "ген" означает сегмент ДНК, вовлеченный в продуцирование полипептидной цепи; он включает области перед кодирующей областью и после нее, "лидерную и трейлерную последовательности", а также промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).
Полипептиды могут состоять из аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т. е. пептидными изостерами, и они могут содержать аминокислоты, отличные от 20 кодируемых генами аминокислот. Полипептиды могут быть модифицированы как с помощью естественных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, так и с помощью методик химической модификации, которые хорошо известны в данной области техники. Такие модификации подробно описаны в базовых пособиях и более подробных монографиях, а также в обширной научной литературе. Модификации могут происходить в любом месте в полипептиде, включая пептидный остов, боковые цепи аминокислот и амино- или карбоксильные концы. Следует понимать, что один и тот же тип модификации может присутствовать в одинаковой или различной степенях в нескольких сайтах в данном полипептиде. Также данный полипептид может содержать множество типов модификаций. Полипептиды могут быть разветвленными, например, в результате убиквитинирования, и они могут быть циклическими с разветвлением или без него. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды могут быть результатом посттрансляционных естественных процессов или могут быть получены с помощью синтетических способов. Модификации включают без ограничения ацетилирование, ацилирование, биотинилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение фрагмента гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизацию, дериватизацию посредством известных защитных/блокирующих групп, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных перекрестных сшивок, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование GPI-якоря, гидроксилирование, йодирование, связывание с молекулой антитела или другим клеточным лигандом, метилирование, ацилирование остатком миристиновой кислоты, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг (например, расщепление), фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатизацию, опосредованное транспортной РНК добавление аминокислот к белкам, например, аргинилирование, и убиквитинирование. (См., например, PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. I-12 (1983); Seifter et al. , Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992).)
Фрагмент полипептида, "обладающий биологической активностью", относится к полипептидам, проявляющим активность, аналогичную, но необязательно идентичную активности исходного полипептида, включая зрелые формы, измеренную в конкретном биологическом анализе, с зависимостью от дозы или без таковой. В том случае, если существует зависимость от дозы, она не обязательно должна быть идентична таковой у полипептида, а скорее практически аналогична с зависимостью от дозы у данной активности по сравнению с исходным полипептидом (т. е. кандидатный полипептид будет проявлять большую активность и не более, чем в приблизительно 25 раз меньшую, и в некоторых вариантах осуществления не более, чем в приблизительно десять раз меньшую, или не более, чем в приблизительно три раза меньшую активность относительно исходного полипептида.)
Гомологи от других биологических видов можно выделять и идентифицировать путем получения подходящих зондов или праймеров из последовательностей, предусмотренных в данном документе, и скрининга подходящего источника нуклеиновой кислоты в отношении необходимого гомолога.
"Вариант" относится к полинуклеотиду или полипептиду, отличающемуся от исходного полинуклеотида или полипептида, однако сохраняющему его существенные свойства. Как правило, варианты в целом являются очень сходными и во многих областях идентичны исходному полинуклеотиду или полипептиду.
На практике то, являются ли какая-либо конкретная молекула нуклеиновой кислоты или полипептид на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичными нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению, можно стандартным образом определять с применением известных компьютерных программ. Предпочтительный способ определения наилучшего общего соответствия между запрашиваемой последовательностью (последовательностью по настоящему изобретению) и рассматриваемой последовательностью, также называемый глобальным выравниванием последовательностей, можно определить с применением компьютерной программы FASTDB на основе алгоритма Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6:237-245). При выравнивании последовательностей как запрашиваемая, так и рассматриваемая последовательности являются последовательностями ДНК. Последовательность РНК можно сравнивать при превращении U в T. Результатом указанного глобального выравнивания последовательностей является процент идентичности. Предпочтительные параметры, применяемые при выравнивании последовательностей ДНК с применением FASTDB для расчета процента идентичности, представляют собой: матрица=унитарная, k-участок=4, штрафной балл за несовпадение=1, штрафной балл за связывание=30, длина группы рандомизации=0, граничный балл=l, штрафной балл за гэп=5, штрафной балл за удлинение гэпа=0,05, размер окна=500 или длина рассматриваемой нуклеотидной последовательности, в зависимости от того, что короче. Если рассматриваемая последовательность короче, чем запрашиваемая последовательность, вследствие делеций 5'- или 3'-конце, а не вследствие внутренних делеций, то для результатов необходимо провести ручную коррекцию. Это происходит потому, что программа FASTDB не учитывает усечения на 5'- и 3'-конце рассматриваемой последовательности при расчете процента идентичности. В случае рассматриваемых последовательностей, усеченных на 5'- или 3'-концах по сравнению с запрашиваемой последовательностью, процент идентичности корректируют путем подсчета количества оснований запрашиваемой последовательности, которые находятся на 5'- и 3'-конце рассматриваемой последовательности, которые не совпадают/не выравнены, в виде процента от всех оснований запрашиваемой последовательности. Является ли нуклеотид совпадающим/выравненным, определяют по результатам выравнивания последовательности с помощью FASTDB. Затем этот процент вычитают из процента идентичности, рассчитанного с помощью вышеуказанной программы FASTDB с применением указанных параметров, с получением конечного показателя процента идентичности. Этот скорректированный показатель является показателем, который применяется для целей настоящего изобретения. Только основания за пределами оснований на 5'- и 3'-конце рассматриваемой последовательности, как показано с помощью выравнивания FASTDB, которые не совпадают/не выравнены с запрашиваемой последовательностью, подсчитывают для целей ручной коррекции показателя процента идентичности. Например, рассматриваемую последовательность из 90 оснований выравнивают с запрашиваемой последовательностью из 100 оснований для определения процента идентичности. Делеции находятся на 5'-конце рассматриваемой последовательности и, следовательно, выравнивание FASTDB не показывает совпадения/выравнивания первых 10 оснований на 5'-конце. Эти 10 "выпавших" оснований представляют собой 10% последовательности (количество оснований на 5'- и 3'-концах, которые не совпадают/общее количество оснований в запрашиваемой последовательности), таким образом, 10% вычитают из показателя процента идентичности, рассчитанного с помощью программы FASTDB. Если оставшиеся 90 оснований полностью совпали, то конечный процент идентичности будет составлять 90%. В другом примере рассматриваемую последовательность из 90 оснований сравнивают с запрашиваемой последовательностью из 100 оснований. В этом случае делеции представляют собой внутренние делеции, то есть они не представляют собой основания на 5'- или 3'-конце рассматриваемой последовательности, которые не совпадают/не выравнены с запрашиваемой последовательностью. В этом случае процент идентичности, рассчитанный с помощью FASTDB, не корректируется вручную. Подчеркнем снова, только основания на 5'- и 3'-конце рассматриваемой последовательности, которые не совпадают/не выравнены относительно запрашиваемой последовательности, корректируют вручную. Тем не менее, в конкретном случае общая идентичность относится только к частям последовательности, которые характеризуются по меньшей мере некоторой степенью сходства с последовательностью, например, SEQ ID NO:1. Другими словами, идентичность последовательности, рассчитанная для запрашиваемой последовательности из 2000 п. о., будет рассчитываться только для части последовательности, содержащей SEQ ID NO:1, или очень похожей на нее части.
В случае полипептида с аминокислотной последовательностью, которая, например, на по меньшей мере 95% "идентична" запрашиваемой аминокислотной последовательности по настоящему изобретению, подразумевается, что аминокислотная последовательность рассматриваемого полипептида идентична с запрашиваемой последовательностью, за исключением того, что рассматриваемая полипептидная последовательность полипептида может включать вплоть до пяти изменений аминокислот на каждые 100 аминокислот запрашиваемой аминокислотной последовательности. Другими словами, для получения полипептида с аминокислотной последовательностью, которая на по меньшей мере 95% идентична запрашиваемой аминокислотной последовательности, в рассматриваемую последовательность могут быть введены, удалены или заменены другой аминокислотой вплоть до 5% аминокислотных остатков. Эти изменения эталонной последовательности могут находиться в амино- или карбоксиконцевом положениях эталонной аминокислотной последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, могут чередоваться с остатками в эталонной последовательности, как по отдельности, так и в виде одной или нескольких непрерывных групп в пределах эталонной последовательности.
На практике то, является ли любой конкретный полипептид на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичным, например, аминокислотным последовательностям, показанным в последовательности, или аминокислотной последовательности, кодируемой депонированным клоном ДНК, можно стандартным образом определять с применением известных компьютерных программ. Предпочтительный способ определения наилучшего общего соответствия между запрашиваемой последовательностью (последовательностью по настоящему изобретению) и рассматриваемой последовательностью, также называемый глобальным выравниванием последовательностей, можно определить с применением компьютерной программы FASTDB на основе алгоритма Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6:237-245). При выравнивании последовательностей как запрашиваемая, так и рассматриваемая последовательности либо обе являются нуклеотидными последовательностями, либо обе являются аминокислотными последовательностями. Результатом указанного глобального выравнивания последовательностей является процент идентичности. Предпочтительные параметры, применяемые для выравнивания аминокислот с помощью FASTDB, представляют собой: матрица=PAM 0, k-участок=2, штрафной балл за несовпадение=I, штрафной балл за связывание=20, длина группы рандомизации=0, граничный балл=l, размер окна=длина последовательности, штрафной балл за гэп=5, штрафной балл за удлинение гэпа=0,05, размер окна=500 или длина рассматриваемой аминокислотной последовательности, в зависимости от того, что короче. Если рассматриваемая последовательность короче, чем запрашиваемая последовательность, вследствие делеций на N- или C-конце, а не вследствие внутренних делеций, то для результатов необходимо провести ручную коррекцию. Это происходит потому, что программа FASTDB не учитывает усечения на N- или C-конце рассматриваемой последовательности при расчете глобального процента идентичности. В случае рассматриваемых последовательностей, усеченных на N- и C-концах по сравнению с запрашиваемой последовательностью, процент идентичности корректируют посредством подсчета количества остатков запрашиваемой последовательности, которые находятся на N- и C-концах рассматриваемой последовательности, которые не совпадают/не выравнены с соответствующим остатком рассматриваемой последовательности, в виде процента от всех оснований запрашиваемой последовательности. Является ли остаток совпадающим/выравненным определяют по результатам выравнивания последовательности с помощью FASTDB. Затем этот процент вычитают из процента идентичности, рассчитанного с помощью вышеуказанной программы FASTDB с применением указанных параметров, с получением конечного показателя процента идентичности. Этот конечный показатель процента идентичности является показателем, который применяется для целей настоящего изобретения. Только остатки на N- и C-концах рассматриваемой последовательности, которые не совпадают/не выравнены с запрашиваемой последовательностью, учитываются для целей ручной коррекции показателя процента идентичности. Иными словами, учитываются только положения остатков в запрашиваемой последовательности за пределами самых дальних N- и C-концевых остатков рассматриваемой последовательности. Только положения остатков за пределами N- и C-терминальных концов рассматриваемой последовательности, как показано при выравнивании FASTDB, которые не совпадают/не выравнены с запрашиваемой последовательностью, корректируют вручную. Никакие другие ручные коррекции не выполняются для целей настоящего изобретения.
Встречающиеся в природе варианты белков называются "аллельными вариантами" и относятся к одной из нескольких альтернативных форм гена, занимающего данный локус в хромосоме организма. (Genes 11, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985).) Эти аллельные варианты могут варьироваться на уровне полинуклеотида и/или полипептида. В качестве альтернативы, не встречающиеся в природе варианты можно получать с помощью методик мутагенеза или с помощью прямого синтеза.
"Метка" относится к средствам, которые способны обеспечивать обнаруживаемый сигнал, как непосредственно, так и посредством взаимодействия с одним или несколькими дополнительными членами системы образования сигнала. Метки, которые обнаруживаются непосредственно и могут применяться в настоящем изобретении, включают флуоресцентные метки. Специфические флуорофоры включают флуоресцеин, родамин, BODIPY, цианиновые красители и т. п.
"Флуоресцентная метка" относится к любой метке, обладающей способностью испускать свет определенной длины волны при активации светом другой длины волны.
"Флуоресценция" относится к любой обнаруживаемой характеристике флуоресцентного сигнала, включая интенсивность, спектр, длину волны, внутриклеточное распределение и т. д.
"Обнаружение" флуоресценции относится к оцениванию флуоресценции клетки с применением качественных или количественных способов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения флуоресценцию будут обнаруживать качественным образом. Другими словами, или флуоресцентный маркер присутствует, что указывает на экспрессию рекомбинантного слитого белка, или нет. В других случаях флуоресценцию можно определять с применением количественных способов, например, измерения интенсивности, спектра или внутриклеточного распределения флуоресценции, позволяющих проводить статистическое сравнение значений, полученных в различных условиях. Уровень также можно определять с применением качественных способов, таких как визуальный анализ и сравнение человеком нескольких образцов, например, образцов, обнаруживаемых с помощью флуоресцентного микроскопа или другого оптического детектора (например, системы анализа изображений и т. д.). "Изменение" или "модуляция" флуоресценции относится к любой обнаруживаемой разнице в интенсивности, внутриклеточном распределении, спектре, длине волны или другом аспекте флуоресценции при конкретном условии по сравнению с другим условием. Например, "изменение" или "модуляцию" обнаруживают количественно, а разница представляет собой статистически значимую разницу. Любые "изменения" или "модуляции" флуоресценции можно обнаруживать с помощью стандартного инструмента, такого как флуоресцентный микроскоп, CCD или любой другой флуоресцентный детектор, и можно обнаруживать с применением автоматической системы, такой как интегрированные системы, или они могут отражать субъективное обнаружение изменения наблюдателем-человеком.
"Зеленый флуоресцентный белок" (GFP) представляет собой белок, состоящий из 238 аминокислот (26,9 кДа), изначально выделенный из медузы Aequorea victoria/Aequorea aequorea/Aequorea forskalea, которая флуоресцирует зеленым светом при воздействии синего света. GFP из A. victoria характеризуется главным пиком возбуждения при длине волны 395 нм и второстепенным пиком при 475 нм. Его пик излучения наблюдается при 509 нм, что находится в нижней зеленой части видимого спектра. GFP из морского пера (Renilla reniformis) характеризуется одним главным пиком возбуждения при 498 нм. Вследствие потенциальной возможности широкого применения и растущих потребностей исследователей было сконструировано множество различных мутантов GFP. Первым главным улучшением была точечная мутация (S65T), описанная Roger Tsien в 1995 году в Nature. Эта мутация значительно улучшила спектральные характеристики GFP, что привело к повышенной флуоресценции, фотостабильности и сдвигу главного пика возбуждения на 488 нм, при этом пик излучения сохранялся при 509 нм. Добавление к этому остову точечной мутации (F64L), повышающей эффективность фолдинга при 37°C, привело к получению GFP с повышенной эффективностью (EGFP). EGFP характеризуется коэффициентом экстинкции (обозначается как ε), также известным как его оптическое сечение, составляющим 9,13×10-21 м²/молекула, также приводимым как 55000 л/(моль⋅см). Superfolder-GFP, серия мутаций, которые позволяют GFP претерпевать быстрый фолдинг и созревать даже при слиянии с пептидами, характеризующимися затруднительным фолдингом, был описан в 2006 году.
"Желтый флуоресцентный белок" (YFP) является генетическим мутантным вариантом зеленого флуоресцентного белка, полученного из Aequorea victoria. Его пик возбуждения составляет 514 нм, а пик излучения составляет 527 нм.
Применяемые в данном документе формы единственного числа включают ссылку на формы множественного числа, если контекст явно не указывает на обратное.
"Вирус" представляет собой субмикроскопический инфекционный агент, который не способен расти или размножаться за пределами клетки-хозяина. Каждая вирусная частица, или вирион, состоит из генетического материала, ДНК или РНК, в пределах защитной белковой оболочки, называемой капсидом. Форма капсида варьируется от простых спиральных и икосаэдрических (полиэдральных или почти сферических) форм до более сложных структур с хвостами или оболочкой. Вирусы инфицируют клеточные формы жизни, и их объединяют в группы животных, растительных и бактериальных вирусов в соответствии с типом инфицируемого хозяина.
Применяемый в данном документе термин "транссинаптический вирус" относится к вирусам, способным мигрировать из одного нейрона в другой связанный нейрон через синапс. Примерами таких транссинаптических вирусов являются рабдовирусы, например вирус бешенства, и альфагерпесвирусы, например вирус псевдобешенства или вирус простого герпеса. Применяемый в данном документе термин "транссинаптический вирус" также охватывает вирусные субъединицы, которые сами по себе обладают способностью мигрировать из одного нейрона в другой связанный нейрон через синапс, и биологические векторы, такие как модифицированные вирусы, включающие такую субъединицу и демонстрирующие способность мигрировать из одного нейрона в другой связанный нейрон через синапс.
Транссинаптическая миграция может быть как антероградной, так и ретроградной. Во время ретроградной миграции вирус будет перемещаться из постсинаптического нейрона в пресинаптический нейрон. Соответственно, во время антероградной миграции вирус будет перемещаться из пресинаптического нейрона в постсинаптический нейрон.
Гомологи относятся к белкам, которые имеют общего предшественника. Аналоги не имеют общего предшественника, однако обладают некоторым функциональным (а не структурным) сходством, которое приводит к включению их в отдельный класс (например, трипсин-подобные сериновые протеиназы и субтилизины явно не являются родственными, их структуры вне активного сайта полностью различные, однако они имеют фактически геометрически идентичные активные сайты и, таким образом, считаются примером конвергентной эволюции в аналоги).
Существует два подкласса гомологов - ортологи и паралоги. Ортологи представляют собой один и тот же ген (например, цитохром 'c') у различных биологических видов. Два гена у одного и того же организма не могут быть ортологами. Паралоги являются результатом дупликации генов (например, гемоглобин бета и дельта). Если два гена/белка гомологичны и находятся в одном и том же организме, они являются паралогами.
Применяемый в данном документе термин "нарушение" относится к недомоганию, заболеванию, болезни, клиническому состоянию или патологическому состоянию.
Применяемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к среде-носителю, которая не затрагивает эффективность биологической активности активного ингредиента, является химически инертной и не является токсичной для пациента, которому ее вводят.
Применяемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемое производное" относится к любому гомологу, аналогу или фрагменту средства, например, идентифицированному с применением способа скрининга по настоящему изобретению, которые являются относительно нетоксичными для субъекта.
Термин "терапевтическое средство" относится к любой молекуле, соединению или лечению, которые способствуют предупреждению или лечению нарушений или осложнений нарушений.
Композиции, содержащие такое средство, составленное в совместимом фармацевтическом носителе, можно получать, упаковывать и маркировать для лечения.
Если комплекс является водорастворимым, то его можно составлять в подходящем буфере, например, в забуференном фосфатом солевом растворе или других физиологически совместимых растворах.
В качестве альтернативы, если полученный комплекс характеризуется слабой растворимостью в водных растворителях, то его можно составлять с неионогенным поверхностно-активным веществом, таким как Tween или полиэтиленгликоль. Таким образом, соединения и их физиологически приемлемые сольваты можно составлять для введения посредством ингаляции или инсуффляции (либо через рот, либо через нос) или путем перорального, буккального, парентерального, ректального введения или, в случае опухолей, непосредственной инъекции в солидную опухоль.
В случае перорального введения фармацевтический препарат может находиться в жидкой форме, например, растворах, сиропах или суспензиях, или может присутствовать в виде лекарственного продукта для разбавления водой или другой подходящей средой-носителем перед применением. Такие жидкие препараты можно получать общепринятыми способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие средства (например, сорбитный сироп, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгирующие средства (например, лецитин или аравийская камедь); неводные среды-носители (например, миндальное масло, жирные сложные эфиры или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Фармацевтические композиции могут быть в форме, например, таблеток или капсул, полученных общепринятыми способами с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, такими как связывающие средства (например, прежелатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); смазывающие средства (например, стеарат магния, тальк или диоксид кремния); разрыхлители (например, картофельный крахмал или крахмалгликолят натрия) или увлажняющие средства (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки можно покрывать с помощью способов, широко известных в данной области техники.
Препараты для перорального введения можно подходящим образом составлять для обеспечения контролируемого высвобождения активного соединения.
В случае введения посредством ингаляции соединения для применения в соответствии с настоящим изобретением удобно доставлять в форме спрея-аэрозоля из пакетов под давлением или с помощью небулайзера с применением подходящего пропеллента, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением единица дозирования может определяться за счет обеспечения клапана для доставки отмеренного количества. В случае применения в ингаляторе или инсуффляторе, например, капсулы и картриджи из желатина можно составлять содержащими порошковую смесь соединения и подходящую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал.
Соединения можно составлять для парентерального введения путем инъекции, например, болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Составы для инъекции могут быть представлены в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах или многодозовых контейнерах с добавленным консервантом.
Композиции могут быть в таких формах как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных средах-носителях, и могут содержать вспомогательные вещества для составления, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. В качестве альтернативы, активный ингредиент может находиться в форме порошка для разбавления подходящей средой-носителем, например, стерильной апирогенной водой, перед применением.
Соединения также можно составлять в виде средства для местного нанесения, такого как крем или лосьон.
В дополнение к составам, описанным ранее, соединения также можно составлять в виде депо-препарата. Такие составы длительного действия можно вводить путем имплантации (например, внутриглазной, подкожной или внутримышечной) или путем внутриглазной инъекции.
Таким образом, например, соединения можно составлять с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами, или в виде умеренно растворимых производных, например, в виде умеренно растворимой соли. Липосомы и эмульсии являются широко известными примерами сред-носителей для доставки или носителей для гидрофильных лекарственных средств.
При необходимости композиции могут присутствовать в упаковке или дозирующем устройстве, которые могут содержать одну или несколько стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Например, упаковка может предусматривать металлическую или пластиковую фольгу, например, блистерную упаковку. Упаковка или дозирующее устройство могут сопровождаться инструкциями по введению.
В настоящем изобретении также предусмотрены наборы для осуществления терапевтических схем введения по настоящему изобретению. Такие наборы содержат в одном или нескольких контейнерах терапевтически или профилактически эффективные количества композиций в фармацевтически приемлемой форме.
Композиция во флаконе из набора может находиться в форме фармацевтически приемлемого раствора, например, в комбинации со стерильным солевым раствором, раствором декстрозы или буферным раствором или другой фармацевтически приемлемой стерильной жидкостью. В качестве альтернативы, комплекс может быть лиофилизированным или высушенным; в этом случае набор необязательно дополнительно содержит в контейнере фармацевтически приемлемый раствор (например, солевой раствор, раствор декстрозы и т. д.), предпочтительно стерильный, для разбавления комплекса с образованием раствора для инъекционных целей.
В другом варианте осуществления набор дополнительно содержит иглу или шприц, предпочтительно упакованные в стерильной форме, для осуществления инъекции комплекса, и/или упакованный пропитанный спиртом тампон. Необязательно включены инструкции для введения композиций врачом или пациентом.
Если не определено иное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно среднему специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при осуществлении на практике или тестировании настоящего изобретения можно применять способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, ниже описываются подходящие способы и материалы. В случае противоречия настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не предполагаются как ограничивающие.
ПРИМЕРЫ
Генетическая конструкция
Промотор, применяемый в данном примере (964 п. о.; SEQ ID NO:3), состоит из одной SEQ ID NO:1, соединенной с минимальным промотором SV40, промотором под SEQ ID NO:2. Кодирующую последовательность ChR2-eGFP вставляли непосредственно после данных промоторов и оптимизированной последовательности Козак (GCCACC), а за ней располагался посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE) и сайт полиаденилирования SV40. Нацеливание на нейроны сетчатки осуществляли с применением AAV серотипа 2/8 при титре, составляющем 2,9E+10 GC/мл.
Вирусная трансфекция и получение ткани
Для введения AAV в глаза анестезированных животных осуществляли прокол склеры недалеко от хрусталика с помощью острой иглы 30 калибра. 2 мкл суспензии частиц AAV инъецировали субретинально с помощью шприца Гамильтона. Через 3 недели образцы выделенной сетчатки фиксировали в течение 30 мин в 4% PFA в PBS, с последующей стадией промывания в PBS при 4 градусах C. Сетчатки целиком обрабатывали с помощью 10% нормальной сыворотки крови осла (NDS), 1% BSA, 0,5% Triton X-100 в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Обработку моноклональными Ab крысы к GFP (Molecular Probes Inc.; 1:500) и поликлональными антителами козы к ChAT (Millipore: 1:200) в 3% NDS, 1% BSA, 0,5% Triton X-100 в PBS осуществляли в течение 5 дней при комнатной температуре. Обработку вторичными Ab осла к антителам крысы, конъюгированными с Alexa Fluor-488 (Molecular Probes Inc.; 1:200), антителами к антителам козы, конъюгированными с Alexa Fluor-633, и красителем Hoechst осуществляли в течение 2 ч. Срезы промывали, монтировали с реагентом ProLong Gold, препятствующим выгоранию флуоресценции (Molecular Probes Inc.), на предметных стеклах и фотографировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Zeiss LSM 700 Axio Imager Z2 (Carl Zeiss Inc.).
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Friedrich Miescher for Biomedical Research
<120> Промотор, специфический в отношении клеток пигментного эпителия
сетчатки приматов
<130> 57957
<160> 3
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 750
<212> ДНК
<213> Mus musculus
<400> 1
tcaagcctcc taccgccttt gttatgcaaa catatcaaac gccctccttt gttatgcaaa 60
agggctggaa cggggccttt gttatgcaaa tcgccctccc cgatcccttt gttatgcaaa 120
tttgacgaat tcccaccttt gttatgcaaa caaatctcct accctccttt gttatgcaaa 180
gtgagagggg ctgcaccttt gttatgcaaa atgcggcccc tgagaccttt gttatgcaaa 240
aaccatgtac gcttgccttt gttatgcaaa ccgcctgttg cttggccttt gttatgcaaa 300
gccacgcgat tggcgccttt gttatgcaaa gctcggttat gtacaccttt gttatgcaaa 360
gctactttaa acttgccttt gttatgcaaa tcacgacctg accgtccttt gttatgcaaa 420
aacggttgaa atagtccttt gttatgcaaa atgatattga atagtccttt gttatgcaaa 480
aatttagatg ccgacccttt gttatgcaaa ggaatgggcg tgctgccttt gttatgcaaa 540
ttttcgctgc gacagccttt gttatgcaaa catgctcgcc actcaccttt gttatgcaaa 600
ggtctaacaa tgaccccttt gttatgcaaa ctacgtggaa tagatccttt gttatgcaaa 660
ccccgagttt ttgaaccttt gttatgcaaa atcagtaact tcattccttt gttatgcaaa 720
atgtgactta acctcccttt gttatgcaaa 750
<210> 2
<211> 214
<212> ДНК
<213> sv40
<400> 2
gctcgagatc tgcgatctgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc 60
gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatc gctgactaat 120
tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg 180
aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaa 214
<210> 3
<211> 964
<212> ДНК
<213> Mus musculus
<400> 3
tcaagcctcc taccgccttt gttatgcaaa catatcaaac gccctccttt gttatgcaaa 60
agggctggaa cggggccttt gttatgcaaa tcgccctccc cgatcccttt gttatgcaaa 120
tttgacgaat tcccaccttt gttatgcaaa caaatctcct accctccttt gttatgcaaa 180
gtgagagggg ctgcaccttt gttatgcaaa atgcggcccc tgagaccttt gttatgcaaa 240
aaccatgtac gcttgccttt gttatgcaaa ccgcctgttg cttggccttt gttatgcaaa 300
gccacgcgat tggcgccttt gttatgcaaa gctcggttat gtacaccttt gttatgcaaa 360
gctactttaa acttgccttt gttatgcaaa tcacgacctg accgtccttt gttatgcaaa 420
aacggttgaa atagtccttt gttatgcaaa atgatattga atagtccttt gttatgcaaa 480
aatttagatg ccgacccttt gttatgcaaa ggaatgggcg tgctgccttt gttatgcaaa 540
ttttcgctgc gacagccttt gttatgcaaa catgctcgcc actcaccttt gttatgcaaa 600
ggtctaacaa tgaccccttt gttatgcaaa ctacgtggaa tagatccttt gttatgcaaa 660
ccccgagttt ttgaaccttt gttatgcaaa atcagtaact tcattccttt gttatgcaaa 720
atgtgactta acctcccttt gttatgcaaa gctcgagatc tgcgatctgc atctcaatta 780
gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 840
cgcccattct ccgccccatc gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 900
ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 960
caaa 964
<---
Claims (16)
1. Применение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты для экспрессии экзогенного гена в клетке пигментного эпителия сетчатки примата, где выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 1 или состоит из нее, и где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты является эффективной для управления экспрессией экзогенного гена в клетке пигментного эпителия сетчатки примата, если последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный экзогенный ген, функционально связана с указанной выделенной молекулой нуклеиновой кислоты.
2. Применение по п. 1, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты дополнительно содержит минимальный промотор.
3. Применение по п. 2, где минимальный промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2.
4. Применение по любому из пп. 1-3, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты является частью кассеты экспрессии.
5. Применение по п. 4, где указанная кассета экспрессии является частью вектора.
6. Применение по п. 5, где указанный вектор представляет собой вирусный вектор.
7. Применение по п. 6, где вирусный вектор представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вектора (AAV).
8. Применение выделенной молекулы нуклеиновой кислоты для лечения заболевания, ассоциированного с пигментным эпителием сетчатки, где выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 1 или состоит из нее, и где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты является эффективной для управления экспрессией экзогенного гена в клетке пигментного эпителия сетчатки примата, если последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный экзогенный ген, функционально связана с указанной выделенной молекулой нуклеиновой кислоты.
9. Применение по п. 8, где указанное заболевание, ассоциированное с пигментным эпителием сетчатки, выбрано из группы, состоящей из возрастной макулярной дегенерации, пигментной дистрофии сетчатки, диабетической ретинопатии и гипертрофии пигментного эпителия сетчатки.
10. Применение по п. 8 или 9, где указанная молекула выделенной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит минимальный промотор.
11. Применение по п. 10, где минимальный промотор содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2.
12. Применение по любому из пп. 8-11, где указанная выделенная молекула нуклеиновой кислоты является частью кассеты экспрессии.
13. Применение по п. 12, где указанная кассета экспрессии является частью вектора.
14. Применение по п. 13, где указанный вектор представляет собой вирусный вектор.
15. Применение по п. 13, где вирусный вектор представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вектора (AAV).
16. Применение по любому из пп. 1-13, где экзогенный ген кодирует канальный родопсин или галородопсин.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP17201828.5 | 2017-11-15 | ||
EP17201828 | 2017-11-15 | ||
PCT/IB2018/059015 WO2019097454A1 (en) | 2017-11-15 | 2018-11-15 | Primate retinal pigment epithelium cell-specific promoter |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020119176A RU2020119176A (ru) | 2021-12-16 |
RU2020119176A3 RU2020119176A3 (ru) | 2022-01-26 |
RU2773940C2 true RU2773940C2 (ru) | 2022-06-14 |
Family
ID=
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012051599A2 (en) * | 2010-10-15 | 2012-04-19 | Eos Neuroscience, Inc. | Modulation neural pathways |
WO2014033095A1 (en) * | 2012-08-27 | 2014-03-06 | Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research | Retinal off circuit-specific promoter |
WO2015118507A1 (en) * | 2014-02-10 | 2015-08-13 | Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research | Aii retinal amacrine cell-specific promoter |
WO2016174624A1 (en) * | 2015-04-30 | 2016-11-03 | Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research | Promoter for the specific expression of genes in müller cells |
RU2612788C2 (ru) * | 2010-03-23 | 2017-03-13 | Интрексон Корпорейшн | Векторы, условно экспрессирующие терапевтические белки, клетки-хозяева, содержащие указанные векторы, и их применение |
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2612788C2 (ru) * | 2010-03-23 | 2017-03-13 | Интрексон Корпорейшн | Векторы, условно экспрессирующие терапевтические белки, клетки-хозяева, содержащие указанные векторы, и их применение |
WO2012051599A2 (en) * | 2010-10-15 | 2012-04-19 | Eos Neuroscience, Inc. | Modulation neural pathways |
WO2014033095A1 (en) * | 2012-08-27 | 2014-03-06 | Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research | Retinal off circuit-specific promoter |
WO2015118507A1 (en) * | 2014-02-10 | 2015-08-13 | Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research | Aii retinal amacrine cell-specific promoter |
WO2016174624A1 (en) * | 2015-04-30 | 2016-11-03 | Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research | Promoter for the specific expression of genes in müller cells |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
CARVALHO, LIVIA S, AND LUK H VANDENBERGHE. Promising and delivering gene therapies for vision loss. Vision research, 2015, v.111, Pt B, pp.124-33, doi:10.1016/j.visres.2014.07.013. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11739349B2 (en) | Primate retinal pigment epithelium cell-specific promoter | |
RU2766353C2 (ru) | Synp198, промотор для специфической экспрессии генов в ганглионарных клетках сетчатки, избирательных в отношении направления | |
AU2018376544B2 (en) | SynP61, a primate retinal pigment epithelium cell-specific promoter | |
EP3383439B1 (en) | Synp161, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors | |
EP3384033B1 (en) | Synp160, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors | |
EP3383438B1 (en) | Synp159, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors | |
EP3383440B1 (en) | Synp162, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors | |
US9999685B2 (en) | AII retinal amacrine cell-specific promoter | |
EP3289090B1 (en) | Promoter for the specific expression of genes in müller cells | |
US20140287510A1 (en) | Rod cell-specific promoter | |
US9579399B2 (en) | Retinal OFF circuit-specific promoter | |
EP3176177A1 (en) | Synp157, a promoter for the specific expression of genes in rod photoreceptors | |
US9862970B2 (en) | Retinal on bipolar cells-specific artificial promoter | |
RU2773940C2 (ru) | Промотор, специфический в отношении клеток пигментного эпителия сетчатки приматов |