RU2773709C1

RU2773709C1 - Method for extraction of pigments from cells of microalgae tetraselmis viridis

Info

Publication number: RU2773709C1
Application number: RU2021109213A
Authority: RU
Inventors: Ирина Алексеевна Харчук; Светлана Юрьевна Горбунова
Filing date: 2021-04-02
Publication date: 2022-06-08

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology. A method for the extraction of pigments from the cells of the microalgae Tetraselmis viridis is proposed, including the disintegration of raw biomass using an abrasive substance - quartz sand; extraction of the pigment complex with 100% acetone in a water bath at 40-50°C, followed by centrifugation of the extract to separate the soluble part containing the pigment complex. The insoluble part is subjected to repeated extraction and separation until the precipitate and supernatant are completely discolored.

EFFECT: invention provides an increase in the yield of pigments from the raw biomass of the unicellular alga Tetraselmis viridis while reducing the time and labor intensity of the process.

1 cl, 1 dwg, 1 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологической промышленности и аквакультуре и позволяет извлекать биологически активные вещества из биомассы одноклеточной водоросли рода Tetraselmis. Предлагаемый способ позволяет извлекать пигменты из микроводорослей с наименьшими потерями.The invention relates to the biotechnological industry and aquaculture and allows the extraction of biologically active substances from the biomass of a single-celled algae of the genus Tetraselmis. The proposed method allows extracting pigments from microalgae with minimal losses.

Область применения: для экспресс оценки качества кормового сырья в аквакультуре.Scope: for rapid assessment of the quality of feed raw materials in aquaculture.

Виды Tetraselmis привлекательны как для исследований, так и для промышленности. Они прекрасный образец для изучения скорости роста планктона, а также эволюционных изменений многоклеточности на примере колоний клеток. Кроме того, многие виды в настоящее время представляют интерес в качестве биотоплива из-за высокого содержания в них липидов.Species of Tetraselmis are attractive for both research and industry. They are an excellent model for studying the growth rate of plankton, as well as evolutionary changes in multicellularity using the example of cell colonies. In addition, many species are currently of interest as biofuels due to their high lipid content.

Tetraselmis viridis зеленая водоросль, представитель подтипа Chlorophytina, и принадлежит к небольшому классу Chlorodendrophyceae, который вместе с Pedinophyceae, Trebouxiophyceae, Ulvophyceae и Chlorophyceae образует ядро Chlorophyta. Клеточная оболочка представителей подтипа Chlorophytina состоит из целлюлозы и белков, однако отряд Chlorodendrales, к которому относится Tetraselmis viridis, характеризуется наличием жестких покровов типа теки, которая состоит из нескольких слоев чешуек объединенных между собой [1, 20]. Из-за особенностей строения, клеточная оболочка препятствует извлечению биологически ценных веществ из клетки. Учитывая разнообразие микроводорослей, принадлежащих к подтипу Chlorophytina, методы выделения пигментов из клеток тоже разнообразны. Так как их оболочки устойчивы к химическим воздействиям, то они являются основным препятствием для извлечения из клетки ценных биологически активных компонентов. Способы их разрушения разнообразны: от простых до комплексных. Они могут включать кипячение или замораживание биомассы, ферментативный гидролиз компонентов биомассы, позволяющий перевести биологически активные вещества в водорастворимое состояние, механическую мацерацию.Tetraselmis viridis is a green algae, a member of the subphylum Chlorophytina, and belongs to the small class Chlorodendrophyceae, which, together with Pedinophyceae, Trebouxiophyceae, Ulvophyceae, and Chlorophyceae, forms the nucleus of Chlorophyta. The cell membrane of representatives of the Chlorophytina subtype consists of cellulose and proteins, however, the order Chlorodendrales, to which Tetraselmis viridis belongs, is characterized by the presence of rigid integuments such as theca, which consists of several layers of scales united with each other [1, 20]. Due to structural features, the cell membrane prevents the extraction of biologically valuable substances from the cell. Given the diversity of microalgae belonging to the Chlorophytina subtype, methods for isolating pigments from cells are also diverse. Since their shells are resistant to chemical influences, they are the main obstacle to the extraction of valuable biologically active components from the cell. The methods of their destruction are diverse: from simple to complex. They can include boiling or freezing of biomass, enzymatic hydrolysis of biomass components, which allows to transfer biologically active substances into a water-soluble state, mechanical maceration.

Известен способ получения хлорофиллов и каротиноидов из Tetraselmis chuii, культивируемых в различных средах [3]. Культуры водорослей оценивали по их росту, биохимическому составу и накоплению каротиноидов. Клетки собирали на стационарной фазе роста спомощью центрифугирования при 8000 об / мин в течение 10 минут, далее двукратно промывали стерильной дистиллированной водой. Затем образцы сушили вымораживанием и хранили при -20°С до использования. Для определения хлорофилла, навеску Tetraselmis chuii экстрагировали 10 мл 90% ацетоном. Продукцию хлорофилла Т. chuii анализировали по методу Бойда [4] путем измерения спектров поглощения экстрактов при 665 и 750 нм соответственно. Из недостатков заявленного способа можно отметить низкую эффективностью применения процесса замораживания биомассы, в качестве способа дезинтеграции клеточной оболочки микроводорослей.A known method for obtaining chlorophylls and carotenoids from Tetraselmis chuii cultivated in various media [3]. Algae cultures were evaluated by their growth, biochemical composition, and accumulation of carotenoids. Cells were collected at stationary growth phase by centrifugation at 8000 rpm for 10 minutes, then washed twice with sterile distilled water. The samples were then freeze dried and stored at -20°C until use. To determine chlorophyll, a sample of Tetraselmis chuii was extracted with 10 ml of 90% acetone. The production of T. chuii chlorophyll was analyzed by the Boyd method [4] by measuring the absorption spectra of the extracts at 665 and 750 nm, respectively. Among the disadvantages of the claimed method, one can note the low efficiency of the biomass freezing process as a method for disintegrating the cell wall of microalgae.

Известны методы экстракции каротиноидов из клеток Tetraselmis [5] акклиматизированных при слабом освещении. Клетки Tetraselmis выращивали на питательной среде F/2, при низкой интенсивности света в течении 24 часов в сутки и температуре 13°С. В первом случае фильтры с лиофилизированными клетками Tetraselmis sp.экстрагировали смесью ацетон: фосфатный буфер (рН=7,2). Во время экстракции образцы были защищены от света. Во втором случае замороженные клетки Tetraselmis wettsteinii экстрагировали смесью ацетон: метанол в соотношении 7:3 и фильтровали через слой карбоната магния. Недостатком данных методов является нестабильность метанольного экстракта, что приводит к образованию продуктов деградации хлорофилла. Замораживание клеток Tetraselmis не сопровождается их разрушением, клеточная оболочка остается слабопроницаемой для органических растворителей.Known methods of extraction of carotenoids from Tetraselmis cells [5] acclimatized in low light. Tetraselmis cells were grown on F/2 nutrient medium, at low light intensity for 24 hours a day and at a temperature of 13°C. In the first case, filters with lyophilized Tetraselmis sp. cells were extracted with a mixture of acetone: phosphate buffer (pH=7.2). During extraction, the samples were protected from light. In the second case, frozen cells of Tetraselmis wettsteinii were extracted with a mixture of acetone:methanol in a ratio of 7:3 and filtered through a pad of magnesium carbonate. The disadvantage of these methods is the instability of the methanol extract, which leads to the formation of chlorophyll degradation products. Freezing of Tetraselmis cells is not accompanied by their destruction, the cell membrane remains poorly permeable to organic solvents.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, являются способы выделения пигментов водоросли Tetraselmis suecica с помощью ультразвука. В первом варианте клетки отбирали через 3 часа после завершения светового периода, чтобы исключить потенциальное воздействие недавнего света [6]. Клетки фильтровали через фильтры GF/F, а затем экстрагировали ультразвуком с 5 мл 90% ацетона и хранили в течение ночи при 5°С. Во время процедуры экстракции образцы были защищены от света. Экстракты фильтровали и анализировали методом химической ионизации при атмосферном давлении жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии ((APCI LC-MS). Во втором варианте образцы (3-5 мл) фильтровали через фильтры из стекловолокна (GF/F Whatman, 25 мм) при низком давлении вакуума и хранили при - 20°С до начала анализа [7]. Экстракцию пигмента проводили с использованием 100% ацетона. После добавления экстрагента биомассу водорослей подвергали холодной обработке ультразвуком (PRO250. Pro Scientific Inc. Оксфорд), разрушенные таким образом клетки сохраняли при - 20°С в течение 8-10 часов. Затем пробирки центрифугировали в роторной центрифуге (центрифуга 5804R, Эппендорф) при 3000 об. в мин. до 15 мин при 0 С. Супернатант фильтровали с использованием шприца Acrodisc через фильтры (лаборатория Гельмана). Вся процедура проводилась в тусклом свете, чтобы избежать деградации пигмента. Недостатками данных методов является необходимость приобретения дорогостоящего оборудования и трудоемкость метода.The closest technical solution, chosen as a prototype, are methods for isolating the pigments of the algae Tetraselmis suecica using ultrasound. In the first variant, cells were collected 3 hours after the end of the light period to exclude potential exposure to recent light [6]. Cells were filtered through GF/F filters and then sonicated with 5 ml of 90% acetone and stored overnight at 5°C. During the extraction procedure, the samples were protected from light. The extracts were filtered and analyzed by chemical ionization at atmospheric pressure liquid chromatography-mass spectrometry ((APCI LC-MS). In the second version, samples (3-5 ml) were filtered through glass fiber filters (GF/F Whatman, 25 mm) at low vacuum pressure and stored at -20°C until analysis [7].The pigment was extracted using 100% acetone.After adding the extractant, the algae biomass was subjected to cold sonication (PRO250. Pro Scientific Inc. Oxford), the cells thus destroyed were stored at - 20° C. for 8-10 hours The tubes were then centrifuged in a rotary centrifuge (centrifuge 5804R, Eppendorf) at 3000 rpm for 15 minutes at 0 C. The supernatant was filtered using an Acrodisc syringe through the filters (Gelman laboratory). The whole procedure was carried out in dim light to avoid pigment degradation.The disadvantages of these methods are the need to purchase expensive equipment and the complexity of the method. Yes.

Техническим результатом изобретения Способ экстракции пигментов из клеток микроводоросли Tetraselmis viridis, является повышение выхода пигментов из сырой биомассы одноклеточной водоросли Tetraselmis viridis при сокращении времени и трудоемкости процесса, а также уменьшении объемов используемых растворителей, что приводит к удешевлению способа.The technical result of the invention The method for extracting pigments from the cells of the Tetraselmis viridis microalgae is to increase the yield of pigments from the raw biomass of the unicellular algae Tetraselmis viridis while reducing the time and laboriousness of the process, as well as reducing the volume of solvents used, which reduces the cost of the method.

Для достижения указанного результата предложен способ выделения пигментов из биомассы микроводоросли Tetraselmis viridis. Способ заключается в обработке сырой биомассы микроводоросли органическим растворителем, например ацетоном. Полученные пигменты отделяют, при этом указанные манипуляции проводят до полного обесцвечивания экстрагента, с последующим объединением целевого продукта. При этом влажную биомассу микроводоросли гомогенизируют измельчением, путем перетирания с кварцевым песком, заливают 100% ацетоном и, полученную суспензию биомассы, помещают на водяную баню при температуре 40-50°С.To achieve this result, a method is proposed for isolating pigments from the biomass of the microalgae Tetraselmis viridis. The method consists in processing raw biomass of microalgae with an organic solvent, such as acetone. The resulting pigments are separated, while these manipulations are carried out until the extractant is completely discolored, followed by the combination of the target product. At the same time, the wet microalgae biomass is homogenized by grinding, by grinding with quartz sand, poured with 100% acetone, and the resulting biomass suspension is placed in a water bath at a temperature of 40-50°C.

Для достижения максимальной степени извлечения пигментной фракции предлагаемое нами изобретение предполагает проведение комплексного разрушения клеточной стенки микроводоросли с последующей экстракцией целевого продукта органическим растворителем.To achieve the maximum degree of extraction of the pigment fraction, our invention involves the complex destruction of the cell wall of microalgae, followed by extraction of the target product with an organic solvent.

Согласно предлагаемому способу для извлечения пигментной фракции используют микроводоросли Tetraselmis viridis. На стационарной стадии роста клетки отделяют от культуральной среды путем центрифугирования. Влажную биомассу с влагосодержанием 100% гомогенизируют измельчением/мацерацией с помощью кварцевого песка и суспензируют в 3 мл органического растворителя, например, ацетоне. Для дальнейшего разрушения клеток, полученную суспензию водорослей и органического растворителя помещают на водяную баню, продолжая мацерацию клеток, и выдерживают 3-5 мин при температуре 40-50°С. Экстракт охлаждают, центрифугируют при 3000 об/мин. Супернатант сливают, к осадку приливают 2 мл растворителя. Нерастворимую часть подвергают повторной экстракции и разделяют. Манипуляцию повторяют до полного обесцвечивания осадка и надосадочной жидкости. Объединенный экстракт перемешивают и измеряют спектры поглощения пигментов.According to the proposed method, Tetraselmis viridis microalgae are used to extract the pigment fraction. At the stationary stage of growth, the cells are separated from the culture medium by centrifugation. The wet biomass with a moisture content of 100% is homogenized by grinding/maceration with silica sand and suspended in 3 ml of an organic solvent, eg acetone. For further cell destruction, the resulting suspension of algae and organic solvent is placed in a water bath, continuing cell maceration, and kept for 3-5 minutes at a temperature of 40-50°C. The extract is cooled, centrifuged at 3000 rpm. The supernatant is drained, 2 ml of the solvent is added to the precipitate. The insoluble part is re-extracted and separated. The manipulation is repeated until the precipitate and supernatant are completely discolored. The combined extract is stirred and the absorption spectra of the pigments are measured.

При механической активации биомассы водорослей происходит: механическое разрушение клеток, растертых с абразивным ингредиентом; разупорядочение надмолекулярной структуры клеточных стенок; повышение их проницаемости по отношению к органическим растворителям.With mechanical activation of algae biomass, the following occurs: mechanical destruction of cells ground with an abrasive ingredient; disordering of the supramolecular structure of cell walls; increasing their permeability with respect to organic solvents.

Эффективность экстракции пигментов из клеток микроводорослей достигается путем сочетания механического и термического способов разрушения клеточных стенок, о чем свидетельствует меньшая затрата времени, необходимая для осуществления экстракции.The efficiency of pigment extraction from microalgae cells is achieved by a combination of mechanical and thermal methods of destruction of cell walls, as evidenced by the shorter time required for extraction.

Разрушенные клеточные стенки, получаемые после механической активации с кварцевым песком, представляют собой плотную суспензию разрушенных клеток и кристаллов песка от светло- до темно-зеленого цвета, который может непосредственно использоваться для дальнейшей экстракции пигментного комплекса. После механической активации полупродукт суспендируют в органических растворителях и проводят экстракцию пигментного комплекса. Нагревание на водяной бане позволяет ускорить процесс. Экстракт разделяют фильтрацией на растворимую часть, содержащую пигментный комплекс, и нерастворимую часть.Destroyed cell walls, obtained after mechanical activation with quartz sand, are a dense suspension of destroyed cells and light to dark green sand crystals, which can be directly used for further extraction of the pigment complex. After mechanical activation, the intermediate is suspended in organic solvents and the pigment complex is extracted. Heating in a water bath speeds up the process. The extract is separated by filtration into a soluble part containing the pigment complex and an insoluble part.

Общим для прототипа и заявляемого способа является применение одного и того же органического растворителя. Основные отличия от прототипа заключаются в том, что в заявляемом способе сырые клетки растирают с абразивным ингредиентом, мацерация клеток продолжается в растворе органического растворителя и применена экстракция с подогревом на водяной бане, что способствует эффективной вытяжке пигментов из клеток.Common to the prototype and the proposed method is the use of the same organic solvent. The main differences from the prototype are that in the claimed method, raw cells are ground with an abrasive ingredient, cell maceration continues in an organic solvent solution and heated extraction in a water bath is used, which contributes to the effective extraction of pigments from cells.

Способ поясняется иллюстрациями на фиг. 1., где 1 - горячая ацетоновая экстракция; 2 - ацетоновая экстракция; 3 - ацетоновая экстракция (предварительное замораживание клеток при t -14°С, экспозиция 24 часа); 4 -спиртовая экстракция (при t -14°С, экспозиция 1 час).The method is illustrated in Fig. 1., where 1 - hot acetone extraction; 2 - acetone extraction; 3 - acetone extraction (preliminary freezing of cells at t -14°C, exposure 24 hours); 4-alcohol extraction (at t -14°C, exposure 1 hour).

Проведенный патентный поиск по международной классификации не выявил аналогичных способов извлечения биологически активных веществ из биомассы одноклеточной водоросли рода Tetraselmis viridis, поэтому сделан вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна». Совокупность существенных признаков заявляемого способа также не выявлена, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого препарата и способа его получения критерию «изобретательский уровень».The conducted patent search according to the international classification did not reveal similar methods for extracting biologically active substances from the biomass of unicellular algae of the genus Tetraselmis viridis, therefore, it was concluded that the proposed technical solution complies with the criterion of "novelty". The set of essential features of the proposed method is also not identified, which allows us to conclude that the proposed drug and the method of its production comply with the "inventive step" criterion.

Изобретение поясняется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. Микроводоросли Tetraselmis viridis выращивали накопительным методом в стеклянном культиваторе плоскопараллельного типа [8], с рабочим объемом 3 л при боковом поверхностном освещении 10 кЛк. Скорость продувки воздухом через распылители в культуре составляла 1л⋅мин^-1⋅л^-1. Температура среды автоматически поддерживалась на уровне 24°С. На стационарной стадии роста для определения пигментов отбирали пробы объемом по 5 м, клетки осаждали центрифугированием. Для этого использовали лабораторную центрифугу типа ОПН-3 ТУ 5-375-4261-76, частота вращения ротора составляла 3000 об/ми. Допускаемое приведенное отклонение заданной частоты вращения не более ±10%. Надосадочную жидкость сливали. К осадку добавляли кварцевый песок и мацерировали с целью разрушения клеточных оболочек, затем приливали экстрагент объемом 2 мл и продолжали растирать клетки микроводорослей. В качестве экстрагента использовали 100%-ый ацетон. Дальнейшую дезинтеграцию клеток проводили нагреванием на водяной бане в температурном диапазоне 40-50°С, продолжая размельчать клетки в течение 3-5 мин. Экстракт охлаждали, центрифугировали при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, к осадку приливали 2 мл растворителя. Нерастворимую часть подвергали повторной экстракции и разделению. Манипуляцию повторяли до полного обесцвечивания осадка и над осадочной жидкости. Извлечение пигментов проводили при освещенности 2 кЛк. Объем суммарного экстракта составил 7,1 мл. Выход суммарных хлорофиллов составил 1,7%, каротиноидов 0,29%.Example 1. Tetraselmis viridis microalgae were grown by the accumulative method in a glass cultivator of a plane-parallel type [8], with a working volume of 3 l at side surface illumination of 10 kLx. The rate of air blowing through the atomizers in the culture was 1l⋅min ^-1 ⋅l ^-1 . The medium temperature was automatically maintained at 24°C. At the stationary growth stage, 5 m samples were taken to determine the pigments, and the cells were precipitated by centrifugation. To do this, we used a laboratory centrifuge type OPN-3 TU 5-375-4261-76, the rotor speed was 3000 rpm. Permissible reduced deviation of the specified speed is not more than ±10%. The supernatant was discarded. Quartz sand was added to the precipitate and macerated to destroy the cell membranes, then an extractant of 2 ml was added and the microalgae cells continued to be triturated. 100% acetone was used as an extractant. Further disintegration of the cells was carried out by heating in a water bath in the temperature range of 40–50°C, continuing to crush the cells for 3–5 min. The extract was cooled, centrifuged at 3000 rpm. The supernatant liquid was decanted, and 2 ml of the solvent was added to the precipitate. The insoluble part was re-extracted and separated. The manipulation was repeated until complete discoloration of the sediment and over the sedimentary liquid. The extraction of pigments was carried out at an illumination of 2 kLx. The volume of the total extract was 7.1 ml. The yield of total chlorophylls was 1.7%, carotenoids 0.29%.

Пример 2. То же, что в примере 1, но не использовали водяную баню. Объем суммарного экстракта составил 21,5 мл. Выход суммарных хлорофиллов составил 1,31%, каротиноидов 0,19%.Example 2 Same as example 1, but no water bath was used. The volume of the total extract was 21.5 ml. The yield of total chlorophylls was 1.31%, carotenoids 0.19%.

Пример 3. То же, что в примере 2, но клетки Т. viridis после отделения от культуральной среды помещали в морозильную камеру на 24 часа, при t -14°С). Объем суммарного экстракта составил 9,5 мл. Выход суммарных хлорофиллов составил 1,41%, каротиноидов 0,15%.Example 3. The same as in example 2, but the cells of T. viridis after separation from the culture medium were placed in a freezer for 24 hours, at t -14°C). The volume of the total extract was 9.5 ml. The yield of total chlorophylls was 1.41%, carotenoids 0.15%.

Пример 4. То же, что в примере 3, но к клеткам Т. viridis после отделения от культуральной приливали 2 мл этилового спирта и помещали в морозильную камеру при t -14°С, экспозиция 1 час. Объем суммарного экстракта составил 11,3 мл. Выход суммарных хлорофиллов составил 1,06%, каротиноидов 0,17%.Example 4. The same as in example 3, but after separation from the culture cells, 2 ml of ethanol was added to the cells of T. viridis and placed in a freezer at t -14°C, exposure 1 hour. The volume of the total extract was 11.3 ml. The yield of total chlorophylls was 1.06%, carotenoids 0.17%.

Содержание пигментов (% от сухой массы СМ) в зависимости от способа обработки биомассы с использованием различных растворителей показано в таблице 1.The content of pigments (% of the dry mass of SM) depending on the method of processing biomass using various solvents is shown in table 1.

Таким образом, по сравнению с прототипом заявляемое техническое решение позволяет проще и с большим выходом извлекать пигментный комплекс из сырой биомассы одноклеточной водоросли Tetraselmis viridis. Применение в заявленном способе дополнительной механической обработки биомассы Tetraselmis viridis с абразивным веществом (кварцевым песком) и проведение экстракции на водяной бане позволяет разрушить клетки водоросли, а также разупорядочить структуру клеточных стенок. Это приводит к увеличению проницаемости клеточных стенок для органических растворителей, возрастанию их реакционной способности, позволяет сократить продолжительность операций экстракции и затраты органических растворителей. Одновременно с этим увеличивается выход пигментов из клеток водорослей. Перечисленные выше достоинства заявленного способа делают его более простым в исполнении и экономически эффективным, чем способ по прототипу.Thus, in comparison with the prototype, the proposed technical solution makes it easier and with a high yield to extract the pigment complex from the raw biomass of the unicellular algae Tetraselmis viridis. The use in the claimed method of additional mechanical processing of Tetraselmis viridis biomass with an abrasive substance (quartz sand) and extraction in a water bath allows destroying algae cells, as well as disordering the structure of cell walls. This leads to an increase in the permeability of cell walls to organic solvents, an increase in their reactivity, and makes it possible to reduce the duration of extraction operations and the cost of organic solvents. At the same time, the output of pigments from algae cells increases. The above advantages of the claimed method make it easier to perform and cost-effective than the prototype method.

Источники информации, принятые во вниманиеSources of information taken into account

1. Guiry M.D. in Guiry, M.D. & Guiry, G.M. 2020. AlgaeBase. Worldwide electronic publication, National University of Ireland, Galway. http://www.algaebase.org; searched on 29 September 2020;1. Guyry M.D. in Guiry, M.D. & Guiry, G.M. 2020. AlgaeBase. Worldwide electronic publication, National University of Ireland, Galway. http://www.algaebase.org; searched on September 29, 2020;

2. Охапкин А.Г., Юлова Г.А. Основы альгологии: Учебное пособие. - Нижний Новгород: Издательство Нижегородского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского, 2010. - 340 с).2. Okhapkin A.G., Yulova G.A. Fundamentals of Algology: Textbook. - Nizhny Novgorod: Publishing House of the Nizhny Novgorod State University. N.I. Lobachevsky, 2010. - 340 p.).

3. Khatoon Н., Haris Н., Rahman N.A., Zakaria M.N., Begum Н., Mian S. Growth, Proximate Composition and Pigment Production of Tetraselmis chuii Cultured with Aquaculture Wastewater J. Ocean Univ. China (Oceanic and Coastal Sea Research) https://doi.org/10.1007/s11802-018-3428-7 ISSN 1672-5182, 2018 17 (3): 641-646 http://www.ouc.edu.cn/xbywb/ E-mail:xbywb@ouc.edu.cn3. Khatoon N., Haris H., Rahman N.A., Zakaria M.N., Begum H., Mian S. Growth, Proximate Composition and Pigment Production of Tetraselmis chuii Cultured with Aquaculture Wastewater J. Ocean Univ. China (Oceanic and Coastal Sea Research) https://doi.org/10.1007/s11802-018-3428-7 ISSN 1672-5182, 2018 17 (3): 641-646 http://www.ouc.edu.cn /xbywb/ Email:xbywb@ouc.edu.cn

4. Boyd, С.E., 1979. Water Quality in Warm Water Fish Ponds. Auburn University Agriculture Experiment Station, Auburn, AL, 359pp.4. Boyd, C.E., 1979. Water Quality in Warm Water Fish Ponds. Auburn University Agriculture Experiment Station, Auburn, AL, 359pp.

5. Egeland E.S., Eikrem W., Throndsen J., Wilhelm C, Zapata M, Liaaen-Jensen S. Carotenoids from farther prasinophytes. Biochem. Syst. Ecol., 23 (1995), pp.747-755, 10.1016/0305-1978(95)00075-55. Egeland E.S., Eikrem W., Throndsen J., Wilhelm C, Zapata M, Liaaen-Jensen S. Carotenoids from farther prasinophytes. Biochem. Syst. Ecol., 23 (1995), pp.747-755, 10.1016/0305-1978(95)00075-5

6. Borghinia F., Colacevicha A., Bergaminob N., Micarellic P., Dattilob A.M., Focardib S., Focardia S., Loiselleb S.A. The microalgae Tetraselmis suecica in mesocosms under different light regimes. Chemistry and Ecology Vol.25, No. 5, October 2009, 345-357. https://doi.org/10.1080/027575409031931486. Borghinia F., Colacevicha A., Bergaminob N., Micarellic P., Dattilob A.M., Focardib S., Focardia S., Loiselleb S.A. The microalgae Tetraselmis suecica in mesocosms under different light regimes. Chemistry and Ecology Vol.25, No. 5, October 2009, 345-357. https://doi.org/10.1080/02757540903193148

7. Sangeeta Mahableshwar Naik, Arga Chandrashekar Anil Influence of darkness on pigments of Tetraselmis indica (Chlorodendrophyceae, Chlorophyta) Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, Volume 186, September 2018, Pages 17-22, https://doi.org/10.1016/j.jphotobiol.2018.06.010).7. Sangeeta Mahableshwar Naik, Arga Chandrashekar Anil Influence of darkness on pigments of Tetraselmis indica (Chlorodendrophyceae, Chlorophyta) Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, Volume 186, September 2018, Pages 17-22, https://doi.org/ 10.1016/j.jphotobiol.2018.06.010).

8. Тренкеншу Р.П., Лелеков A.C., Боровков А.Б., Новикова Т.М. Унифицированная установка для лабораторных исследований микроводорослей // Вопросы современной альгологии. 2017. №1 (13). URL: http://algology.ru/10978. Trenkenshu R.P., Lelekov A.S., Borovkov A.B., Novikova T.M. Unified installation for laboratory research of microalgae // Problems of modern algology. 2017. No. 1 (13). URL: http://algology.ru/1097

Claims

A method for extracting pigments from the cells of the microalgae Tetraselmis viridis, including the disintegration of the raw biomass and the extraction of the pigment complex with 100% acetone, characterized in that the raw biomass of the unicellular alga Tetraselmis viridis is used, which is previously disintegrated with an abrasive substance - quartz sand, and the extraction of the pigment complex 100 % acetone is carried out in a water bath in a temperature range of 40-50°C, followed by centrifugation of the extract to separate the soluble part containing the pigment complex, and the insoluble part is subjected to repeated extraction and separation until the precipitate and supernatant are completely discolored.