RU2772193C1 - Способ ранней диагностики глиомы - Google Patents
Способ ранней диагностики глиомы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2772193C1 RU2772193C1 RU2021113365A RU2021113365A RU2772193C1 RU 2772193 C1 RU2772193 C1 RU 2772193C1 RU 2021113365 A RU2021113365 A RU 2021113365A RU 2021113365 A RU2021113365 A RU 2021113365A RU 2772193 C1 RU2772193 C1 RU 2772193C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- glioma
- diagnosis
- crna
- dna
- patient
- Prior art date
Links
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 title claims abstract description 27
- 229920001880 Circular RNA Polymers 0.000 claims abstract description 30
- 239000002070 nanowire Substances 0.000 claims abstract description 21
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 15
- 230000000295 complement Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 claims description 10
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 13
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 21
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 9
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 9
- 229920001239 microRNA Polymers 0.000 description 9
- 230000000771 oncological Effects 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 5
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 4
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 4
- 229920000160 (ribonucleotides)n+m Polymers 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 3
- 108020004459 Small Interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004223 overdiagnosis Methods 0.000 description 3
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 108020004388 MicroRNAs Proteins 0.000 description 2
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 2
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 2
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000005669 field effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000001459 lithography Methods 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000767 polyaniline Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- 206010001488 Aggression Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 210000003169 Central Nervous System Anatomy 0.000 description 1
- 206010009244 Claustrophobia Diseases 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 210000002889 Endothelial Cells Anatomy 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 210000001808 Exosomes Anatomy 0.000 description 1
- 102100011858 FOXP1 Human genes 0.000 description 1
- 101700028501 FOXP1 Proteins 0.000 description 1
- 102100011856 FOXP2 Human genes 0.000 description 1
- 101700039417 FOXP2 Proteins 0.000 description 1
- 206010016277 Fear of closed space Diseases 0.000 description 1
- 206010017758 Gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N Guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 102100008941 NFIX Human genes 0.000 description 1
- 101700020989 NFIX Proteins 0.000 description 1
- 230000005913 Notch signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 206010033664 Panic attack Diseases 0.000 description 1
- 210000002307 Prostate Anatomy 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 108020004417 Untranslated RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000011231 colorectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 239000002322 conducting polymer Substances 0.000 description 1
- 229920001940 conductive polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000407 conserved sequence Polymers 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 231100000722 genetic damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory Effects 0.000 description 1
- 230000002530 ischemic preconditioning Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 1
- 229920005627 miR-379 Polymers 0.000 description 1
- 229920001894 non-coding RNA Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 230000000405 serological Effects 0.000 description 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- -1 succinimide ester Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000107 tumor biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области медицинской диагностики. Предложен способ ранней диагностики глиомы, включающий выбор последовательности ДНК-олигонуклеотидных зондов, комплементарной к участкам кольцевой РНК, ассоциированной с развитием глиомы, и последующую регистрацию кольцевой РНК, циркулирующей в крови пациента, с помощью биосенсора нанопроволочного чипа. По образованию комплексов между указанными последовательностями ДНК-олигонуклеотидных зондов и комплементарными им участками кольцевой РНК диагностируют глиому. Изобретение обеспечивает надежность диагностики при повышении чувствительности и быстродействия на уровне нескольких минут. 1 ил., 3 табл., 1 пр.
Description
Предлагаемое изобретение относится к области медицинской диагностики, и может быть использовано для ранней диагностики злокачественных новообразований.
Злокачественное новообразование (опухоль) - это образование, которое возникает при бесконтрольном делении и росте клеток в различных органах или тканях организма, способных к инвазии в прилежащие ткани и метастазированию в отдаленные органы. Современное предположение о том, что является причинами возникновения злокачественных новообразований заключается в мультфакториальности заболевания. Таким образом, причинами развития онкопатологий могут быть: наследственная предрасположенность, снижение иммунитета, некоторые заболевания и инфекции, а также воздействие факторов окружающей среды.
В настоящее время проблема борьбы со злокачественными новообразованиями является одной из наиболее актуальных в медицине. На современном этапе развития клинической онкологии основной тенденцией является стремление к выявлению злокачественных опухолей на раннем этапе их развития, что является важным условием эффективности лечения и обеспечивает пятилетнюю выживаемость в 70-100% случаев. Вместе с тем, диагностика ранних форм злокачественных новообразований из-за слабовыраженной симптоматики сложна. Необходимо всестороннее клиническое обследование больных с применением комплексных методов, а также формирование групп повышенного риска развития злокачественных новообразований и наблюдение за этой категорией пациентов.
Глиома является наиболее распространенной онкологической патологией центральной нервной системы и характеризуется высокой агрессивностью, рецидивом и смертностью. Высокая смертность обусловлена отсутствием эффективных методов лечения и диагностических тестов.
Во многих случаях для дифференциальной диагностики необходимо проводить комплексное инструментальное обследование. В настоящее время хорошо известно, что успехи клинической диагностики опухолей основываются на комплексном использовании различных методов исследования. Постоянно совершенствующимся методом диагностики является ультразвуковое исследование. Его достоинствами являются высокая разрешающая способность, быстрота постановки диагноза и безвредность.
Так, известен способ диагностики злокачественных новообразований (а.с.№1639242, МПК G01N 33/49), который заключается в проведении двукратного ультразвукового облучения плазмы в течение трех минут. В этом диагностическом методе перед первым облучением регистрируют уровень темнового тока, а второе облучение начинают при достижении плазмой исходного уровня темнового тока, затем определяют площади интенсивностей свечения первого и второго пика. Злокачественное новообразование диагностируют при соотношении пиков 2,5 и более.
Недостатками данного изобретения является значительное увеличение времени исследования, а длительное воздействие ультразвука на исследуемый образец плазмы крови приводит к перегреву и частой деструкции, что увеличивает число ошибочных диагнозов. Также при применении указанного способа высока вероятность ошибок из-за неконтролируемых всплесков свечения, возникающих в начале первого воздействия ультразвука на исследуемую жидкость, это приводит к гипердиагностике рака. Кроме того, в этом способе отсутствует контроль температуры, что также может приводить к большим погрешностям в диагностике.
Другой способ выявления злокачественных новообразований (RU №2077269, кл. A61B 8/00, G01N 33/49) основан на ультразвуковом облучении эталонной жидкости и плазмы крови, включающий определение времени убывания интенсивности свечения от момента максимальной интенсивности до исходного уровня. При этом дополнительно измеряют дискретное изменение интенсивности свечения во времени, график полученной зависимости аппроксимируют двумя пересекающимися прямыми, по которым определяют время нарастания интенсивности от исходного уровня до максимального и максимальное значение интенсивности, затем определяют среднюю скорость нарастания интенсивности свечения плазмы в соответствии с представленными математическими выражениями, при этом в качестве эталонной жидкости используется буферный раствор.
Недостатками указанного способа являются жестко установленная зависимость между временем нарастания интенсивности свечения и температурой исследуемой жидкости, что приводит к ошибкам диагностики, так как для одной и той же жидкости при различных температурах определено различное время нарастания. Кроме того, в данном способе температура жидкости не контролируется, а время убывания свечения до исходного значения определяется интенсивностью ультразвука, чувствительностью фотоприемника и помехозащищенностью ультразвуковой ячейки. Также метод не позволяет фиксировать высоту столба жидкости, что приводит к различному соотношению стационарной/динамической ультразвуковой волны и, тем самым, к различному характеру свечения, не имеющего отношения к индивидуальным диагностическим свойствам исследуемой жидкости. Высока вероятность ошибок из-за неконтролируемых всплесков свечения, возникающих в начале первого воздействия ультразвука на исследуемую жидкость, приводит к гипердиагностике рака, что также является ограничением этого метода. В способе отмечено значительное увеличение времени проведения диагностики, что неприемлемо при проведении массовых измерений.
Существующие на сегодняшний день инструментальные методы обследования и сопряженные с ними диагностические процедуры не являются совершенными. Основными методами скрининга являются клинический осмотр и биопсия.
Биопсия, предоставляет возможность определения типов клеток, подверженных пролиферации, гистологических характеристик, генетических повреждений и других особенностей, связанных с развитием онкологического процесса. Однако метод биопсийного исследования ограничен неопределенной интерпретацией результатов, неэффективен на ранней стадии заболевания, а также является инвазивным методом, который вызывает дискомфорт у пациента. В настоящее время диагностика глиомы в основном ограничивается визуализацией, включая магниторезонансную и компьютерную томографии, которые обычно проводятся, когда заболевание находится поздней стадии [Lai N.S., et al. (2015) Br. J. Cancer, 112(7), 1241-1246.]. МРТ является дорогостоящим диагностическим методом, кроме того абсолютными противопоказаниями к проведению МРТ является присутствие в теле пациента кардиостимулятора или других программируемых имплантированных устройств. Пациентам, которые страдают клаустрофобией (боязнью закрытых пространств) также не рекомендуют использование МРТ, поскольку панические приступы во время нахождения в тоннеле аппарата могут не позволить провести исследование.
Большинство белковых маркеров присутствуют в крови в низкой (менее 10-13 М) и ультранизкой концентрации (менее 10-15 М) [Lisitsa A.V., Ponomarenko E.A., Lokhov P.G., Archakov A.I. Postgenomic Medicine: Alternative to Biomarkers. Annals of the Russian Academy of Medical Sciences. 2016;71(3):255-260]. Так, исследования по валидации биомаркера для диагностики опухоли мозга были проведены многими научными группами и достигли достаточного прогресса [Lai N.S., et al. (2015) Br. J. Cancer, 112(7), 1241-1246., Westphal M., Lamszus K. (2015) Nat. Rev. Neurol., 11(10), 556-566.]. Тем не менее, нет исследований, направленных на поиск потенциальных биомаркеров для диагностики и прогноза развития заболевания после терапии, особенно после лучевой терапии, которая является одной из важных стратегий лечения глиомы. Циркулирующие опухолевые биомолекулы, включая ДНК и белки, являются многообещающими маркерами в диагностике глиомы, но чувствительность этих маркеров низкая [Wei X, Chen D, Lv T, Li G, Qu S (2016), Mol. Neurobiol., 53(1), 163-170].
Применение стандартных иммуногистохимических, иммуноаффинных методов (ИФА) в клинической диагностике ограничено для высокочувствительной белковой регистрации вследствие их: (1) низкой концентрационной чувствительности, не менее 10-13-10-14 моль/л, (2) необходимостью использования ферментных и флуоресцентных меток; (3) зачастую невозможностью проводить мультиплексные анализы нескольких серологических маркеров; (4) высокой стоимостью используемых реагентов и оборудования.
Часто большая часть идентифицированных белков не является продуктом опухолевых клеток, а относится к неспецифическим белкам воспаления. Так, несмотря на широкое распространение в практическом здравоохранении использование анализа на простат-специфичный антиген, этот тест зачастую приводит к ложноположительной диагностике из-за его недостаточной специфичности [Lead time and overdiagnosis in prostate-specific antigen screening: importance of methods and context. Draisma G., et. al. J Natl Cancer Inst 2009; 101: 374-383]. Поэтому вопрос использования этих белков в качестве онкомаркеров является дискуссионным.
Близким к вышеописанным методам ранней диагностики онкопатологий является метод, основанный на использовании нанопроволочного чипа к биосенсору, описанный в [Attomolar detection of extracellular microRNAs released from living prostate cancer cells by a plasmonic nanowire interstice sensor. Siyeong Ya., et. al. Nanoscale, 2017; 9: 17387-17395]. Однако это устройство позволяет проводить диагностику опухолевых заболеваний только по анализу клеток. Невозможность использования крови для определение микроРНК является недостатком этого метода, поскольку получение крови менее болезненно, чем биопсия. Кроме того, в работе использован подход на основе плазменного резонанса, что требует для регистрации раковых клеток использование дополнительных дорогостоящих оптических элементов.
Биосенсор, содержащего нанопроволоки из полианилина, также, может быть, использован для диагностики [Detection of MicroRNAs Using Target-Guided Formation of Conducting Polymer Nanowires in Nanogaps. Yi Fan. et al. J. AM. CHEM. SOC., 2007; 129(17): 5437-5443]. Однако полианилиновые нанопроволоки, которые являются полимерами, недостаточно стойки к внешним условиям. Более того, этот сенсор позволяет проводить анализ только раковых клеток, а не крови пациента.
Как правило, для нанопроволочной детекции молекул, ассоциированных с развитием онкологических заболеваний, обычно используется микроРНК (миРНК) как ранний маркер развития заболевания. Однако недостаток использования миРНК для диагностики рака заключается в том, что миРНК являются короткими молекулами (18-22 нуклеотидов), которые дают возможность регистрировать маркеры заболевания, но с недостаточно высокой чувствительностью, которая требуется для ранней диагностики.
Способ, продемонстрировавший возможность специфичной детекции миРНК-126 (маркера рака легких) в клеточной культуре при концентрации 10-16 М с помощью нанопроволочного биосенсора описан в работе [Multiplexed detection of lung cancer biomarkers in patients serum with CMOS-compatible silicon nanowire arrays. Gao A. et al. Biosensors and Bioelectronics.2017; 91: 482-488].
Прототипом настоящего изобретения является способ диагностики онкологических заболеваний, включающий регистрацию миРНК, содержащихся в крови пациента с диагнозом рак молочной железы или рак яичников. Регистрацию миРНК проводят с использованием нанопроволочного чипа (НП-чип), на поверхности которого ковалентно иммобилизуют совокупность ДНК-олигонуклеотидных зондов, комплементарных к миРНК, ассоциированным с развитием рака молочной железы или рака яичников. Такой НП-чип инкубируют с в образце, содержащем миРНК, выделенных из плазмы крови пациента. При этом образуются комплексы между иммобилизованными ДНК зондами и специфичными им миРНК. Это событие сопровождается изменением величины тока, протекающего через сенсорные элементы НП-чипа. (RU 2696114, кл. А61В 8/08, опубл. 31.07.2019 г.)
Данный способ выявления микроРНК имеет следующие недостатки: (1) небольшая длина нуклеотидной последовательности микроРНК, (2) небольшой отрицательный заряд микроРНК, определяемый суммарным зарядом нуклеотидов, входящих в эту нуклеиновую кислоту, (3) влияние целого спектра объектов с разным зарядовым состоянием в растворе биологической жидкости.
Техническим результатом предлагаемого в настоящем изобретении способа ранней диагностики глиомы является обеспечение надежности диагностики при повышении чувствительности и быстродействия на уровне нескольких минут.
Для достижения заявленного технического результата предлагается способ ранней диагностики глиомы, включающий выбор последовательности ДНК-олигонуклеотидных зондов
5’-(NH2)-(T)10GGGTGGGCAGGGAGGGTGGAGCGGGTT
TGTTCCAAGTGCCCCAGCCTCTC,
или
5’-(NH2)-(T)10ACACTGAGGGCGGTGACCCCATCCTC
CGCTGGGTCCCGATAGAGCTCGCT,
или
5’-(NH2)-(T)10AAAGCGCGGACGTGAGGCAGCAGTGCC
TCGATGAACGGGTGGAACTCATC,
комплементарной к участкам кольцевой РНК, ассоциированной с развитием глиомы, и последующую регистрацию кольцевой РНК, циркулирующей в крови пациента, с помощью биосенсора нанопроволочного чипа по изменению тока, протекающего через биосенсор, в момент образования после инкубации поверхности нанопроволочного чипа в образце крови пациента, комплексов между указанными последовательностями ДНК-олигонуклеотидных зондов, и комплементарными им участками кольцевой РНК.
НП-чип к биосенсору содержит на своей поверхности массив нанопроволок, которые являются чувствительными элементами. Особенностью сформированных нанопроволок является использование встроенного оксида кремния, кремниевой подложки в качестве подзатворного диэлектрика и тылового затвора, который регулирует чувствительность прибора. Эти составляющие обеспечивают нанопроволочные структуры функциями полевого транзистора.
НП-чип был изготовлен с помощью CMOS (complementary metal-oxide-semiconductor) технологии построения электронных схем со структурой металл-диэлектрик-полупроводник методом газофазного восстановления и литографии. Такой биосенсор характеризуется чувствительностью на субфемтомолярном уровне, быстродействием - порядка нескольких минут, низкой чувствительностью к контаминациям.
Кольцевая РНК (кРНК) принадлежит к классу некодирующих РНК, которые в отличие от линейных РНК образуют ковалентно замкнутые кольца. Они отвечают за ошибки в сплайсинге и рассматриваются как низкосодержащиеся, но имеющие важные функции в регуляции генов.
Также кРНК привлекают внимание тем, что могут быть использованы как биомаркеры для диагностики и определения стадии таких патологий как рак предстательной железы, рак желудка, колоректальный рак, рак мочевого пузыря и др. [Li, Y.; Zheng, Q.; Bao, Ch.; Li, Sh.; Guo, W.; Zhao, J.; Chen, D.; Gu, J.; He, X.; Huang, Sh. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Research 2015, 25, 981-984.; Xia, Q.; Ding, T.; Zhang, G.; Li, Z.; Zeng, L.; Zhu, Y.; Guo, J.; Hou, J.; Zhu, T.; Zheng, J.; Wang, J. Circular RNA Expression Profiling Identifies Prostate Cancer- Specific circRNAs in Prostate Cancer.Cell. Physiol. Biochem 2018, 50(5), 1903-1915].
Еще одним преимуществом использования кРНК для диагностики онкологических заболеваний является их стабильность. Структура кРНК имеет высокой консервативной последовательностью и поэтому обладает пониженной способностью к деградации рибонуклеазами по сравнению с длинными линейными РНК молекулами.
В известных способах в качестве молекул-зондов используется олигонуклеотидные зонды, в частности РНК или ДНК фрагменты, которые наиболее распространены для производства диагностических систем. Однако РНК-зонды характеризуются невысокой стабильностью к воздействию внешних условий, в частности к процедуре отмывки поверхности чипа от молекул партнеров. Поэтому при изготовлении стабильных НП-чипов, предназначенных для многоразового использования, вместо РНК-зондов, в предлагаемом способе ранней диагностики онкологических заболеваний используются ДНК-олигонуклеотиды (о-ДНК), так как они обладают повышенной стабильностью к воздействию внешних условий. НП-чип к биосенсору содержит на своей поверхности массив ннопроволок, которые являются чувствительными элементами. Особенностью сформированных нанопроволок является использование встроенного оксида кремния, кремниевой подложки в качестве подзатворного диэлектрика и тылового затвора, который регулирует чувствительность прибора.
Эти составляющие обеспечивают нанопроволочные структуры функциями полевого транзистора.
НП-чип был изготовлен с помощью CMOS (complementary metal-oxide-semiconductor) технологии построения электронных схем со структурой металл-диэлектрик-полупроводник методом газофазного восстановления и литографии. Такой биосенсор характеризуется чувствительностью на субфемтомолярном уровне, быстродействием - порядка нескольких минут, низкой чувствительностью к контаминациям.
Особенностью и существенными признаками предлагаемого способа как необходимого условия проведения ранней диагностики гликомы является:
- выбор последовательности о-ДНК-зондов, комплементарной к участкам кРНК, непосредственно выделенной из крови пациента;
- использование биоспецифических участков кРНК, выделенной из образца крови пациента, ассоциированной с развитием глиомы;
- иммобилизация на поверхности НП-чипа выбранных о-ДНК-зондов;
- образование комплексов между биоспецифическими участками кРНК и иммобилизованными на поверхности НП-чипа молекулами о-ДНК-зондами;
- измерение сигнала изменения тока, протекающего через чувствительные элементы НП-чипа, в момент образования комплексов между иммобилизованными на их поверхности молекулами о-ДНК-зондами и биоспецифичными участкам кРНК.
Предлагаемая в настоящем изобретении диагностическая тест-система выявления кРНК, ассоциированного с развитием глиомы, позволяет повысить чувствительность обнаружения циркулирующей в крови кРНК как минимум до уровня 10-15 М (без амплификации), что соответствует ранней стадии развития онкопатологии за короткий промежуток времени - порядка десяти минут.
Проведенный анализ уровня техники показал, что в современных диагностических тест-системах онкологических заболеваний не использованы технические решения с использованием биоспецифичных участков кРНК в качестве маркеров онкологического заболевания, таким образом, предлагаемое техническое решение, соответствует критерию «новизна».
При анализе известных аналогов не обнаружены предложения, включающих совокупность существенных признаков, изложенных в формуле изобретения, из чего следует, что для специалистов, занимающихся диагностикой онкологических заболеваний, оно явным образом не следует из уровня техники и, следовательно, соответствует критерию «изобретательский уровень».
ПРИМЕР 1.
Способ ранней диагностики онкологического заболевания – глиомы осуществлялся следующим образом.
Для подготовки НП-чипа экспериментально выбиралась последовательность о-ДНК-зондов, комплементарная последовательности кРНК, циркулирующей в крови пациента с предполагаемым диагнозом глиома (табл. 1).
Таблица 1
Наименование ДНК-олигонуклеотидов |
Последовательность ДНК-олигонуклеотида |
«probe_1» | 5’-(NH2)-(T)10GGGTGGGCAGGGAGGGTGGAGCGGGTT TGTTCCAAGTGCCCCAGCCTCTC |
«probe_2» | 5’-(NH2)-(T)10ACACTGAGGGCGGTGACCCCATCCTC CGCTGGGTCCCGATAGAGCTCGCT |
«probe_3» | 5’-(NH2)-(T)10AAAGCGCGGACGTGAGGCAGCAGTGCC TCGATGAACGGGTGGAACTCATC |
Для функционализации НП-чипа с помощью бифункционального кросс-линкера на основе сукцинимидного эфира проводилась ковалентная иммобилизация на поверхность нанопроволок оДНК-зондов – «probе_1», «probе_2», «probe_3». (табл.1).
Выделение кРНК из плазмы крови пациента проводили с использованием набора ExtractRNA (Евроген, ВС032). Реагент в составе набора представляет собой монофазный водный раствор фенола и гуанидин-изо-тиоцианата и служит для быстрого лизиса клеток. Это не исключает использование и другого способа безгуанидинового выделения кРНК из крови, например, на основе фенол-хлороформной экстракции или фенольной экстракции.
Электрические измерения проводились с помощью 10-ти канальной системы сбора и сохранения данных на основе аналого-цифрового преобразователя. Во время измерений поверхность нанопровлочных структур чипа была использована в качестве управляющего электрода (затвора транзистора). В предлагаемом способе использовались НП-чипы n-типа проводимости.
Комплементарные к о-ДНК зондам последовательности кРНК приведены в табл. 2.
Таблица 2
Наименование ДНК-олигонуклеотидов |
Соответствующая кРНК |
«cs_1» | Circ-SHKBP1 [He QR, Zhao LN, Liu YH, Liu XB, Zheng J, Yu H, et al Circ-SHKBP1 regulates the angiogenesis of U87 glioma-exposed endothelial cells through miR-544a/FOXP1 and miR-379/FOXP2 pathways. Mol Ther Nucleic Acids. 2018;10:331–48] |
«cs_2» | circRNA CIRCNFIX [Xu HY, Zhang Y, Qi L, Ding LJ, Jiang H, Yu HQ NFIX circular RNA promotes glioma progression by regulating miR-34a-5p via notch signaling pathway. Front Mol Neurosci. 2018;11:225] |
«cs_3» | Hsa_circ_0074362 [Song XF, Zhang NB, Han P, Moon BS, Lai RK, Wang K, et al Circular RNA profile in gliomas revealed by identification tool UROBORUS. Nucleic Acids Res. 2016;44:e87] |
Непосредственно предлагаемый способ ранней диагностики глиомы осуществлялся следующим образом.
В буферный раствор (7 мкл), содержащий кРНК, выделенные из плазмы крови пациента с диагнозом глиома, добавляли в измерительную кювету, содержащую 100 мкл буферного раствора. Поверхность НП-чипа была иммобилизирована олигонуклеотидным зондом «probe_1» (табл.1).
Временные зависимости тока Ids(t) регистрировались при напряжении на затворе транзисторов Vg=50 В и напряжении исток-сток Vds=0,1 В в режиме реального времени. Полученные результаты представлялись в виде зависимостей Ids(t), отражающих разностный сигнал между рабочим (с иммобилизованным о-ДНК зондом - «probe_1») и контрольным (не содержащим молекул-зондов) НП-чипа биосенсора ((Ids).
Результаты предлагаемого способа при использовании НП-чипа приведены на рисунке 1, где кривая 1 показывает изменение сигнала тока, соответствующего диагностике образца 1 (табл.3), полученного от пациента с предполагаемым диагнозом глиома (черная линия, маркер ■), а кривая 2 - изменение сигнала тока, соответствующего диагностике образца 36 (талб. 3), полученного от здорового добровольца (черная линия, маркер •). Стрелками указано добавление раствора с кРНК (а) и отмывочного буферного раствора(в).
Характеристика обследованных пациентов с выявленным онкологическим заболеванием - глиомой приведена в таблице 3. Пациенты после обследования с помощью предлагаемого способа проходили стандартное обследование в клинике, где им ставился окончательный диагноз, приведенный в таблице 3 в колонке “Стадия”.
Таблица 3
НП-сенсор | |||||
Образец | Патология | Стадия | «probe 1» | «probe 2» | «probe 3» |
№1 | глиома | 1 | + | + | + |
№2 | глиома | 1 | + | + | + |
№36 | здоровый доброволец | - | - | - | - |
№37 | здоровый доброволец | - | - | - | - |
«+» - есть сигнал; «-» - нет сигнала |
--->
Перечень последовательностей нуклеодитов кольцевой РНК
<110> Federalnoe gosudarstvennoe biudzhetnoe nauchnoe uchrezhdenie
Nauchno-issledovatelskii institut biomeditsinskoi khimii imeni
V N Orekhovicha IBMKH
<120> Sposob diagnostiki gliomy
<140> 2021113365
<141> 08.09.2021
<400>
SEQ ID 1
GTCCAGGAGGTGCAGCCCATCACCAGTTATGACGCGGCAGGCTCCTTCCTCCTC
CTGGGCTGCAACAACGGCTCCATTTACTACGTGGGTGAGCAGCAGCCTGTGTCCC
GGGTGCCCGAGACCCTCCCCTGGGAGAGGGGAAGGGAGGGAGAGAGGCTGGGGC
ACTTGGAACAAACCCGCTCCACCCTCCCTGCCCACCCCAGATGTGCAGAAGTTCCC
CTTGCGCATGAAAGACAACGACCTCCTTGTCAGCGAGCTCTATCGGGACCCAGCGG
AGGATGGGGTCACCGCCCTCAGTGTCTACCTCACCCCCAAGACCA (151-201)
SEQ ID 2
GTCCAGGAGGTGCAGCCCATCACCAGTTATGACGCGGCAGGCTCCTTCCTCCT
CCTGGGCTGCAACAACGGCTCCATTTACTACGTGGGTGAGCAGCAGCCTGTGTC
CCGGGTGCCCGAGACCCTCCCCTGGGAGAGGGGAAGGGAGGGAGAGAGGCTGGG
GCACTTGGAACAAACCCGCTCCACCCTCCCTGCCCACCCCAGATGTGCAGAAGTTC
CCCTTGCGCATGAAAGACAACGACCTCCTTGTCAGCGAGCTCTATCGGGACCCAG
CGGAGGATGGGGTCACCGCCCTCAGTGTCTACCTCACCCCCAAGACCA (251-351)
SEQ ID 3
GATGAGTTCCACCCGTTCATCGAGGCACTGCTGCCTCACGTCCGCGCTTTCTC
CTACACCTGGTTCAACCTGCAGGCGCGGAAGCGCAAGTACTTCAAGAAGCATGA
AAAGCGGATGTCGAAGGACGAGGAGCGGGCGGTGAAGGACGAGCTGCTGGGCGA
AAGCCCGAGATCAAGCAGAAGTGGGCATCCCGGCTGCTGGCCAAGCTGCGCAAG
GACATCCGGCCCGAGTTCCGCGAGGACTTCGTGCTGACCATCACGGGCAAGAAGCC
CCCCTGCTGCGTGCTCTCCAACCCCGACCAGAAGGGCAAGATCCGGCGGATTGAC
TGCCTGCGCCAGGCTGACAAGGTGTGGCGGCTGGACCTGGTCATGGTGATTTTGTTT
AAGGGGATCCCCCTGGAAAGTACTGATGGGGAGCGGCTCTACAAGTCGCCTCAGTG
CTCGAACCCCGGCCTGTGCGTCCAGCCACATCACATTGGAGTCACAATCAAAGAAC
TGGATCTTTATCTGGCTTACTTTGTCCACACTCCGG (1-50)
Последовательности нуклеотидов участка кольцевой РНК,комплементарные
последовательности кольцевой РНК, циркулирующей в крови пациента
с предполагаемым диагнозом глиома
<110> Federalnoe gosudarstvennoe biudzhetnoe nauchnoe uchrezhdenie
Nauchno-issledovatelskii institut biomeditsinskoi khimii imeni
V N Orekhovicha IBMKH
<120> Sposob diagnostiki gliomy
<140> 2021113365
<141> 08.09.2021
<400>
SEQ ID 1 GAGAGGCTGGGGCACTTGGAACAAACCCGCTCCACCCTCCCTGCCCACCC (151-201)
SEQ ID 2 AGCGAGCTCTATCGGGACCCAGCGGAGGATGGGGTCACCGCCCTCAGTGT (251-351)
SEQ ID 3 GATGAGTTCCACCCGTTCATCGAGGCACTGCTGCCTCACGTCCGCGCTTT (1-50)
<---
Claims (10)
- Способ ранней диагностики глиомы, включающий выбор последовательности ДНК-олигонуклеотидных зондов
- 5'-(NH2)-(T)10GGGTGGGCAGGGAGGGTGGAGCGGGTT
- TGTTCCAAGTGCCCCAGCCTCTC,
- или
- 5'-(NH2)-(T)10ACACTGAGGGCGGTGACCCCATCCTC
- CGCTGGGTCCCGATAGAGCTCGCT,
- или
- 5'-(NH2)-(T)10AAAGCGCGGACGTGAGGCAGCAGTGCC
- TCGATGAACGGGTGGAACTCATC,
- комплементарной к участкам кольцевой РНК, ассоциированной с развитием глиомы, и последующую регистрацию кольцевой РНК, циркулирующей в крови пациента, с помощью биосенсора нанопроволочного чипа по изменению тока, протекающего через биосенсор, в момент образования после инкубации поверхности нанопроволочного чипа в образце крови пациента комплексов между указанными последовательностями ДНК-олигонуклеотидных зондов и комплементарными им участками кольцевой РНК.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2772193C1 true RU2772193C1 (ru) | 2022-05-18 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2922861A1 (en) * | 2012-11-26 | 2015-09-30 | Caris Science Inc. | Biomarker compositions and methods |
RU2696114C2 (ru) * | 2017-12-27 | 2019-07-31 | Общество с ограниченной ответственностью "ПостгенТех" (ООО "ПостгенТех") | Способ диагностики рака молочной железы и рака яичников |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2922861A1 (en) * | 2012-11-26 | 2015-09-30 | Caris Science Inc. | Biomarker compositions and methods |
RU2696114C2 (ru) * | 2017-12-27 | 2019-07-31 | Общество с ограниченной ответственностью "ПостгенТех" (ООО "ПостгенТех") | Способ диагностики рака молочной железы и рака яичников |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MALSAGOVA K.A. et al. SOI-Nanowire Biosensor for the Detection of Glioma-Associated miRNAs in Plasma. Chemosensors. 2020 October 2; 8(4): 95. SUN J. et al. Functions and clinical significance of circular RNAs in glioma. Mol Cancer. 2020; 19: 34. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2612482T3 (es) | Marcadores en la orina para la detección del cáncer de vejiga | |
Chung et al. | GLUT1 gene is a potential hypoxic marker in colorectal cancer patients | |
US20230127823A1 (en) | Non-Invasive Gene Mutation Detection in Lung Cancer Patients | |
JP2012526544A5 (ru) | ||
CN111662982B (zh) | 用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测的生物标志物及其应用 | |
CN111826466B (zh) | 乙型肝炎感染患者或携带者外泌体miRNA分子标志物组合及筛查试剂盒 | |
Kamer et al. | Predicting brain metastasis in early stage non-small cell lung cancer patients by gene expression profiling | |
Bauman et al. | Strategies, considerations, and recent advancements in the development of liquid biopsy for glioblastoma: A step towards individualized medicine in glioblastoma | |
RU2772193C1 (ru) | Способ ранней диагностики глиомы | |
RU2696114C2 (ru) | Способ диагностики рака молочной железы и рака яичников | |
KR20130022204A (ko) | 유방암 진단을 위한 엑소좀 내의 ANT2 mRNA의 이용방법 | |
Kim et al. | For physicians managing voiding dysfunction, improving the detection rate of early prostate cancer and discrimination from benign prostatic hyperplasia, in a molecular biomarker aspects | |
JP7226732B2 (ja) | 尿中腫瘍マーカーによるがん検出方法、キット及び装置 | |
CN112534068A (zh) | 使用液体活检多种癌基因生物标志物的乳腺癌早期诊断及治疗后监测的方法 | |
Tipatet et al. | Detection of acquired radioresistance in breast cancer cell lines using Raman spectroscopy and machine learning | |
ES2799973A1 (es) | Panel de metabolitos como biomarcadores para el diagnostico de cancer de pancreas | |
CN112129954B (zh) | Mmp7、ctse或lamc2蛋白在制备肝内胆管细胞癌诊断试剂中的应用 | |
Kraaijpoel et al. | Novel biomarkers to detect occult cancer in patients with unprovoked venous thromboembolism: Rationale and design of the PLATO-VTE study | |
ES2856232B2 (es) | Biomarcadores para predecir la respuesta de un sujeto a una terapia con bcg, metodos y usos basados en los mismos | |
RU2790290C1 (ru) | Способ ранней диагностики онкологического заболевания | |
Deig et al. | Blood-based nucleic acid biomarkers as a potential tool to determine radiation therapy response in non-small cell lung cancer | |
Mokni et al. | Review on recent advances in urinary biomarkers based electrochemical sensors for prostate cancer detection | |
Shao et al. | Aptamer-Based Functionalized SERS Biosensor for Rapid and Ultrasensitive Detection of Gastric Cancer-Related Biomarkers | |
US20150011411A1 (en) | Biomarkers of cancer | |
Ivanov et al. | Nanoribbon Biosensor for Detection of microRNA Associated with Prostate Cancer in Humans |