RU2769836C2 - Способ получения биологического образца для исследования методом сканирующей зондовой нанотомографии - Google Patents
Способ получения биологического образца для исследования методом сканирующей зондовой нанотомографии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2769836C2 RU2769836C2 RU2020124899A RU2020124899A RU2769836C2 RU 2769836 C2 RU2769836 C2 RU 2769836C2 RU 2020124899 A RU2020124899 A RU 2020124899A RU 2020124899 A RU2020124899 A RU 2020124899A RU 2769836 C2 RU2769836 C2 RU 2769836C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biological sample
- substrate
- silk fibroin
- pouring
- scanning probe
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/36—Embedding or analogous mounting of samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N23/00—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00
- G01N23/02—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by transmitting the radiation through the material
- G01N23/04—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by transmitting the radiation through the material and forming images of the material
- G01N23/046—Investigating or analysing materials by the use of wave or particle radiation, e.g. X-rays or neutrons, not covered by groups G01N3/00 – G01N17/00, G01N21/00 or G01N22/00 by transmitting the radiation through the material and forming images of the material using tomography, e.g. computed tomography [CT]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Radiology & Medical Imaging (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области нанотехнологии и может быть использовано для получения биологических образцов для исследований методом сканирующей зондовой нанотомографии (СЗНТ). Способ получения биологического образца для исследования методом сканирующей зондовой нанотомографии включает заливку биологического образца в полимерную среду. При этом заливку биологического образца проводят на подложке в виде пленки из фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori толщиной 1-100 мкм, содержащей 5-100% фиброина шелка по массе. Изобретение обеспечивает сокращение времени получения биологического образца для исследований методом СЗНТ за счет сокращения манипуляций путем использования оригинальной подложки при заливке биологических образцов в полимерную среду; сохранение целостности и структуры биологического образца за счет обеспечения его адгезии в процессе заливки в полимерную среду путем использования оригинальной подложки, обладающей необходимым запасом механической прочности; обеспечение достаточного уровня биосовместимости подложки для получения образцов клеток млекопитающего за счет возможности культивирования клеток на подложке. 1 з.п. ф-лы, 4 ил.
Description
Изобретение относится к области нанотехнологии и может быть использовано для получения биологических образцов для исследований методом сканирующей зондовой нанотомографии (СЗНТ).
Известен способ получения биологических образцов для исследований методом СЗНТ, включающий дегидратацию образцов с последующей заливкой в пластиковой ячейке для заливки образцов в полимерную среду, представляющую собой смесь смол с дальнейшей полимеризацией до твердого состояния [Luft J Н., Improvements in ероху resin embedding methods. The Journal of biophysical and biochemical cytology, vol. 9,2 (1961): 409-14. doi:10.1083/jcb.9.2.409]. После отвердевания полимерной среды образец отделяют от ячейки и исследуют методом СЗНТ.
Недостаток этого способа заключается в том, что в процессе отвердевания образец может оседать на дно ячейки, что может приводить к повреждению образца при отделении от поверхности ячейки, а, следовательно, к нарушению его структуры. Некоторые разновидности биологических образцов, такие как микроносители, микрочастицы, суспензии, необходимо позиционировать на подложках для их концентрирования в процессе получения образца, однако известный способ не включает в себя использование такой подложки.
Для исследования биологических образцов клеток зачастую необходимо адгезировать их на поверхности посуды для культивирования клеток, а затем производить заливку в полимерную среду.
Однако в этом случае для каждой задачи необходимо подбирать посуду, которая не будет разрушаться от воздействия дегидратирующих агентов, но в то же время будет позволять осуществление всех необходимых манипуляций при культивировании и заливке в полимерную среду, а также позволять отделение залитого образца от поверхности посуды без возможности его повреждений.
Это приводит к многостадийности процесса получения биологического образца, что может привести к гибели клеток в составе биологического образца или образованию артефактов в ходе заливки в полимерную среду и получению недостоверных данных в ходе анализа.
Техническая проблема заключается в необходимости создания универсальной и механически прочной подложки для заливки биологических образцов в полимерную среду, которая может обеспечивать как правильное позиционирование биологических образцов в процессе заливки, так и адгезию биологических образцов и структур в их составе.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в
- сокращении времени получения биологического образца для исследований методом СЗНТ за счет сокращения манипуляций путем использования оригинальной подложки при заливке биологических образцов в полимерную среду;
- сохранении целостности и структуры биологического образца за счет обеспечения его адгезии в процессе заливки в полимерную среду путем использования оригинальной подложки, обладающей необходимым запасом механической прочности;
- обеспечении достаточного уровня биосовместимости подложки для получения образцов клеток млекопитающего за счет возможности культивирования клеток на подложке.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Заливку биологического образца в полимерную среду проводят на подложке в виде пленки из фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori толщиной 1-100 мкм, содержащей 5-100% фиброина шелка по массе.
Существует вариант, в котором пленка из фиброина шелка дополнительно содержит добавку в количестве до 95% по массе.
Существует вариант, в котором для получения биологического образца, содержащего клетки млекопитающего, их предварительно культивируют на подложке в виде пленки из фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori толщиной 1-100 мкм, содержащей 5-100% фиброина шелка по массе.
Изобретение поясняются следующими фигурами.
На Фиг. 1 изображена подложка из фиброина шелка, полученная методом полива водного раствора фиброина шелка на поверхности полированного тефлона.
На Фиг. 2 изображена подложка из фиброина шелка, покрытая раствором коллагена, иммобилизованная на поверхности пластика.
На Фиг. 3 представлено изображение гепатоцита, полученное методом сканирующей зондовой микроскопии, адгезированного на подложке из фиброина шелка, полученное методом сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ), размер скана 32×15 мкм2, диапазон вариации высоты 40 нм, размерный отрезок 4 мкм, стрелкой указана подложка из фиброина шелка.
На Фиг. 4 представлена трехмерная СЗНТ-реконструкция гепатоцита, адгезированного на подложке из фиброина шелка, 32.0×15.0×2.8 мкм3, толщина среза 200 нм, размерный отрезок 5 мкм.
Способ получения биологического образца для исследований методом СЗНТ осуществляется следующим образом.
Заливку биологических образцов в полимерную среду производят на подложке в виде пленки из фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori толщиной 1-100 мкм, содержащей 5-100% фиброина шелка по массе (фиг. 1). Для этого в пластиковую ячейку для заливки помещают пленку из фиброина шелка, проводят дегидратацию биологического образца и заливку в полимерную среду.
Кроме этого существует вариант, в котором пленка из фиброина шелка дополнительно содержит добавку в количестве до 95% по массе. Для этого в состав пленки из фиброина шелка вводят добавку путем введения в раствор фиброина шелка, из которого получают пленку, этого вещества в сухом виде или в виде раствора и перемешивают, например, с помощью автоматической пипетки или магнитной мешалки. Затем из раствора получают пленку, которую помещают в пластиковую ячейку для заливки и проводят дегидратацию биологического образца и заливку в полимерную среду. В качестве добавки могут быть использованы, например, вещества, повышающие адгезию клеток (коллаген - фиг. 2, желатин, фибронектин и др.), вещества, регулирующие скорость деградации (хитозан, поликапролактон и др.), добавки, изменяющие пористость и шероховатость пленки (микрочастицы, наночастицы и др.), различные низкомолекулярные вещества (соли, оксиды и др.).
Кроме этого существует вариант, в котором для получения биологических образцов, содержащих клетки млекопитающего, их предварительно культивируют на подложке из фиброина шелка. Для этого пленку из фиброина шелка размещают на поверхности посуды для культивирования клеток или помещают в среду инкубации.
Перед выполнением исследований методом СЗНТ могут быть осуществлены предварительные срезы полученного биологического образца в требуемой плоскости при помощи ультрамикротома. Толщина срезов может лежать в диапазоне от 10 до 1000 нм. Полученные срезы и поверхность образца могут быть также исследованы с применением методов сканирующей зондовой оптической нанотомографии (как показано, например, в RU 2680726, С1), сканирующей зондовой микроскопии, электронной и флуоресцентной оптической микроскопии.
Образец для исследования методом СЗНТ получали следующим образом.
Подложку на основе фиброина шелка получали на поверхности чашки Петри диаметром 5 см. Для этого выделяли фиброин шелка из шелковых нитей 4-0 (Моснитки, Россия). Навеску шелка из нитей массой 1 г кипятили на водяной бане в 500 мл бидистиллированной воды с добавлением 1260 мг соды в течение 40 минут. Затем промывали 3,6 л дистиллированной воды. Далее трижды кипятили в 500 мл бидистиллированной воды 30 минут, промывая 3,6 л дистиллированной воды после каждого кипячения. Очищенный фиброин шелка сушили на воздухе при комнатной температуре. Далее получали водный раствор фиброина шелка. Для этого в раствор, приготовленный из расчета 389 мг CaCl2, 388 мкл C2H5OH и 544 мкл H2O на 1 мл раствора, вносили навеску фиброина массой 130 мг/мл. Нагревали на водяной бане при 40°С в течение 4 часов. После чего производили диализ раствора против бидистиллированной воды, в данном примере было проведено 5 смен диализа по 30 минут. Полученный после диализа водный раствор фиброина шелка наносили на дно чашки Петри и высушивали при комнатной температуре. Высушенный фиброин шелка растворяли в муравьиной кислоте из расчета 20 мг/мл при нагревании до 40°С на водяной бане в течение 30 минут. Полученный раствор наносили на дно чашек Петри диаметром 5 см из расчета 5 мл на чашку и высушивали в течение двух суток при комнатной температуре. После высыхания раствора фиброина шелка на дно чашки Петри наносили по 1 мл раствора фибронектина с концентрацией 10 мкг/мл для повышения адгезии клеток и высушивали в течение двух суток при комнатной температуре.
Таким образом, получали подложку толщиной 1 мкм для подготовки образца гепатоцитов крысы породы Wistar. В чашке Петри с подложкой проводили выделение первичной культуры гепатоцитов крысы породы Wistar. Изолированные гепатоциты инкубировали в термостате при температуре 37°С и 5% углекислого газа в течение 24 часов. Затем проводили заливку образцов в полимерную среду (эпоксидную смолу). Для этого из чашки Петри отбирали среду инкубации и производили две короткие отмывки стерильным 0,9% раствором хлорида натрия. После этого в чашку Петри вносили 2,5% раствор глутарового альдегида в натрий-фосфатном буфере (рН=7,4) и инкубировали в течение 2 часов в темноте при +4°С и двукратно отмывали стерильным 0,9% раствором хлорида натрия. Затем производили дегидратацию гепатоцитов проводкой по спиртам с увеличивающейся концентрацией по схеме:
а) р-р этанола 30% - 10 мин;
б) р-р этанола 50% - 10 мин;
в) р-р этанола 70% - 10 мин;
г) р-р этанола 80% - 10 мин;
д) р-р этанола 96% - 10 мин.
Образец отмывали трехкратно 100% этиловым спиртом по 10 минут, а затем инкубировали в смеси 100% этилового спирта и эпоксидной смолы в соотношении 1:1 в течение 30 минут, после чего образец переносили в смесь 100% этилового спирта и эпоксидной смолы в соотношении 1:2 и инкубировали в течение 30 минут. Для заливки образцов использовалась эпоксидная среда (Ероху Embedding Medium kit, Sigma-Aldrich, Cat. №45359-1EA-F). Образец заключали в эпоксидную среду, инкубировали в термостате при 45°С в течение 24 часов, после чего продолжали инкубацию в течение 72 часов при температуре 60°С. Затем образец гепатоцитов на подложке в эпоксидной смоле отделяли от дна чашки Петри с помощью скальпеля.
После отделения залитых в эпоксидную среду образцов клеток выполнялась локализация гепатоцитов с помощью флуоресцентного микроскопа. Затем выполнялись первичные срезы образца ультрамикротомом в плоскости, перпендикулярной плоскости образца и при помощи флуоресцентной микроскопии измерялось расстояние от плоскости среза до изучаемого скаффолда. В соответствии с выполненными измерениями производилась последовательность срезов образца контролируемой толщины.
На фиг. 3 приведено изображение образца гепатоцита, полученное методом сканирующей зондовой микроскопии, стрелка указывает на подложку из фиброина шелка. Для оценки трехмерной морфологии гепатоцита, адгезированного на подложке из фиброина шелка в виде пленки была выполнена трехмерная реконструкция фрагмента клетки при помощи метода СЗНТ. Для этого было выполнено 14 последовательных срезов образца толщиной 200 нм и получено 14 последовательных СЗМ-изображений участка скаффолда размером 32×16 мкм2. Полученная визуализация трехмерной структуры гепатоцита показана на фиг. 4.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет обеспечить правильное позиционирование биологического образца в процессе заливки и адгезию биологических структур в его составе при значительном сокращении количества манипуляций с биологическим образцом и сохранении его целостности.
Claims (2)
1. Способ получения биологического образца для исследования методом сканирующей зондовой нанотомографии, включающий заливку биологического образца в полимерную среду, отличающийся тем, что заливку биологического образца проводят на подложке в виде пленки из фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori толщиной 1-100 мкм, содержащей 5-100% фиброина шелка по массе.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для получения биологического образца, содержащего клетки млекопитающего, их предварительно культивируют на подложке в виде пленки из фиброина шелка тутового шелкопряда Bombyx mori толщиной 1-100 мкм, содержащей 5-100% фиброина шелка по массе.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020124899A RU2769836C2 (ru) | 2020-07-27 | 2020-07-27 | Способ получения биологического образца для исследования методом сканирующей зондовой нанотомографии |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020124899A RU2769836C2 (ru) | 2020-07-27 | 2020-07-27 | Способ получения биологического образца для исследования методом сканирующей зондовой нанотомографии |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2020124899A3 RU2020124899A3 (ru) | 2022-01-27 |
| RU2020124899A RU2020124899A (ru) | 2022-01-27 |
| RU2769836C2 true RU2769836C2 (ru) | 2022-04-06 |
Family
ID=80445067
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020124899A RU2769836C2 (ru) | 2020-07-27 | 2020-07-27 | Способ получения биологического образца для исследования методом сканирующей зондовой нанотомографии |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2769836C2 (ru) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2443805C1 (ru) * | 2010-08-20 | 2012-02-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный университет технологии и дизайна" (СПГУТД) | Способ получения пленки на основе фиброина шелка для изготовления контактных линз |
-
2020
- 2020-07-27 RU RU2020124899A patent/RU2769836C2/ru active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2443805C1 (ru) * | 2010-08-20 | 2012-02-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный университет технологии и дизайна" (СПГУТД) | Способ получения пленки на основе фиброина шелка для изготовления контактных линз |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ЕФИМОВ А.Е. ТРЕХМЕРНЫЙ АНАЛИЗ МИКРО- И НАНОСТРУКТУРЫ БИОМАТЕРИАЛОВ, КЛЕТОК И ТКАНЕЙ МЕТОДОМ СКАНИРУЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ НАНОТОМОГРАФИИ / Диссертация на соиск. уч. степ. д.б.н., Москва, 2018. * |
| ЕФИМОВ А.Е. ТРЕХМЕРНЫЙ АНАЛИЗ МИКРО- И НАНОСТРУКТУРЫ БИОМАТЕРИАЛОВ, КЛЕТОК И ТКАНЕЙ МЕТОДОМ СКАНИРУЮЩЕЙ ЗОНДОВОЙ НАНОТОМОГРАФИИ / Диссертация на соиск. уч. степ. д.б.н., Москва, 2018. САФОНОВА Л.А. Разработка и исследование 2D и 3D биодеградируемых скаффолдов на основе фиброина шелка для регенеративной медицины / Диссертация на соиск. уч. степ. к.б.н., Москва, 2019. САФОНОВА Л.А. и др. ПЛЕНКИ НА ОСНОВЕ ФИБРОИНА ШЕЛКА ДЛЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ ПОЛНОСЛОЙНОЙ РАНЫ КОЖИ У КРЫС / ВЕСТНИК ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ, 2016, том XVIII, N 3, стр. 74-84. САФОНОВА Л.А. и др. Биологические свойства пленок из регенерированного фиброина шелка / Современные технологии в медицине, 2015, том 7, N 3, стр. 6-13. * |
| САФОНОВА Л.А. и др. Биологические свойства пленок из регенерированного фиброина шелка / Современные технологии в медицине, 2015, том 7, N 3, стр. 6-13. * |
| САФОНОВА Л.А. и др. ПЛЕНКИ НА ОСНОВЕ ФИБРОИНА ШЕЛКА ДЛЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ ПОЛНОСЛОЙНОЙ РАНЫ КОЖИ У КРЫС / ВЕСТНИК ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ И ИСКУССТВЕННЫХ ОРГАНОВ, 2016, том XVIII, N 3, стр. 74-84. * |
| САФОНОВА Л.А. Разработка и исследование 2D и 3D биодеградируемых скаффолдов на основе фиброина шелка для регенеративной медицины / Диссертация на соиск. уч. степ. к.б.н., Москва, 2019. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2020124899A3 (ru) | 2022-01-27 |
| RU2020124899A (ru) | 2022-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7560050B2 (ja) | 三次元組織体及びその製造方法、並びに、三次元組織体の形成剤 | |
| US4963490A (en) | Porous inorganic membrane support and method | |
| Wang et al. | Human induced pluripotent stem cell-derived beating cardiac tissues on paper | |
| JP2012527283A (ja) | 合成移植片 | |
| JP2012213390A (ja) | コラーゲンゲル膜及び培養容器 | |
| Verma et al. | Three-dimensional multiscale fiber matrices: development and characterization for increased HepG2 functional maintenance for bio-artificial liver application | |
| CN108047482A (zh) | 一种多孔壳聚糖微载体及其制备方法和应用 | |
| RU2769836C2 (ru) | Способ получения биологического образца для исследования методом сканирующей зондовой нанотомографии | |
| RU2766727C2 (ru) | Способ получения биологического образца для исследований методом сканирующей зондовой нанотомографии | |
| CN1587959A (zh) | 基于原子力显微镜观察的生物样品包埋块的制备方法 | |
| Betriu et al. | Culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds | |
| JP2009229339A (ja) | 顕微鏡観察用サンプル作製方法、及びそれに用いるキット | |
| CN114042191A (zh) | 一种细胞打印的成骨功能化支架及其制备方法和应用 | |
| Parisi et al. | Porous yet dense matrices: using ice to shape collagen 3D cell culture systems with increased physiological relevance | |
| JP7416185B2 (ja) | 立体的細胞構造体の製造方法 | |
| RU2740872C1 (ru) | Подложка для исследования биологического образца методом сканирующей зондовой нанотомографии и способ ее получения | |
| Nie et al. | Spheroid formation of human keratinocyte: balancing between cell-substrate and cell-cell interaction | |
| Lim et al. | Spatial distribution of mammalian cells grown on macroporous microcarriers with improved attachment kinetics | |
| RU2732598C1 (ru) | Микроноситель для клеток на основе натурального шелка и способ его получения | |
| CN111334472A (zh) | Pbmc体外3d胶原蛋白水凝胶培养基及其制备方法 | |
| JP2002142752A (ja) | コラーゲンコート細胞培養容器及びその製造方法 | |
| CN115011546B (zh) | 一种鱼类细胞体外三维培养、诱导分化和冷冻保存方法 | |
| CN115109743B (zh) | 一种复合丝素蛋白仿生类肝小叶支架及其制备方法与应用 | |
| RU2793462C1 (ru) | Способ пробоподготовки клеточно-инженерной конструкции на основе полимолочной кислоты и культуры эукариотических клеток для гистологического анализа | |
| CN114107175B (zh) | 一种利用机械拉伸诱导肠类器官生长的类器官培养方法 |