RU2767359C1

RU2767359C1 - Strain "a/chicken/chelyabinsk/314-1/2020 h9n2" of avian influenza virus of genus alphainfluenzavirus of species influenza a virus subtype h9 for control of antigenic and immunogenic activity of vaccines against avian influenza and for production of biopreparations for diagnosis and specific prevention of avian influenza type a subtype h9

Info

Publication number: RU2767359C1
Application number: RU2021113015A
Authority: RU
Inventors: Ольга Сергеевна Осипова; Виктория Юрьевна Сосипаторова; Николай Геннадьевич Зиняков; Марина Алексеевна Волкова; Дмитрий Борисович Андрейчук; Илья Александрович Чвала
Priority date: 2021-05-04
Filing date: 2021-05-04
Publication date: 2022-03-17

Abstract

FIELD: veterinary science; biotechnology.

SUBSTANCE: invention refers to veterinary virology and biotechnology and concerns a novel strain of influenza type A subtype H9 of Orthomyxoviridae family, genus Alphainfluenzavirus, deposited in the collection of FGBI "ARRIAH" under registration number: No. 333 — dep/20-121 — SCMS FGBU "ARRIAH". Proposed strain is reproduced in 11-day-old chicken embryos of SPF chickens, where it reaches an infectious titre of not less than 8.5 lg EID₅₀/cm³. In the composition of the inactivated vaccine, the strain has pronounced antigenic and immunogenic properties, inducing production of specific antibodies trapped in ELISA and RTGA.

EFFECT: disclosed strain can be used to control antigenic and immunogenic activity of avian influenza vaccines, as well as for preparing biopreparations for diagnosis and specific prevention of avian influenza type A subtype H9.

1 cl, 5 tbl, 1 dwg, 5 ex

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к получению нового штамма вируса гриппа птиц подтипа Н9, и может быть использовано для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц подтипа Н9, а также при разработке и изготовлении средств диагностики и специфической профилактики гриппа птиц подтипа Н9.The invention relates to the field of veterinary virology and biotechnology, namely, to obtain a new strain of avian influenza virus subtype H9, and can be used to control the antigenic and immunogenic activity of vaccines against avian influenza subtype H9, as well as in the development and manufacture of diagnostic tools and specific prevention of influenza birds of subtype H9.

Грипп птиц - остро протекающая, высококонтагиозная вирусная болезнь домашних, синантропных и диких птиц, характеризуется септицемией, проявляется угнетением, отеками, поражением органов дыхания и пищеварения [3].Avian influenza is an acute, highly contagious viral disease of domestic, synanthropic and wild birds, characterized by septicemia, manifested by depression, edema, damage to the respiratory and digestive organs [3].

Возбудитель - РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Orthomyxoviridae (по классификации International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) - 00.046), роду Alphainfluenzavirus (ID: 197911 no классификации The National Center for Biotechnology Information (NCBI), к виду Influenza A virus (ID 00.046.0.01.001).The causative agent is an RNA-containing virus belonging to the Orthomyxoviridae family (according to the classification of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) - 00.046), the genus Alphainfluenzavirus (ID: 197911 no classification of The National Center for Biotechnology Information (NCBI), to the species Influenza A virus (ID 00.046.0.01.001).

На сегодняшний день грипп птиц вызывается только вирусом гриппа А, который подразделяется на подтипы на основе антигенных различий двух поверхностных гликопротеинов: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). На данный момент известно 18 гемагглютинирующих (Н1-Н18) и 11 нейраминидазных подтипов (N1-N11) вирусов гриппа А [11].To date, avian influenza is caused only by influenza A virus, which is subdivided into subtypes based on antigenic differences between two surface glycoproteins: hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). Currently, 18 hemagglutinating (H1-H18) and 11 neuraminidase subtypes (N1-N11) of influenza A viruses are known [11].

Вирусы низкопатогенного гриппа птиц подтипа H9N2 показывают практически одинаково низкую патогенность в экспериментальных условиях при тестировании с помощью IVPI, однако в полевых условиях они часто демонстрируют заболеваемость и смертность от средней до высокой степени [13].Low pathogenicity avian influenza viruses of the H9N2 subtype show almost equally low pathogenicity under experimental conditions when tested by IVPI, but in the field they often show moderate to high morbidity and mortality [13].

Способность данных вирусов обмениваться генетическим материалом, повышает вероятность эволюции и появления вирусов с неизвестными свойствами, возможно, с высоким пандемическим потенциалом [2].The ability of these viruses to exchange genetic material increases the likelihood of the evolution and emergence of viruses with unknown properties, possibly with a high pandemic potential [2].

В связи с возможностью инфицирования людей вирусом гриппа птиц подтипа H9N2, Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) уделяет ему пристальное внимание наряду с вирусом гриппа птиц подтипов Н5, Н7, проводит работу по антигенной и генетической характеристике вируса для разработки средств специфической профилактики в целях готовности к возможной пандемии [9, 16].In connection with the possibility of human infection with the H9N2 avian influenza virus, the World Health Organization (WHO) pays close attention to it along with the H5, H7 avian influenza virus subtypes, is working on the antigenic and genetic characterization of the virus in order to develop specific prevention tools in order to be prepared for possible pandemics [9, 16].

Известны штаммы вируса гриппа птиц, выделенные на территории РФ, используемые для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.Known strains of avian influenza virus isolated in the territory of the Russian Federation, used for the manufacture of diagnostic and vaccine preparations.

Известен штамм "НОВОСИБИРСКИЙ" вируса гриппа птиц Influenzae virus avicum для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц [5]. Это производственный штамм вируса гриппа птиц типа А, подтипа H5N1.Known strain "NOVOSIBIRSK" avian influenza virus Influenzae virus avicum to control the immunogenic and antigenic activity of vaccines and the manufacture of biological products for the diagnosis and specific prevention of avian influenza [5]. This is an industrial strain of avian influenza virus type A, subtype H5N1.

Известен штамм A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 вируса гриппа птиц Influenza virus avicum типа А подтипа Н5 для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н5 [6].A strain A/goose/Kalmykia/813/16 H5N8 of the avian influenza virus Influenza virus avicum type A subtype H5 is known to control the antigenic and immunogenic activity of vaccines against avian influenza and for the manufacture of biological products for the diagnosis and specific prevention of avian influenza type A subtype H5 [6] .

Известен штамм A/chiken/Kostroma/3175/17 H5N2 вируса гриппа птиц подтипа H5N2 Infuenza A virus рода Alphainfluenzavirus для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц и для изготовления антигенсодержащих диагностикумов [7].A strain A/chiken/Kostroma/3175/17 H5N2 of the avian influenza virus subtype H5N2 Infuenza A virus of the genus Alphainfluenzavirus is known to control the antigenic and immunogenic activity of avian influenza vaccines and to manufacture antigen-containing diagnosticums [7].

Известен штамм «A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2» вируса гриппа птиц (аналог), выделенный на территории Приморского края. Штамм предназначен для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н9 [8]. Однако указанный штамм имеет следующие недостатки: штамм относится к генетической линии Y280, представители которой широко распространены на территории Китая и Юго-Восточной Азии, но исходя из литературных данных, вирусы H9N2 генетической линии G1 не менее широко распространены [11]. Изоляты этой генетической линии выделяли во многих странах Ближнего Востока, включая Египет, Иран, Израиль, Саудовскую Аравию и Объединенные Арабские Эмираты [12, 17]. Вирус также регулярно изолировали в Ираке, Иордании, Кувейте, Ливане и Омане [14,15]. В РФ за период 2012-2020 гг.вирусы генетической линии G1 выявляли в Амурской области (A/chicken/Amursky/03/12, A/chicken/Amur_Russia/17/2018), Челябинской области (A/chicken/Chelyabinsk/30/2019), Новосибирской области (A/chicken/Siberia/03/2018) и Забайкальском крае (A/chicken/Zabaikal/2137/2019) [1, 4].Known strain "A/chicken/Primorsk/419/2018 H9N2" avian influenza virus (analog), isolated in Primorsky Krai. The strain is designed to control the antigenic and immunogenic activity of vaccines against avian influenza and for the manufacture of biological products for the diagnosis and specific prevention of avian influenza type A subtype H9 [8]. However, this strain has the following disadvantages: the strain belongs to the Y280 genetic line, whose representatives are widespread in China and Southeast Asia, but based on the literature data, H9N2 viruses of the G1 genetic line are no less widespread [11]. Isolates of this genetic line have been isolated in many countries of the Middle East, including Egypt, Iran, Israel, Saudi Arabia, and the United Arab Emirates [12, 17]. The virus has also been routinely isolated in Iraq, Jordan, Kuwait, Lebanon, and Oman [14,15]. In the Russian Federation for the period 2012-2020, G1 genetic lineage viruses were detected in the Amur Region (A/chicken/Amursky/03/12, A/chicken/Amur_Russia/17/2018), Chelyabinsk Region (A/chicken/Chelyabinsk/30/ 2019), Novosibirsk region (A/chicken/Siberia/03/2018) and Trans-Baikal Territory (A/chicken/Zabaikal/2137/2019) [1, 4].

Техническая проблема заключается в расширении арсенала актуальных штаммов вируса гриппа птиц типа А подтипа Н9, циркулирующих на территории РФ, и обладающих инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющих иммуногенные свойства после инактивации, обеспечивая тем самым получение чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов и вакцинных препаратов, создающих эффективную защиту домашней птицы против гомологичного вируса.The technical problem is to expand the arsenal of current strains of avian influenza virus type A subtype H9 circulating in the Russian Federation and possessing infectious, antigenic and immunogenic activity, retaining immunogenic properties after inactivation, thereby ensuring the production of sensitive and highly specific diagnosticums and vaccine preparations that create effective protection of poultry against homologous virus.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцинный штамм A/chicken/Israel/215/2007 H9N2 (Ck/215), относящийся к генетической линии G1 и используемый в Израиле при изготовлении вакцины против низкопатогенного вируса гриппа птиц подтипа Н9 [10]. Однако этот штамм имеет ряд недостатков. Штамм был выделен более десяти лет назад и антигенно отличается от ныне существующих вариантов, а одним из важнейших факторов выбора эффективного штамма для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики, а так же для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против вирусов гриппа птиц является антигенное соответствие между гемагглютининовым белком вакцины и штаммом, циркулирующим в полевых условиях. Штамм A/chicken/Israel/215/2007 H9N2 антигенно отличается от изолятов, циркулирующих на территории РФ.The closest to the proposed invention in terms of essential features is the vaccine strain A/chicken/Israel/215/2007 H9N2 (Ck/215), belonging to the G1 genetic line and used in Israel in the manufacture of a vaccine against low pathogenic avian influenza virus subtype H9 [10]. However, this strain has a number of disadvantages. The strain was isolated more than ten years ago and antigenically differs from the currently existing variants, and one of the most important factors in choosing an effective strain for the manufacture of biological products for diagnostics and specific prevention, as well as for controlling the antigenic and immunogenic activity of vaccines against avian influenza viruses is the antigenic correspondence between the hemagglutinin protein of the vaccine and the strain circulating in the field. The A/chicken/Israel/215/2007 H9N2 strain is antigenically different from the isolates circulating in the Russian Federation.

Указанная проблема решена путем получения штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц, который может использоваться для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц подтипа Н9.This problem was solved by obtaining the A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain of the avian influenza virus, which can be used to control the immunogenic and antigenic activity of vaccines and the manufacture of biological preparations for the diagnosis and specific prevention of H9 subtype avian influenza.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2», был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2020 г. из проб, поступивших с птицефабрики Челябинской области Российской Федерации.The virus isolate, which served as a source for obtaining the A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain, was isolated at the FGBI ARRIAH in 2020 from samples received from a poultry farm in the Chelyabinsk region of the Russian Federation.

В результате вирусовыделения из гомогената внутренних органов кур был получен штамм «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц.As a result of virus isolation from the homogenate of the internal organs of chickens, the strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2" of the avian influenza virus was obtained.

Штамм прошел 3 пассажа на 11-суточных СПФ-куриных эмбрионах. Способен вызывать гибель эмбрионов кур в течение 48-72 ч инкубации.The strain passed 3 passages on 11-day-old SPF-chicken embryos. Able to cause death of chicken embryos within 48-72 hours of incubation.

Подтип H9N2 идентифицирован методами полимеразной цепной реакции (ПЦР), нуклеотидного секвенирования, в РТГА (реакция торможения гемагглютинации) и РИНА (реакция ингибиции нейраминидазной активности).The H9N2 subtype was identified by the polymerase chain reaction (PCR), nucleotide sequencing, RTGA (hemagglutination inhibition test) and RINA (neuraminidase activity inhibition test).

При проведении филогенетического анализа нуклеотидной последовательности фрагмента гена НА участка 1414-1573 п. н. было установлено, что исследуемый изолят «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц принадлежит к генетической линии G1, широко распространенной на территории Ближнего Востока.When conducting a phylogenetic analysis of the nucleotide sequence of the HA gene fragment of the region 1414-1573 bp. It was found that the studied isolate "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2" of the avian influenza virus belongs to the G1 genetic line, which is widespread in the Middle East.

По фрагменту гена НА наиболее генетически близкими оказались последовательности вирусов гриппа птиц подтипа H9N2, выделенные в Израиле (98,2-99,0% совпадений), а также последовательности вирусов гриппа птиц подтипа H9N2, выделенные на территории стран Ближнего Востока (98-99% совпадений).According to the HA gene fragment, the sequences of H9N2 subtype avian influenza viruses isolated in Israel (98.2-99.0% coincidence), as well as the sequences of H9N2 subtype avian influenza viruses isolated in the Middle East (98-99% coincidences).

Сайт расщепления гемагглютинина содержит основные аминокислоты и имеет структуру RSSR/GLF, что позволяет охарактеризовать вирус как потенциально низковирулентный.The hemagglutinin cleavage site contains basic amino acids and has the RSSR/GLF structure, which makes it possible to characterize the virus as potentially low virulent.

Штамм «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц типа А, подтипа H9N2, депонирован 11 декабря 2020 г. в Государственную коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» под регистрационным номером №333 - деп/20-121-ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».The strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2" of avian influenza virus type A, subtype H9N2, was deposited on December 11, 2020 in the State Collection of Microorganism Strains of the Federal Center for Animal Health under registration number No. 333 - deposit /20-121-GKSHM FGBI "ARRIAH".

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц для контроля иммуногенной и антигенной активности вакцин и для приготовления биопрепаратов для специфической профилактики и диагностики гриппа птиц.The possibility of using the A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain of the avian influenza virus to control the immunogenic and antigenic activity of vaccines and to prepare biological preparations for the specific prevention and diagnosis of avian influenza has been experimentally confirmed.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении (фиг. 1). На фиг. 1 представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса гриппа птиц подтипа Н9. Дендрограмма основана на сравнении нуклеотидных последовательностей участка гена гемагглютинина.The essence of the invention is illustrated in the graphic image (Fig. 1). In FIG. Figure 1 shows a dendrogram reflecting the phylogenetic relationships of the A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain with epizootic and vaccine strains of H9 subtype avian influenza virus. The dendrogram is based on a comparison of the nucleotide sequences of the hemagglutinin gene region.

Показано, что исследуемый штамм «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» принадлежит к обширной линии штаммов G1, выявленных на территории стран Ближнего Востока.It was shown that the studied strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2" belongs to an extensive line of G1 strains identified in the Middle East.

Сущность изобретения пояснена следующим перечнем последовательностей:The essence of the invention is illustrated by the following sequence listing:

SEQ ID №1: представляет последовательность нуклеотидов фрагмента гена гемагглютинина штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2»;SEQ ID No. 1: represents the nucleotide sequence of the hemagglutinin gene fragment of the strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2";

SEQ ID №2: представляет последовательность аминокислот фрагмента гемагглютинина штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2».SEQ ID No. 2: represents the amino acid sequence of the hemagglutinin fragment of the strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2".

Исследования основывались на определении первичной структуры фрагмента гена гемагглютинина (НА) испытуемого образца штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» с последующим анализом филогенетического родства с другими штаммами и изолятами вируса гриппа птиц подтипа H9N2. В результате секвенирования была определена нуклеотидная (360 н.о.) и аминокислотная (119 а.о.) последовательности фрагмента гена НА штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2».The studies were based on determining the primary structure of the hemagglutinin (HA) gene fragment of the test sample of the A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain, followed by analysis of phylogenetic relationships with other strains and isolates of the H9N2 subtype avian influenza virus. As a result of sequencing, the nucleotide (360 n.a.) and amino acid (119 a.a.) sequences of the HA gene fragment of the strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2" were determined.

Штамм «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.The A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain of the avian influenza virus is characterized by the following features and properties.

Морфологическая характеристикаMorphological characteristic

Штамм «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Alphainfluenzavirus, виду Influenza A virus, подтипу H9N2 и обладает морфологическими признаками, характерными для вируса гриппа типа А.The A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain of avian influenza virus belongs to the Orthomyxoviridae family, Alphainfluenzavirus genus, Influenza A virus species, H9N2 subtype, and has morphological features characteristic of type A influenza virus.

Вирионы вируса гриппа - оболочечные, плеоморфные. Диаметр сфероподобных частиц около 100 нм; нитевидные частицы около 17 нм в диаметре, длиной 250 нм и более. На поверхности вириона находятся шипообразные выступы (до 14 нм), образованные гомотримерами НА. В промежутках между кластерами НА у вирусов типа А размещаются молекулы NA.Influenza virus virions are enveloped, pleomorphic. The diameter of spherical particles is about 100 nm; filamentous particles about 17 nm in diameter, 250 nm or more in length. On the surface of the virion, there are spike-like protrusions (up to 14 nm) formed by HA homotrimers. NA molecules are located between HA clusters in type A viruses.

Липидная мембрана окружает петлеобразные филаменты нуклеокапсидов с восемью фрагментами вирусного генома, каждый из которых представлен линейной одноцепочечной антисмысловой РНК.The lipid membrane surrounds loop-shaped filaments of nucleocapsids with eight fragments of the viral genome, each of which is represented by a linear single-stranded antisense RNA.

Общая длина генома составляет около 13600 нуклеотидов (нт). Наиболее крупный фрагмент (№1) содержит около 2350 и.о.; №2 - чуть менее 2350 и.о.; №3, как правило, - 2250 и.о.; №4 - 1780 и.о.; №5 - 1575 и.о.; №6 -1420 и.о.; №7 - 1050 и.о.; №8 - 900 н.о.The total length of the genome is about 13,600 nucleotides (nt). The largest fragment (No. 1) contains about 2350 a.i.; No. 2 - a little less than 2350 acting; No. 3, as a rule, - 2250 acting; No. 4 - 1780 acting; No. 5 - 1575 acting; No. 6 -1420 acting; No. 7 - 1050 acting; No. 8 - 900 N.O.

На обоих концах каждой геномной цепи РНК содержатся повторяющиеся отрезки, причем повторы 5'-концевого участка (у вирусов типа А они имеют вид 5'-AGUAGAAACAAGG) комплементарны инвертированным повторам, расположенным на 3'-конце. Кроме того, 3'-концевые участки некоторых фрагментов генома содержат консервативные отрезки, типичные для вирусных штаммов, поражающих субъектов определенного биологического вида [ICTV-International Committee on Taxonomy of Viruses].At both ends of each genomic RNA strand, repeating segments are contained, and the repeats of the 5'-terminal region (in type A viruses they have the form 5'-AGUAGAAACAAGG) are complementary to the inverted repeats located at the 3'-end. In addition, the 3'-terminal regions of some genome fragments contain conservative segments typical of viral strains that infect subjects of a certain biological species [ICTV-International Committee on Taxonomy of Viruses].

Антигенные свойстваAntigenic properties

По своим антигенным свойствам штамм «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц относится к семейству Orthomyxoviridae, роду Alphainfluenzavirus, виду Influenza A virus, типу А, подтипу H9N2.According to its antigenic properties, the strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2" of the avian influenza virus belongs to the family Orthomyxoviridae, genus Alphainfluenzavirus, species Influenza A virus, type A, subtype H9N2.

Гемагглютинирующая активность штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» подавляется специфической сывороткой к вирусу гриппа птиц подтипа H9N2 («IZSVe», Италия), что подтверждает принадлежность штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц к подтипу Н9. Титр специфической сыворотки составил 6 log₂. Нейраминидазная активность штамма подавляется специфической сывороткой к вирусу гриппа птиц (ВГП) подтипа H5N2 («IZSVe», Италия).The hemagglutinating activity of the strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2" is suppressed by specific serum to the avian influenza virus subtype H9N2 ("IZSVe", Italy), which confirms the belonging of the strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2" avian influenza virus subtype H9. The specific serum titer was 6 log ₂ . The neuraminidase activity of the strain is inhibited by specific serum to the avian influenza virus (AIV) subtype H5N2 (IZSVe, Italy).

Биотехнологические свойстваBiotechnological properties

Инактивированный вирус индуцирует антитела, выявляемые методами реакции торможения гемагглютинирующей активности (РТГА). Так, через 14 суток после однократной иммунизации цыплят инактивированной вакциной из штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц в прививном объеме 0,5 см³/гол средний титр антител по группе к НА, обеспечивающим реакцию торможения гемагглютинации, составил 3,8 log₂ (таблица 5).The inactivated virus induces antibodies detected by the hemagglutination inhibition test (HITA). So, 14 days after a single immunization of chickens with an inactivated vaccine from the A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain of the avian influenza virus in an inoculation volume ^of 0.5 cm inhibition of hemagglutination, amounted to 3.8 log ₂ (table 5).

Гено- и хемотаксономическая характеристикиGeno- and chemotaxonomic characteristics

Штамм «A/chicken/Chelyabinsky314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц типа А подтипа Н9 является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 250×10⁶ Д.The A/chicken/Chelyabinsky314-1/2020 H9N2 strain of avian influenza virus type A subtype H9 is an RNA-containing virus with a molecular weight of 250×10 ⁶ D.

Геном вируса гриппа представлен однонитевой РНК негативной полярности в виде 8 нитей (сегментов) в комплексе с белком нуклеопротеина (NP).The genome of the influenza virus is represented by single-stranded RNA of negative polarity in the form of 8 strands (segments) in complex with a nucleoprotein (NP) protein.

Вирионы вируса гриппа имеют наружную липопротеиновую оболочку, чаще сферической формы. Диаметр сферических форм около 100 нм. Вирусные частицы содержат РНК - 1%, белки - 70%, жиры - 20%, углеводы - до 8%.Influenza virus virions have an outer lipoprotein envelope, often spherical in shape. The diameter of the spherical shapes is about 100 nm. Virus particles contain RNA - 1%, proteins - 70%, fats - 20%, carbohydrates - up to 8%.

Антигенная вариабельность и таксономическая классификация вируса основана на идентификации двух основных поверхностных белков -гемагглютинина и нейраминидазы.The antigenic variability and taxonomic classification of the virus is based on the identification of two major surface proteins, hemagglutinin and neuraminidase.

Устойчивость к внешним факторамResistance to external factors

Штамм «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса ГП чувствителен к детергентам, формальдегиду, бета-пропиолактону, производным азиридина, быстро инактивируется при прогревании (56°С), ультрафиолетовом облучении и при рН ниже 5,0.The strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2" of the HP virus is sensitive to detergents, formaldehyde, beta-propiolactone, aziridine derivatives, and is quickly inactivated upon heating (56°C), ultraviolet irradiation and at pH below 5.0.

Дополнительные признаки и свойстваAdditional features and properties

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.Immunogenic activity - immunogenic as part of an inactivated vaccine.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает. Иммунизация цыплят дозой, в два раза превышающей прививную, не вызывает видимых клинических изменений в общем состоянии птицы, а также локальных поражений ткани в месте введения.Reactogenicity - does not possess reactogenic properties. Immunization of chickens with a dose twice the vaccination dose does not cause visible clinical changes in the general condition of the bird, as well as local tissue lesions at the injection site.

Патогенные свойстваPathogenic properties

Вирулентность - низкая (не вызывает гибель зараженной птицы в дозе 10^7,0 ЭЛД₅₀).Virulence - low (does not cause the death of an infected bird at a dose of 10 ^7.0 ELD ₅₀ ).

Контагиозность - контагиозен. Неиммунные цыплята заражаются при совместном содержании с зараженными.Contagious - contagious. Non-immune chickens become infected when kept together with infected ones.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.The essence of the invention is illustrated by examples of its use, which do not limit the scope of the invention.

Пример 1.Example 1

Определение подтиповой антигенной характеристики штамма проводили с помощью перекрестной реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и реакции ингибиции нейраминидазной активности (РИНА) с референтными гипериммунными сыворотками к антителам 16 Н-типов вируса гриппа птиц и с референтными сыворотками против гриппа птиц подтипов N1-N2 по нейраминидазе. Образцы вирусной суспензии исследовали предварительно в реакции гемагглютинации (РГА) для определения гемагглютинирующей активности вируса. Активность штамма вируса гриппа птиц «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» в РГА составила 8 log₂. В качестве отрицательного контроля использовали нормальную сыворотку крови кур производства ФГБУ «ВНИИЗЖ». Результаты представлены в таблице 1 и таблице 2.Determination of the subtype antigenic characteristics of the strain was carried out using a cross-reaction of hemagglutination inhibition (HAI) and the reaction of inhibition of neuraminidase activity (RINA) with reference hyperimmune sera to antibodies of 16 H-types of avian influenza virus and with reference sera against avian influenza subtypes N1-N2 for neuraminidase. Samples of the viral suspension were preliminarily examined in the hemagglutination test (HHA) to determine the hemagglutination activity of the virus. The activity of the avian influenza virus strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2" in the RHA was 8 log ₂ . As a negative control, we used normal blood serum of chickens produced by the Federal State Budgetary Institution "ARRIAH". The results are presented in table 1 and table 2.

В РТГА гемагглютинирующая активность испытуемого образца подавлялась специфической сывороткой к вирусу гриппа птиц подтипа H9N2 («IZSVe», Италия), что подтверждает принадлежность образца штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц к подтипу Н9. Титр сыворотки составил 6 log₂.In RTGA, the hemagglutination activity of the test sample was suppressed by a specific serum for the H9N2 subtype avian influenza virus (IZSVe, Italy), which confirms that the sample of the A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain of the avian influenza virus belongs to the H9 subtype. Serum titer was 6 log ₂ .

В РИНА нейраминидазная активность испытуемого образца подавлялась специфической сывороткой к вирусу гриппа птиц подтипа H5N2 («IZSVe», Италия).In the RINA, the neuraminidase activity of the test sample was suppressed by a specific serum for the H5N2 subtype avian influenza virus (IZSVe, Italy).

Согласно результатам серологических исследований штамм «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» был отнесен к вирусу гриппа птиц подтипа H9N2.According to the results of serological studies, the A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain was assigned to the H9N2 subtype avian influenza virus.

Также для подтиповой принадлежности штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» проводили молекулярно-биологические исследования экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ), полученной от зараженных данным штаммом свободных от специфической патогенной микрофлоры куриных эмбрионов (СПФ-КЭ). Для этого выделяли общую РНК, которую использовали для постановки обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Первичную индикацию гена М проводили методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ), используя праймеры M25F, M124R и флуоресцентно-меченный олигонуклеотидный зонд М64. С помощью классической ОТ-ПЦР амплифицировали фрагмент гена НА. Методом секвенирования была определена нуклеотидная последовательность фрагмента (360 н. о.) гена НА штамма вируса гриппа птиц «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» и соответствующая ей аминокислотная последовательность (119 а. о.). Было установлено, что по фрагменту гена НА к штамму вируса гриппа птиц «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» наиболее близкими оказались последовательности вирусов гриппа А птиц подтипа Н9, выделенные ранее на территории стран Ближнего Востока (98-99% совпадений).Also, for the subtype of the strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2", molecular biological studies of extraembryonic fluid (EEF) obtained from chicken embryos free from specific pathogenic microflora (SPF-CE) infected with this strain were performed. To do this, total RNA was isolated, which was used to set up the reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Primary indication of the M gene was performed by real-time RT-PCR (RT-PCR-RT) using primers M25F, M124R and fluorescently labeled oligonucleotide probe M64. A fragment of the HA gene was amplified using classical RT-PCR. The nucleotide sequence of the fragment (360 bp) of the HA gene of the avian influenza virus strain A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 and the corresponding amino acid sequence (119 bp) were determined by sequencing. It was found that, according to the HA gene fragment, the sequences of H9 subtype avian influenza A viruses previously isolated in the Middle East (98-99% coincidences).

Таким образом, на основании серологических и молекулярно-биологических исследований установлена принадлежность штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» к семейству Orthomyxoviridae, роду Alphainfluenzavirus, виду Influenza A virus, типу А, подтипу H9N2.Thus, based on serological and molecular biological studies, the strain “A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2” was established to belong to the family Orthomyxoviridae, genus Alphainfluenzavirus, species Influenza A virus, type A, subtype H9N2.

Пример 2.Example 2

Для использования штаммов вируса в качестве контрольных штаммов при заражении в целях контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, а также для использования в качестве диагностического и производственного необходимо получить штамм вируса с высокой инфекционной активностью. Для определения инфекционной активности штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц из вирусного материала готовили ряд десятикратных последовательных разведений (от 10^-1 до 10^-10). Каждое разведение вируса инокулировали в аллантоисную полость четырем 11-суточным СПФ-куриным эмбрионам (КЭ) в объеме 0,2 см³. Четырем эмбрионам контрольной группы вводили ФБР тем же способом в объеме 0,2 см³. Специфичность гибели подтверждали в реакции гемагглютинирующей активности (РГА) исследованием экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ) от каждого зараженного эмбриона. Титр вируса в образце определяли по методу Кербера и выражали в единицах ЭИД₅₀/см³ (таблица 3).To use virus strains as control strains during infection in order to control the antigenic and immunogenic activity of vaccines, as well as for use as a diagnostic and production one, it is necessary to obtain a virus strain with high infectious activity. To determine the infectious activity of the strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2" of the avian influenza virus, a series of ten-fold serial dilutions (from 10 ^-1 to 10 ^-10 ) was prepared from the viral material. Each dilution of the virus was inoculated into the allantoic cavity of four 11-day-old SPF-chicken embryos (CE) in a volume of 0.2 cm ³ . Four embryos of the control group were injected with PBS in the same way in a volume of 0.2 cm ³ . The specificity of death was confirmed in the hemagglutination activity test (HA) by examining the extraembryonic fluid (EEF) from each infected embryo. The titer of the virus in the sample was determined by the method of Kerber and expressed in units of EID ₅₀ /cm ³ (table 3).

Таким образом, инфекционная (in vivo) активность штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц при 10-кратном титровании в СПФ-КЭ составила 8,5 lg ЭИД₅₀/см³.Thus, the infectious (in vivo) activity of the strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2" of the avian influenza virus during 10-fold titration in SPF-CE was 8.5 lg EID ₅₀ /cm ³ .

Пример 3.Example 3

Для использования штамма для контроля антигенной и иммуногенной активности, а так же для приготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц подтипа Н9 необходимо получить штамм, свободный от контаминации чужеродными вирусами, бактериями и грибами. Подтверждение отсутствия контаминации бактериальной и грибной микрофлорой проводили в соответствии с ГОСТ 28085 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности». Отсутствие контаминации микоплазмами проводили в соответствии с требованиями ГФ XIV, том 1, с. 1201-1222.To use the strain to control antigenic and immunogenic activity, as well as to prepare biopreparations for the diagnosis and specific prevention of H9 subtype avian influenza, it is necessary to obtain a strain free from contamination by foreign viruses, bacteria and fungi. Confirmation of the absence of contamination by bacterial and fungal microflora was carried out in accordance with GOST 28085 “Biological medicinal products for veterinary use. Method of bacteriological control of sterility. The absence of contamination with mycoplasmas was carried out in accordance with the requirements of the Global Fund XIV, volume 1, p. 1201-1222.

В результате исследований установлено, что штамм «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц не контаминирован бактериями, грибами и микоплазмами. В результате испытаний с применением методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) было установлено, что штамм «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц не контаминирован вирусами ньюкаслской болезни (НБ), инфекционного бронхита кур (ИБК), инфекционного ларинготрахеита птиц (ИЛТ), инфекционной бурсальной болезни (ИББ), реовирусом птиц и содержит в своем составе только геном вируса гриппа птиц типа А подтипа H9N2.As a result of the research, it was found that the A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain of the avian influenza virus is not contaminated with bacteria, fungi and mycoplasmas. As a result of tests using polymerase chain reaction (PCR) and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), it was found that the A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain of avian influenza virus was not contaminated with Newcastle influenza viruses. diseases (NB), infectious bronchitis of chickens (IBK), infectious avian laryngotracheitis (ILT), infectious bursal disease (IBD), avian reovirus and contains only the genome of the avian influenza virus type A subtype H9N2.

Пример 4.Example 4

Патогенные свойства штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц изучали на цыплятах 30-суточного возраста. В опыте использовали птицу яичного кросса. Штамм «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц вводили цыплятам внутримышечно в объеме 0,5 см³ с инфекционной активностью 106 ЭИД50/см³. В результате у цыплят наблюдали характерные клинические признаки заболевания (угнетенное состояние, взъерошенность оперения, отказ от корма и т.д.), гибели зараженной птицы не было отмечено.The pathogenic properties of the A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain of avian influenza virus were studied in 30-day-old chickens. An egg cross bird was used in the experiment. The A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain of avian influenza virus was injected intramuscularly into chickens in a volume of 0.5 cm ³ with an infectious activity of 106 EID50/cm ³ . As a result, typical clinical signs of the disease were observed in chickens (depression, ruffled plumage, refusal to feed, etc.), and no death of the infected bird was noted.

Таким образом, штамм «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц является низковирулентным.Thus, the A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain of the avian influenza virus is low virulent.

Пример 5.Example 5

Для получения иммунных сывороток крови к штамму «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» приготовили вакцину, содержащую в качестве основного компонента данный штамм (предлагаемое изобретение). Для изготовления вакцины использовали адъювант Montanide ISA 70 (SEPPIC, Франция). Для приготовления антигена использовали экстраэмбриональную жидкость СПФ-КЭ зараженных штаммом «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» с инфекционной активностью 8,5 ЭИД₅₀/см³, при этом гемагглютинирующая активность составляла значение 6 log₂. Для инактивации инфекционных свойств вируса гриппа птиц использовали бета-пропиолактон (БПЛ). Для этого из исходного раствора БПЛ готовили 10%-ный рабочий раствор на стерильной деминерализованной воде. В сосуд с вируссодержащей жидкостью вносили рабочий раствор БПЛ до конечной концентрации 0,05%. Сосуд с содержимым инкубировали при температуре (18-26)°С в течение 24 ч при постоянном перемешивании на шейкере. После окончания процесса инактивации вирусный материал помещали в холодильник (4-8)°С, предварительно из сосуда отбирали пробу материала в объеме 5,0 см³ для проведения исследований по определению полноты инактивации вируса и стерильности материала. После подтверждения полноты инактивации готовили серию лабораторного образца вакцины. Для этого смешивали 30 частей антигена с заданными характеристиками и 70 частей адъюванта. Содержание антигенного материала и масляного адъюванта в прививной дозе вакцины в соотношении 30:70 является оптимальным, так как обеспечивает толерантную презентацию антигена в организме иммунизированной птицы. Эмульсию получали на гомогенизаторе при 3000 об/мин. Иммунизацию 30-суточного возраста цыплят проводили внутримышечно в прививном объеме 0,5 см³ на голову. На 14 и 42 сутки после вакцинации у иммунизированных птиц отбирали кровь и исследовали на наличие специфических антител к вирусу гриппа птиц типа А подтипа Н9 в ИФА и РТГА (таблица 4, 5).To obtain immune blood sera against the strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2", a vaccine was prepared containing this strain as the main component (the proposed invention). The adjuvant Montanide ISA 70 (SEPPIC, France) was used to manufacture the vaccine. To prepare the antigen, the extraembryonic fluid of SPF-CE infected with the A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain with an infectious activity of 8.5 EID ₅₀ /cm ³ was used, while the hemagglutination activity was 6 log ₂ . Beta-propiolactone (BPL) was used to inactivate the infectious properties of the avian influenza virus. For this purpose, a 10% working solution in sterile demineralized water was prepared from the initial LPL solution. The working solution of BPL was added to the vessel with the virus-containing liquid to a final concentration of 0.05%. The vessel with the contents was incubated at a temperature of (18-26)°C for 24 h with constant stirring on a shaker. After the end of the inactivation process, the viral material was placed in a refrigerator (4-8)°C; a sample of the material in a volume of 5.0 cm ³ was previously taken from the vessel to conduct studies to determine the completeness of the virus inactivation and the sterility of the material. After confirming the completeness of inactivation, a series of laboratory samples of the vaccine was prepared. To do this, 30 parts of the antigen with the desired characteristics and 70 parts of the adjuvant were mixed. The content of antigenic material and oil adjuvant in the inoculation dose of the vaccine in the ratio of 30:70 is optimal, as it ensures tolerant presentation of the antigen in the body of the immunized bird. The emulsion was obtained on a homogenizer at 3000 rpm. Immunization of 30-day-old chickens was carried out intramuscularly in a grafting volume of 0.5 cm ³ per head. On days 14 and 42 after vaccination, blood was taken from immunized birds and examined for the presence of specific antibodies to the avian influenza virus type A subtype H9 in ELISA and RTGA (table 4, 5).

Результаты исследований свидетельствуют о выраженной антигенной активности лабораторного образца вакцины на основе штамма «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц рода Alphainfluenzavirus вида Influenza A virus подтипа Н9, т.к. установлено наличие специфических антител к вирусу гриппа подтипа H9N2 в ИФА и антигемагглютининов к вирусу гриппа птиц подтипа H9N2 в РТГА.The results of the studies indicate a pronounced antigenic activity of the laboratory sample of the vaccine based on the A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain of the avian influenza virus of the genus Alphainfluenzavirus of the species Influenza A virus subtype H9, because the presence of specific antibodies to the influenza virus subtype H9N2 in ELISA and antihemagglutinins to the avian influenza virus subtype H9N2 in RTHA were established.

Таким образом, заявляемый штамм «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц рода Alphainfluenzavirus вида Influenza A virus подтипа Н9 необходим для создания диагностических препаратов, используемых при типировании новых вирусных вариантов, оценки активности противовирусных препаратов и эффективности вакцин, а так же для создания биопрепаратов для специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н9.Thus, the claimed strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2" of the avian influenza virus of the genus Alphainfluenzavirus of the species Influenza A virus subtype H9 is necessary to create diagnostic preparations used in typing new viral variants, assess the activity of antiviral drugs and the effectiveness of vaccines , as well as for the creation of biological products for the specific prevention of avian influenza type A subtype H9.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Штамм «A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2» вируса гриппа птиц рода Alphainfluenzavirus вида Influenza A virus подтипа H9 для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин против гриппа птиц и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики гриппа птиц типа А подтипа Н9»:Sources of information taken into account when compiling the description of the invention to the application for the issuance of a patent of the Russian Federation for the invention "Strain "A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2" of the avian influenza virus of the genus Alphainfluenzavirus of the species Influenza A virus subtype H9 to control antigenic and immunogenic activity of vaccines against avian influenza and for the manufacture of biological products for the diagnosis and specific prevention of avian influenza type A subtype H9":

1. Анализ генетических свойств изолята вируса гриппа A/Chicken/Chelyabinsk/30/2019 H9N2, выделенного на территории Челябинской области / Н.Г. Зиняков, О. С.Осипова, П. Б. Акшалова и др. // Ветеринария сегодня. - 2019. - №4 (31). - С.49-53.1. Analysis of the genetic properties of the A/Chicken/Chelyabinsk/30/2019 H9N2 influenza virus isolate isolated in the Chelyabinsk region / N.G. Zinyakov, O. S. Osipova, P. B. Akshalova et al. // Veterinary science today. - 2019. - No. 4 (31). - P.49-53.

2. Низкопатогенный грипп птиц, вызванный вирусом подтипа Н9. Обзор литературы. / Варкентин А.В., Волков М.С., Ирза В.Н. - В.: Труды федерального центра охраны здоровья животных, 2014, Т.12 (1). С. 41-53.2. Low pathogenic avian influenza caused by the H9 subtype virus. Literature review. / Varkentin A.V., Volkov M.S., Irza V.N. - V .: Proceedings of the Federal Center for Animal Health, 2014, V.12 (1). pp. 41-53.

3. Ортомиксовирусы. Руководство по вирусологии. / Каверин Н.В., Львов Д.К., Щелканов М.Ю. - М.: МИА, 2013, С.307 - 313.3. Orthomyxoviruses. Guide to Virology. / Kaverin N.V., Lvov D.K., Shchelkanov M.Yu. - M.: MIA, 2013, S.307 - 313.

4. О распространении вируса низкопатогенного гриппа A/H9N2 в мире и на территории Российской Федерации. Проблемы искоренения болезни / М.С. Волков, А.В. Варкентин, В.Н. Ирза // ВетС.- 2019. - №3. - С.51-55.4. On the spread of the low pathogenic influenza A/H9N2 virus in the world and on the territory of the Russian Federation. Problems of disease eradication / M.S. Volkov, A.V. Varkentin, V.N. Irza // VetS. - 2019. - No. 3. - P.51-55.

5. Патент РФ №2323740, МПК А61К 39/145, C12N 7/00, 2006 г. 5. RF patent No. 2323740, IPC A61K 39/145, C12N 7/00, 2006

6. Патент РФ №2647566, МПК А61К 39/145, C12N 7/00, 2017 г. 6. RF patent No. 2647566, IPC A61K 39/145, C12N 7/00, 2017

7. Патент РФ №2736788, МПК C12N 7/00, 2020 г. 7. RF patent No. 2736788, IPC C12N 7/00, 2020

8. Патент РФ №2736786, МПК C12N 7/00, 2020 г. 8. RF patent No. 2736786, IPC C12N 7/00, 2020

9. Antigenic and genetic characteristics of zoonotic influenza A viruses and development of candidate vaccine viruses for pandemic preparedness. -URL:https://www.who.int/influenza/vaccines/virus/202103_zoonotic_vaccinevirus update.pdf (дата обращения 11.03.21).9. Antigenic and genetic characteristics of zoonotic influenza A viruses and development of candidate vaccine viruses for pandemic preparedness. -URL: https://www.who.int/influenza/vaccines/virus/202103_zoonotic_vaccinevirus update.pdf (accessed 03/11/21).

10. Antigenic Cartography of H9 Avian Influenza Virus and Its Application to Vaccine Selection/ Y.Wang, I. Davidson, R. Fouchier, E. Spackman - Avian Diseases, 2015. Vol.60(ls). -P.218-225.10. Antigenic Cartography of H9 Avian Influenza Virus and Its Application to Vaccine Selection/ Y. Wang, I. Davidson, R. Fouchier, E. Spackman - Avian Diseases, 2015. Vol.60(ls). -P.218-225.

11. A Global Perspective on H9N2 Avian Influenza Virus / T. P. Peacock, J. James, J. E. Sealy and M. Iqbal. - Viruses, 2019. Vol.11.- P. 620-628.11. A Global Perspective on H9N2 Avian Influenza Virus / T. P. Peacock, J. James, J. E. Sealy and M. Iqbal. - Viruses, 2019. Vol.11.- P. 620-628.

12. Characterization of avian H9N2 influenza viruses from United Arab Emirates 2000 to 2003/ Aamir U.B., Wernery U., Ilyushina, N., Webster R.G.// Virology.- 2007.- Vol.361.- P. 45-55.12. Characterization of avian H9N2 influenza viruses from United Arab Emirates 2000 to 2003/ Aamir U.B., Wernery U., Ilyushina, N., Webster R.G.// Virology.- 2007.- Vol.361.- P. 45-55.

13. Epidemiological survey and genetic evolution of H9 subtype influenza viruses in Shanghai, China, from 2006 to 2010 / J.P. Zhou, F.F. Ge, J. Liu [et al.] // Arch. Virology. - 2012. - Vol.157. - P. 1193-1198.13. Epidemiological survey and genetic evolution of H9 subtype influenza viruses in Shanghai, China, from 2006 to 2010 / J.P. Zhou, F.F. Ge, J. Liu [et al.] // Arch. Virology. - 2012. - Vol.157. - P. 1193-1198.

14. Genetic analysis of H9N2 avian influenza viruses circulated in broiler flocks: Acase study in Iraq in 2014-2015/ Kraidi Q.A., Madadgar O., Ghalyanchi Langeroudi A., Karimi V. // Virus Genes. -2017.-Vol.53- P. 205-214.14. Genetic analysis of H9N2 avian influenza viruses circulated in broiler flocks: A case study in Iraq in 2014-2015/ Kraidi Q.A., Madadgar O., Ghalyanchi Langeroudi A., Karimi V. // Virus Genes. -2017.-Vol.53-P. 205-214.

15. Genetic comparison of H9N2 AI viruses isolated in Jordan in 2003/ Monne I., Cattoli G., Mazzacan E. [et al] //Avian Dis.- 2007.- Vol.51.-P. 451-454.15. Genetic comparison of H9N2 AI viruses isolated in Jordan in 2003/ Monne I., Cattoli G., Mazzacan E. [et al] //Avian Dis.- 2007.- Vol.51.-P. 451-454.

16. Infection with avian influenza viruses / OIE. Terrestrial Animal Health Code, 2019. Chapter 10.4. - URL: https://www.oie.int/standard-setting/terrestrial-code/access-online (дата обращения 11.03.21).16. Infection with avian influenza viruses / OIE. Terrestrial Animal Health Code, 2019. Chapter 10.4. - URL: https://www.oie.int/standard-setting/terrestrial-code/access-online (accessed 03/11/21).

17. Summary of avian influenza Activity in Europe, Asia, and Africa, 2006-2009/ I.H. Brown // Avian Dis. - 2010. - Vol.54. - P. 187-193.17. Summary of avian influenza Activity in Europe, Asia, and Africa, 2006-2009/ I.H. Brown // Avian Dis. - 2010. - Vol.54. - P. 187-193.

Claims

A/chicken/Chelyabinsk/314-1/2020 H9N2 strain of avian influenza virus of the family Orthomyxoviridae, genus Alphainfluenzavirus of the species Influenza A virus subtype H9, deposited in the Collection of Microorganism Strains of the Federal State Budgetary Institution “ARRIAH” under registration number: No. 333 - dep / 20- 121-GKSHM FGBI "ARRIAH" for the manufacture of biological products for the specific prevention of avian influenza type A subtype H9.