RU2766343C1 - Способ получения гкр-чипа для иммунохимического анализа - Google Patents
Способ получения гкр-чипа для иммунохимического анализа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2766343C1 RU2766343C1 RU2020141723A RU2020141723A RU2766343C1 RU 2766343 C1 RU2766343 C1 RU 2766343C1 RU 2020141723 A RU2020141723 A RU 2020141723A RU 2020141723 A RU2020141723 A RU 2020141723A RU 2766343 C1 RU2766343 C1 RU 2766343C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- chip
- substance
- colloidal solution
- deionized water
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/65—Raman scattering
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к оборудованию, а именно созданию чипа для иммунохимического анализа (ИХА) с применением эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР). Способ получения ГКР-чипа включает обработку кремниевой подложки путем ее модифицирования веществом структуры:
при воздействии ультразвука и последующей мобилизации наночастиц серебра из концентрированного коллоидного раствора. Приготовление коллоидного раствора включает растворение 5,1 мг нитрата серебра в 30 мг деионизированной воды, растворение 9,8 мг цитрата натрия в 300 мкл деионизированной воды, доведение раствора нитрата серебра до кипения и добавление к нему по каплям раствора цитрата натрия, охлаждение полученного коллоидного раствора до комнатной температуры и последующее его концентрирование в 2-50 раз. Изобретение обеспечивает получение технического результата, заключающегося в повышении качества анализа за счет повышения точности определения искомого вещества, уменьшение времени, затрачиваемого на получение результатов, и повышение удобства пользования при одновременном увеличении срока хранения полученных результатов. 4 ил., 2 табл., 7 пр.
Description
Изобретение относится к созданию чипа для иммунохимического анализа (ИХА) с применением эффекта гигантского комбинационного рассеяния (ГКР).
В настоящее время иммуночипы находят применение в скрининге антител, обнаружении наркотических веществ, диагностических системах для многих заболеваний (малярии, СПИДа, туберкулеза и т.д.) и многих других областях.
В настоящее время развитие ИХА направлено не только в сторону повышения точности определения искомого вещества, но и на уменьшение времени, затрачиваемого на получение результатов и возможность проведения анализа вне стен лаборатории. На практике уже нашли широкое применение системы для быстрого скрининга - тест-полоски (стрип-тесты) [М.-С. Hennion, D. Barcelo «Strengths and limitations of immunoassays for effective and effcient use for pesticide analysis in water samples: A review», Analytica Chimica Acta, 1998, 362, 3-34]. Но, несмотря на высокую скорость получения аналитического отклика, они имеют относительно невысокую чувствительность и служат лишь для качественного определения вещества в пробе. Ограничения мобильности многих методов ИХА из-за громоздкости оборудования, применяемого для детекции иммунных комплексов, дали стимул многим исследователям к разработке портативных оптических систем, интегрированных с иммуночипами (иммуносенсорами) [D. Sugumar, L. Kong «Lab-on-Chip Devices for Immunoassays)), In: Li D. (eds) Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics, 2015, Springer, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4614-5491-5_775].
Разработано большое количество различных ГКР-субстратов, предназначенных для решения разнообразных задач по идентификации веществ с применением ИХА. Например, в патентной заявке [GB 2439656 А, 2006 «Detection of enhanced multiplex signals by surface enhanced raman spectroscopy (sers)»] для таргетного захвата антигенов из аналита применяют чипы с иммобилизованными на их поверхностях меченными ГКР-репортерами антителами. Для получения сигнала используют детектирующие антитела, ковалентно связанные с наночастицами золота. Недостатком этого изобретения является трудновоспроизводимая методика синтеза конъюгатов антител и наночастиц серебра.
В качестве прототипа предлагаемого изобретения взят способ получения ГКР-чипа, описанный в патенте [0587008 А1, 1994 «Surface-enhaced raman spectroscopy immunoassay))]. На очищенную поверхность предметных стекол осаждались частицы серебра, полученные путем восстановления реагента Толленса D-глюкозой. Таким образом была сформирована наноостровковая пленка металла толщиной порядка 100 нм. Чипы показали хорошее усиление сигнала комбинационного рассеяния на примере динитробензола и его конъюгата с бычьим сывороточным альбумином. Была продемонстрирована принципиальная возможность определения соединений на примере изменения ГКР-спектров 2-[4-гидроксифенилазо]бензойной кислоты вследствие ее специфического взаимодействия с авидином. К недостаткам изобретения следует отнести:
• достаточно сложную и трудновоспроизводимую методику получения ГКР-поверхности;
• наноостровковая серебряная пленка, получаемая на предметных стеклах, обладает неоднородными свойствами, что может привести к невоспроизводимости результатов анализа;
• не приведены статистические данные о воспроизводимости сигнала с применением получаемых ГКР-чипов, что ставит под сомнение возможность их реализации в количественном ИХА;
• короткий срок хранения - 1 неделя.
Техническим результатом предложенного изобретения является совершенствование способа получения ГКР-чипа для ИХА, повышение стабильности и воспроизводимости получаемых результатов анализа, а также увеличение срока хранения.
Технический результат достигается путем получения ГКР-чипа для ИХА, представляющего собой кремниевую подложку, модифицированную веществами следующей структуры:
где Х=-Cl, -Br, -I, -F, -ОСН3, -ОС2Н5; Y=-NH2, -CN, -SH; n=3-10, с иммобилизованными на ее поверхности в двух зонах коллоидными частицами серебра. Коллоидный раствор серебра для иммобилизации получен путем восстановления нитрата серебра цитратом натрия и его последующим концентрированием. В качестве метки используют вещество, обладающее хорошо различимым ГКР-спектром и хорошо связывающееся с белковыми молекулами.
Изобретение характеризуется следующими графическими материалами:
• Фиг. 1 - Поверхность кремниевой подложки после иммобилизации на нее частиц серебра из коллоидного раствора;
• Фиг. 2 - ГКР-спектр тетраметилродаминизотиоцианата (ТРИТЦ), полученного на изготовленных ГКР-субстратах;
• Фиг. 3 - Распределение величины относительной интенсивности сигнала первой и второй зон внутри партии ГКР-подложек. Интенсивность спектров оценена по величине пика спектра ТРИТЦ 1641 см-1. По оси абсцисс отложены отношения интенсивностей сигнала первой и второй зон, по оси ординат - количество подложек, соответствующих этим отношениям;
• Фиг. 4 - График зависимости интенсивности ГКР-сигнала от концентрации конъюгата иммуноглобулина кролика с ТРИТЦ (IgGкр-ТРИТЦ) в координатах lgI (-lgC).
Пример 1.
Приготовление коллоидного раствора нитрата серебра
5,1 мг нитрата серебра марки х.ч. растворяют в 30 мл деионизированной воды. 9,8 мг цитрата натрия растворяют в 300 мкл деионизированной воды. Раствор нитрата серебра доводят до кипения при интенсивном перемешивании и к нему по каплям добавляют раствор цитрата натрия. Реакцию проводят в течение 60 минут. После этого полученный коллоидный раствор охлаждают до комнатной температуры и концентрируют в 2-50 раз в ячейке на мембране с размером пор 4 нм.
Пример 2
Модифицирование кремниевых подложек
Кремниевые подложки обрабатывают ультразвуком в аммиачной смеси в течение 30 минут, затем тщательно промывают деионизированной водой.
Промытые подложки обрабатывают ультразвуком в 0,1-15% водном растворе вещества структуры:
где Х=-Cl, -Br, -I, -F, -ОСН3, -ОС2Н5; Y=-NH2, -CN, -SH; n=3-10, после чего тщательно промывают деионизированной водой.
Пример 3
Иммобилизация частиц серебра на модифицированную кремниевую поверхность
На каждую кремниевую подложку из примера 2 наносят по 2 одинаковые капли коллоидного раствора серебра из примера 1. Иммобилизацию частиц серебра проводят в течение 2 часов в закрытой чашке Петри, после чего подложки высушивают и промывают водой. Поверхность полученных ГКР-субстратов охарактеризована при помощи двухлучевого просвечивающего электронного микроскопа (Фиг. 1).
Пример 4
Получение сигнала на ГКР-субстратах
Полученные ГКР-субстраты погружают в 0,02% водный раствор ТРИТЦ на 5 минут, после чего ополаскивают в воде, высушивают на воздухе и проводят измерение сигнала при длине волны возбуждающего лазера 523 нм (Фиг. 2).
Пример 5
Характеристика воспроизводимости сигнала
Проводят статистическую обработку относительной интенсивности сигнала первой и второй зоны для 100 ГКР-подложек по величине пика 1641 см-1 с применением методики, описанной в примере 4 (Фиг. 3). Из рисунка видно, что для ГКР-субстратов, полученных заявляемым способом, отклонение отношения интенсивностей сигналов двух зон не превышает 20% для каждой из подложек.
Пример 6
Приготовление конъюгата IgGкр-ТРИТЦ
IgGкр был выбран в качестве модели из-за того, что антитела, применяемые во всех известных схемах ИХА, относятся к этой фракции белков.
1 rp IgGкр растворяют в 5 мл физиологического раствора и доводят рН до 9,0, затем при интенсивном перемешивании к нему добавляют по каплям 6 мл свежеприготовленного раствора ТРИТЦ в ДМСО (с=2,5 мг/мл). Реакцию проводят 3 часа при рН 9,0. Реакционную смесь отделяют от непрореагировавшего ТРИТЦ диализом против PBS. В результате получается раствор меченого IgGкр-ТРИТЦ в PBS с концентрацией белка 1 мг/мл и соотношением белок/краситель - 1/4.
Пример 7
Определение зависимости интенсивности ГКР-сигнала от концентрации конъюгата IgG-ТРИТЦ
Делают серию кратных разведений раствора IgGкр-ТРИТЦ из примера 6 путем его разбавления PBS в 2 раза. Таким образом получают растворы меченого белка с концентрациями от 1 до 2,0×10-3 мг/мл. В эти растворы погружают подложки аналогично примеру 4. На основании полученных данных построен график зависимости интенсивности ГКР-сигнала от концентрации конъюгата IgGкр-ТРИТЦ в логарифмических координатах (Фиг. 4). Из рисунка видно, что график имеет прямолинейный участок при значениях -lgC от 0 до 2, что соответствует диапазону концентраций белка от 1 до 8,0×10-3 мг/мл. Это говорит о том, что применение при таких условиях меченых иммунореагентов делает возможным реализацию различных схем твердофазного ИХА (прямой, сэндвич, конкурентный) в количественном анализе. В конкретном случае предел обнаружения белкового соединения будет составлять 8,0×10-3 мг/мл, так как после этой точки график выходит на плато. Этот предел можно будет впоследствии снизить путем подбора другого более чувствительного красителя или методики мечения иммунореагентов.
Claims (3)
- Способ получения ГКР–чипа для иммунохимического анализа путем обработки кремниевой подложки, отличающийся тем, что ее модифицируют веществом структуры:
- при воздействии ультразвука и последующей иммобилизации наночастиц серебра из концентрированного коллоидного раствора, приготовление которого включает растворение 5,1 мг нитрата серебра в 30 мл деионизированной воды, растворение 9,8 мг цитрата натрия в 300 мкл деионизированной воды, доведение раствора нитрата серебра до кипения и добавление к нему по каплям раствора цитрата натрия, охлаждение полученного коллоидного раствора до комнатной температуры и его концентрирование в 2-50 раз.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020141723A RU2766343C1 (ru) | 2020-12-16 | 2020-12-16 | Способ получения гкр-чипа для иммунохимического анализа |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020141723A RU2766343C1 (ru) | 2020-12-16 | 2020-12-16 | Способ получения гкр-чипа для иммунохимического анализа |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2766343C1 true RU2766343C1 (ru) | 2022-03-15 |
Family
ID=80736515
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020141723A RU2766343C1 (ru) | 2020-12-16 | 2020-12-16 | Способ получения гкр-чипа для иммунохимического анализа |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2766343C1 (ru) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080074661A1 (en) * | 2006-09-21 | 2008-03-27 | Jingwu Zhang | Online analyte detection by surface enhanced Raman scattering (SERS) |
US20100099579A1 (en) * | 2005-09-15 | 2010-04-22 | Ashutosh Chilkoti | Non-fouling polymeric surface modification and signal amplification method for biomolecular detection |
JP2016024070A (ja) * | 2014-07-22 | 2016-02-08 | セイコーエプソン株式会社 | 電場増強素子、ラマン分光装置、および電子機器 |
RU2659987C2 (ru) * | 2016-12-07 | 2018-07-04 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Планарный твердофазный оптический сенсор для определения белковых соединений методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния и его применение для детектирования белковых соединений |
CN106404739B (zh) * | 2016-09-07 | 2018-10-30 | 江南大学 | 一种表面增强拉曼散射基底、制备方法及其应用 |
WO2019146692A1 (ja) * | 2018-01-25 | 2019-08-01 | 王子ホールディングス株式会社 | 分析用基板 |
-
2020
- 2020-12-16 RU RU2020141723A patent/RU2766343C1/ru active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20100099579A1 (en) * | 2005-09-15 | 2010-04-22 | Ashutosh Chilkoti | Non-fouling polymeric surface modification and signal amplification method for biomolecular detection |
US20080074661A1 (en) * | 2006-09-21 | 2008-03-27 | Jingwu Zhang | Online analyte detection by surface enhanced Raman scattering (SERS) |
JP2016024070A (ja) * | 2014-07-22 | 2016-02-08 | セイコーエプソン株式会社 | 電場増強素子、ラマン分光装置、および電子機器 |
CN106404739B (zh) * | 2016-09-07 | 2018-10-30 | 江南大学 | 一种表面增强拉曼散射基底、制备方法及其应用 |
RU2659987C2 (ru) * | 2016-12-07 | 2018-07-04 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Планарный твердофазный оптический сенсор для определения белковых соединений методом спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния и его применение для детектирования белковых соединений |
WO2019146692A1 (ja) * | 2018-01-25 | 2019-08-01 | 王子ホールディングス株式会社 | 分析用基板 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Liu et al. | Signal amplification strategies for paper-based analytical devices | |
Fu et al. | Ultrasensitive detection of the β-adrenergic agonist brombuterol by a SERS-based lateral flow immunochromatographic assay using flower-like gold-silver core-shell nanoparticles | |
RU2608656C2 (ru) | Связанные со стрептавидином магнитные частицы и способ их изготовления | |
JP5132664B2 (ja) | イムノクロマトグラフ方法 | |
US4786589A (en) | Immunoassay utilizing formazan-prelabeled reactants | |
Tian et al. | Copper deposition-induced efficient signal amplification for ultrasensitive lateral flow immunoassay | |
US20100255599A1 (en) | Surface enhanced resonance raman scattering spectroscopy (serrs) nanoparticle probes and methods of use | |
KR102261179B1 (ko) | 측면 흐름 분석-기반의 면역 검출용 접합체 및 이를 사용한 면역 검출 방법 | |
JP7141458B2 (ja) | クロマトグラフキットおよびクロマトグラフ方法 | |
Qin et al. | Boronate affinity material-based sensors for recognition and detection of glycoproteins | |
US20200292538A1 (en) | Surface enhanced raman spectroscopy (sers) microfluidics biosensor for detecting single and/or multiple analytes | |
CN113302474A (zh) | 基于表面增强拉曼散射的靶物质检测用基板的制造方法,基于其的靶物质检测用基板及使用其的靶物质检测方法 | |
Hu et al. | SERS-based immunoassay using core–shell nanotags and magnetic separation for rapid and sensitive detection of cTnI | |
Luan et al. | Responsive photonic barcodes for sensitive multiplex bioassay | |
Wang et al. | Simultaneous quantitative detection of IL-6 and PCT using SERS magnetic immunoassay with sandwich structure | |
Shen et al. | In situ Raman enhancement strategy for highly sensitive and quantitative lateral flow assay | |
Li et al. | A capillary-based microfluidic chip with the merits of low cost and easy fabrication for the rapid detection of acute myocardial infarction | |
EP3564675A1 (en) | Metal resin complex and use thereof | |
Ilyas et al. | SERS immuno-and apta-assays in biosensing/bio-detection: Performance comparison, clinical applications, challenges | |
US20230305001A1 (en) | Ultra-sensitive digital rapid chromatographic assay system and method for analytes detection | |
Yang et al. | Ultrasensitive multiplex SERS immunoassay based on porous Au–Ag alloy nanoparticle–amplified Raman signal probe and encoded photonic crystal beads | |
RU2766343C1 (ru) | Способ получения гкр-чипа для иммунохимического анализа | |
Lv et al. | A quantum dot microspheres-based highly specific and sensitive three-dimensional microarray for multiplexed detection of inflammatory factors | |
KR102043622B1 (ko) | 표면 개질된 금 나노입자를 이용한 측방유동 분석-기반 바이오센서 | |
Cordina et al. | Rapid and sensitive glycan targeting by lectin-SERS assay |