RU2764304C1

RU2764304C1 - Agent for producing an antifungal peptide antibiotic active against pathogens of invasive mycoses

Info

Publication number: RU2764304C1
Application number: RU2020141227A
Authority: RU
Inventors: Вера Сергеевна Садыкова; Марина Леонидовна Георгиева; Евгений Александрович Рогожин; Елена Николаевна Биланенко; София Андреевна Бондаренко; Ирина Александровна Гаврюшина; Анастасия Евгеньевна Куварина
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2022-01-17

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: proposed are an application of the strain of Sodiomyces alkalinus RNCM F-3762 as a producer of an antifungal peptide antibiotic hydrophobin Sa-HFB1 and an application of the resulting hydrophobin Sa-HFB1 as an agent active against pathogens of invasive mycoses with multidrug resistance.EFFECT: inventions ensure production of an agent with high activity against mould and yeast pathogenic fungi, including clinical isolates, with multidrug resistance to polyenes and azoles applied in medical practice for treating opportunistic mycoses, including cryptococcoses and candidiases.2 cl, 4 dwg, 3 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано в фармакологии и медицине.The invention relates to the field of medical microbiology and can be used in pharmacology and medicine.

Проблема распространения антибиотикорезистентных штаммов патогенных микроорганизмов является одним из общепризнанных глобальных вызовов системе здравоохранения во всех станах мира, включая и РФ. Широкое применение антибиотиков в последние десятилетия привело к тому, что до 30% случаев инфекционных заболеваний не поддается терапии стандартными препаратами, включая антибиотики последних поколений. Сдерживание экспансии резистентных штаммов, наблюдаемое по всему миру, требует применения комплексных радикальных мер, включающих разработку принципиально новых средств подавления размножения бактерий и грибов в организме человека.The problem of the spread of antibiotic-resistant strains of pathogenic microorganisms is one of the generally recognized global challenges to the healthcare system in all countries of the world, including the Russian Federation. The widespread use of antibiotics in recent decades has led to the fact that up to 30% of cases of infectious diseases cannot be treated with standard drugs, including antibiotics of the latest generations. The containment of the expansion of resistant strains, observed throughout the world, requires the use of comprehensive radical measures, including the development of fundamentally new means of suppressing the reproduction of bacteria and fungi in the human body.

Грибы - одна из самых разнообразных групп живых организмов, тем не менее, к настоящему времени описана только небольшая часть видов грибов грибных видов (около 100000), и из них только менее 1% исследовано на предмет фармакологического потенциала. Продуценты биоактивных соединений выявлены среди многих родов грибов-аскомицетов: Aspergillus, Penicillium, Acremonium, Fusarium, Alternaria, Trichoderma и Phoma (Berdy, 2005).Fungi are one of the most diverse groups of living organisms, yet only a small proportion of fungal species (about 100,000) have been described to date, and of these, only less than 1% have been investigated for pharmacological potential. Producers of bioactive compounds have been identified among many genera of ascomycete fungi: Aspergillus, Penicillium, Acremonium, Fusarium, Alternaria, Trichoderma, and Phoma (Berdy, 2005).

Традиционно микроорганизмы, продуцирующие антибиотики, выделяли из образцов почвы. Тем не менее, этот источник, по большей части, исчерпан и на первый план в поиске новых антимикробных соединений выходят нетрадиционные биотопы с недавно открытыми организмами (Sanchez, Demain, 2017). Эти биотопы включают в себя засушливые почвы, пещеры, районы с высокими (горячие источники) или низкими температурами, высокой соленостью и щелочностью, глубины морей и океанов и т.д. Выживание в таких условиях инициирует выработку различных метаболитов, имеющих своеобразную биохимию. За прошедшие 10-15 лет было выделено и охарактеризовано более 20000 таких соединений, продуцируемых экстремофильными микроорганизмами (Imhoff, 2016; Butler, Blaskovich, 2017). Несмотря на сложности обнаружения и культивирования экстремофильных грибов, проводимые скрининговые исследования показывают их огромный потенциал в качестве источников новых биоактивных соединений (Ibrar et al., 2020).Traditionally, antibiotic-producing microorganisms have been isolated from soil samples. However, this source has mostly been exhausted, and non-traditional biotopes with recently discovered organisms come to the fore in the search for new antimicrobial compounds (Sanchez and Demain, 2017). These biotopes include arid soils, caves, areas with high (hot springs) or low temperatures, high salinity and alkalinity, deep seas and oceans, etc. Survival in such conditions initiates the production of various metabolites with a peculiar biochemistry. Over the past 10–15 years, more than 20,000 such compounds produced by extremophilic microorganisms have been isolated and characterized (Imhoff, 2016; Butler and Blaskovich, 2017). Despite the difficulties in detecting and cultivating extremophilic fungi, ongoing screening studies show their great potential as sources of new bioactive compounds (Ibrar et al., 2020).

Среди различных групп экстремофильных организмов наименее изученной остаются алкалофилы, способные к росту и развитию при высоких значениях рН окружающей среды. Природными биотопами, где складываются такие условия, служат побережья содовых озер в аридных областях Евразии, Африки и Америки. Среди алкалофилов - продуцентов антимикробных соединений большую долю занимают бактерии, в частности, актиномицеты, потенциал же алкалофильных грибов практически не изучен. У алкалотолерантного гриба Paecilomyces lilacinus показан синтез пептидных антибиотиков 1907-II и 1907-VIII с антибактериальной и антифунгальной активностями. Алкалофильный гриб Aspergillus flavus продуцирует койевую кислоту и фомалигол А, обладающие активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. Алкалофильные изоляты двух видов грибов из почв пустыни Египта обладали антибактериальной активностью в отношении грамположительных бактерий (Hozzein et al., 2019). У штаммов алкалофильного гриба Emericellopsis alkalina, изолированных из щелочных засоленных почв, выделен и описан новый липопептаибол - эмерициллипсин А, обладающий антифунгальной, антибактериальной, в том числе и по отношению к грамположительным бактериям, образующим биопленки, а также противоопухолевой активностями (Rogozhin et al., 2018; Sadykova et al., 2020).Among the various groups of extremophilic organisms, the least studied are the alkaliphiles capable of growth and development at high environmental pH values. The natural biotopes where such conditions are formed are the shores of soda lakes in the arid regions of Eurasia, Africa and America. Among the alkaliphiles producing antimicrobial compounds, bacteria, in particular, actinomycetes, occupy a large proportion, while the potential of alkaliphilic fungi is practically not studied. The synthesis of peptide antibiotics 1907-II and 1907-VIII with antibacterial and antifungal activities was shown in the alkalotolerant fungus Paecilomyces lilacinus. The alkaliphilic fungus Aspergillus flavus produces kojic acid and fomaligol A, which are active against gram-positive and gram-negative bacteria. Alkaliphilic isolates of two fungal species from Egyptian desert soils had antibacterial activity against Gram-positive bacteria (Hozzein et al., 2019). In strains of the alkalophilic fungus Emericellopsis alkalina, isolated from alkaline saline soils, a new lipopeptaibol, emericillipsin A, has been isolated and described, which has antifungal, antibacterial, including against gram-positive bacteria that form biofilms, as well as antitumor activities (Rogozhin et al., 2018; Sadykova et al., 2020).

Особенно интересны представители недавно описанного рода Sodiomyces (Plectosphaerellaceae), для которых подтвержден облигатно-алкалофильный тип адаптации (Grum-Grzhimaylo et al., 2013). Показано, что в геноме S. alkalinus есть последовательности, кодирующие основные ферменты, необходимые для биосинтеза бета-лактамных антибиотиков (Grum-Grzhimaylo et al., 2018). При этом известно, что бета-лактамы быстро разлагаются при высоких значениях рН (Deshpande et al., 2004).Particularly interesting are the representatives of the recently described genus Sodiomyces (Plectosphaerellaceae), for which the obligate alkaliphilic type of adaptation has been confirmed (Grum-Grzhimaylo et al., 2013). It has been shown that the S. alkalinus genome contains sequences encoding the main enzymes required for the biosynthesis of beta-lactam antibiotics (Grum-Grzhimaylo et al., 2018). However, beta-lactams are known to rapidly degrade at high pH values (Deshpande et al., 2004).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по спектру антибиотической активности, который следует принять за ближайший аналог, является штамм алкалофильного микромицета Emericellopsis alkalina, депонированный в ВКПМ под номером F-1428, который продуцирует комплекс антимикробных липопептидов эмерициллипсинов А-Е с высокой фунгицидной активностью, в том числе к резистентным микроскопическим и дрожжевым патогенным грибам и к условно-патогенным грамположительным бактериям, препятствуя образованию у них биопленок (патенты РФ №2704421 и №2710377).The closest to the proposed invention in terms of the spectrum of antibiotic activity, which should be taken as the closest analogue, is the strain of the alkaliphilic micromycete Emericellopsis alkalina, deposited in the VKPM under the number F-1428, which produces a complex of antimicrobial lipopeptides emericillipsins A-E with high fungicidal activity, including to resistant microscopic and yeast pathogenic fungi and to opportunistic gram-positive bacteria, preventing the formation of biofilms in them (RF patents No. 2704421 and No. 2710377).

Предложен штамм алкалофильного гриба Sodiomyces alkalinus, депонированный в ВКМ под номером F-3762, который продуцирует соединение пептидной природы - гидрофобии II класса с высокой фунгицидной активностью, в том числе к резистентным микроскопическим и дрожжевым патогенным грибам.A strain of the alkaliphilic fungus Sodiomyces alkalinus is proposed, deposited in the VKM under the number F-3762, which produces a peptide compound of class II hydrophobia with high fungicidal activity, including resistance to microscopic and yeast pathogenic fungi.

Гидрофобины известны только для высших мицелиальных грибов (надотдел Dikaryomycotera) и, как сообщается, являются одними из самых поверхностно-активных белков в природе. Они секретируются в растворимой форме и спонтанно локализуются и самоорганизуются на поверхности раздела гидрофильно/гидрофобных фаз, спор и апикальных гиф грибов, где они собираются в нерастворимые амфипатические эластичные водоотталкивающие оболочки, позволяя грибным гифам адаптироваться к ограничениям в среде обитания, вызванным межфазными силами. Гидрофобины очень эффективно понижают поверхностное натяжение воды, позволяя гифам покидать водную среду и расти на воздухе (Bayry et al., 2012; Aimanianda, Latge, 2010). Функциональные свойства гидрофобинов включают устойчивость к стрессу, поверхностно-активные взаимодействия с растениями-хозяевами у фитопатогенных грибов (Zhang et al., 2011; Cai et al., 2020). В последние годы одним из наиболее перспективных направлений использования гидрофобинов считается их применение в качестве пенообразующих и пеностабилизирующих агентов в пищевой промышленности, при этом эффект, вызываемый гидрофобинами, намного выше, чем у всех известных в настоящее время стабилизаторов пены. Однако в литературе до настоящего времени нет упоминаний об их антимикробных свойствах.Hydrophobins are known only from higher filamentous fungi (superdivision Dikaryomycotera) and are reported to be among the most surface-active proteins in nature. They are secreted in soluble form and spontaneously localize and self-organize at the hydrophilic/hydrophobic interface, spores and apical hyphae of fungi, where they assemble into insoluble amphipathic elastic water-repellent shells, allowing fungal hyphae to adapt to habitat constraints caused by interfacial forces. Hydrophobins very effectively lower the surface tension of water, allowing hyphae to leave the aquatic environment and grow in air (Bayry et al., 2012; Aimanianda and Latge, 2010). Functional properties of hydrophobins include stress resistance, surface active interactions with host plants in phytopathogenic fungi (Zhang et al., 2011; Cai et al., 2020). In recent years, one of the most promising areas for the use of hydrophobins is their use as foaming and foam stabilizing agents in the food industry, while the effect caused by hydrophobins is much higher than that of all currently known foam stabilizers. However, there is no mention of their antimicrobial properties in the literature so far.

Техническим результатом изобретения является штамм облигатно алкалофильного микроскопического гриба Sodiomyces alkalinus, продуцирующий гидрофобии II класса с высокой активностью к плесневым и дрожжевым патогенным грибам, включая клинические изоляты, с мультирезистентностью к полиенам и азолам, применяющимся в медицинской практике для лечения оппортунистических микозов, в том числе криптококкозов и кандидозов.The technical result of the invention is a strain of the obligately alkaliphilic microscopic fungus Sodiomyces alkalinus, producing class II hydrophobia with high activity against mold and yeast pathogenic fungi, including clinical isolates, with multiresistance to polyenes and azoles, used in medical practice for the treatment of opportunistic mycoses, including cryptococcosis and candidiasis.

Пример 1. Определение видовой принадлежности штаммаExample 1. Determination of the strain species

Объект патентования - штамм ВКМ F-3762 вида Sodiomyces alkalinus Grum-Grzhim., Debets & Bilanenko (Plectosphaerellaceae, Glomerellales, Hypocreomycetidae, Sordariomycetes, Pezizomycotina, Ascomycota). Этот штамм является типовым для вида, депонирован также в CBS (CBS 110278).The object of patenting is the strain VKM F-3762 of the species Sodiomyces alkalinus Grum-Grzhim., Debets & Bilanenko (Plectosphaerellaceae, Glomerellales, Hypocreomycetidae, Sordariomycetes, Pezizomycotina, Ascomycota). This strain is the type strain of the species and is also deposited with CBS (CBS 110278).

Культурально-морфологические признаки.Cultural and morphological features.

Макроморфологические признаки.Macromorphological features.

S. alkalinus является облигатным алкалофилом, т.е. не способен к росту при кислых значениях рН среды. При культивировании на щелочной среде (ЩА) для штамма ВКМ F-3762 отмечены максимальные скорости роста (по сравнению со средами с кислыми и нейтральными значениями рН) и в полной мере выражены все характерные для него морфолого-культуральные признаки (рис. 1, А). Колонии на ЩА довольно быстро растут, достигая 38-40 мм за 10 дней; сначала белые, затем с черными концентрическими зонами вследствие интенсивного образования плодовых тел. Колонии бархатистые до шерстистых. Обратная сторона не окрашена или чуть желтоватая. Запах приятный, напоминает цветочный. При околонейтральных значениях рН среды (6-7) гриб значительно снижает скорость роста, при этом слабо развито или отсутствует бесполое и половое спороношение, воздушный мицелий слабовыраженный, а гифы часто имеют деформированный вид с многочисленными вздутиями (рис. 1, Б).S. alkalinus is an obligate alkaliphile, i.e. not capable of growth at acidic pH values. When cultivating on an alkaline medium (AA), the VKM F-3762 strain showed maximum growth rates (compared to media with acidic and neutral pH values) and all its characteristic morphological and cultural features were fully expressed (Fig. 1, A) . Colonies on SC grow rather quickly, reaching 38-40 mm in 10 days; first white, then with black concentric zones due to the intensive formation of fruiting bodies. Colonies velvety to woolly. The reverse side is not colored or slightly yellowish. The smell is pleasant, reminiscent of a flower. At near-neutral pH values (6-7), the fungus significantly reduces the growth rate, while asexual and sexual sporulation is poorly developed or absent, aerial mycelium is weakly expressed, and hyphae often have a deformed appearance with numerous swellings (Fig. 1, B).

Микроморфологические признаки при культивировании на щелочном агаре.Micromorphological features during cultivation on alkaline agar.

Плодовые тела темно-коричневые, образуются на поверхности субстрата, шаровидные, замкнутые, 120-250 мкм в диаметре. Оболочка плодового тела (перидий) псевдопаренхиматозная, со складчатой поверхностью, состоит из 3-5 слоев угловатых (чаще шестиугольных) клеток. Парафизы отсутствуют. Сумки тонкостенные, оболочка сумок расплывается до созревания аскоспор, и аскоспоры находятся в слизистой массе внутри плодового тела (рис. 1, В). Аскоспоры освобождаются после разрыва оболочки плодового тела. Аскоспоры овальные или эллипсоидальные, 12-15 х 5-7 мкм, с одной перегородкой в середине, без перетяжки в месте расположения септы, толстостенные, светлокоричневые, гладкие (рис. 1, Г).Fruit bodies are dark brown, formed on the surface of the substrate, spherical, closed, 120-250 microns in diameter. The shell of the fruiting body (peridium) is pseudoparenchymal, with a folded surface, consists of 3-5 layers of angular (usually hexagonal) cells. Paraphyses are absent. The asci are thin-walled, the shell of the asci is blurred before the maturation of the ascospores, and the ascospores are located in the mucous mass inside the fruiting body (Fig. 1, C). Ascospores are released after rupture of the fruiting body shell. Ascospores oval or ellipsoidal, 12-15 x 5-7 µm, with one septum in the middle, without constriction at the location of the septum, thick-walled, light brown, smooth (Fig. 1d).

Бесполое спороношение Acremonium-тюдобное. Стелющиеся вегетативные гифы тонкостенные, бесцветные, толщиной 0,5 - 2,0 мкм. Образование конидий обильное, конидиеносцы отходят главным образом от одиночных воздушных гиф, иногда от тяжей воздушных гиф. Ветвление конидиеносцев базитонно-мутовчатое, присутствуют также и одиночные веточки (рис. 1, Д, Е). Фиалиды 15-60 мкм длиной, постепенно сужающиеся к концу, довольно тонкостенные. Конидии образуются в слизистых головках, чаще шаровидных, иногда коротко-цилиндрических. Конидии полушаровидные или широко эллипсоидальные, 4,5-5,5 х 4,1-4,6 мкм, неокрашенные. Хламидоспоры отсутствуют.Asexual sporulation Acremonium-tyudobnoe. Creeping vegetative hyphae are thin-walled, colorless, 0.5 - 2.0 µm thick. The formation of conidia is abundant, conidiophores depart mainly from single aerial hyphae, sometimes from strands of aerial hyphae. The branching of conidiophores is basitonic-whorled; there are also single branches (Fig. 1, E, F). Phialides 15-60 µm long, gradually tapering towards the end, rather thin-walled. Conidia are formed in mucous heads, more often spherical, sometimes short-cylindrical. Conidia are hemispherical or broadly ellipsoidal, 4.5-5.5 x 4.1-4.6 µm, unstained. Chlamydospores are absent.

Молекулярно-генетические признаки.Molecular genetic features.

Идентификация проведена на основе анализа последовательностей нескольких генетических локусов: LSU, SSU, ITS, 5,8S rDNA, RPB2, TEF1-α (Grum-Grzhimaylo et al., 2013). Все последовательности размещены в GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=Sodiomyces+alkalinus).Identification was based on sequence analysis of several genetic loci: LSU, SSU, ITS, 5.8S rDNA, RPB2, TEF1-α (Grum-Grzhimaylo et al., 2013). All sequences are available from GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=Sodiomyces+alkalinus).

Физиолого-биохимические признаки.Physiological and biochemical signs.

Способен продуцировать щелочные гемицеллюлолазы и целлюлазы (Grum-Grizhmailo et al., 2018) и гидрофобины 2 класса с противогрибковыми свойствами.Able to produce alkaline hemicellulase and cellulases (Grum-Grizhmailo et al., 2018) and class 2 hydrophobins with antifungal properties.

Пример 2. Определение фунгицидной активности штамма в отношении штаммов условно-патогенных мицелиальных и дрожжевых грибовExample 2. Determination of the fungicidal activity of a strain against strains of opportunistic filamentous and yeast fungi

Для изучения антимикробной активности выбрана щелочная среда на буферной основе, позволяющая поддерживать при культивировании рН 10,5: минеральная основа: Na₂CO₃-24, NaHCO₃-6, NaCl-6, KNO₃-1, K₂HPO₄-1; солодовый экстракт (15°Б) - 200 мл, дрожжевой экстракт-1, агар-20; H₂O диет.800 мл.To study the antimicrobial activity, an alkaline buffer-based medium was chosen, which allows maintaining pH 10.5 during cultivation: mineral base: Na ₂ CO ₃ -24, NaHCO ₃ -6, NaCl-6, KNO ₃ -1, K ₂ HPO ₄ -1 ; malt extract (15°B) - 200 ml, yeast extract-1, agar-20; H ₂ O diet. 800 ml.

В качестве посевного материала используют 5-ти суточную культуру гриба, полученную на щелочном сусло-агаре. Штамм выращивают в специализированной жидкой щелочной среде (300 мл) с рН 10,5 в стационарных условиях в колбах на 500 мл в течение 14 суток при 25°С. Биомассу мицелия и спор отделяют центрифугированием на центрифуге. Антибиотические вещества из отфильтрованной культуральной жидкости (кж) и грибной биомассы экстрагируют этилацетатом (при соотношении экстрагента и культуральной жидкости 5:1). Полученные экстракты упаривают в вакууме на роторном испарителе

(Швейцария) досуха при 42°С, сухой остаток - препарат хранят при 4°С. Для определения антибиотической активности используют диско-диффузионный метод (Егоров, 2004). Диски пропитывают препаратом, растворенным в 60% водном растворе этанола, и сушат их на воздухе в стерильных условиях. Антимикробную активность определяют в исходной культуральной жидкости, в спиртовых концентратах КЖ с помощью стерильных бумажных дисков (бумага фильтровальная Ф ГОСТ 12026-76, Россия), смоченных в экстрактах и высушенных в стерильных условиях.A 5-day-old culture of the fungus obtained on alkaline wort agar is used as an inoculum. The strain is grown in a specialized liquid alkaline medium (300 ml) with a pH of 10.5 under stationary conditions in 500 ml flasks for 14 days at 25°C. Mycelial biomass and spores are separated by centrifugation in a centrifuge. Antibiotic substances from the filtered culture liquid (CL) and fungal biomass are extracted with ethyl acetate (at a ratio of extractant and culture liquid 5:1). The obtained extracts are evaporated in vacuum on a rotary evaporator.

(Switzerland) to dryness at 42°C, dry residue - the drug is stored at 4°C. The disk diffusion method is used to determine antibiotic activity (Egorov, 2004). The discs are impregnated with the preparation dissolved in 60% aqueous ethanol solution and dried in air under sterile conditions. Antimicrobial activity is determined in the original culture fluid, in alcoholic concentrates of QOL using sterile paper discs (filter paper F GOST 12026-76, Russia), soaked in extracts and dried under sterile conditions.

Первоначально антифунгальную активность штаммов оценивают методом диффузии в агар на тест-культурах условно-патогенных микроорганизмов грибов. Спектр антимикробной активности культуральной жидкости, экстрактов и индивидуальных соединений определяют на тест-культурах мицелиальных и дрожжевых микроскопических грибов и бактерий из коллекции культур «Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе»: условно-патогенные плесневые и дрожжевые тест-культуры грибов: Aspergillus flavus 7К, A. fumigatus КБП F-37, A. oryzae IK, A. niger INA 00760, A. terreus 4К, Fusarium solani 890, Penicillium brevicompactum VKM F-4481, P. chrysogenum VKM F-4499, Candida albicans ATCC 2091, C. tropicales INA 00763 (таблица 1).Initially, the antifungal activity of the strains is assessed by the agar diffusion method on test cultures of opportunistic fungal microorganisms. The spectrum of antimicrobial activity of the culture liquid, extracts and individual compounds is determined on test cultures of filamentous and yeast microscopic fungi and bacteria from the culture collection of the G.F. Gause": conditionally pathogenic mold and yeast test cultures of fungi: Aspergillus flavus 7K, A. fumigatus KBP F-37, A. oryzae IK, A. niger INA 00760, A. terreus 4K, Fusarium solani 890, Penicillium brevicompactum VKM F -4481, P. chrysogenum VKM F-4499, Candida albicans ATCC 2091, C. tropicales INA 00763 (Table 1).

Пример 3. Выделение и идентификация гидрофобина Sa-HFBl из этилацетаной фракции КЖ штаммаExample 3. Isolation and identification of hydrophobin Sa-HFBl from the ethylacetate fraction of the QOL strain

Разделение активных фракций проводят путем аналитической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) с использованием колонки XBridge 5 мкм 100А размером 250x4.6 мм «Waters» (США) в растущем линейном градиенте концентрации ацетонитрила в качестве подвижной фазы (элюент А - 0.1%-ная трифторуксусная кислота, ТФУ, в воде MQ, элюентом В - 80%-ный ацетонитрил с 0.1%-ной водной ТФУ) при скорости потока 950 мкл/мин. Для ОФ-ВЭЖХ используют ультраградиентный ацетонитрил фирмы «Panreac» (Испания) и ТФУ производства «Sigma-Aldrich» (США). Детектирование разделяемых веществ осуществляли при трех длинах волн (214, 247 и 280 нм) в градиенте концентрации элюента В: 16-28% - за 12 мин; 28-55% - за 27 мин; 55-75% - за 20 мин и 75-85% - за 10 мин с последующим изократическим элюированием в течение 25 мин. В результате получают профиль компонентов активного концентрата штамма, насчитывающий три преобладающие фракции (рис. 3,4) с различной степенью гидрофобности.Separation of active fractions is carried out by analytical reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) using an XBridge 5 μm 100A column with a size of 250x4.6 mm "Waters" (USA) in a growing linear concentration gradient of acetonitrile as a mobile phase (eluent A - 0.1 % trifluoroacetic acid, TFA, in water MQ, eluent B - 80% acetonitrile with 0.1% aqueous TFA) at a flow rate of 950 μl/min. For RP-HPLC, ultragradient acetonitrile from Panreac (Spain) and TFA from Sigma-Aldrich (USA) are used. Detection of separated substances was carried out at three wavelengths (214, 247 and 280 nm) in the concentration gradient of eluent B: 16-28% - in 12 min; 28-55% - in 27 minutes; 55-75% in 20 minutes and 75-85% in 10 minutes followed by isocratic elution for 25 minutes. As a result, a profile of the components of the active concentrate of the strain is obtained, numbering three predominant fractions (Fig. 3.4) with different degrees of hydrophobicity.

С целью масштабирования получения индивидуального компонента, полученные в ходе ОФ-ВЭЖХ фракции, соответствующие отдельным пикам, собирают вручную, затем избыток органического растворителя (ацетонитрила) удаляют упариванием на вакуумной центрифуге SpeedVac «Savant» (США) и лиофилизируют «Labconco» (США) для удаления остаточных количеств ТФУ (рис. 3).In order to scale up the production of an individual component, the fractions obtained during RP-HPLC corresponding to individual peaks are collected manually, then the excess organic solvent (acetonitrile) is removed by evaporation on a SpeedVac Savant vacuum centrifuge (USA) and lyophilized by Labconco (USA) for removal of residual amounts of TFA (Fig. 3).

Молекулярную массу активного соединения устанавливают на MALDI времяпро летном масс-спектрометре Auto Speed MALDI TOF/TOF «BrukerDaltonics» (Германия), оснащенном УФ лазером 355 нм (Nd:YAG) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона. На мишени смешивают по 1 мкл раствора образца и 1 мкл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) с концентрацией 10 мг/мл в 20%-ном ацетонитриле с 0.5%-ной ТФУ кислотой, полученную смесь высушивают на воздухе. С помощью МАЛДИ масс-спектрометрического анализа устанавливают среднюю молекулярную массу соединения - 7918,4 Да (рис. 3). Характер распределения сигналов m/z с шагом более чем в 100 Да свидетельствует о фрагментации молекулы посредством гидролиза гликозидных связей, что определяет разницу в молекулярной массе с агликоном (7586,34 Да) примерно в 332 Да, что предположительно соответствует наличию остатков сахаров (рис. 4).The molecular weight of the active compound was determined on a BrukerDaltonics Auto Speed MALDI TOF/TOF MALDI time-of-flight mass spectrometer (Germany) equipped with a 355 nm UV laser (Nd:YAG) in the positive ion mode using a reflectron. On the target, 1 μl of the sample solution and 1 μl of a 10 mg/ml solution of 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) in 20% acetonitrile with 0.5% TFA acid are mixed on the target, and the resulting mixture is dried in air. Using MALDI mass spectrometric analysis, the average molecular weight of the compound was determined to be 7918.4 Da (Fig. 3). The nature of the distribution of m/z signals with a step of more than 100 Da indicates fragmentation of the molecule due to the hydrolysis of glycosidic bonds, which determines the difference in molecular weight with aglycone (7586.34 Da) by about 332 Da, which presumably corresponds to the presence of sugar residues (Fig. 4).

Спектры поглощения снимают с использованием спектрофотометра UV-1800 («Shimadzu», Япония) и кварцевых кювет на 2 мл с длиной оптического пути 1 см.Absorption spectra were recorded using a UV-1800 spectrophotometer (Shimadzu, Japan) and 2 ml quartz cuvettes with an optical path length of 1 cm.

N-концевое секвенирование по методу Эдмана осуществляют с использованием автоматического секвенатора белков и пептидов PPSQ-33A («Shimadzu», Япония) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Для обработки полученных данных используют официальное программное обеспечение LabSolution («Shimadzu», Япония).N-terminal sequencing according to the Edman method is carried out using a PPSQ-33A automatic protein and peptide sequencer (Shimadzu, Japan) in accordance with the manufacturer's protocol. To process the obtained data, the official LabSolution software (Shimadzu, Japan) is used.

Выделенное активное соединение Sa-HFB1 по совокупности выявленных структурных особенностей (молекулярная масса, соотношение поглощения на определенных длинах волн) соответствует полипептидному соединению из группы гидрофобинов II класса.The isolated active compound Sa-HFB1 according to the totality of the identified structural features (molecular weight, absorption ratio at certain wavelengths) corresponds to a polypeptide compound from the group of class II hydrophobins.

Пример 4. Определение фунгицидной активности этилацетатной фракции штамма в отношении клинических изолятов мицелиальных и дрожжевых грибов, резистентных к азоламExample 4. Determination of the fungicidal activity of the ethyl acetate fraction of the strain in relation to clinical isolates of mycelial and yeast fungi resistant to azoles

Опыт проводят согласно примеру 2, но в качестве тест-объектов используют клинические изоляты дрожжевых грибов, возбудителей инвазивных кандидозов с множественной резистентностью к применяемым антибиотикам - азолам: Candida albicans 1582 м - возбудитель кандидоза пищевода на фоне туберкулеза с легочным компонентом, туберкулезом селезенки и ВИЧ, С.glabrata 1402 м - возбудитель кандидоза легких на фоне туберкулеза и ВИЧ, С.krusei 1447 м - фиброзно-кавернозный туберкулез легких, С.tropicalis 156 м - возбудитель кандидоза легких на фоне туберкулеза и ВИЧ. Также используют изоляты мицелиальных грибов - возбудителей инвазивных аспергиллезов с множественной резистентностью к применяемым антибиотикам - азолам: Aspergillus fumigatus 390 м - фиброзно-кавернозный туберкулез легких; A. niger 219 - фиброзно-кавернозный туберкулез легких; Cryptococcus neoformans 297 м - фиброзно-кавернозный туберкулез легких, криптококкоз с распадом легких, вторичный иммунодефицит (таблица 2).The experiment is carried out according to example 2, but clinical isolates of yeast fungi, pathogens of invasive candidiasis with multiple resistance to the antibiotics used - azoles are used as test objects: Candida albicans 1582 m - the causative agent of esophageal candidiasis against the background of tuberculosis with a pulmonary component, tuberculosis of the spleen and HIV, С.glabrata 1402 m - the causative agent of lung candidiasis on the background of tuberculosis and HIV, С.krusei 1447 m - fibrous-cavernous pulmonary tuberculosis, С.tropicalis 156 m - the causative agent of pulmonary candidiasis on the background of tuberculosis and HIV. Also use isolates of filamentous fungi - pathogens of invasive aspergillosis with multiple resistance to the antibiotics used - azoles: Aspergillus fumigatus 390 m - fibrous-cavernous pulmonary tuberculosis; A. niger 219 - fibrous-cavernous pulmonary tuberculosis; Cryptococcus neoformans 297 m - fibrous-cavernous pulmonary tuberculosis, cryptococcosis with lung decay, secondary immunodeficiency (table 2).

Sa-HFB 1 проявляет выраженную антифунгальную активность к дрожжевым грибам, в том числе клиническим изолятам - возбудителям инвазивных микозов (рис. 2, таблицы 2, 3).Sa-HFB 1 exhibits pronounced antifungal activity against yeast fungi, including clinical isolates that cause invasive mycoses (Fig. 2, Tables 2, 3).

МПК Sa-HFB 1 для Cryptococcus neoformans 297 м составляет 1 мкг/мл, а в концентрации 16 мкг/мл он ингибирует С. albicans 1582 м, 8 мкг/мл A. fumigatus 390 м (таблица 3).Sa-HFB 1 MIC for Cryptococcus neoformans 297 m is 1 μg/ml, and at a concentration of 16 μg/ml it inhibits C. albicans 1582 m, 8 μg/ml A. fumigatus 390 m (table 3).

Список литературы:Bibliography:

1. Aimanianda, V.; Latge, J.P. Fungal hydrophobins form a sheath preventing immune recognition of airborne conidia // Virulence. 2010. V. 1. T. 3. P. 185-187.1. Aimanianda, V.; Latge, J.P. Fungal hydrophobins form a sheath preventing immune recognition of airborne conidia // Virulence. 2010. V. 1. T. 3. P. 185-187.

2. Bayry, J.; Aimanianda, V.; Guijarro, J.I.; Sunde, M.; Latge, J.P. Hydrophobins-unique fungal proteins // PLoS Pathog. 2012. V. 8. T. 5. el002700.2 Bayry, J.; Aimanianda, V.; Guijarro, J.I.; Sunde, M.; Latge, J.P. Hydrophobins-unique fungal proteins // PLoS Pathog. 2012. V. 8. T. 5. el002700.

3. Berdy, J. Bioactive microbial metabolites. A personal view. // J. Antibiot. 2005. V. 58. Т. LP. 1-26.3. Berdy, J. Bioactive microbial metabolites. A personal view. // J. Antibiot. 2005. V. 58. T. LP. 1-26.

4. Butler, M.S; Blaskovich, M.A.; Cooper, M.A. Antibiotics in the clinical pipeline at the end of 2015 // The Journal of Antibiotics. 2017. V. 70. Т. LP. 3-24.4. Butler, M.S.; Blaskovich, M.A.; Cooper, M.A. Antibiotics in the clinical pipeline at the end of 2015 // The Journal of Antibiotics. 2017. V. 70. T. LP. 3-24.

5. Cai, F.; Gao, R.; Zhao, Z.; Ding, M.; Jiang, S.; Yagtu, C; Zhu, H.; Zhang, J.; Ebner, Т.; Mayrhofer-Reinhartshuber, M.; Kainz, P.; Chenthamara, K.; Akcapinar, G.B.; Shen, Q.; Druzhinina, I.S. Evolutionary compromises in fungal fitness: hydrophobins can hinder the adverse dispersal of conidiospores and challenge their survival // The ISME Journal. 2020. V. 14. T. 10. P. 2610-2624.Егоров, H.C. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров - Москва : Наука, 2004. - 528 с.5 Cai, F.; Gao, R.; Zhao, Z.; Ding, M.; Jiang, S.; Yagtu, C; Zhu, H.; Zhang, J.; Ebner, T.; Mayrhofer-Reinhartshuber, M.; Kainz, P.; Chenthamara, K.; Akcapinar, G. B.; Shen, Q.; Druzhinina, I.S. Evolutionary compromises in fungal fitness: hydrophobins can hinder the adverse dispersal of conidiospores and challenge their survival // The ISME Journal. 2020. V. 14. T. 10. P. 2610-2624. Egorov, H.C. Fundamentals of the doctrine of antibiotics / N.S. Egorov - Moscow: Nauka, 2004. - 528 p.

6. Deshpande, A.D.; Baheti, K.G.; Chatterjee, N.R. Degradation of b-lactam antibiotics // Current science. 2004. V. 87. T. 12. P. 1684-1695.6. Deshpande, A.D.; Baheti, K.G.; Chatterjee, N.R. Degradation of b-lactam antibiotics // Current science. 2004. V. 87. T. 12. P. 1684-1695.

7. Grum-Grzhimaylo, A.A.; Debets, A.J.M.; van Diepeningen, A.D.; Georgieva, M.L.; Bilanenko, E.N. Sodiomyces alkalinus, a new holomorphic alkaliphilic ascomycete within the Plectosphaerellaceae // Persoonia. 2013. V. 31. P. 147-158.7. Grum-Grzhimaylo, A.A.; Debets, A.J.M.; van Diepeningen, A.D.; Georgiev, M. L.; Bilanenko, E.N. Sodiomyces alkalinus, a new holomorphic alkaliphilic ascomycete within the Plectosphaerellaceae // Persoonia. 2013. V. 31. P. 147-158.

8. Grum-Grzhimaylo, A.A.; Falkoski, D.L.; van den Heuvel, J.; Valero-Jiménez, C.A.; Min, В.; Choi, I.-G.; Lipzen, A.; Daum, C.G.; Aanen, D.K.; Tsang, A.; Henrissat, В.; Bilanenko, E.N.; de Vries, R.P.; van Kan, J.A.L.; Grigoriev, I.G.; Debets, A.J.M. The obligate alkalophilic soda-lake fungus Sodiomyces alkalinus has shifted to a protein diet // Mol. Ecol. 2018. V. 27. P. 4808-4819.8. Grum-Grzhimaylo, A.A.; Falkoski, D.L.; van den Heuvel, J.; Valero-Jiménez, C.A.; Min, W.; Choi, I.-G.; Lipzen, A.; Daum, C.G.; Aanen, D.K.; Tsang, A.; Henrissat, W.; Bilanenko, E.N.; deVries, R.P.; van Kan, J.A.L.; Grigoriev, I. G.; Debets, A.J.M. The obligate alkalophilic soda-lake fungus Sodiomyces alkalinus has shifted to a protein diet // Mol. ecol. 2018. V. 27. P. 4808-4819.

9. Hozzein, W.N.; Ali, M.I.A.; Ahmed, M.S. Antimicrobial activities of some alkaliphilic and alkaline-resistant microorganisms isolated from Wadi Araba, the eastern desert of Egypt. // Life Science Journal. 2013. V. 4. Т. 1. P. 1823-1828.9 Hozzein, W. N.; Ali, M.I.A.; Ahmed, M.S. Antimicrobial activities of some alkaliphilic and alkaline-resistant microorganisms isolated from Wadi Araba, the eastern desert of Egypt. // Life Science Journal. 2013. V. 4. T. 1. P. 1823-1828.

10. Ibrar, M.; Ullah, M.W.; Manan, S.; Farooq, U.; Rafiq, M.; Hasan F. Fungi from the extremes of life: an untapped treasure for bioactive compounds // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2020. V. 104. T. 7. P. 2777-2801.10. Ibrar, M.; Ullah, M. W.; Manan, S.; Farooq, U.; Rafiq, M.; Hasan F. Fungi from the extremes of life: an untapped treasure for bioactive compounds // Appl. microbiol. Biotechnol. 2020. V. 104. T. 7. P. 2777-2801.

11. Imhoff, J.F. Natural Products from Marine Fungi - Still an Underrepresented Resource // Marine Drugs. 2016. V. 14. Т. 1. P. 19-37.11. Imhoff, J.F. Natural Products from Marine Fungi - Still an Underrepresented Resource // Marine Drugs. 2016. V. 14. T. 1. P. 19-37.

12. Rogozhin, E.A.; Sadykova, V.S.; Baranova, A.A.; Vasilchenko, A.S.; Lushpa, V.A.; Mineev, K.S.; Georgieva, M.L.; Kul'ko, A.B.; Krasheninnikov, M.E.; Lyundup, A.V.; Vasilchenko, A.V.; Andreev, Y. A. A novel lipopeptaibol Emericellipsin A with antimicrobial and antitumor activity produced by the extremophilic fungus Emericellopsis alkalina II Molecules. 2018. V. 23 (11). T. 2785. P. 1-12.12. Rogozhin, E.A.; Sadykova, V.S.; Baranova, A.A.; Vasilchenko, A.S.; Lushpa, V.A.; Mineev, K.S.; Georgiev, M. L.; Kul'ko, A.B.; Krasheninnikov, M.E.; Lyundup, A.V.; Vasilchenko, A.V.; Andreev, Y. A. A novel lipopeptaibol Emericellipsin A with antimicrobial and antitumor activity produced by the extremophilic fungus Emericellopsis alkalina II Molecules. 2018. V. 23 (11). T. 2785. P. 1-12.

13. Sadykova V.S., Gavryushina I.A., Kuvarina A.E., Markelova N.N., Sedykh N.G., Georgieva M.L., Barashkova A.C. and Rogozhin E.A. Antimicrobic activity of the lipopeptide emericellipsin A isolated from Emericellopsis alkalina against biofilm-forming bacteria // Applied Biochemistry and Microbiology. 2020. V. 56. N. 3. P. 292-297.13. Sadykova V.S., Gavryushina I.A., Kuvarina A.E., Markelova N.N., Sedykh N.G., Georgieva M.L., Barashkova A.C. and Rogozhin E.A. Antimicrobic activity of the lipopeptide emericellipsin A isolated from Emericellopsis alkalina against biofilm-forming bacteria // Applied Biochemistry and Microbiology. 2020. V. 56. N. 3. P. 292-297.

14. Sánchez, S.; Demain, A.L. The amazing world of antibiotics. // Biochemical Pharmacology. 2017. V. 133. T. 1-3. P. 1-11.14. Sanchez, S.; Demain, A.L. The amazing world of antibiotics. // Biochemical Pharmacology. 2017. V. 133. T. 1-3. P. 1-11.

15. Zhang, S.; Xia, Y.X.; Kim, В.; Keyhani, N.O. Two hydrophobins are involved in fungal spore coat rodlet layer assembly and each play distinct roles in surface interactions, development and pathogenesis in the entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana II Mol. Microbiol. 2011. V. 80. P. 811-826.15. Zhang, S.; Xia, Y.X.; Kim, W.; Keyhani, N.O. Two hydrophobins are involved in fungal spore coat rodlet layer assembly and each play distinct roles in surface interactions, development and pathogenesis in the entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana II Mol. microbiol. 2011. V. 80. P. 811-826.

16. Садыкова, B.C.; Рогожин, E.A.; Баранова, A.A.; Георгиева, М.Л.; Биланенко, Е.Н.; Васильченко, A.C. Штамм Emericellopsis alkalina Bilanenko & Georgieva - продуцент антибиотиков - пептаиболов с антигрибной и антибактериальной активностью // Патент на изобретение RU 2704421 С1, 28.10.2019. Заявка №2019113489 от 06.05.2019.16. Sadykova, B.C.; Rogozhin, E.A.; Baranova, A.A.; Georgieva, M.L.; Bilanenko, E.N.; Vasilchenko, A.S. Strain Emericellopsis alkalina Bilanenko & Georgieva - producer of antibiotics - peptaibols with antifungal and antibacterial activity // Patent for invention RU 2704421 C1, 10/28/2019. Application No. 2019113489 dated 05/06/2019.

17. Садыкова, B.C.; Рогожин, Е.А.; Баранова, А.А.; Георгиева, М.Л.; Биланенко, Е.Н.; Гаврюшина, И.А.; Васильченко, А.С.Способ получения противогрибкового антибиотика Эмерициллипсина А // Патент на изобретение RU 2710377 С1, 26.12.2019. Заявка №2019104723 от 20.02.2019.17. Sadykova, B.C.; Rogozhin, E.A.; Baranova, A.A.; Georgieva, M.L.; Bilanenko, E.N.; Gavryushina, I.A.; Vasilchenko, A.S. Method for obtaining the antifungal antibiotic Emericillipsin A // Patent for invention RU 2710377 C1, 12/26/2019. Application No. 2019104723 dated February 20, 2019.

Claims

1. Application of the strain Sodiomyces alkalinus VKM F-3762 as a producer of an antifungal peptide antibiotic active against pathogens of invasive mycoses with multiple resistance.

2. Application of hydrophobin Sa-HFB1 obtained from the strain Sodiomyces alkalinus VKM F-3762 with the amino acid sequence

TYIACPISLY GNAQCCATDI LGLANLDCES PTDVPRDAGH 40 FQRTCADVGK RARCCAIPVL GQALLCIQPA GAN 73,

as an antifungal antibiotic active against pathogens of invasive mycoses with multiple resistance.