RU2763933C1 - Test system for identifying a mutation in the btpkd gene of the domestic dog (canis lupus familiaris), causing polycystic kidney disease - Google Patents

Test system for identifying a mutation in the btpkd gene of the domestic dog (canis lupus familiaris), causing polycystic kidney disease Download PDF

Info

Publication number
RU2763933C1
RU2763933C1 RU2020143074A RU2020143074A RU2763933C1 RU 2763933 C1 RU2763933 C1 RU 2763933C1 RU 2020143074 A RU2020143074 A RU 2020143074A RU 2020143074 A RU2020143074 A RU 2020143074A RU 2763933 C1 RU2763933 C1 RU 2763933C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
gene
btpkd
kidney disease
test system
polycystic kidney
Prior art date
Application number
RU2020143074A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Юлия Викторовна Мукий
Денис Игоревич Богомаз
Ольга Андреевна Павлова
Иван Артемьевич Владимиров
Original Assignee
Юлия Викторовна Мукий
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Юлия Викторовна Мукий filed Critical Юлия Викторовна Мукий
Priority to RU2020143074A priority Critical patent/RU2763933C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2763933C1 publication Critical patent/RU2763933C1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: described is a test system for identifying a mutation (SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A) in the BTPKD gene, causing polycystic kidney disease in dogs. The test system includes a mixture for conducting a polymerase chain reaction using the developed primers, Taqman probes of the diagnosed allele, and "plug" oligonucleotides for another allele, presented below: Primer F - CCTCAAGCCTGTCCATCTGT; Primer R - GGAGAGCCAGATGTGCTTGT; Probe mut - FAM-TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-BHQ1; Plug wt - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-NH2; Probe wt - FAM - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-BHQ1; Plug mut - TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-NH2.
EFFECT: invention expands the range of means of identifying mutations causing polycystic kidney disease in dogs.
1 cl, 2 dwg, 1 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к области ветеринарной генетики и биотехнологии.The invention relates to the field of veterinary genetics and biotechnology.

Известна мутация в гене BTPKD (SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A) собаки домашней (Canis lupus familiaris), вызывающая поликистоз почек.There is a known mutation in the BTPKD gene (SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A) of a domestic dog (Canis lupus familiaris), which causes polycystic kidney disease.

Однако для детекции этой мутации необходимо создание тест-ситемы на определение собак-носителей данной мутации или собак, больных поликистозом.However, to detect this mutation, it is necessary to create a test system to identify dogs carrying this mutation or dogs with polycystic disease.

Техническим результатом является обеспечение достоверной диагностики поликистоза почек у собак, вызванной мутацией в гене BTPKD.The technical result is to provide a reliable diagnosis of polycystic kidney disease in dogs caused by a mutation in the BTPKD gene.

Технический результат достигается тем, что в тест-системе для выявления мутации в гене BTPKD, вызывающей поликистоз почек у собак включающую амплификационную смесь для проведения полимеразной цепной реакции, состоящую из 1х буфера с сульфатом аммония, Taq-полимеразы, смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), магния хлорида используют разработанные праймеры, Taqman зонды диагностируемой аллели, а также олигонуклеотид-«заглушку» для другой аллели, имеющими следующие последовательности:The technical result is achieved by the fact that in a test system for detecting a mutation in the BTPKD gene that causes polycystic kidney disease in dogs, it includes an amplification mixture for carrying out a polymerase chain reaction, consisting of 1x buffer with ammonium sulfate, Taq polymerase, a mixture of deoxynucleotide triphosphates (dNTP), magnesium chloride using the developed primers, Taqman probes of the diagnosed allele, as well as a stub oligonucleotide for another allele, having the following sequences:

Праймер F - CCTCAAGCCTGTCCATCTGTPrimer F - CCTCAAGCCTGTCCATCTGT

Праймер R - GGAGAGCCAGATGTGCTTGTPrimer R - GGAGAGCCAGATGTGCTTGT

Зонд mut - FAM-TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-BHQ1Probe mut - FAM-TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-BHQ1

Заглушка wt - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-NH2 Plug wt - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-NH 2

Зонд wt - FAM - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-BHQ1Probe wt - FAM - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-BHQ1

Заглушка mut - TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-NH2,Plug mut - TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-NH 2 ,

а также контрольные образцы на дикотипный и мутантный вариант фрагмента гена BTPKD.as well as control samples for the wild-type and mutant variant of the BTPKD gene fragment.

В качестве контролей созданы две генетические конструкции - плазмиды, содержащие дикотипный и мутантный вариант фрагмента гена BTPKD. Положительный контроль для дикотипных диагностических систем получили путем амплификации фрагмента гена, полученный из ДНК здоровой собаки и его клонирования в вектор pJet1.2, мутантный вариант изготовили путем синтеза синтетической последовательности ДНК с последующим клонированием ее в вектор pJet1.2. ДНК гетерозиготы по мутации имитирована путем эквимолярного смешивания плазмид обоих типов после измерения их концентрации на электрофорезе в агарозном геле.As controls, two genetic constructs were created - plasmids containing a wild-type and a mutant version of the BTPKD gene fragment. A positive control for wildtype diagnostic systems was obtained by amplifying a gene fragment obtained from healthy dog DNA and cloning it into the pJet1.2 vector; a mutant variant was prepared by synthesizing a synthetic DNA sequence followed by cloning it into the pJet1.2 vector. Heterozygous DNA for the mutation was simulated by equimolar mixing of both types of plasmids after measuring their concentration on agarose gel electrophoresis.

В качестве матрицы использовали 1 мкл разбавленного раствора контрольной плазмиды (исходная плазмида 50 гн/мкл разбавлялась 1:10000) с фрагментом гена дикого типа, с фрагментом мутантной аллели гена или их смеси, имитирующей гетерозиготу. «Преимущества клонирования ПЦР-продукта в вектор» заключается в устойчивом долговременном хранении контрольных матриц в виде плазмиды внутри бактериального штамма, с неограниченной возможностью копирования и наработки.As a template, 1 μl of a diluted solution of a control plasmid (initial plasmid 50 gn/μl was diluted 1:10,000) with a wild-type gene fragment, a fragment of a mutant gene allele, or a mixture of both mimicking a heterozygote was used. The "advantages of cloning a PCR product into a vector" lies in the stable long-term storage of control templates in the form of a plasmid inside a bacterial strain, with an unlimited possibility of copying and production.

Реакционная смесь для ПЦР-РВ в варианте с «заглушками» разделена на два объема, каждый из которых содержит: Праймер прямой (F), Праймер обратный (R), Зонд, комплементарный одной из аллелей (wt - дикий тип, mut - мутантная аллель), Олигонуклеотид - заглушку, комплементарный другой аллели. В качестве контроля используют 2 вида матриц: для дикой аллели, для мутантной аллели. Детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда. Применение «заглушек» и раздельная детекция аллелей в двух независимых реакционных объемах дает возможность достижения наилучшего баланса между специфичностью и эффективностью системы и точной подстройки специфичности с помощью изменения соотношения концентраций зонда и «заглушки». Такая постановка ПЦР-РВ позволяет быстро установить в изучаемых образцах ДНК наличие трех вариантов генотипов, и, следовательно, выявить наличие или отсутствие мутантной аллели и определить наличие, отсутствие патологии или носительство.The reaction mixture for real-time PCR in the version with “plugs” is divided into two volumes, each of which contains: Forward primer (F), Reverse primer (R), Probe complementary to one of the alleles (wt - wild type, mut - mutant allele ), Oligonucleotide - stub, complementary to another allele. As a control, 2 types of matrices are used: for the wild allele, for the mutant allele. Detection of amplification products is carried out using the principle of cleavage of a fluorescent label at the 5' end of the oligonucleotide probe. The use of "stubs" and separate detection of alleles in two independent reaction volumes makes it possible to achieve the best balance between the specificity and efficiency of the system and fine-tune specificity by changing the ratio of probe and "stub" concentrations. Such a RT-PCR setup makes it possible to quickly establish the presence of three variants of genotypes in the studied DNA samples, and, therefore, to identify the presence or absence of a mutant allele and determine the presence, absence of pathology or carriage.

Использование разных видов контроля в виде матриц, специфических праймеров, зондов и «звглушек» к разным вариантам генома (на мутантную и дикую аллели) позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирке.The use of different types of control in the form of templates, specific primers, probes, and plugs for different genome variants (for mutant and wild alleles) makes it possible to control the correct progress of the reaction in each tube.

При конструировании праймеров, зондов и заглушек выполнены требования: высокая степень гомологии с исследуемыми вариантами мутации гена, отсутствие участков отжигающихся «сами на себя», отсутствие «шпилек», что подтверждено результататами програмной проверки специфичности связывания праймеров и гибридизационных зондов, программной проверки олигонуклеотидов на возможность образования шпилек и димеров.When designing primers, probes, and stubs, the following requirements were met: a high degree of homology with the studied variants of the gene mutation, the absence of regions annealing "on themselves", the absence of "hairpins", which was confirmed by the results of software testing of the binding specificity of primers and hybridization probes, software testing of oligonucleotides for the possibility formation of hairpins and dimers.

Конструирование специфических праймеров, зондов и «заглушек» осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей, опубликованный на ресурсе GeneBank и подбора условий для проведения РВ-ПЦР с применением разработанных праймеров, зондов, несущих флуорохром и гаситель флуоресценции и «заглушек» комплементарных части амплифицируемого фрагмента.The design of specific primers, probes and "stubs" was carried out using computer programs based on the analysis of nucleotide sequences published on the GeneBank resource and the selection of conditions for conducting RT-PCR using the developed primers, probes carrying a fluorochrome and a fluorescence quencher and "stubs" of the complementary part amplified fragment.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательный уровень».The features that distinguish the claimed technical solution are aimed at achieving a technical result and have not been identified in the study of this and related fields of science and technology and, therefore, meet the criterion of "inventive step".

Сущность изобретения поясняется фиг. 1 «Результаты ПЦР-РВ для детекции мутантной аллели BTPKD (3:1)» и фиг. 2 «Результаты ПЦР-РВ для детекции дикотипной аллели BTPKD (3:1)», где представлен скриншот результатов ПЦР-РВ в виде графиков, отражающих варианты детекции дикотипной, мутантной аллели и варианта гетерозиготного генотипа.The essence of the invention is illustrated in Fig. 1 "RT-PCR results for the detection of the BTPKD (3:1) mutant allele" and FIG. 2 “RT-PCR results for BTPKD (3:1) wild-type allele detection”, which shows a screenshot of the RT-PCR results in the form of graphs showing the detection options for the wild-type, mutant allele and heterozygous genotype variant.

Пример конкретного использования тест-системы для выявления мутации в гене BTPKD у собак.An example of a specific use of the test system to detect mutations in the BTPKD gene in dogs.

Исследование состоит из трех этапов:The study consists of three stages:

1. Выделение ДНК из биоматериала (соскобов энетеробуккального эпителия).1. Isolation of DNA from the biomaterial (scrapings of the enterobuccal epithelium).

2. Проведение ПЦР-РВ.2. Real-time PCR.

3. Интерпретация полученных результатов.3. Interpretation of the obtained results.

1. Для исследования у собак берут пробу энтеробуккального эпителия. Выделение тотальной ДНК собаки домашней производилось методом, с применением бромида цетилтриметиламмония (ЦТАБ).1. For research, a sample of enterobuccal epithelium is taken from dogs. The isolation of the total DNA of a domestic dog was carried out by the method using cetyltrimethylammonium bromide (CTAB).

Состав буфера: 1,4 М NaCl, 0,02 М ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 0,1М Трис - HCl с рН=8,0 (гидроксиметиламинометана гидрохлорид), дистиллированная вода.Buffer composition: 1.4 M NaCl, 0.02 M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.1M Tris-HCl pH=8.0 (hydroxymethylaminomethane hydrochloride), distilled water.

Материал (соскоб буккального эпителия) переносили в пробирку типа Eppendorf объемом 1,5 мл, с добавлением 1 мл экстрагирующего буфера. После чего образец инкубировали на +56°C в течение 40 минут, с периодическим перемешиванием содержимого. После инкубации в пробирку добавляли 0,5 мл хлороформа, выдерживали 40 минут при комнатной температуре, содержимое пробирки постоянно перемешивали. Центрифугировали в течение 5 минут при 10000 об/мин. Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку типа Eppendorf объемом 1,5 мл, добавляли 2/3 объема изопропилового спирта, перемешивали. Далее выдерживали при комнатной температуре 30 минут для преципитации ДНК. Центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин. Супернатант сливали и промывали осадок 80% этанолом. Повторно центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин. После удаления супернатанта, осадок нуклеиновой кислоты высушивали при комнатной температуре, затем растворяли его в 60 мкл стерильной деионизированной воды, хранили полученный образец ДНК при -20°C.The material (scraping of buccal epithelium) was transferred into a 1.5 ml Eppendorf tube with the addition of 1 ml of extraction buffer. After that, the sample was incubated at +56°C for 40 minutes, with periodic mixing of the contents. After incubation, 0.5 ml of chloroform was added to the tube, kept for 40 minutes at room temperature, the contents of the tube were constantly stirred. Centrifuged for 5 minutes at 10,000 rpm. The upper phase was transferred into a clean 1.5 ml Eppendorf tube, 2/3 volume of isopropyl alcohol was added, and mixed. Then kept at room temperature for 30 minutes for DNA precipitation. Centrifuged for 10 minutes at 10,000 rpm. The supernatant was discarded and the precipitate was washed with 80% ethanol. Centrifuged again for 10 minutes at 10,000 rpm. After removing the supernatant, the nucleic acid precipitate was dried at room temperature, then dissolved in 60 µl of sterile deionized water, and the resulting DNA sample was stored at -20°C.

2. Апробацию диагностической системы производили в ПЦР-РВ анализаторе нуклеиновых кислот АНК-16 (Сертификат соответствия № РОСС RU.ME01. Н00423, Институт аналитического приборостроения РАН, Россия). Реакцию проводили в объеме 20 мкл. Амплификационная смесь содержит: 2 мкл 10 х буфер с сульфатом аммония для Taq-полимеразы, 0,125 мМ смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), 0,25 мкМ праймер прямой, 0,25 мкМ праймер обратный, 0,125е.а/мкл Taq-полимераза, 2,5 мМ магния хлорид, 0,125 мкМ Taqman зонда диагностируемой аллели, а также олигонуклеотид-«заглушку» для другой аллели в объеме 0,250 мкМ. Все используемые реактивы производства ООО «Бигль», Россия. В качестве матрицы в смесь добавляли 1 мкл разбавленного раствора контрольной плазмиды (с фрагментом гена дикого типа, с фрагментом мутантной аллели гена или их смеси, имитирующей гетерозиготу. После первоначальной денатурации при 94°C в течение 200 с 40 циклов амплификации проводили в следующем температурно-временном режиме: денатурация - 94°C, 18 с, отжиг праймеров - 60°C, 40 с, элонгация - 72°C, 40 с.2. Approbation of the diagnostic system was carried out in the RT-PCR ANK-16 nucleic acid analyzer (Certificate of Conformity No. ROSS RU.ME01. H00423, Institute of Analytical Instrumentation, Russian Academy of Sciences, Russia). The reaction was carried out in a volume of 20 μl. Amplification mix contains: 2 µl 10 x ammonium sulfate Taq polymerase buffer, 0.125 mM deoxynucleotide triphosphate (dNTP) mixture, 0.25 µM forward primer, 0.25 µM reverse primer, 0.125 e.a/µl Taq polymerase, 2 .5 mM magnesium chloride, 0.125 µM Taqman probe of the diagnosed allele, and a 0.250 µM stub oligonucleotide for the other allele. All reagents used are manufactured by Beagle LLC, Russia. As a template, 1 μl of a diluted solution of a control plasmid (with a wild-type gene fragment, a mutant allele gene fragment, or a mixture of both mimicking a heterozygote) was added to the mixture. After initial denaturation at 94°C for 200 s, 40 cycles of amplification were time mode: denaturation - 94°C, 18 s, primer annealing - 60°C, 40 s, elongation - 72°C, 40 s.

Тест-система позволяет специфически амплифицировать фрагмент гена BTPKD, для установления генотипа собаки в мультиплексной полимеразной цепной реакции.The test system allows specifically amplifying a fragment of the BTPKD gene to determine the dog's genotype in a multiplex polymerase chain reaction.

Система состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР и комплекта контрольных образов.The system consists of a set of reagents for multiplex PCR and a set of control samples.

Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок пробирку типа Eppendorf объемом 1,5 мл, включая пробирки с матрицами и отрицательным контролем. Во все пробирки вносят реакционную смесь и добавляют исследуемые образцы ДНК в количестве 1 мкл, в отдельные пробироки вносят 1 мкл матрицы - разбавленного раствора контрольной плазмиды с фрагментом гена дикого типа, с фрагментом мутантной аллели гена. В пробирку для отрицательного контроля вносят 1 мл дистиллированной воды.Select the required number of disposable 1.5 ml Eppendorf type tubes, including tubes with matrices and negative control. The reaction mixture is added to all tubes and the studied DNA samples are added in the amount of 1 μl, 1 μl of the matrix - a diluted solution of the control plasmid with a wild-type gene fragment, with a fragment of the mutant allele of the gene - is added to separate tubes. Add 1 ml of distilled water to the negative control tube.

3. Интерпретация результатов анализа.3. Interpretation of the results of the analysis.

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала - анализируются с помощью программного обеспечения используемого генетического анализатора для проведения ПЦР-РВ АНК-16, согласно прилагаемой инструкции производителя.The obtained data - fluorescent signal accumulation curves - are analyzed using the software of the used genetic analyzer for conducting PCR-RT ANK-16, according to the attached manufacturer's instructions.

В таблице 1 представлены данные, по которым можно установить существенную разницу в эффективности специфической и неспецифической реакции. Эффективность рассчитана ПО прибора АНК-16.Table 1 presents data that can be used to establish a significant difference in the effectiveness of a specific and non-specific reaction. Efficiency calculated by ANK-16 device software.

Figure 00000001
Figure 00000001

Таким образом, для выявления собак-носителей (генотип GA) мутации в гене BTPKD(SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A), а также животных, больных поликистозом (гнотип АА) можно использовать разработанную тест систему. При наличии генотипа дикого типа (GG), т.е. животное здоровое на графике фиг. 2 результат будет отображаться в виде графика wt/wt. Если собака является носителем мутантной аллели (генотип GA), то результат детекции будет соответствовать графику mut/wt, представленном на фиг. 1 и фиг. 2. При наличии мутации в гомозиготном состоянии (поликистоз, генотип АА), график будет соответствовать, представленному на фиг. 1 и фиг. 2 как mut/ mut.Thus, to identify dogs carrying (GA genotype) a mutation in the BTPKD gene (SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A), as well as animals with polycystic disease (AA gnotype), the developed test system can be used. In the presence of the wild-type (GG) genotype, i.e. a healthy animal in the graph of Fig. 2 the result will be displayed as a wt/wt graph. If the dog is a carrier of the mutant allele (GA genotype), then the detection result will correspond to the mut/wt plot shown in FIG. 1 and FIG. 2. If there is a mutation in the homozygous state (polycystic, AA genotype), the graph will correspond to that shown in Fig. 1 and FIG. 2 as mut/ mut.

Заявляемую тест-систему рекомендовано использовать в ветеринарной генетике, а именно к средствам выявления носительства или диагностики заболевания поликистоз почек, вызванный мутацией в гене BTPKD у собак породы английский бультерьер, керн-терьер, вест-хайленд-вайт терьер или малинуа, что соответствует уровню «промышленная применимость».The inventive test system is recommended for use in veterinary genetics, namely for the means of detecting carriage or diagnosing the disease of polycystic kidney disease caused by a mutation in the BTPKD gene in dogs of the breed English Bull Terrier, Cairn Terrier, West Highland White Terrier or Malinois, which corresponds to the level of " industrial applicability.

Claims (7)

Тест-система для выявления мутации (SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A) в гене BTPKD (Bull Terriers Polycystic Kidney Disease), вызывающей поликистоз почек у собак, включающая амплификационную смесь для проведения полимеразной цепной реакции, состоящую из десятикратного (10х) буфера с сульфатом аммония, Taq-полимеразы, смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), магния хлорида, а также разработанных праймеров, разработанных Taqman зондов диагностируемой аллели и разработанных олигонуклеотидов-«заглушек» для другой аллели, представленных ниже:Test system for detection of mutations (SNP: 6:38856816; NC_006588.3:g.38856816G>A) in the BTPKD (Bull Terriers Polycystic Kidney Disease) gene that causes polycystic kidney disease in dogs, including an amplification mixture for polymerase chain reaction, consisting from tenfold (10x) ammonium sulfate buffer, Taq polymerase, a mixture of deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), magnesium chloride, as well as developed primers, developed by Taqman probes for the diagnosed allele and developed oligonucleotides-"stubs" for the other allele, presented below: Праймер F - CCTCAAGCCTGTCCATCTGTPrimer F - CCTCAAGCCTGTCCATCTGT Праймер R - GGAGAGCCAGATGTGCTTGTPrimer R - GGAGAGCCAGATGTGCTTGT Зонд mut - FAM-TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-BHQ1Probe mut - FAM-TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-BHQ1 Заглушка wt - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-NH2 Plug wt - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-NH 2 Зонд wt - FAM - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-BHQ1Probe wt - FAM - CCTCGTGGCCGAGCTGCAG-BHQ1 Заглушка mut - TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-NH2.Stub mut - TCCTCGTGGCCAAGCTGCAG-NH 2 .
RU2020143074A 2020-12-24 2020-12-24 Test system for identifying a mutation in the btpkd gene of the domestic dog (canis lupus familiaris), causing polycystic kidney disease RU2763933C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020143074A RU2763933C1 (en) 2020-12-24 2020-12-24 Test system for identifying a mutation in the btpkd gene of the domestic dog (canis lupus familiaris), causing polycystic kidney disease

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020143074A RU2763933C1 (en) 2020-12-24 2020-12-24 Test system for identifying a mutation in the btpkd gene of the domestic dog (canis lupus familiaris), causing polycystic kidney disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2763933C1 true RU2763933C1 (en) 2022-01-11

Family

ID=80040328

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020143074A RU2763933C1 (en) 2020-12-24 2020-12-24 Test system for identifying a mutation in the btpkd gene of the domestic dog (canis lupus familiaris), causing polycystic kidney disease

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2763933C1 (en)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006320355A1 (en) * 2005-12-01 2007-06-07 Bioarts & Research Corp. Online marketplace for animal genetics
RU2458131C1 (en) * 2010-12-07 2012-08-10 Федеральное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта Test system for mutation detection in human fumarylacetoacetate hydrolase and alpha-1-antitrypsin genes
WO2020186154A1 (en) * 2019-03-14 2020-09-17 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for supporting renal health

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006320355A1 (en) * 2005-12-01 2007-06-07 Bioarts & Research Corp. Online marketplace for animal genetics
RU2458131C1 (en) * 2010-12-07 2012-08-10 Федеральное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта Test system for mutation detection in human fumarylacetoacetate hydrolase and alpha-1-antitrypsin genes
WO2020186154A1 (en) * 2019-03-14 2020-09-17 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for supporting renal health
US11013705B2 (en) * 2019-03-14 2021-05-25 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for supporting renal health

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PUYA GHARAHKHANI et al. A Non-Synonymous Mutation in the Canine Pkd1 Gene Is Associated with Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease in Bull Terriers. PLoS ONE, 6(7), e22455. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Collins et al. Developmental validation of a single-tube amplification of the 13 CODIS STR loci, D2S1338, D19S433, and amelogenin: the AmpFℓSTR® Identifiler® PCR amplification kit
Mohamad et al. Comparison of gene nature used in real-time PCR for porcine identification and quantification: A review
EP2660331B1 (en) Method for single cell genome analysis and kit therefor
KR102018122B1 (en) Biomarkers for Individual confirmation of Hanwoo Beef and uses thereof
JP6234463B2 (en) Nucleic acid multiplex analysis method
RU2700480C1 (en) Test system for determining species affiliation of tissues of chickens and pigs in food raw materials, fodder and food products
AU2003258012A1 (en) Methods and compositions for genotyping
England et al. Sexing chickens (Gallus gallus domesticus) with high-resolution melting analysis using feather crude DNA
Zhang et al. A new multiplex assay of 17 autosomal STRs and Amelogenin for forensic application
US20200216903A1 (en) Mitochondrial Disease Genetic Diagnostics
US8012691B2 (en) Multiplex compositions and methods for quantification of human nuclear DNA and human male DNA and detection of PCR inhibitors
RU2763933C1 (en) Test system for identifying a mutation in the btpkd gene of the domestic dog (canis lupus familiaris), causing polycystic kidney disease
Mattarucchi et al. Different real time PCR approaches for the fine quantification of SNP's alleles in DNA pools: assays development, characterization and pre-validation
Ji et al. A method for determining zygosity of transgenic zebrafish by TaqMan real-time PCR
Kipen et al. Analysis of HEPH gene polymorphism on the x chromosome for identification of wild boar and domestic pig
JP7541586B2 (en) PCR method and PCR kit for enhancing allele discrimination
Soejima et al. Selective quantification of human DNA by real-time PCR of FOXP2
RU2725539C1 (en) Test system for identification of dna tissues of rats and mice in dry fodder and meat semi-products
Kanchanaphum Identification of human DNA by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique combined with white ring precipitation of Cu (OH) 2
Naaum et al. An introduction to DNA-based tools for seafood identification
Sukumolanan et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay coupled with a lateral flow dipstick test for detection of myosin binding protein C3 A31P mutation in maine coon cats
Losi et al. An alternative method to isoenzyme profile for cell line identification and interspecies cross-contaminations: cytochrome b PCR-RLFP analysis
KR101520502B1 (en) Single Nucleotide Polymorphism Markers in Swine and Method for Determination of Domestic Pork Origin by Using the Same
Bhattacharya Application of genomics tools in meat quality evaluation
RU2809553C1 (en) Method for determining fgfr3 gene alleles using real-time pcr method