RU2763400C1 - Method for suppressing the adhesive properties of cholera vibrio - Google Patents

Method for suppressing the adhesive properties of cholera vibrio Download PDF

Info

Publication number
RU2763400C1
RU2763400C1 RU2020142829A RU2020142829A RU2763400C1 RU 2763400 C1 RU2763400 C1 RU 2763400C1 RU 2020142829 A RU2020142829 A RU 2020142829A RU 2020142829 A RU2020142829 A RU 2020142829A RU 2763400 C1 RU2763400 C1 RU 2763400C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
diclofenac
adhesion
chitin
cells
vibrio cholerae
Prior art date
Application number
RU2020142829A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Надежда Александровна Селянская
Сергей Олегович Водопьянов
Original Assignee
Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека filed Critical Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Priority to RU2020142829A priority Critical patent/RU2763400C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2763400C1 publication Critical patent/RU2763400C1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: proposed is a method for suppressing the adhesive properties of cholera vibrio, including introduction of 3 mg/l of diclofenac into one of two 50 ml flasks contaminated with a suspension of 104 m.c./ml of cholera vibrio and with 4 chitin plates with a size of 0.3×0.3 cm, sustaining at 28°C for up to two days; after 2-12-24-48 hours, the chitin plates are removed from the flasks, washed three times in saline solution, then each plate is placed in a 1.5 ml container with 0.5 ml of distilled water, temperature lysis of cells at 99°C for 30 minutes and DNA isolation are executed; then the amount of cholera vibrio cells in the supernatant, adhered to chitin, is determined by the PCR method in a control flask without diclofenac and in a flask with diclofenac, the adhesion indicator and the degree of suppression of adhesion of cholera vibrio cultures are calculated.
EFFECT: invention expands the scope of methods for suppressing the adhesion of cholera vibrio and evaluation thereof.
1 cl, 2 tbl, 2 ex

Description

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для снижения адгезивных свойств холерных вибрионов.The present invention relates to medical microbiology and can be used to reduce the adhesive properties of Vibrio cholerae.

Известно, что начальный этап патогенеза холеры заключается во взаимодействии с клетками эпителия тонкого кишечника путем адгезии. В тоже время известна способность холерных вибрионов формировать биопленку на твердом субстрате: камнях, хитиновых панцирях ракообразных, где холерные вибрионы переживают неблагоприятные условия внешней среды. Для человека биопленки могут являться средством инфицирования при употреблении загрязненной планктоном воды или необработанных морепродуктов. В связи с этим актуальным является поиск препаратов, снижающих адгезивную активность возбудителей, и способов ее изучения.It is known that the initial stage of the pathogenesis of cholera is the interaction with the epithelial cells of the small intestine by adhesion. At the same time, the ability of cholera vibrios to form a biofilm on a solid substrate is known: stones, chitin shells of crustaceans, where cholera vibrios survive adverse environmental conditions. For humans, biofilms can be a means of infection through the consumption of plankton-contaminated water or unprocessed seafood. In this regard, it is important to search for drugs that reduce the adhesive activity of pathogens, and ways to study it.

Известен способ ингибирования адгезии бактерий на сетчатых имплантах в комбинации с биоцидами (1). Однако этот способ не может быть применен в отношении возбудителя холеры.A known method of inhibiting the adhesion of bacteria on mesh implants in combination with biocides (1). However, this method cannot be applied to the causative agent of cholera.

Известен способ подавления пищевыми минералами адезивной способности Vibrio cholerae, включающий воздействие субингибирующих концентраций минералов: цинка, селена и марганца (2) а также способ оценки адгезивных свойств холерных вибрионов Vibrio cholerae El Tor и Vibrio cholerae O139 на клеточной культуре Hu Tu -80 (3).A known method of suppressing the adhesive ability of Vibrio cholerae with food minerals, including the effect of sub-inhibitory concentrations of minerals: zinc, selenium and manganese (2) as well as a method for assessing the adhesive properties of Vibrio cholerae El Tor and Vibrio cholerae O139 on cell culture Hu Tu -80 (3) .

Однако эти способы являются трудоемкими и требуют для изучения адгезии использования лабораторных животных или перевиваемой клеточной культуры.However, these methods are laborious and require the use of laboratory animals or continuous cell culture to study adhesion.

Известен способ моделирования биопленок, формируемых Vibrio cholerae 01 серогруппы на поверхности хитина (4), включающий использование хитина в виде пластин речного рака, на поверхности которых образуются как простые, так и сложные биопленки Vibrio cholerae, анализ последних проводят в ПЦР с использование праймеров к INDEL-локусу 1699, подтверждая присутствие клеток токсигенного штамма в составе сложной биопленки и способность колонизировать поверхность хитина.A known method for modeling biofilms formed by Vibrio cholerae 01 serogroup on the surface of chitin (4), including the use of chitin in the form of crayfish plates, on the surface of which both simple and complex Vibrio cholerae biofilms are formed, the analysis of the latter is carried out in PCR using primers to INDEL -locus 1699, confirming the presence of cells of the toxigenic strain in the complex biofilm and the ability to colonize the surface of chitin.

Однако этот способ не эффективен в возможности подавлять и изучать адгезивные свойства Vibrio cholerae, так как его задача состояла в разработке способа моделирования биопленок.However, this method is not effective in being able to suppress and study the adhesive properties of Vibrio cholerae, since its task was to develop a method for modeling biofilms.

За прототип выбран способ определения степени ингибирующей способности сахаров на процесс адгезии холерных вибрионов (5) включающий инкубацию исследуемой культуры с эритроцитами, причем адгезию холерных вибрионов проводят в присутствии ингибитора, в качестве которого используют углеводы,For the prototype, a method was chosen for determining the degree of inhibitory ability of sugars on the process of adhesion of cholera vibrios (5) including incubation of the studied culture with erythrocytes, and the adhesion of cholera vibrios is carried out in the presence of an inhibitor, which is used as carbohydrates,

Недостатком этого способа является необходимость использования эритроцитов, отсутствие возможности динамических наблюдений за влиянием веществ на процесс адгезии, а также невозможность сопоставить концентрацию адгезированных клеток с их концентрацией в свободном (планктонном) состоянии.The disadvantage of this method is the need to use erythrocytes, the lack of the possibility of dynamic observations of the influence of substances on the adhesion process, as well as the inability to compare the concentration of adherent cells with their concentration in the free (planktonic) state.

Техническая задача предполагаемого изобретения состояла в разработке нового эффективного способа подавления адгезии холерных вибрионов и ее оценки.The technical problem of the proposed invention was to develop a new effective method for suppressing the adhesion of Vibrio cholerae and its evaluation.

Поставленная техническая задача достигается тем, что в способе подавления адгезии холерных вибрионов, включающем использование препарата, понижающего экспрессию генов регуляции адгезии, в качестве ингибитора используют диклофенак в концентрации 3 мг/л, который вводят в один из двух флаконов объемом 50 мл контаминированных взвесью 104 микробных клеток холерных вибрионов/мл и 4-х хитиновых пластин размером 0,3×0,3 см, которые помещают в оба флакона и выдерживают при температуре 28°С до двух суток, а через 2-12-24-48 часов пластины хитина достают из флаконов, трехкратно промывают в физиологическом растворе, после этого каждую пластину помещают в отдельную емкость 1,5 мл, содержащую 0,5 мл дистиллированной воды, и проводят температурный лизис клеток и выделение ДНК, путем прогревания при 99°С в течение 30 мин, а затем методом ПЦР определяют количество клеток холерного вибриона в супернатанте и количество адгезированных на хитине клеток в контрольном флаконе (без диклофенака) и во флаконе с диклофенаком, затем рассчитывают показатель адгезии культур холерных вибрионов по формулеThe stated technical problem is achieved by the fact that in the method of suppressing the adhesion of Vibrio cholerae, including the use of a drug that lowers the expression of adhesion regulation genes, diclofenac is used as an inhibitor at a concentration of 3 mg/l, which is injected into one of two 50 ml vials contaminated with a suspension of 10 4 microbial cells of cholera vibrios / ml and 4 chitin plates 0.3 × 0.3 cm in size, which are placed in both vials and kept at a temperature of 28 ° C for up to two days, and after 2-12-24-48 hours chitin plates taken out of the vials, washed three times in physiological saline, after that each plate is placed in a separate container of 1.5 ml containing 0.5 ml of distilled water, and temperature lysis of cells and DNA extraction are carried out by heating at 99°C for 30 min , and then the PCR method determines the number of Vibrio cholerae cells in the supernatant and the number of cells adhered to chitin in the control flask (without diclofenac) and in the flask with diclofenac, then the adhesion index of vibrio cholerae cultures is calculated according to the formula

Figure 00000001
, где ПА - показатель адгезии;
Figure 00000001
, where PA - adhesion index;

Nx - количество ДНК, адгезированного на хитине;Nx is the amount of DNA adhered to chitin;

Nc - количесто ДНК в супернатанте,Nc is the amount of DNA in the supernatant,

причем если ПА без воздействия диклофенака больше, чем ПА в присутствии диклофенака, значит, препарат подавил адгезию, а степень подавления адгезии определяют по коэффициенту КИ по формулеmoreover, if PA without diclofenac exposure is greater than PA in the presence of diclofenac, then the drug has suppressed adhesion, and the degree of adhesion suppression is determined by the CI coefficient according to the formula

Figure 00000002
, где ПА - показатель адгезии;
Figure 00000002
, where PA - adhesion index;

ПАд - показатель адгезии в присутствии диклофенака,PAd - adhesion index in the presence of diclofenac,

при этом за слабую степень ингибирующей активности принимают КИ в пределах от 0-1,5, среднюю степень - в пределах 1,6-2,0, высокую - более 2,1.at the same time, CI ranging from 0-1.5 is taken as a weak degree of inhibitory activity, an average degree is within 1.6-2.0, a high degree is more than 2.1.

Способ осуществляется следующим образом.The method is carried out as follows.

Для проведения способа подавления адгезии холерных вибрионов используют препарат, понижающий экспрессию генов регуляции адгезии, а именно производное фенилуксусной кислоты-диклофенак в концентрации 3 мг/л (субингибирующая концентрация).To carry out the method of suppressing the adhesion of Vibrio cholerae, a drug is used that lowers the expression of adhesion regulation genes, namely, a derivative of phenylacetic acid-diclofenac at a concentration of 3 mg/l (subinhibitory concentration).

При этом в роли субстрата для адгезии холерных вибрионов применяют хитин, полученный из пластин речного рака Astacus astacus размером 0,3×0,3 см.At the same time, chitin obtained from plates of crayfish Astacus astacus 0.3 × 0.3 cm in size is used as a substrate for adhesion of cholera vibrios.

Первоначально готовят 18-часовую агаровую культуру холерных вибрионов, для этого изучаемый штамм высевают на агар Мартена и готовят взвесь по стандарту мутности до конечной концентрации 104 м.к./мл.Initially, an 18-hour agar culture of Vibrio cholerae is prepared; for this, the studied strain is sown on Marten agar and a suspension is prepared according to the turbidity standard to a final concentration of 10 4 mc/ml.

Затем в два флакона объемом 50 мл с речной автоклавированной водой, контаминированной взвесью 104 м.к./мл холерных вибрионов, помещают пластины хитина в количестве 4 шт. в каждый флакон и выдерживают при температуре 28°С до двух суток. Причем в один флакон предварительно добавляют раствор диклофенака до концентрации 3 мг/л. Через 2-12-24-48 часов пластины хитина достают из флаконов, трехкратно промывают в физиологическом растворе и каждую пластину переносят в пробирку емкостью 1,5 мл, содержащую 0,5 мл дистиллированной воды. После этого проводят температурный лизис клеток путем прогревания кипячением пластин до 99°С в течение 30 минут и выделение ДНК.Then, in two 50 ml bottles with autoclaved river water contaminated with a suspension of 10 4 mc/ml of vibrio cholerae, chitin plates are placed in the amount of 4 pcs. in each vial and kept at a temperature of 28°C for up to two days. Moreover, a solution of diclofenac is preliminarily added to one vial to a concentration of 3 mg / l. After 2-12-24-48 hours, the chitin plates are removed from the vials, washed three times in physiological saline, and each plate is transferred into a 1.5 ml test tube containing 0.5 ml of distilled water. After that, temperature cell lysis is carried out by heating the plates by boiling to 99°C for 30 minutes and DNA isolation.

Следующий этап способа заключается в определении количества клеток холерного вибриона в супернатанте каждого флакона и количества адгезированных на хитин клеток как во флаконе с диклофенаком, так и без него (контрольный) при помощи метода ПЦР согласно МУ 2.3.256-09.The next step of the method consists in determining the number of Vibrio cholerae cells in the supernatant of each vial and the number of cells adhered to chitin both in the vial with diclofenac and without it (control) using the PCR method according to MU 2.3.256-09.

Затем рассчитывают показатель адгезии который определяют по формулеThen the adhesion index is calculated, which is determined by the formula

Figure 00000003
Figure 00000003

где ПА - показатель адгезии;where PA - adhesion index;

Nx - количество ДНК, адгезированного на хитин;Nx is the amount of DNA adhered to chitin;

Nc - количество ДНК в супернатанте,Nc is the amount of DNA in the supernatant,

Если ПА без воздействия диклофенака больше, чем ПА в присутствии диклофенака, значит, диклофенак подавляет адгезию.If PA without exposure to diclofenac is greater than PA in the presence of diclofenac, then diclofenac inhibits adhesion.

Степень подавления адгезии определяют по коэффициенту ингибиции КИ, который равен отношению показателя адгезии (ПА) без воздействия препарата диклофенака к показателю адгезии в присутствии диклофенака (ПАд):The degree of adhesion suppression is determined by the CI inhibition coefficient, which is equal to the ratio of the adhesion index (PA) without exposure to the drug diclofenac to the adhesion index in the presence of diclofenac (PAd):

Figure 00000004
Figure 00000004

Интерпретацию результатов проводят по шкале ингибирующей активности, при этом за слабую степень ингибирующей активности принимают КИ в пределах от 0 до 1,5, среднюю степень - в пределах 1,6-2,0, высокую - более 2,1.Interpretation of the results is carried out on a scale of inhibitory activity, while a weak degree of inhibitory activity is taken as CI ranging from 0 to 1.5, an average degree - within 1.6-2.0, a high degree - more than 2.1.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что адгезию холерных вибрионов подавляют в присутствии ингибитора, который понижает экспрессию генов регуляции адгезии, в качестве которого используют производное фенилуксусной кислоты -диклофенак в концентрации 3 мг/л. Использование изобретения позволяет уменьшить прикрепление клеток (адгезию) холерного вибриона к субстрату in vitro.The essence of the proposed invention lies in the fact that the adhesion of cholera vibrios is suppressed in the presence of an inhibitor that reduces the expression of adhesion regulation genes, which is used as a derivative of phenylacetic acid - diclofenac at a concentration of 3 mg/l. The use of the invention makes it possible to reduce the attachment of cells (adhesion) of Vibrio cholerae to the substrate in vitro.

Пример 1Example 1

Изучали воздействие диклофенака в концентрации 3 мг/л на адгезивные свойства штаммов: V. cholerae O1 El Tor 19191 (ctx+, tcp+, выделен от человека в 2010 г., г. Москва), V. cholerae O1 El Tor 19667 (ctx+, tcp+, выделен от человека в 2012 г., г. Москва), V. cholerae О1 El Tor 19241 (ctx+, tcp+, выделен из воды, 2011 г., Ростовская область). Культуры взяты из коллекции Ростовского противочумного института.We studied the effect of diclofenac at a concentration of 3 mg/l on the adhesive properties of strains: V. cholerae O1 El Tor 19191 (ctx+, tcp+, isolated from a human in 2010, Moscow), V. cholerae O1 El Tor 19667 (ctx+, tcp+ , isolated from a human in 2012, Moscow), V. cholerae О1 El Tor 19241 (ctx+, tcp+, isolated from water, 2011, Rostov region). The cultures were taken from the collection of the Rostov Anti-Plague Institute.

В шесть флаконов с речной автоклавированной водой (по 50 мл), контаминированной взвесью 104/мл микробных клеток бактерий (на каждый штамм по два флакона), помещают пластины речного рака Astacus astacus размером 0,3×0,3 см в количестве 4 штук в каждый флакон и выдерживают при t 28±2°С до 2 суток, при этом в один флакон из двух для каждого штамма предварительно добавляют раствор диклофенака до концентрации 3 мг/л. Через 2-12-24-48 ч пластинки хитина достают из флаконов, трехкратно промывают в физиологическом растворе. Количество клеток холерного вибриона в супернатанте и количество адгезированных на хитин клеток в контрольном флаконе (без диклофенака) и во флаконе с диклофенаком определяют методом ПЦР по количеству ДНК. Затем по формуле рассчитывают показатель адгезии культур холерных вибрионов и коэффициент ингибиции. По шкале ингибирующей активности проводят интерпретацию результатов (см. таблицу 1).In six bottles with autoclaved river water (50 ml each) contaminated with a suspension of 10 4 /ml of microbial bacterial cells (two bottles for each strain), plates of crayfish Astacus astacus 0.3 × 0.3 cm in size are placed in the amount of 4 pieces in each vial and kept at t 28±2°C for up to 2 days, while in one vial of two for each strain diclofenac solution is preliminarily added to a concentration of 3 mg/l. After 2-12-24-48 hours, the chitin plates are removed from the vials, washed three times in physiological saline. The number of Vibrio cholerae cells in the supernatant and the number of cells adhered to chitin in the control vial (without diclofenac) and in the vial with diclofenac are determined by PCR by the amount of DNA. Then, according to the formula, the index of adhesion of cultures of cholera vibrios and the coefficient of inhibition are calculated. According to the scale of inhibitory activity, the results are interpreted (see table 1).

Figure 00000005
Figure 00000005

n* - число клеток ДНК увеличенное в 103.n* - number of DNA cells increased by 10 3 .

Как видно из таблицы, в первые часы воздействия (до 12 часов) диклофенак обладает высокой степенью ингибирующей активности (КИ 2,1-10,7) в отношении всех трех штаммов. Наибольшее значение индекса адгезии наблюдается в отношении штамма V. cholerae O1 El Tor 19191 при 12 часовом воздействии диклофенака. Через 48 часов коэффициент ингибиции соответствовал наименьшему значению в изученной группе штаммов и составил 1,45, при этом в отношении этого штамма показатель адгезии в присутствии диклофенака в интервале времени 2-48 часов составлял 0,1-0,11.As can be seen from the table, in the first hours of exposure (up to 12 hours), diclofenac has a high degree of inhibitory activity (CI 2.1-10.7) against all three strains. The highest value of the adhesion index is observed in relation to the strain V. cholerae O1 El Tor 19191 at 12 hours of exposure to diclofenac. After 48 hours, the inhibition coefficient corresponded to the lowest value in the studied group of strains and amounted to 1.45, while in relation to this strain, the adhesion index in the presence of diclofenac in the time interval of 2-48 hours was 0.1-0.11.

Пример 2Example 2

Изучали воздействие диклофенака в концентрации 150 мг/л (исходя из максимальной суточной дозы препарата для человека) на адгезивные свойства штаммов V. cholerae O1 El Tor 19667 (ctx+, tcp+, выделен от человека в 2012 г., г. Москва). Культура взята также из коллекции Ростовского противочумного института.We studied the effect of diclofenac at a concentration of 150 mg/l (based on the maximum daily dose of the drug for humans) on the adhesive properties of V. cholerae O1 El Tor 19667 strains (ctx+, tcp+, isolated from humans in 2012, Moscow). The culture was also taken from the collection of the Rostov Anti-Plague Institute.

В два флакона с речной автоклавированной водой (по 50 мл), контаминированной взвесью 104/мл микробных клеток бактерий, помещают пластины речного рака Astacus astacus размером 0,3×0,3 см в количестве 4 штук в каждый флакон и выдерживают при t 28±2°С до 2 суток, при этом в один флакон предварительно добавляют раствор диклофенака до концентрации 150 мг/л. Через 2-12-24-48 ч пластинки хитина достают из флаконов, трехкратно промывают в физиологическом растворе. Количество клеток холерного вибриона в супернатанте и количество адгезированных на хитин клеток в контрольном флаконе (без диклофенака) и во флаконе с диклофенаком определяют методом ПЦР по количеству ДНК. По формуле рассчитывают показатель адгезии культур холерных вибрионов и коэффициент ингибиции. По шкале ингибирующей активности проводят интерпретацию результатов (см. таблицу 2).In two bottles with autoclaved river water (50 ml each) contaminated with a suspension of 10 4 /ml of microbial cells of bacteria, plates of crayfish Astacus astacus 0.3 × 0.3 cm in size are placed in the amount of 4 pieces in each bottle and kept at t 28 ±2°C for up to 2 days, while diclofenac solution is added to one vial to a concentration of 150 mg/l. After 2-12-24-48 hours, the chitin plates are removed from the vials, washed three times in physiological saline. The number of Vibrio cholerae cells in the supernatant and the number of cells adhered to chitin in the control vial (without diclofenac) and in the vial with diclofenac are determined by PCR by the amount of DNA. According to the formula, the index of adhesion of cultures of cholera vibrios and the coefficient of inhibition are calculated. According to the scale of inhibitory activity, the results are interpreted (see table 2).

Figure 00000006
Figure 00000006

Figure 00000007
Figure 00000007

По таблице 2 видно, что в присутствии диклофенака в концентрации 150 мг/л показатель адгезии ниже, чем без диклофенака. Диклофенак в концентрации 150 мг/л обладает средней степенью ингибирующей активности при экспозиции 2-12 ч и низкой степенью - при экспозиции 24-48 ч.Table 2 shows that in the presence of diclofenac at a concentration of 150 mg/l, the adhesion index is lower than without diclofenac. Diclofenac at a concentration of 150 mg / l has an average degree of inhibitory activity at an exposure of 2-12 hours and a low degree at an exposure of 24-48 hours.

Использование предполагаемого изобретения с помощью нового и эффективного способа позволяет снизить адгезию холерных вибрионов, которая является начальным этапом патогенеза инфекции и биопленкообразования и оценить ее динамику при разном времени экспозиции при изучении исследуемых штаммов.The use of the proposed invention with the help of a new and effective method allows to reduce the adhesion of V. cholerae, which is the initial stage of the pathogenesis of infection and biofilm formation, and to evaluate its dynamics at different exposure times when studying the studied strains.

Источники информацииSources of information

1. Кузнецова М.В., Паршаков А.А., Афанасьевская Е.В., Самарцев В.А. Ингибирования адгезии бактерий Staphylococcus на сетчатых имплантах в комбинации с биоцидами (in vitro)// Антибиотики и химиотерапия. - 2017. - Т.62, №1-2. - С. 12-20.1. Kuznetsova M.V., Parshakov A.A., Afanasievskaya E.V., Samartsev V.A. Inhibition of adhesion of Staphylococcus bacteria on mesh implants in combination with biocides (in vitro)// Antibiotics and chemotherapy. - 2017. - V.62, No. 1-2. - S. 12-20.

2. Bhattaram V., Upadhyay A., Yin Н.-В., Mooyottu Sh., Venkitanarayanan К. Effect of Dietary Minerals on Virulence Attributes of Vibrio cholerae/Front Microbiol. 2017 May 19;8:911.2. Bhattaram V., Upadhyay A., Yin H.-V., Mooyottu Sh., Venkitanarayanan K. Effect of Dietary Minerals on Virulence Attributes of Vibrio cholerae/Front Microbiol. 2017 May 19;8:911.

3. «Способ оценки адгезивных свойств холерных вибрионов Vibrio cholerae El Tor и Vibrio cholerae 0139 на клеточной культуре Hu Tu -80». Патент RU №2595423, кл. C12Q 1/02, опубл. 10.07.2016 г., бюл. №24.3. "A method for assessing the adhesive properties of Vibrio cholerae El Tor and Vibrio cholerae 0139 on cell culture Hu Tu -80". Patent RU No. 2595423, class. C12Q 1/02, publ. July 10, 2016, bul. No. 24.

4. «Способ моделирования биопленок, формируемых Vibrio cholera 01 серогруппы на поверхности хитина». Патент №2685878, кл. C12N 11/00, опубл. 23.04.2019 г., бюл. №12.4. "A method for modeling biofilms formed by Vibrio cholera 01 serogroup on the surface of chitin". Patent No. 2685878, class. C12N 11/00, publ. April 23, 2019, bul. No. 12.

5. «Способ определения степени ингибирующей способности сахаров на процесс адгезии холерных вибрионов». Патент RU 2288274, кл. C12Q 1/04, опубликовано 27.11. 2006, бюл. №33.5. "Method for determining the degree of inhibitory ability of sugars on the process of adhesion of cholera vibrios". Patent RU 2288274, class. C12Q 1/04, posted 11/27. 2006, bul. No. 33.

6. Abbas Н.А. Inhibition of virulence factors of Pseudomonas aeruginosa by diclofenac sodium. Roum Arch Microbiol Immunol. 2015;74(3-4):79-85.6. Abbas N.A. Inhibition of virulence factors of Pseudomonas aeruginosa by diclofenac sodium. Room Arch Microbiol Immunol. 2015;74(3-4):79-85.

Claims (8)

Способ подавления адгезивных свойств холерных вибрионов, включающий использование ингибитора, понижающего экспрессию генов регуляции адгезии, отличающийся тем, что в качестве ингибитора используют диклофенак в концентрации 3 мг/л, который вводят в один из двух флаконов объемом 50 мл контаминированных взвесью 104 микробных клеток холерных вибрионов/мл и 4-х хитиновых пластин размером 0,3×0,3 см, которые помещают в оба флакона и выдерживают при температуре 28°С до двух суток, а через 2-12-24-48 часов пластины хитина достают из флаконов, трехкратно промывают в физиологическом растворе, после этого каждую пластину помещают в отдельную емкость 1,5 мл, содержащую 0,5 мл дистиллированной воды, и проводят температурный лизис клеток и выделение ДНК путем прогревания при 99°С в течение 30 мин, а затем методом ПЦР определяют количество клеток холерного вибриона в супернатанте, количество адгезированных на хитине клеток в контрольном флаконе без диклофенака и во флаконе с диклофенаком, затем рассчитывают показатель адгезии культур холерных вибрионов по формулеA method for suppressing the adhesive properties of Vibrio cholerae, including the use of an inhibitor that reduces the expression of adhesion regulation genes, characterized in that diclofenac is used as an inhibitor at a concentration of 3 mg/l, which is injected into one of two 50 ml vials contaminated with a suspension of 10 4 microbial cholera cells vibrios / ml and 4 chitin plates 0.3 × 0.3 cm in size, which are placed in both vials and kept at a temperature of 28 ° C for up to two days, and after 2-12-24-48 hours the chitin plates are removed from the vials , washed three times in physiological saline, after which each plate is placed in a separate container of 1.5 ml containing 0.5 ml of distilled water, and thermal cell lysis and DNA extraction are carried out by heating at 99°C for 30 min, and then by the method PCR determines the number of Vibrio cholerae cells in the supernatant, the number of cells adhered to chitin in the control vial without diclofenac and in the vial with diclofenac, then disperse read the adhesion index of vibrio cholerae cultures according to the formula
Figure 00000008
, где ПА - показатель адгезии;
Figure 00000008
, where PA - adhesion index; Nx - количество ДНК, адгезированного на хитине;Nx is the amount of DNA adhered to chitin; Nc - количесто ДНК в супернатанте,Nc is the amount of DNA in the supernatant, причем если ПА без воздействия диклофенака больше, чем ПА в присутствии диклофенака, значит, препарат подавил адгезию, а степень подавления адгезии определяют по коэффициенту КИ по формулеmoreover, if PA without diclofenac exposure is greater than PA in the presence of diclofenac, then the drug has suppressed adhesion, and the degree of adhesion suppression is determined by the CI coefficient according to the formula
Figure 00000009
, где ПА - показатель адгезии;
Figure 00000009
, where PA - adhesion index; ПАд - показатель адгезии в присутствии диклофенака,PAd - adhesion index in the presence of diclofenac, при этом за слабую степень ингибирующей активности принимают КИ в пределах от 0-1,5, среднюю степень - в пределах 1,6-2,0, высокую - более 2,1.at the same time, CI ranging from 0-1.5 is taken as a weak degree of inhibitory activity, an average degree is within 1.6-2.0, a high degree is more than 2.1.
RU2020142829A 2020-12-23 2020-12-23 Method for suppressing the adhesive properties of cholera vibrio RU2763400C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020142829A RU2763400C1 (en) 2020-12-23 2020-12-23 Method for suppressing the adhesive properties of cholera vibrio

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020142829A RU2763400C1 (en) 2020-12-23 2020-12-23 Method for suppressing the adhesive properties of cholera vibrio

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2763400C1 true RU2763400C1 (en) 2021-12-28

Family

ID=80039874

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020142829A RU2763400C1 (en) 2020-12-23 2020-12-23 Method for suppressing the adhesive properties of cholera vibrio

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2763400C1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2288274C1 (en) * 2005-04-04 2006-11-27 Ростовский-На-Дону Государственный Научно-Исследовательский Противочумный Институт Method for assay of sugar inhibitory capacity degree on adhesion process of cholera vibrio
RU2595423C2 (en) * 2014-12-09 2016-08-27 Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека METHOD OF ESTIMATION OF ADHESIVE PROPERTIES OF CHOLERA VIBRIOS Vibrio cholerae El Tor AND Vibrio cholerae O139 ON CELL CULTURE HuTu-80

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2288274C1 (en) * 2005-04-04 2006-11-27 Ростовский-На-Дону Государственный Научно-Исследовательский Противочумный Институт Method for assay of sugar inhibitory capacity degree on adhesion process of cholera vibrio
RU2595423C2 (en) * 2014-12-09 2016-08-27 Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека METHOD OF ESTIMATION OF ADHESIVE PROPERTIES OF CHOLERA VIBRIOS Vibrio cholerae El Tor AND Vibrio cholerae O139 ON CELL CULTURE HuTu-80

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HISHAM A. ABBAS "Inhibition of virulence factors of Pseudomonas aeruginosa by diclofenac sodium" // Roumanian Archives of microbiology and immunology", 2015, N 74, р.79-85. *
СЕЛЯНСКАЯ Н.А. и др. "Активность пектина в отношении биопленок холерных вибрионов" // Антибиотики и химиотерапия, 2017, N 62 (1-2), с.20-24. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chari et al. In vitro and in vivo antibiofilm effect of copper nanoparticles against aquaculture pathogens
Fraune et al. Bacteria–bacteria interactions within the microbiota of the ancestral metazoan Hydra contribute to fungal resistance
Harris et al. Addition of antifungal skin bacteria to salamanders ameliorates the effects of chytridiomycosis
Abumourad et al. Evaluation of Lactobacillus plantarum as a probiotic in aquaculture: emphasis on growth performance and innate immunity
Bunnoy et al. Probiotic effects of a novel strain, Acinetobacter KU011TH, on the growth performance, immune responses, and resistance against Aeromonas hydrophila of bighead catfish (Clarias macrocephalus Günther, 1864)
Carvalho et al. Antibiotic resistance of Salmonella spp. isolated from shrimp farming freshwater environment in Northeast region of Brazil
Liaqat et al. Tetracycline and chloramphenicol efficiency against selected biofilm forming bacteria
Hamza et al. Efficacy of cell free supernatant from Bacillus licheniformis in protecting Artemia salina against Vibrio alginolyticus and Pseudomonas gessardii
Balachandran et al. A study on the effect of using mangrove leaf extracts as a feed additive in the progress of bacterial infections in marine ornamental fish
Andryukov et al. Phenotypic plasticity as a strategy of bacterial resistance and an object of advanced antimicrobial technologies
Al-Marri et al. Multidrug resistance, biofilm formation, and virulence genes of Escherichia coli from backyard poultry farms
Kovalchuk et al. Biofilm forming activity of non-fermenting gram-negative bacteria
Mata et al. Production of diatom–bacteria biofilm isolated from Seriola lalandi cultures for aquaculture application
RU2763400C1 (en) Method for suppressing the adhesive properties of cholera vibrio
Wagley The Viable but Non-Culturable (VBNC) State in Vibrio Species: Why Studying the VBNC State Now Is More Exciting than Ever
Pradhan et al. Repeated in-vitro and in-vivo exposure leads to genetic alteration, adaptations, and hypervirulence in Salmonella
Aktas et al. Resuscitation of the Helicobacter pylori coccoid forms by resuscitation promoter factor obtained from Micrococcus luteus
Okamoto et al. Bacterial communication between Lactobacillus spp. isolated from poultry in the inhibition of Salmonella Heidelberg—proof of concept
Krause et al. Dietary isothiocyanates, sulforaphane and 2-phenethyl isothiocyanate, effectively impair vibrio cholerae virulence
Pushkareva et al. Hydrobionts as reservoir hosts for infectious agents of bacterial sapronoses
Arayamethakorn et al. Comparative effects of different bacterial lipopolysaccharides on modulation of immune levels to improve survival of the black tiger shrimp
Silva-Hidalgo et al. Identification of bapA in strains of Salmonella enterica subsp. enterica isolated from wild animals kept in captivity in Sinaloa, Mexico
Fitriadi et al. Antibacterial activity of Proteus spp. isolated from the rice-fish farming system cultivation area against A. hydrophila
Enger Survival and inactivation of Aeromonas salmonicida outside the host—a most superficial way of life
Pant et al. Understanding the influence of heavy water stress on the physiology of Salmonella Typhimurium