RU2761892C1

RU2761892C1 - Method for obtaining an orthotopic pdx model of human brain glioblastoma on immunodeficient mice for preclinical study of antitumor effects of cytostatic drugs

Info

Publication number: RU2761892C1
Application number: RU2021107915A
Authority: RU
Inventors: Олег Иванович Кит; Алексей Юрьевич Максимов; Эдуард Евгеньевич Росторгуев; Анна Сергеевна Гончарова; Евгения Марковна Непомнящая; Екатерина Владиславовна Заикина; Екатерина Алексеевна Лукбанова; Анастасия Владимировна Волкова; Мария Вадимовна Миндарь; Дарья Владиславовна Ходакова; Луиза Зулкаидовна Курбанова
Priority date: 2021-03-25
Filing date: 2021-03-25
Publication date: 2021-12-13

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to medicine, namely experimental oncology. A method for obtaining an orthotopic PDX model of human brain glioblastoma on immunodeficient Balb/c Nude mice for preclinical study of antitumor effects of cytostatic drugs includes anesthesia of mice, implantation of tumor material obtained from a patient after surgical resection of glioblastoma by dissecting the skin on the head of an immunodeficient mouse, retreating 2 mm from the point of interocular width. Next, a hole in the skull is formed with the help of boron, into which a tumor fragment with a volume of 8 mm³ is placed. Then a Tachocomb is applied over the defect of the skull bone. Next, the surgical wound is sutured. When the tumor material reaches a volume of 36 mm³, xenografts of glioblastoma of the human brain are transplanted up to the 5^th passage.

EFFECT: invention makes it possible to conduct preclinical tests of cytostatic drugs using a model that preserves certain histological characteristics of tumor material obtained from a donor patient and has a similar level of proliferative activity of tumor tissue.

1 cl, 2 dwg, 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и касается способа получения ортотопической PDX-модели глиобластомы головного мозга человека на иммунодефицитных мышах для доклинического изучения противоопухолевых эффектов цитостатических препаратов, сохраняющей гистологические характеристики донорской опухоли, адаптированной к росту и характеризующейся стабильной кинетикой у иммунодефицитных мышей Balb/c Nude. Изобретение позволяет проводить доклинические испытания цитостатических препаратов на модели, сохраняющей определенные гистологические характеристики опухолевого материала, полученного от пациента-донора и обладающей сходным уровнем пролиферативной активности опухолевой ткани.The invention relates to medicine, namely to experimental oncology, and concerns a method for producing an orthotopic PDX model of human brain glioblastoma in immunodeficient mice for preclinical study of the antitumor effects of cytostatic drugs, preserving the histological characteristics of a donor tumor, adapted to growth and characterized by stable kinetics in immunodeficient mice Balb / c Nude. The invention makes it possible to carry out preclinical tests of cytostatic drugs on a model that retains certain histological characteristics of tumor material obtained from a donor patient and has a similar level of proliferative activity of tumor tissue.

Глиомы представляют собой наиболее часто встречающиеся солидные опухоли центральной нервной системы, на долю которых приходится почти 80% всех первичных новообразований головного мозга (см. Hanif F. et al. Glioblastoma multiforme: a review of its epidemiology and pathogenesis through clinical presentation and treatment //Asian Pacific journal of cancer prevention: APJCP. – 2017. – Т. 18. – №. 1. – С. 3.). Выделяют астроцитарные опухоли, возникающие из клеток астроглии, олигодендроглиомы, эпендимомы и смешанные глиомы (см. Ростовцев Д. М. Злокачественные супратенториальные астроцитарные опухоли организация медицинской помощи, новые технологии и результаты лечения: дис. – Воен.-мед. акад. им. СМ Кирова, 2016.; Agnihotri S. et al. Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies //Archivum immunologiae et therapiae experimentalis. – 2013. – Т. 61. – №. 1. – С. 25-41.).Gliomas are the most common solid tumors of the central nervous system, accounting for almost 80% of all primary neoplasms of the brain (see Hanif F. et al. Glioblastoma multiforme: a review of its epidemiology and pathogenesis through clinical presentation and treatment // Asian Pacific journal of cancer prevention: APJCP. - 2017. - T. 18. - No. 1. - P. 3.). There are astrocytic tumors arising from astroglia cells, oligodendrogliomas, ependymomas and mixed gliomas (see D.M. Rostovtsev. Malignant supratentorial astrocytic tumors, organization of medical care, new technologies and treatment results: dissertation - Military Medical Academy named after SM Kirov, 2016; Agnihotri S. et al. Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies // Archivum immunologiae et therapiae experimentalis. - 2013. - T. 61. - No. 1. - S. 25-41.).

Глиобластомы (ГБ) представляют собой наиболее агрессивный вид первичных астроцитарных опухолей, среди которых выделяют два основных подтипа: первичную глиобластому головного мозга, являющуюся наиболее распространенным вариантом данного типа новообразований (80% случаев) и вторичную глиобластому (см. Ghosh D., Nandi S., Bhattacharjee S. Combination therapy to checkmate Glioblastoma: clinical challenges and advances //Clinical and translational medicine. – 2018. – Т. 7. – №. 1. – С. 33). Первичная глиобластома проявляется в более позднем периоде и характерна для пациентов со средним возрастом 62 года, в то время как вторичная ГБ прогрессирует у молодых пациентов (средний возраст 45 лет) из астроцитом или олигодендроглиом низкой степени злокачественности (см. Kleihues P., Ohgaki H. Primary and secondary glioblastomas: from concept to clinical diagnosis //Neuro-oncology. – 1999. – Т. 1. – №. 1. – С. 44-51.). Glioblastomas (GB) are the most aggressive type of primary astrocytic tumors, among which there are two main subtypes: primary glioblastoma of the brain, which is the most common variant of this type of neoplasm (80% of cases) and secondary glioblastoma (see Ghosh D., Nandi S. , Bhattacharjee S. Combination therapy to checkmate Glioblastoma: clinical challenges and advances // Clinical and translational medicine. - 2018. - T. 7. - No. 1. - P. 33). Primary glioblastoma manifests itself in a later period and is characteristic of patients with an average age of 62 years, while secondary HD progresses in young patients (mean age 45 years) from astrocytomas or oligodendrogliomas of low grade (see Kleihues P., Ohgaki H. Primary and secondary glioblastomas: from concept to clinical diagnosis // Neuro-oncology. - 1999. - T. 1. - No. 1. - S. 44-51.).

Кроме того, выделяют редкий подтип данных опухолей, определяющийся как первичная глиобластома с областями анапластической олигодендроглиомы и участками некроза с пролиферацией сосудов (см. Louis D. N. et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system //Acta neuropathologica. – 2007. – Т. 114. – №. 2. – С. 97-109.). Описанные подтипы характеризуются тенденцией к множественному поражению головного мозга в связи с инфильтративным ростом, гетерогенностью клеточного состава и радиорезистентностью субпопуляции стволовых клеток глиобластомы, что приводит к интенсивному росту опухолевых клеток, оставшихся после проведения циторедуктивных операций и курсов химио- и радиотерапии (см. Дяченко А. А. и др. Эпидемиология первичных опухолей головного мозга:(обзор литературы) //Вестник Российского научного центра рентгенорадиологии Минздрава России. – 2013. – Т. 1. – №. 13.; Шулев Ю. А. и др. Принципы хирургии первичных опухолей головного и спинного мозга //Практическая онкология. – 2013. – Т. 14. – №. 3-2013. – С. 148.). In addition, a rare subtype of these tumors is distinguished, which is defined as primary glioblastoma with areas of anaplastic oligodendroglioma and areas of necrosis with vascular proliferation (see Louis DN et al. The 2007 WHO classification of tumors of the central nervous system // Acta neuropathologica. - 2007. - T. 114. - No. 2. - S. 97-109.). The described subtypes are characterized by a tendency to multiple brain damage due to infiltrative growth, heterogeneity of the cellular composition and radioresistance of a subpopulation of glioblastoma stem cells, which leads to an intensive growth of tumor cells remaining after cytoreductive operations and courses of chemotherapy and radiotherapy (see Dyachenko A. A. et al. Epidemiology of primary brain tumors: (literature review) // Bulletin of the Russian Scientific Center for X-ray Radiology of the Ministry of Health of Russia. - 2013. - T. 1. - No. 13; Shulev Yu. A. et al. Principles of primary surgery tumors of the brain and spinal cord // Practical Oncology. - 2013. - T. 14. - No. 3-2013. - P. 148.).

Прогноз для пациентов с глиобластомой остается неблагоприятным, учитывая, что медиана выживаемости составляет 14-15 месяцев с момента постановки диагноза (см. Ohka F., Natsume A., Wakabayashi T. Current trends in targeted therapies for glioblastoma multiforme //Neurology research international. – 2012. – Т. 2012.).The prognosis for patients with glioblastoma remains poor, given that the median survival is 14-15 months from diagnosis (see Ohka F., Natsume A., Wakabayashi T. Current trends in targeted therapies for glioblastoma multiforme // Neurology research international. - 2012 .-- T. 2012.).

Понимание механизмов ангиогенеза, клеточной миграции и пролиферативных путей, поиск причин резистентности опухолевых клеток глиобластомы к химио- и радиотерапии, а также разработка новых противоопухолевых препаратов являются актуальными вопросами онкологии, в решении которых ключевую роль играют PDX-модели, позволяющие воссоздать необходимые темпы инвазии и пролиферации клеток глиобластомы и сохранить гистологические характеристики опухолевого материала, полученного от пациента-донора. Определенный уровень экпрессии биомаркеров, выявляющийся в опухолевом материале реципиента и сохраняющийся после многократного пассирования является неотъемлемым условием возможности использования животной модели для апробации и внедрения таргетных терапевтических субстанций в практику. Таким образом, идеальная животная модель глиобластомы головного мозга человека должна характеризоваться воспроизводимостью скорости роста и степени злокачественности, коротким временем индукции роста опухолевого узла, а также стандартной выживаемостью. Кроме того, ксенографт должен иметь внутрипаренхимный рост, свойственный глиобластоме, характеризоваться неоваскуляризацией и отсутствием инкапсуляции.Understanding the mechanisms of angiogenesis, cell migration and proliferative pathways, the search for the causes of the resistance of glioblastoma tumor cells to chemotherapy and radiotherapy, as well as the development of new anticancer drugs are topical issues in oncology, in the solution of which PDX-models play a key role, allowing to recreate the required rates of invasion and proliferation. glioblastoma cells and preserve the histological characteristics of the tumor material obtained from the donor patient. A certain level of expression of biomarkers, detected in the tumor material of the recipient and retained after repeated passaging, is an essential condition for the possibility of using an animal model for testing and introducing targeted therapeutic substances into practice. Thus, an ideal animal model of human brain glioblastoma should be characterized by reproducible growth rate and grade of malignancy, short induction time for tumor node growth, and standard survival. In addition, the xenograft should have intraparenchymal growth characteristic of glioblastoma, characterized by neovascularization and lack of encapsulation.

Расширение арсенала PDX-моделей глиобластомы головного мозга, способных сохранить важнейшие молекулярно-генетические характеристики опухолевого материла пациентов-доноров, обеспечит проведение доклинического изучения терапевтических эффектов цитостатических препаратов. Данная модель позволит обнаружить наиболее эффективную дозу препарата, что позволит минимизировать его токсичность и снизить вероятность возникновения некротических процессов.Expanding the arsenal of PDX-models of cerebral glioblastoma, capable of preserving the most important molecular genetic characteristics of the tumor material of donor patients, will provide a preclinical study of the therapeutic effects of cytostatic drugs. This model will allow you to find the most effective dose of the drug, which will minimize its toxicity and reduce the likelihood of necrotic processes.

Известен способ создания модели ксенотрансплантации глиобластомы человека с имуносупрессией орогастральным циклоспорином с помощью подкожной инокуляции культуры клеток глиобластомы, полученной из биоматериала пациента-донора, на 2 сутки после инициации иммуносупрессии путем введения циклоспорина в желудочно-кишечный тракт в дозе 5 мг/кг самцам крыс Вистер весом 229-337 г (см. Cunha A. M. et al. A murine model of xenotransplantation of human glioblastoma with imunosupression by orogastric cyclosporin //Arquivos de neuro-psiquiatria. – 2011. – Т. 69. – №. 1. – С. 112-117.). Данный способ обеспечивает быстрый рост опухоли в связи с проведением иммуносупрессии циклоспорином и простую оценку объемов опухолевого узла без необходимости умерщвления модельного животного. Проведенный исследователями гистопатологический анализ показал отсутствие инкапсуляции, что является одним из критериев соответствия ксенографта глиобластоме головного мозга человека. Недостатком данного способа является невозможность использования данной модели в практике в связи с отсутствием инфильтрации опухолевых клеток в соседние структуры. Кроме того, рост подкожного ксенографта происходит за счет увеличения массы опухолевой ткани, а не за счет миграции клеток глиобластомы, которая обеспечивается органоспецифичным микроокружением и является одной из отличительных особенностей туморогенеза глиобластомы головного мозга человека.A known method for creating a model of xenotransplantation of human glioblastoma with immunosuppression with orogastric cyclosporin using subcutaneous inoculation of a culture of glioblastoma cells obtained from the biomaterial of a donor patient, 2 days after initiation of immunosuppression by introducing cyclosporine into the gastrointestinal tract at a dose of 5 mg / kg to male Wister rats 229-337 g (see Cunha AM et al. A murine model of xenotransplantation of human glioblastoma with imunosupression by orogastric cyclosporin // Arquivos de neuro-psiquiatria. - 2011. - T. 69. - No. 1. - P. 112 -117.). This method provides a rapid tumor growth in connection with the immunosuppression with cyclosporine and a simple assessment of the volumes of the tumor node without the need to kill the model animal. The histopathological analysis carried out by the researchers showed the absence of encapsulation, which is one of the criteria for the compliance of the xenograft with glioblastoma of the human brain. The disadvantage of this method is the impossibility of using this model in practice due to the lack of infiltration of tumor cells into neighboring structures. In addition, the growth of a subcutaneous xenograft occurs due to an increase in the mass of tumor tissue, and not due to the migration of glioblastoma cells, which is provided by an organ-specific microenvironment and is one of the distinctive features of tumorigenesis of glioblastoma in the human brain.

Известен способ создания мышиной модели глиобластомы, предполагающий использование векторов на основе птичьих ретровирусов для переноса мутантного гена EGFR на глиальные клетки-предшественники и астроциты у трансгенных мышей (см. Holland E. C. A mouse model for glioma: biology, pathology, and therapeutic opportunities //Toxicologic pathology. – 2000. – Т. 28. – №. 1. – С. 171-177). Данный способ обеспечивает возможность индукции поражения головного мозга модельного животного, сходные с таковыми у человека благодаря экспрессии конститутивно активной мутантной формы EGFR, амплифицированной в 30-50% глиобластомы головного мозга человека, в клетках глии животного. Описанный метод позволяет имитировать необходимый уровень пролиферации сосудов ксенографта и получить уровень экспрессии глиального фибриллярного кислого белка и нестина, характерный для опухоли человека. Недостатком данного способа является невозможность индукции глиобластомы головного мозга у модельного животного, в точности повторяющей характеристики опухолевой ткани человека, с помощью одной мутации EGFR.A known method of creating a mouse model of glioblastoma, involving the use of vectors based on avian retroviruses to transfer the mutant EGFR gene to glial progenitor cells and astrocytes in transgenic mice (see Holland EC A mouse model for glioma: biology, pathology, and therapeutic opportunities // Toxicologic pathology. - 2000. - T. 28. - No. 1. - S. 171-177). This method enables the induction of brain lesions in a model animal, similar to those in humans, due to the expression of a constitutively active mutant form of EGFR, amplified in 30-50% of glioblastoma of the human brain, in the glial cells of the animal. The described method makes it possible to simulate the required level of proliferation of xenograft vessels and to obtain the level of expression of glial fibrillar acidic protein and nestin, characteristic of a human tumor. The disadvantage of this method is the impossibility of inducing brain glioblastoma in a model animal, which exactly repeats the characteristics of human tumor tissue, using a single EGFR mutation.

Известен способ создания модели глиобластомы, предполагающий разработку доклинической модели глиобластомы головного мозга мышей с помощью индукции сверхэкспрессии EGFR дикого и мутантного типа (vIII) (см. Zhu H. et al. Oncogenic EGFR signaling cooperates with loss of tumor suppressor gene functions in gliomagenesis //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2009. – Т. 106. – №. 8. – С. 2712-2716.). Данный способ обеспечивает возможность индукции опухоли центральной нервной системы модельного животного, характеризующейся тем, что наблюдается интенсивный инфильтративный рост новообразования благодаря коактивации дикого и мутантного типа EGFR, сочетанной с потерей опухоли Ink4A/Arf и PTEN. Недостатком данного способа является сложность, дороговизна и длительность процесса создания трансгенных моделей глиобластомы головного мозга, а также сложность визуализации процесса роста новообразования и проведения замеров объема опухолевого материала.A known method for creating a model of glioblastoma, involving the development of a preclinical model of glioblastoma in the brain of mice using the induction of overexpression of wild and mutant type EGFR (vIII) (see Zhu H. et al. Oncogenic EGFR signaling cooperates with loss of tumor suppressor gene functions in gliomagenesis // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2009. - T. 106. - No. 8. - S. 2712-2716.). This method allows the induction of a tumor of the central nervous system of a model animal, characterized by the fact that there is an intense infiltrative growth of the neoplasm due to the coactivation of the wild and mutant type EGFR, combined with the loss of the tumor Ink4A / Arf and PTEN. The disadvantage of this method is the complexity, high cost and duration of the process of creating transgenic models of glioblastoma of the brain, as well as the complexity of visualizing the growth process of the neoplasm and measuring the volume of tumor material.

Известен способ индукции глиомы высокой степени злокачественности в результате постнатальной потери PTEN или экспрессии мутантного типа EGFR в модели глиомы трансгенной мыши (см. Wei Q. et al. High-grade glioma formation results from postnatal pten loss or mutant epidermal growth factor receptor expression in a transgenic mouse glioma model //Cancer research. – 2006. – Т. 66. – №. 15. – С. 7429-7437.). Данный способ обеспечивает быстрое развитие опухоли, характеризующейся интенсивным инфильтративным ростом и инвазией. Недостатком данного способа является высокий темп роста новообразования, который сразу приводит к прогрессирующей глиоме головного мозга, что делает невозможным изучение процесса инициации туморогеназа. Кроме того, возможно получение различных подтипов опухолей, в том числе астроцитомы и олигодендроглиомы.A known method of inducing high-grade glioma as a result of postnatal loss of PTEN or expression of a mutant type of EGFR in a transgenic mouse glioma model (see Wei Q. et al. High-grade glioma formation results from postnatal pten loss or mutant epidermal growth factor receptor expression in a transgenic mouse glioma model // Cancer research. - 2006. - T. 66. - No. 15. - S. 7429-7437.). This method ensures the rapid development of a tumor characterized by intense infiltrative growth and invasion. The disadvantage of this method is the high growth rate of the neoplasm, which immediately leads to a progressive brain glioma, which makes it impossible to study the process of initiation of tumorigenase. In addition, it is possible to obtain various subtypes of tumors, including astrocytomas and oligodendrogliomas.

Таким образом, описанные способы получения модели глиобластомы головного мозга, предполагающие проведение иммуносупрессии путем орогастрального введения циклоспорина, использование векторов на основе птичьих ретровирусов, индукции сверхэкспрессии EGFR дикого и мутантного типа (vIII), а также постнатальной потери PTEN не позволяют имитировать инфильтрацию опухолевых клеток в соседние структуры, не повторяют органоспецифичного микроокружения, свойственного глиобластоме головного мозга человека. Подкожные ксенографты обеспечивают доступность визуализации опухолевой ткани и оценку объемов опухолевого узла без необходимости умерщвления модельного животного. Однако, не сохраняют ряд особенностей опухолевого материала пациента-донора. Thus, the described methods for obtaining a model of cerebral glioblastoma, involving immunosuppression by orogastric administration of cyclosporine, the use of vectors based on avian retroviruses, induction of overexpression of wild and mutant type EGFR (vIII), as well as postnatal loss of PTEN, do not allow simulating the infiltration of tumor cells into neighboring structures, do not repeat the organ-specific microenvironment characteristic of glioblastoma of the human brain. Subcutaneous xenografts provide access to tumor tissue visualization and assessment of tumor node volumes without the need to sacrifice a model animal. However, a number of features of the donor patient's tumor material are not preserved.

Кроме того, часть указанных методов создания трансгенных моделей глиобластомы являются дорогими и сложными в выполнении, а некоторые способы характеризуются длительным периодом инициации роста опухоли, что является недостатком в связи с небольшой продолжительностью жизни модельных животных.In addition, some of these methods for creating transgenic glioblastoma models are expensive and difficult to implement, and some methods are characterized by a long period of tumor growth initiation, which is a disadvantage due to the short life span of model animals.

Технический результат изобретения заключается в получении ортотопической PDX-модели глиобластомы головного мозга человека на иммунодефицитных мышах для доклинического изучения противоопухолевых эффектов цитостатических препаратов, сохраняющей гистологические характеристики донорской опухоли, адаптированной к росту и характеризующейся стабильной кинетикой у иммунодефицитных мышей Balb/c Nude.The technical result of the invention is to obtain an orthotopic PDX-model of human brain glioblastoma in immunodeficient mice for preclinical study of the antitumor effects of cytostatic drugs, preserving the histological characteristics of the donor tumor, adapted to growth and characterized by stable kinetics in immunodeficient Balb / c Nude mice.

Поставленная задача решается тем, что осуществляют наркотизацию мышей, проведение имплантации опухолевого материала, полученного от пациента после хирургической резекции глиобластомы, путем рассечения кожи на голове иммунодефицитной мыши, отступая 2 мм от точки межглазничной ширины, формирования при помощи бора отверстия в черепе, в которое помещают опухолевый фрагмент объемом 8 мм³, затем над дефектом кости черепа накладывают тахокомб, после чего ушивают операционную рану, по достижении опухолевым материалом объема 36 мм³ ксенографты глиобластомы головного мозга человека перевивают до 5 пассажа. Способ иллюстрируется следующими фигурами:The problem is solved by the fact that the anesthesia of mice is carried out, the implantation of tumor material obtained from the patient after surgical resection of glioblastoma, by cutting the skin on the head of an immunodeficient mouse, deviating 2 mm from the point of interorbital width, forming a hole in the skull with the help of a bur, into which a tumor fragment with a volume of 8 mm ³ , then a tachocomb is applied over the defect in the skull bone, after which the operating wound is sutured, when the tumor material reaches a volume of 36 mm ^3, xenografts of glioblastoma of the human brain are transplanted up to the 5th passage. The method is illustrated by the following figures:

Фиг.1 – глиобластома пациента-донора. Типичные структуры – полиморфизм опухолевых клеток. Изменения в стенках сосудов. Обширные очаги некроза. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 200.Fig. 1 - glioblastoma of a donor patient. Typical structures are tumor cell polymorphism. Changes in the walls of blood vessels. Extensive foci of necrosis. Staining with hematoxylin and eosin. Uv. x 200.

Фиг.2 - PDX-модель глиобластомы человека на иммунодефицитной мыши Balb/c Nude. Полиморфные клетки с высокой митотической активностью. Видны фигуры патологических митозов, а также мелкие очаги некрозов. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 400.Figure 2: PDX model of human glioblastoma in an immunodeficient Balb / c Nude mouse. Polymorphic cells with high mitotic activity. The figures of pathological mitoses are visible, as well as small foci of necrosis. Staining with hematoxylin and eosin. Uv. x 400.

Способ осуществляют следующим образом.The method is carried out as follows.

После проведения пациенту хирургической резекции глиобластомы, выделяют опухолевый фрагмент, исключая области некроза и васкуляризации, помещают его в чашку Петри со средой 199.After the patient undergoes surgical resection of glioblastoma, the tumor fragment is isolated, excluding the areas of necrosis and vascularization, and placed in a Petri dish with medium 199.

Животное наркотизируют с помощью внутримышечного введения препаратов Ксилазин и «Золетил 100» согласно протоколу (см. Патент RU № 2712916, опубл. 03.02.2020, Бюл. №4). Далее проводят имплантацию опухолевого материала путем рассечения кожи на голове иммунодефицитной мыши, отступая 2 мм от точки межглазничной ширины, формирования при помощи бора отверстия в черепе, в которое помещают опухолевый фрагмент объемом 8 мм³, извлеченный из среды 199. Затем над дефектом кости черепа накладывают тахокомб, после чего ушивают операционную рану.The animal is anesthetized by intramuscular injection of Xylazine and Zoletil 100 according to the protocol (see Patent RU No. 2712916, publ. 03.02.2020, bull. No. 4). Next, the tumor material is implanted by dissecting the skin on the head of an immunodeficient mouse, retreating 2 mm from the point of the interorbital width, forming a hole in the skull with the help of a bur, into which a tumor fragment of 8 mm ³ is placed, extracted from medium 199. Then, over the defect in the skull bone, impose tachocomb, after which the operating wound is sutured.

По достижении опухолевым материалом объема 36 мм³ ксенографты глиобластомы головного мозга человека перевивали указанным способом до 5 пассажа (см. табл.1). When the tumor material reached a volume of 36 mm ^3, xenografts of human brain glioblastoma were transplanted in this manner up to 5th passage (see Table 1).

Доля приживления ксенотрансплантата увеличивалась с каждой генерацией и составляла в 1, 2 и 3-м пассажах 20, 50 и 66% соответственно. Начиная с 4-го пассажа наблюдалась адаптация глиобластомы к росту (100% приживления).The proportion of xenograft engraftment increased with each generation and amounted to 20, 50, and 66% in the 1st, 2nd, and 3rd passages, respectively. Starting from the 4th passage, glioblastoma adaptation to growth (100% engraftment) was observed.

Данным способом было создано 50 ортотопических PDX-моделей глиобластомы головного мозга на иммунодефицитных мышах.This method was used to create 50 orthotopic PDX-models of brain glioblastoma in immunodeficient mice.

Таблица 1Table 1

Характеристика роста PDX-модели глиобластомы человека различных генераций на иммунодефицитных мышахGrowth characteristics of PDX-model of human glioblastoma of various generations in immunodeficient mice

№ пассажаPassage number Сайт имплантацииImplantation site % приживления опухолевого материала в организме мыши-реципиента% engraftment of tumor material in the body of the recipient mouse Объем, при котором проводили пересадку опухолевого материалаThe volume at which the tumor material was transplanted Время от момента имплантации опухолевого материала до его пересадкиTime from the moment of implantation of tumor material to its transplant 1one Ортотопический (интракраниально)Orthotopic (intracranial) 20%twenty% 36 мм³ 36 mm ³ 104 суток104 days 22 Ортотопический (интракраниально)Orthotopic (intracranial) 50%50% 36 мм³ 36 mm ³ 74 суток74 days 33 Ортотопический (интракраниально)Orthotopic (intracranial) 66%66% 36 мм³ 36 mm ³ 40 суток40 days 44 Ортотопический (интракраниально)Orthotopic (intracranial) 100%one hundred% 36 мм³ 36 mm ³ 28 суток28 days 55 Ортотопический (интракраниально)Orthotopic (intracranial) 100%one hundred% 36 см³ 36 cm ³ 16 суток16 days

Провели морфологическое исследование, в результате которого в глиальной опухоли пациента-донора, имеющей структуры глиобластомы и состоящей преимущественно из мелких клеток, выделили очаги некроза, располагающиеся в ткани мозга и вокруг сосудов (см. фиг. 1). Вокруг сосудов в очагах некроза имелись псевдопалисадные структуры, представленные многоядерным частоколом вытянутых гиперхромных ядер. В сосудах отмечалась выраженная пролиферация эндотелия. В большинстве полей зрения наблюдалась резко выраженная атипия клеток и высокая митотическая активность.A morphological study was carried out, as a result of which in the glial tumor of the donor patient, which has the structure of glioblastoma and consists mainly of small cells, foci of necrosis were identified, located in the brain tissue and around the vessels (see Fig. 1). Around the vessels in the foci of necrosis, there were pseudopalisad structures, represented by a multinucleated palisade of elongated hyperchromic nuclei. Pronounced endothelial proliferation was noted in the vessels. In most fields of vision, there was a pronounced atypia of cells and high mitotic activity.

Проведенное ИГХ исследование фрагмента, полученного после хирургической резекции, дало основание подтвердить диагноз и выявить экспрессию глиального кислого фибриллярного белка в опухолевых клетках, ядерную экспрессию р53, которая составила 90% и Ki67 – 70%, что свидетельствует о высокой пролиферативной активности.The IHC study of the fragment obtained after surgical resection gave grounds to confirm the diagnosis and reveal the expression of glial acidic fibrillar protein in tumor cells, nuclear expression of p53, which was 90% and Ki67 - 70%, which indicates a high proliferative activity.

В ходе морфологического исследования в представленных PDX-моделях глиобластомы были обнаружены структуры опухоли – глиобластомы, аналогичные первичной опухоли (пациента-донора). В опухоли определялись обширные поля, состоящие из мелких клеток. Отмечалась высокая митотическая активность с наличием фигур патологических митозов, вокруг сосудов наблюдались псевдопалисадные структуры. Кроме того, наблюдалась выраженная пролиферация эндотелия сосудов и немногочисленные очаги некроза (см. фиг. 2).During the morphological study in the presented PDX-models of glioblastoma, tumor structures - glioblastomas, similar to the primary tumor (donor patient) were found. Large fields of small cells were identified in the tumor. There was a high mitotic activity with the presence of figures of pathological mitoses; pseudo palisade structures were observed around the vessels. In addition, there was a pronounced proliferation of the vascular endothelium and a few foci of necrosis (see Fig. 2).

Таким образом, данные морфологического исследования и ИГХ- исследования в представленных PDX-моделях глиобластомы свидетельствовали о наличии аналогичных структур глиобластомы, характерных для донорского фрагмента опухолевого материала.Thus, the data of morphological studies and IHC studies in the presented PDX-models of glioblastoma indicated the presence of similar glioblastoma structures characteristic of a donor fragment of tumor material.

После проверки соответствия полученных PDX-моделей 5 генерации предъявляемым требованиям провели изучение противоопухолевой активности темозоломида, который вводили внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг один раз в сутки в течение 21 дня. Наблюдение осуществляли в течение 26 дней, замер опухоли провели после некропсии и резекции опухоли на 26 сутки эксперимента.After checking the compliance of the obtained PDX-models of the 5th generation with the requirements, we studied the antitumor activity of temozolomide, which was administered intraperitoneally at a dose of 5 mg / kg once a day for 21 days. The observation was carried out for 26 days, the measurement of the tumor was carried out after necropsy and resection of the tumor on the 26th day of the experiment.

Оценку противоопухолевой эффективности темозоломида на полученных ортотопических PDX-моделях глиобластомы головного мозга человека на иммунодефицитных мышах проводили на основании показателя торможения роста опухоли - ТРО%):The assessment of the antitumor efficacy of temozolomide in the obtained orthotopic PDX-models of human brain glioblastoma in immunodeficient mice was carried out on the basis of the tumor growth inhibition index - TPO%):

где

и

– средний объем опухоли (мм³) в контрольной и опытных группах соответственно, расчитанные по формуле Шрека для эллипсоида– V=а×в×с×p/6, где V – объем опухоли (мм³), а, в, с – максимальные диаметры эллипсоида в трех плоскостях (мм).where

and

- the average tumor volume (mm ³ ) in the control and experimental groups, respectively, calculated according to the Shrek formula for the ellipsoid - V = a × b × s × p / 6, where V is the tumor volume (mm ³ ), a, b, s - maximum diameters of the ellipsoid in three planes (mm).

Средний объем ксенографтов на 26 сутки эксперимента в группах 1 (темозоломид) и 2 (контроль) составил 74,5±5,7 и 174,6±7,5 мм³ соответственно. ТРО равнялся 57,3%. Таким образом, была показана противоопухолевая эффективность темозоломида, применяющемся в клинической практике в качестве противоопухолевого препарата для лечения глиобластом, на ортотопической PDX-модели глиобластомы головного мозга человека на иммунодефицитных мышах.The average volume of xenografts on the 26th day of the experiment in groups 1 (temozolomide) and 2 (control) was 74.5 ± 5.7 and 174.6 ± 7.5 mm ^3, respectively. TPO was equal to 57.3%. Thus, the antitumor efficacy of temozolomide, which is used in clinical practice as an antitumor drug for the treatment of glioblastomas, was shown in an orthotopic PDX model of human glioblastoma in immunodeficient mice.

Технико-экономическая эффективность заключается в том, что изобретение позволяет получить ортотопическую PDX-модель глиобластомы головного мозга человека на иммунодефицитных мышах для доклинического изучения противоопухолевых эффектов цитостатических препаратов, которая сохраняет гистологические характеристики опухолевого материала, полученного от пациента-донора, адаптирована к росту и характеризуется стабильной кинетикой у иммунодефицитных мышей Balb/c Nude.The technical and economic efficiency lies in the fact that the invention makes it possible to obtain an orthotopic PDX-model of human brain glioblastoma in immunodeficient mice for preclinical study of the antitumor effects of cytostatic drugs, which retains the histological characteristics of the tumor material obtained from the donor patient, is adapted to growth and is characterized by stable kinetics in immunodeficient Balb / c Nude mice.

Claims

A method for obtaining an orthotopic PDX model of human brain glioblastoma in immunodeficient Balb / c Nude mice for preclinical study of antitumor effects of cytostatic drugs, including anesthesia of mice, implantation of tumor material obtained from a patient after surgical resection of glioblastoma, by dissecting the skin on the head of an immunodeficient mouse , departing 2 mm from the point of the interorbital width, using a bur to form a hole in the skull, into which a tumor fragment with a volume of 8 mm ³ is placed, then a tachocomb is applied over the defect in the skull bone, after which the surgical wound is sutured, when the tumor material reaches a volume of 36 mm ³ xenografts glioblastomas of the human brain are transplanted up to the 5th passage.