RU2757987C1

RU2757987C1 - Device for carrying out amplification of nucleic acids

Info

Publication number: RU2757987C1
Application number: RU2020142284A
Authority: RU
Inventors: Дмитрий Владимирович Каникевич; Станислав Юрьевич Пауль; Павел Александрович Захарченко; Евгений Вячеславович Горский; Кирилл Владимирович Колесниченко
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью «Троицкий инженерный центр» (ООО «ТИЦ»)
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2021-10-25

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology. A device for carrying out amplification of nucleic acids is proposed. The device consists of a housing with a hole for installing a chip cartridge and a cover, a thermal cycling unit, and an optical system. The thermal cycling unit is located horizontally in the lower zone of the device body, and the optical system is located above the thermal cycling unit, the place for the chip-cartridge is located in the lower zone of the optical system. In this case, the light source is made in the form of narrow-band light-emitting diodes installed along the side ends of the cartridge-chip, and the fluorescence signal receiving unit is located directly above the reaction wells of the cartridge-chip, where the fluorescence signal receiving unit is equipped with multispectral sensors or separate photodiodes.

EFFECT: invention provides an increase in the compactness, versatility and speed of the device with an increase in its reliability when carrying out various studies not only in the laboratory, but also in the field in real time.

6 cl, 4 dwg

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено, в частности, для использования в компактном переносном виде для проведения ПЦР (полимеразной цепной реакции) в режиме реального времени. The invention relates to the field of biotechnology and is intended, in particular, for use in a compact portable form for carrying out PCR (polymerase chain reaction) in real time.

Из области техники известна система для обработки нескольких биологических образцов, проведения химической или биохимической реакции и обеспечения вывода результатов анализа, включающая
модуль подготовки образца, реакционный модуль, включающий реакционную камеру с получением продукта реакции, амплификацию множества маркеров коротких тандемных повторов (STR-маркеров), модуль подготовки образца и реакционный модуль интегрированы в одноразовый картридж, включающий камеру для образца, камеру для смешивания и реакционную камеру, выполненную с возможностью термоциклирования, плату с реагентами или картридж с реагентами, содержащие реагенты для проведения химической или биохимической реакции, включающей термоциклирование, модуль анализа, имеющий жидкостное сообщение с реакционной камерой и выполненный с возможностью проведения анализа продукта реакции, термоциклёр, сконфигурированный для циклического изменения температуры в реакционной камере, компьютеризированную систему управления, сконфигурированную для управления системой (см. патент RU № 2559541, МПК C12M 1/18, опубл. В 2013 году). Эта система предназначена для решения большого круга задач по исследованию жидких образцов и имеет сложную конструкцию.A system is known in the art for processing multiple biological samples, carrying out a chemical or biochemical reaction and providing the output of the analysis results, including
a sample preparation module, a reaction module including a reaction chamber for obtaining a reaction product, amplification of a plurality of short tandem repeat markers (STR markers), a sample preparation module and a reaction module are integrated into a disposable cartridge including a sample chamber, a mixing chamber and a reaction chamber, made with the possibility of thermal cycling, a board with reagents or a cartridge with reagents containing reagents for carrying out a chemical or biochemical reaction, including thermal cycling, an analysis module in fluid communication with the reaction chamber and made with the possibility of analyzing the reaction product, a thermal cycler configured for cyclic temperature change in the reaction chamber, a computerized control system configured to control the system (see patent RU No. 2559541, IPC C12M 1/18, published in 2013). This system is designed to solve a wide range of tasks for the study of liquid samples and has a complex design.

Известен прибор – «лаборатория на чипе», включающий лазерный источник с фильтром, первое и второе зеркала, управляющие направлением света, проходящего через первый фильтр, поляризатор, поляризующий свет, отраженный вторым зеркалом, светоделитель, разделяющий поляризованный свет, проходящий через поляризатор, линзу, которая коллимирует поляризованный свет на материал образца в микроканале, линзу, которая собирает флуоресценцию, излучаемую возбужденными флуоресцентно меченными биоматериалами поляризованным светом, излучаемым из части генерации поляризации, третье зеркало, контролирующее направление флуоресценции, проходящей через линзу, второй фильтр, фильтрующий флуоресценцию, отраженную третьим зеркалом, поляризованный светоделитель, разделяющий флуоресценцию, проходящую через второй фильтр, третий фильтр, который фильтрует флуоресценцию, проходящую через поляризованный светоделитель, вертикальные и горизонтальные фотоэлектронные умножители, которые измеряют сигналы флуоресценции излучаемого света, проходящего через третий фильтр, в вертикальной и горизонтальной плоскостях, поляризатор, установленный перед горизонтальным ФЭУ, осциллограф, который измеряет поляризацию флуоресценции, проходящую через фотоэлектронные умножители (ФЭУ), между первым фильтром и первым зеркалом помещается оптический прерыватель, состоящий из вращающегося диска с прорезями, для периодического включения / выключения источника света (см. опубликованную заявку US2007117220, МПК C12M3/00, опубл. в 2007 г.). Данное техническое решение представляет собой достаточно сложное и громоздкое устройство, которое количественно измеряет взаимодействие между биомолекулами и флуоресцентно мечеными биоматериалами, а также активность ферментов с использованием измерения поляризации флуоресценции. Known device - "laboratory on a chip", which includes a laser source with a filter, the first and second mirrors that control the direction of light passing through the first filter, a polarizer that polarizes the light reflected by the second mirror, a beam splitter that separates the polarized light passing through the polarizer, a lens, which collimates polarized light onto the sample material in a microchannel, a lens that collects fluorescence emitted by excited fluorescently labeled biomaterials, polarized light emitted from a polarization generation part, a third mirror that controls the direction of fluorescence passing through the lens, a second third filter that filters out the fluorescence mirror , a polarized beam splitter that separates fluorescence passing through a second filter, a third filter that filters fluorescence passing through a polarized beam splitter, vertical and horizontal photomultiplier tubes that measure fluorescence signals of the received light passing through the third filter in the vertical and horizontal planes, a polarizer installed in front of the horizontal PMT, an oscilloscope that measures the polarization of fluorescence passing through photomultiplier tubes (PMTs), an optical chopper consisting of a rotating disk is placed between the first filter and the first mirror with slots, for periodically turning on / off the light source (see. published application US2007117220, IPC C12M3 / 00, publ. in 2007). This technical solution is a rather complex and cumbersome device that quantitatively measures the interaction between biomolecules and fluorescently labeled biomaterials, as well as enzyme activity using fluorescence polarization measurements.

Известен прибор для детектирования капельной ПЦР-амплификации на основе микрофлюидного чипа, включающий светодиодный источник возбуждения света, асферическую линзу, причем светодиод в качестве точечного источника света помещён в фокус линзы так, что свет, излучаемый светодиодом, коллимируется через линзу для формирования параллельного пучка света, отображаемого в области чипа (см. патент CN109652298, Кл. C12M1/00, опубл. в 2019 г.). В этом устройстве капля, содержащая молекулы ДНК, вводится в капельный микрофлюидный чип с помощью пипетки, затем чип помещают в блок амплификации капельной ПЦР для проведения реакции ПЦР-амплификации, а флуорохром в капле возуждается с помощью светодиода и светофильтра. Изображение флуоресцентной капли фокусируют с помощью алгоритма автофокусировки. Затем получают ряд изображений различных частей чипа с помощью сканирования. Сделанные изображения объединяют для получения полной информации об исследуемой области капли чипа. С помощью этой автоматизированной конструкции получают конечный результат очень медленно. В ней не предусмотрено ускорение работы и увеличение количества исследуемых образцов.There is a known device for detecting drop PCR amplification based on a microfluidic chip, including an LED source of light excitation, an aspherical lens, and the LED as a point light source is placed in the focus of the lens so that the light emitted by the LED is collimated through the lens to form a parallel light beam, displayed in the area of the chip (see patent CN109652298, CL. C12M1 / 00, published in 2019). In this device, a droplet containing DNA molecules is introduced into a droplet microfluidic chip using a pipette, then the chip is placed in a droplet PCR amplification unit to carry out a PCR amplification reaction, and the fluorochrome in the droplet is excited by an LED and a light filter. The fluorescent droplet image is focused using an autofocus algorithm. Then a series of images of different parts of the chip are obtained by scanning. The obtained images are combined to obtain complete information about the investigated region of the chip droplet. With this automated design, the end result is obtained very slowly. It does not provide for the acceleration of work and an increase in the number of samples under study.

Известно устройство прямой количественной ПЦР, которое включает в себя распределитель жидкости, модуль термоциклёра и модуль обработки изображений, распределитель жидкости используется для распределения смеси образцов в каждое отверстие одноразового чипа ПЦР; модуль термоциклёра используется для размещения одноразового ПЦР-чипа и обеспечения условий для проведения реакции амплификации на смеси образцов в каждое отверстие одноразового ПЦР-чипа; а модуль обработки изображений расположен в модуле термоциклёра и используется для измерения интенсивности флуоресценции флуоресцентного красителя в каждом отверстии одноразового чипа ПЦР до и после амплификации (см. патент CN210916083, Кл. C12M1/34, опубл. в 2020 г.). В этом патенте рассмотрены различные варианты выполнения устройства в целом и его отдельных узлов. Однако, описание носит общий и схематический характер. В патенте не раскрыты технические подробности устройства и его узлов.A direct quantitative PCR device is known, which includes a liquid dispenser, a thermal cycler module and an image processing module; a liquid dispenser is used to dispense a mixture of samples into each hole of a disposable PCR chip; a thermal cycler module is used to place a disposable PCR chip and provide conditions for carrying out an amplification reaction on a mixture of samples in each hole of the disposable PCR chip; and the image processing module is located in the thermal cycler module and is used to measure the fluorescence intensity of the fluorescent dye in each hole of the disposable PCR chip before and after amplification (see patent CN210916083, CL. C12M1 / 34, published in 2020). This patent discusses various embodiments of the device as a whole and its individual units. However, the description is general and schematic. The patent does not disclose the technical details of the device and its components.

Известно устройство для идентификации нуклеиновых кислот с помощью полимеразной цепной реакции, включающей введение жидких образцов, содержащих нуклеиновую кислоту, в зону реакции на верхней поверхности теплопроводной подложки микрочипа; изоляцию внесенных образцов от атмосферы; контакт нуклеиновой кислоты образца с компонентами полимеразной цепной реакции при термоциклировании образцов с отводом тепла через внешнюю поверхность микрочипа; флуоресцентное детектирование изменения количества продуктов полимеразной цепной реакции при термоциклировании; идентификация количества исходной нуклеиновой кислоты в образцах по динамике роста флуоресцентного сигнала, при этом используемый микрочип содержит теплопроводную подложку из теплопроводного материала (см. опубликованную заявку US2011189683, МПК C12M1/34, опубл. в 2011 г.). Специфика данного технического решения заключается в том, что введенные образцы изолируются путем отделения их от атмосферы слоем жидкости, не смешивающейся с водой, которая удерживается на верхней поверхности теплопроводной подложки с помощью периферийного барьера.Known device for identifying nucleic acids using polymerase chain reaction, including the introduction of liquid samples containing nucleic acid into the reaction zone on the upper surface of the heat-conducting substrate of the microchip; isolation of the introduced samples from the atmosphere; contact of the nucleic acid of the sample with the components of the polymerase chain reaction during thermal cycling of the samples with heat removal through the outer surface of the microchip; fluorescent detection of changes in the amount of polymerase chain reaction products during thermal cycling; identification of the amount of the initial nucleic acid in the samples by the dynamics of the growth of the fluorescent signal, while the microchip used contains a heat-conducting substrate made of heat-conducting material (see published application US2011189683, IPC C12M1 / 34, published in 2011). The specificity of this technical solution lies in the fact that the introduced samples are isolated by separating them from the atmosphere with a layer of liquid immiscible with water, which is retained on the upper surface of the heat-conducting substrate by means of a peripheral barrier.

Известен прибор для проведения ПЦР-анализа с помощью одноразового чипа, включающий оптическую головку, состоящую из 6 идентичных по устройству каналов, каждый из которых включает оптическую систему возбуждения и считывания флуоресценции, при этом система возбуждения состоит из излучающего светодиода, коллиматора, узкополосного светофильтра и объектива, с помощью которого освещается реакционная камера чипа, а для считывания флуоресцентного сигнала используют аналогичную оптическую схему с использованием регистрирующего фотодиода. Вся оптическая головка находится на каретке линейного привода и способна совершать движения вдоль камер чипа, последовательно считывая флуоресценцию из каждой реакционной камеры каждым из спектральных каналов (см. патент RU № 2703776, МПК C12Q 1/6806, опубл. В 2019 году). Специфика медленной работы прибора с такой оптической системой и его использования обоснованы ограничивающими конструктивными признаками прибора.There is a known device for PCR analysis using a disposable chip, which includes an optical head consisting of 6 channels identical in structure, each of which includes an optical system for excitation and reading of fluorescence, while the excitation system consists of an emitting LED, a collimator, a narrow-band light filter and an objective , with the help of which the reaction chamber of the chip is illuminated, and a similar optical scheme is used to read the fluorescent signal using a recording photodiode. The entire optical head is located on the linear drive carriage and is capable of moving along the chambers of the chip, sequentially reading the fluorescence from each reaction chamber by each of the spectral channels (see patent RU No. 2703776, IPC C12Q 1/6806, published in 2019). The specifics of the slow operation of the device with such an optical system and its use are justified by the limiting design features of the device.

Наиболее близким аналогом к заявленному изобретению является модуль устройства анализа «лаборатория на чипе», предназначенный для флуоресцентного измерения полимеразной цепной реакции (ПЦР) или для другого метода анализа, такого как анализ кривой плавления, включающий одноразовый чип-картридж с реакционными лунками, узел подготовки образцов, оптическую систему с источником света для флуоресцентного возбуждения реактива, автоматизированным светофильтром, датчиком изображения, корпус устройства анализа «лаборатория на чипе», дисплей и электронную систему управления. Корпус модуля имеет отверстие для вставки одноразового чипа-картриджа, содержащего анализируемый материал, в устройство анализа «лаборатория на чипе». Корпус имеет заднюю сторону с соединительным отверстием для подключения кабеля электропитания к устройству анализа «лаборатория на чипе». Кроме того, корпус имеет сторону стоячей поверхности, имеющую интерфейс для обслуживания аналитического устройства «лаборатория на чипе». Сторона стоячей поверхности имеет такую форму, чтобы устанавливать устройство анализа «лаборатория на чипе» во время работы. Задняя сторона имеет такую форму, чтобы использоваться как дополнительная стоящая поверхность устройства анализа «лаборатория на чипе», когда кабель извлекается из соединительного отверстия (см. опубликованные заявки WO2019202070 , МПК B01L9/00, опубл. в 2019 г. и WO2020083768, МПК G01J3/02, опубл. в 2020 году заявитель - BOSCH GMBH ROBERT [DE]). Известный модуль имеет достаточно компактную конструкцию по сравнению с другими лабораторными приборами, но этот сложный прибор выполнен с функциональной избыточностью, недопустимой для прибора, который предназначен для работы в режиме реального времени, при этом для его работы требуется конструктивно сложный чип-картридж. The closest analogue to the claimed invention is a “laboratory on a chip” analysis device module designed for fluorescence measurement of polymerase chain reaction (PCR) or for another analysis method, such as melting curve analysis, including a disposable chip cartridge with reaction wells, a sample preparation unit , an optical system with a light source for fluorescent excitation of the reagent, an automated light filter, an image sensor, a laboratory-on-a-chip analysis device housing, a display and an electronic control system. The module case has a hole for inserting a disposable chip-cartridge containing the analyzed material into the laboratory-on-a-chip analysis device. The housing has a rear side with a connection hole for connecting the power cable to the lab-on-a-chip analysis device. In addition, the housing has a side of a standing surface that has an interface for servicing the laboratory-on-a-chip analytical device. The side of the standing surface is shaped to accommodate the lab-on-a-chip analysis device during operation. The back is shaped to be used as an additional standing surface of the lab-on-a-chip analysis device when the cable is removed from the connecting hole (see published applications WO2019202070, IPC B01L9 / 00, published 2019 and WO2020083768, IPC G01J3 / 02, published in 2020 by the applicant - BOSCH GMBH ROBERT [DE]). The known module has a rather compact design compared to other laboratory instruments, but this complex instrument is made with functional redundancy that is unacceptable for a device that is designed to operate in real time, while its operation requires a structurally complex chip cartridge.

Техническая проблема заключается в том, что описанные устройства работают медленно и не обеспечивают достижения высокой точности исследований при проведении ПЦР (полимеразной цепной реакции) в режиме реального времени в «полевых» (не лабораторных) условиях, например, при выезде на дом к больному, в автомобиле, на улице. В них остается нерешенной задача упрощения средств исследования при высокой результативности. Решение данной задачи не должно ограничиваться только возможностью проведения амплификации нуклеиновых кислот в лабораторных условиях. Найденное решение должно давать возможность проводить различные исследования не только в лабораторных условиях, но и в местах, не предназначенных для медицинских целей. The technical problem is that the described devices work slowly and do not provide high accuracy of studies when carrying out PCR (polymerase chain reaction) in real time in the "field" (non-laboratory) conditions, for example, when going home to a patient, in car, on the street. In them, the problem of simplifying research tools with high efficiency remains unsolved. The solution to this problem should not be limited only by the possibility of carrying out amplification of nucleic acids in laboratory conditions. The found solution should make it possible to carry out various studies not only in laboratory conditions, but also in places not intended for medical purposes.

Настоящее изобретение направлено на решение технической задачи повышения компактности, универсальности и быстродействия прибора для проведения амплификации нуклеиновых кислот с увеличением его надежности при проведении различных исследований.The present invention is aimed at solving the technical problem of increasing the compactness, versatility and speed of the device for carrying out amplification of nucleic acids with an increase in its reliability in carrying out various studies.

Решение поставленной технической задачи достигается за счет того, что в приборе для проведения амплификации нуклеиновых кислот, состоящем из корпуса с отверстием для установки чипа-картриджа на его передней панели и крышки, расположенных внутри корпуса блока термоциклирования, оптической системы, состоящей из узла возбуждения флуоресценции реакционных лунок чипа-картриджа, включающего источник света и светофильтры, и узла приёма сигнала флуоресценции (фотоприёмного устройства), и электронной системы управления с дисплеем и интерфейсами для подключения других устройств, блок термоциклирования расположен горизонтально в нижней зоне корпуса прибора, а оптическая система расположена над блоком термоциклирования таким образом, что место для горизонтального положения чипа-картриджа размещено в нижней зоне оптической системы, при этом источник света выполнен в виде узкополосных светодиодов , установленных вдоль боковых торцов чипа-картриджа, причём узел приёма сигнала флуоресценции (фотоприёмное устройство) расположен непосредственно над реакционными лунками чипа-картриджа, причём узел приёма сигнала флуоресценции (фотоприёмное устройство) либо снабжён мульти-спектральными сенсорами, каждый из которых расположен над отдельной лункой, либо снабжён отдельными фотодиодами, каждый из которых расположен над отдельной лункой, выполненными с однополосными и/или многополосными интерференционными светофильтрами. Узел приёма сигнала флуоресценции (фотоприёмное устройство) снабжён линзами. Прибор снабжён световой RGB индикацией, расположенной на передней панели корпуса. Прибор снабжён USB-разъемом для подключения к внешнему компьютеру, а также USB-разъемом для передачи результатов ПЦР на внешний Flash-накопитель, размещёнными на торцевой стороне корпуса. Блок термоциклирования снабжён радиальным вентилятором, расположенным внутри корпуса рядом с блоком термоциклирования. Дисплей расположен на крышке прибора.The solution to this technical problem is achieved due to the fact that in the device for carrying out amplification of nucleic acids, consisting of a housing with a hole for installing a chip-cartridge on its front panel and a cover located inside the housing of the thermocycling unit, an optical system consisting of a unit for excitation of fluorescence of reaction wells of the chip-cartridge, which includes a light source and light filters, and a fluorescence signal receiving unit (photodetector), and an electronic control system with a display and interfaces for connecting other devices, the thermal cycling unit is located horizontally in the lower area of the device body, and the optical system is located above the unit thermal cycling in such a way that the place for the horizontal position of the chip-cartridge is located in the lower zone of the optical system, while the light source is made in the form of narrow-band LEDs installed along the side ends of the chip-cartridge, and the unit for receiving the fluorescence signal (photodetector device) is located directly above the reaction wells of the chip cartridge, and the unit for receiving the fluorescence signal (photodetector) is either equipped with multi-spectral sensors, each of which is located above a separate well, or equipped with separate photodiodes, each of which is located above a separate well, made with single-band and / or multi-band interference filters. The fluorescence signal receiving unit (photodetector) is equipped with lenses. The device is equipped with RGB light indication located on the front panel of the case. The device is equipped with a USB connector for connecting to an external computer, as well as a USB connector for transferring PCR results to an external Flash drive, located on the front side of the case. The thermal cycling unit is equipped with a radial fan located inside the casing next to the thermal cycling unit. The display is located on the cover of the device.

Изобретение поясняется чертежами. The invention is illustrated by drawings.

На фиг.1 изображен прибор для проведения амплификации нуклеиновых кислот в рабочем состоянии, в изометрии. На фиг. 2 – то же без корпуса, в изометрии. На фиг. 3 изображена оптическая система, в изометрии. На фиг. 4 изображён одноразовый чип-картридж, в изометрии. Figure 1 shows a device for carrying out amplification of nucleic acids in working condition, in isometric view. FIG. 2 - the same without the body, in isometric view. FIG. 3 shows the optical system, in perspective. FIG. 4 is a perspective view of a disposable chip cartridge.

Прибор для проведения амплификации нуклеиновых кислот имеет компактный корпус 1 (см. фиг.1). Корпус 1 оснащён крышкой 2. Прибор содержит расположенные в корпусе 1 блок 3 термоциклирования, устройство для размещения чипа-картриджа 4 (см. фиг. 4), оптическую систему (см. фиг. 3), включающую узел возбуждения флуорофоров и флуоресцентных красителей и узел приёма сигнала флуоресценции (узел детекции оптического сигнала), узел отображения результатов измерений с дисплеем 5, который может быть расположен на крышке 2, и электронную систему управления (см. фиг. 2). Блок 3 термоциклирования может быть выполнен на основе элемента Пельтье (термоэлектрического преобразователя) и включает нагревательный блок 6. Блок 3 термоциклирования снабжен модулем измерения температуры для точного управления и контроля температурой термоциклирования (на рисунке не показано), ребристым радиатором 7, расположенным под нижней площадкой элемента Пельтье, предназначенным для отвода выделяемого тепла и радиальным вентилятором 8, предназначенным для охлаждения радиатора 7. Радиальный вентилятор 8 расположен в корпусе 1 рядом с блоком 3 термоциклирования. Боковое расположение радиального вентилятора 8 относительно блока 3 термоциклирования позволяет минимизировать габариты прибора. Нагревательный блок 6 также является частью устройства для размещения чипа-картриджа 4, т.к. заправленный исследуемой пробой чип-картридж 4 при установке в прибор должен быть прижат к блоку 6. The device for carrying out amplification of nucleic acids has a compact body 1 (see figure 1). Case 1 is equipped with a cover 2. The device contains a thermal cycling unit 3 located in case 1, a device for placing a chip-cartridge 4 (see Fig. 4), an optical system (see Fig. 3), which includes a unit for excitation of fluorophores and fluorescent dyes and a unit receiving a fluorescence signal (optical signal detection unit), a unit for displaying measurement results with a display 5, which can be located on the cover 2, and an electronic control system (see Fig. 2). The thermocycling unit 3 can be made on the basis of a Peltier element (thermoelectric converter) and includes a heating unit 6. The thermocycling unit 3 is equipped with a temperature measurement module for precise control and monitoring of the thermal cycling temperature (not shown in the figure), a finned radiator 7 located under the lower platform of the element Peltier designed to remove the generated heat and a radial fan 8 designed to cool the radiator 7. The radial fan 8 is located in the housing 1 next to the thermal cycling unit 3. The lateral arrangement of the radial fan 8 relative to the thermal cycling unit 3 allows minimizing the dimensions of the device. The heating unit 6 is also part of the device for housing the chip-cartridge 4, since The chip cartridge 4 filled with the test sample must be pressed against block 6 when installed in the device.

Чип-картридж 4 (см. фиг. 4) представляет собой плоскую прозрачную пластину, изготовленную из полимерного материала с высокой биоинертностью, низкой автофлуоресценцией и высоким уровнем прохождения света. С нижней стороны в пластине выполнены реакционные лунки 9 (реакционные ячейки) для заправки исследуемыми образцами и реагентами. Каждая реакционная лунка 9 имеет заправочное отверстие 10 и отверстие 11 для выхода воздуха, расположенные сверху чипа-картриджа 4. Чип-картридж 4 имеет герметизирующую плёнку с обеих сторон (на рисунке не показано), плотно прилегающую к поверхности и обеспечивающую полную герметизацию лунок 9 и отверстий 10 и 11. Одноразовый чип-картридж 4 может быть снабжен пазами 12, предназначенными для фиксации в нижней зоне оптической системы прибора для амплификации нуклеиновых кислот на нагревательной пластине 6. Прибор может быть снабжен устройством автоматической загрузки чипа-картриджа 4 (на рисунке не показано) в рабочее положение.Chip cartridge 4 (see Fig. 4) is a flat transparent plate made of a polymer material with high bioinertness, low autofluorescence and high light transmission. On the lower side of the plate, reaction wells 9 (reaction cells) are made for filling with the test samples and reagents. Each reaction well 9 has a filling hole 10 and an air outlet 11 located on top of the chip cartridge 4. The chip cartridge 4 has a sealing film on both sides (not shown in the figure), which adheres tightly to the surface and ensures complete sealing of the wells 9 and holes 10 and 11. The disposable chip cartridge 4 can be equipped with grooves 12 intended for fixing in the lower zone of the optical system of the nucleic acid amplification device on the heating plate 6. The device can be equipped with an automatic loading device for the chip cartridge 4 (not shown in the figure ) into working position.

Устройство для размещения чипа-картриджа 4, в свою очередь является частью оптической системы (см. фиг. 3) прибора и установлено в его нижней зоне. Узел возбуждения флуорофоров и/или флуоресцентных красителей оптической системы включает расположенные на плате 13 по боковым сторонам оптической системы узкополосные светодиоды 14 с минимальным углом расходимости излучения, расположенные непосредственно напротив соответствующих реакционных лунок 9 одноразового чипа-картриджа 4 по его боковым торцам. Вариант исполнения одноразового чипа-картриджа 4 показан на фиг. 4. На плате 13 могут располагать как один, так и несколько светодиодов 14 в зависимости от того, какие флуоресцентные красители предполагается использовать. А также в зависимости от количества лунок 9 и длины чипа-картриджа 4. При этом каждый светодиод 14 может возбуждать флуорофоры сразу в нескольких лунках 9 чипа-картриджа 4. Для спектрального разделения возбуждающего излучения и излучения флуорофоров (например, FAM, HEX, ROX и Cy5) между каждым светодиодом 14 и торцом чипа-картриджа 4 установлен соответствующий интерференционный светофильтр 15 с максимумами пропускания, например в диапазоне 470, 520, 580, 635 нм. Для увеличения количества полезного излучения, проникающего внутрь чипа-картриджа 4, обеспечивают минимальное расстояние между возбуждающими светодиодами 14 и торцом чипа-картриджа 4. The device for placing the chip-cartridge 4, in turn, is part of the optical system (see Fig. 3) of the device and is installed in its lower zone. The unit for excitation of fluorophores and / or fluorescent dyes of the optical system includes narrow-band LEDs 14 located on the board 13 on the lateral sides of the optical system with a minimum angle of radiation divergence, located directly opposite the corresponding reaction wells 9 of the disposable chip cartridge 4 at its lateral ends. An embodiment of a disposable chip cartridge 4 is shown in FIG. 4. On the board 13 can be placed as one or several LEDs 14, depending on what fluorescent dyes are supposed to be used. And also depending on the number of wells 9 and the length of the chip cartridge 4. In this case, each LED 14 can excite fluorophores in several wells 9 of the chip cartridge 4. For spectral separation of the exciting radiation and the emission of fluorophores (for example, FAM, HEX, ROX and Cy5) between each LED 14 and the end face of the chip-cartridge 4 there is a corresponding interference filter 15 with transmission maxima, for example, in the range of 470, 520, 580, 635 nm. To increase the amount of useful radiation entering the inside of the chip cartridge 4, a minimum distance is provided between the driving LEDs 14 and the end face of the chip cartridge 4.

Узел приёма сигнала флуоресценции (узел детекции оптического сигнала) представляет собой оптическую фокусирующую систему - фотоприёмное устройство 16, расположенное непосредственно над реакционными лунками 9 чипа-картриджа 4. Фотоприёмное устройство 16 состоит из линз 17. Их количество зависит от типа фотоприёмного устройства 16. При использовании в качестве фотоприёмного устройства 16 отдельных фотодиодов, каждый из которых расположен над отдельной лункой 9, в систему устанавливают однополосные и/или многополосные интерференционные светофильтры 18 со спектрами пропускания, соответствующими спектрам излучения флуоресцентных красителей. Например, такие светофильтры 18 могут иметь максимумы пропускания в диапазонах 520, 560 и 680 нм и блокировку паразитного излучения возбуждающих светодиодов 14 в диапазонах 470 и 635 нм. При этом при использовании в схеме отдельных фотодиодов над каждой лункой 9 в качестве фотоприёмного устройства 16 допускается использование двух и более комбинаций флуоресцентных красителей.The unit for receiving a fluorescence signal (unit for detecting an optical signal) is an optical focusing system - a photodetector 16, located directly above the reaction wells 9 of the chip-cartridge 4. The photodetector 16 consists of lenses 17. Their number depends on the type of photodetector 16. When using as a photodetector 16 separate photodiodes, each of which is located above a separate hole 9, single-band and / or multi-band interference filters 18 with transmission spectra corresponding to the emission spectra of fluorescent dyes are installed in the system. For example, such filters 18 may have transmission maxima in the 520, 560, and 680 nm ranges and block spurious radiation from the driving LEDs 14 in the 470 and 635 nm ranges. In this case, when using separate photodiodes in the circuit above each well 9 as a photodetector 16, it is allowed to use two or more combinations of fluorescent dyes.

Также в оптическую систему в качестве фотоприёмного устройства 16 допускается установка оптических мульти-спектральных сенсоров, представляющих собой сборку единичных фотодиодов, расположенных в общем корпусе, каждый из которых расположен над отдельной лункой 9 (на рисунке не показано). На каждый фотодиод устанавливают собственный интерференционный светофильтр (на рисунке не показано) с полосами пропускания, соответствующими спектрам излучения применяемых флуорофоров. При этом для увеличения площади фоточувствительного элемента и равномерного распределения излучения в плоскости фокусировки, фотодиоды с фильтрами каждого спектрального диапазона могут быть объединены в пары. В случае использования мульти-спектральных сенсоров не требуется установка дополнительных многополосных светофильтров, при этом появляется возможность проводить мультиплексную полимеразную цепную реакцию с возможностью одновременного определения большого числа мишеней в одной пробе – во всех реакционных лунках 9 чипа-картриджа 4 (до 24 мишеней). It is also allowed to install optical multi-spectral sensors in the optical system as a photodetector 16, which are an assembly of single photodiodes located in a common housing, each of which is located above a separate hole 9 (not shown in the figure). Each photodiode is equipped with its own interference filter (not shown in the figure) with passbands corresponding to the emission spectra of the fluorophores used. In this case, to increase the area of the photosensitive element and uniform distribution of radiation in the focusing plane, photodiodes with filters of each spectral range can be combined in pairs. In the case of using multi-spectral sensors, the installation of additional multiband light filters is not required, while it becomes possible to carry out a multiplex polymerase chain reaction with the possibility of simultaneous determination of a large number of targets in one sample - in all reaction wells 9 of the chip cartridge 4 (up to 24 targets).

Узел отображения результатов измерений включает плату 19 обработки сигнала, принятого от фотопрёмного устройства 16, встроенный компьютер 20 (электронную систему управления) для переработки поступающих сигналов и их вывода на дисплей 5 в виде, например, графика ПЦР-кривой. Для обеспечения удобной работы, управления функциями прибора, а также отображения результатов измерений прибор может быть оснащен сенсорным LCD дисплеем 5. Дисплей 5 может быть расположен на крышке 2. На лицевой (передней панели корпуса 1) может быть предусмотрена световая RGB индикация 21 различных режимов работы прибора, таких, как процесс термоциклирования, наличие чипа-картриджа 4, обнаружение патогена, сигнализация о появлении различных неисправностей в работе и т.д. Прибор может быть оснащен USB-разъемом 22 для подключения к внешнему компьютеру, а также USB-разъемом 23 для передачи результатов ПЦР на внешний Flash-накопитель. The unit for displaying the measurement results includes a board 19 for processing the signal received from the photodetector 16, an embedded computer 20 (electronic control system) for processing incoming signals and displaying them on the display 5 in the form of, for example, a PCR curve graph. To ensure convenient operation, control the device functions, as well as display the measurement results, the device can be equipped with a touchscreen LCD display 5. Display 5 can be located on the cover 2. On the front (front panel of the housing 1), RGB light indication of 21 different operating modes can be provided devices, such as the process of thermal cycling, the presence of a chip-cartridge 4, detection of a pathogen, signaling of various malfunctions in operation, etc. The device can be equipped with a USB connector 22 for connecting to an external computer, as well as a USB connector 23 for transferring PCR results to an external Flash drive.

Прибор для проведения амплификации нуклеиновых кислот используют следующим образом. Чип-картридж 4 заправляют реагентами, содержащими флуорофоры (флуоресцентные красители), с помощью дозатора или шприца с плоской иглой. Заправочное отверстие 10, как и отверстие 11 для выхода воздуха имеют ступенчатую форму. Такая форма отверстий 10 и 11 предотвращает возможное повреждение герметизирующей плёнки дозатором или иглой на нижней стороне чипа-картриджа 4, которая герметизирует лунки 9. В одну лунку 9 (например, с габаритами: диаметр 7 мм и высотой 0,6 мм) помещается до 24 мкл жидкости (реагентов). Габариты лунки 9 могут быть разными: шире, тоньше или глубже, при этом важно, чтобы объем лунки 9 не изменился. Заправочные отверстия 10 расположены таким образом, чтобы иметь максимально возможное расстояния друг от друга во избежание возможной контаминации между лунками 9. Чип-картридж 4 в данном примере, изображенном на фиг. 4, имеет шесть лунок 9. Две из них предполагается использовать для положительного и отрицательного контроля. Форма чипа-картриджа 4, его размеры и количество лунок 9 зависят от оптической системы, в которой будут использованы. После незначительной доработки оптического узла можно адаптировать любое количество лунок 9 на одном чипе-картридже 4.An apparatus for carrying out amplification of nucleic acids is used as follows. Chip cartridge 4 is filled with reagents containing fluorophores (fluorescent dyes) using a dispenser or flat-needle syringe. The filling hole 10, like the air outlet 11, have a stepped shape. This shape of holes 10 and 11 prevents possible damage to the sealing film by the dispenser or the needle on the underside of the chip cartridge 4, which seals the wells 9. One well 9 (for example, with dimensions: 7 mm in diameter and 0.6 mm in height) can accommodate up to 24 μl of liquid (reagents). The dimensions of hole 9 can be different: wider, thinner or deeper, while it is important that the volume of hole 9 does not change. The filling holes 10 are located so as to have the greatest possible distance from each other in order to avoid possible contamination between the wells 9. The chip cartridge 4 in this example shown in FIG. 4 has six wells 9. Two of these are intended to be used for positive and negative controls. The shape of the chip cartridge 4, its dimensions and the number of wells 9 depend on the optical system in which it will be used. After minor modifications to the optical assembly, any number of 9 wells can be adapted on one chip cartridge 4.

После заправки всех лунок 9 герметизируют заправочные отверстия 10 и отверстия 11 для выхода воздуха. Для этого используют прозрачную плёнку с тонким слоем клея (на рисунке не показано). Плёнку клеящей стороной прикладывают к верхней поверхности чипа-картриджа 4 и равномерно разглаживают. Этот метод позволяет с высокой эффективностью герметизировать отверстия 10 и 11, при этом лунки 9 окончательно герметизируются тоже, что позволяет избежать разгерметизации во время амплификации. Благодаря наличию заливных воронок (фасок) в отверстиях 10 практически исключается попадание заливаемой жидкости на верхнюю поверхность чипа-картриджа 4. После герметизации чип-картридж 4 вставляют в прибор для проведения амплификации нуклеиновых кислот.After filling all holes 9, the filling holes 10 and the air outlet holes 11 are sealed. To do this, use a transparent film with a thin layer of glue (not shown in the figure). The adhesive side of the film is applied to the upper surface of the chip-cartridge 4 and evenly smoothed out. This method makes it possible to seal holes 10 and 11 with high efficiency, while wells 9 are also finally sealed, which avoids depressurization during amplification. Due to the presence of filling funnels (chamfers) in the holes 10, it is practically excluded that the liquid being poured onto the upper surface of the chip-cartridge 4. After sealing, the chip-cartridge 4 is inserted into the device for carrying out amplification of nucleic acids.

Использование в блоке 3 термоциклирования чипа-картриджа 4 элемента Пельтье размером, например, 40x40 мм даёт возможность не только равномерно нагревать все лунки 9 чипа-картриджа 4, но и значительно уменьшить габариты прибора для ПЦР. Максимальная тепловая мощность элемента составляет 170 Вт, но фактически блок 3 загружен лишь на 30%. Это позволяет снизить нагрузку на элемент Пельтье и увеличить его срок службы. При старте амплификации элемент Пельтье нагревает блок 6 (он может быть выполнен из алюминия). Нагревательный блок 6 передает тепло на плотно прижатый к нему чип-картридж 4 с лунками 9. Внутри нагревательного блока 6 и под нижней керамической площадкой элемента Пельтье можно установить термопары или терморезисторы для более точного управления и контроля температурой термоциклирования. Расположенный под нижней площадкой элемента Пельтье ребристый радиатор 7 отводит выделяемое тепло, а радиальный вентилятор 8 его дополнительно охлаждает. Такая компактная конструкция блока 3 термоциклирования позволяет значительно уменьшить размеры прибора в целом. The use of 4 Peltier elements in the thermal cycling unit 3 of the chip-cartridge with a size of, for example, 40x40 mm makes it possible not only to uniformly heat all the wells 9 of the chip-cartridge 4, but also to significantly reduce the dimensions of the PCR device. The maximum thermal power of the element is 170 W, but in fact, block 3 is loaded only by 30%. This reduces the stress on the Peltier element and increases its service life. When the amplification starts, the Peltier element heats up block 6 (it can be made of aluminum). The heating block 6 transfers heat to the chip cartridge 4 with wells 9 tightly pressed against it. Inside the heating block 6 and under the lower ceramic platform of the Peltier element, thermocouples or thermistors can be installed for more precise control and monitoring of the temperature of thermal cycling. The finned radiator 7 located under the lower platform of the Peltier element removes the generated heat, and the radial fan 8 additionally cools it. Such a compact design of the thermal cycling unit 3 makes it possible to significantly reduce the size of the device as a whole.

В процессе работы прибора после каждого цикла происходит измерение уровня флуоресценции флуоресцентных красителей, при этом интенсивность излучения говорит о первоначальном количестве интересующих молекул в исследуемом образце. Измерение уровня флуоресценции осуществляют компактной оптической системой (см. фиг. 3), включающей узел возбуждения флуорофоров и флуоресцентных красителей и узел приёма сигнала флуоресценции (узел детекции оптического сигнала). Во время амплификации происходит торцевое возбуждение флуорофоров. Для спектрального разделения возбуждающего излучения и излучения флуорофоров между светодиодами 14 и торцом чипа-картриджа 4 установлены интерференционные светофильтры 15 с максимумами пропускания в диапазонах длин волн, соответствующих длинам волн поглощения красителей. В оптической системе обеспечено минимальное расстояние между возбуждающими светодиодами 14 и торцами чипа-картриджа 4 для увеличения количества полезного излучения, проникающего внутрь чипа-картриджа 4. During the operation of the device, after each cycle, the level of fluorescence of fluorescent dyes is measured, while the radiation intensity indicates the initial number of molecules of interest in the sample under study. The measurement of the fluorescence level is carried out with a compact optical system (see Fig. 3), which includes a unit for excitation of fluorophores and fluorescent dyes and a unit for receiving a fluorescence signal (unit for detecting an optical signal). During amplification, fluorophores face excitation occurs. For spectral separation of the exciting radiation and the fluorophore radiation, interference filters 15 with transmission maxima in the wavelength ranges corresponding to the absorption wavelengths of the dyes are installed between the LEDs 14 and the end face of the cartridge chip 4. The optical system provides a minimum distance between the driving LEDs 14 and the ends of the chip cartridge 4 to increase the amount of useful radiation that penetrates into the chip cartridge 4.

Излучение флуоресцентного красителя исследуемого образца улавливает система линз 17 с интерференционным светофильтром 18 со спектрами пропускания, соответствующими спектрам излучения флуоресцентных красителей. Сигнал, зарегистрированный фотоприёмным устройством 16 оптической системы, поступает в плату обработки сигнала, а встроенный компьютер обрабатывает данные и выводит их на дисплей 5 в виде графика (на рисунке не показано) или, например в виде графика ПЦР-кривой. Если на лицевой панели предусмотрена световая RGB индикация 21 различных режимов работы прибора, таких, как процесс термоциклирования, наличие чипа-картриджа 4, обнаружение патогена, сигнализация о появлении различных неисправностей в работе и т.д., то при небольшом усложнении прибора значительно облегчается управление его работой. Оснащение прибора USB-разъемом 22 для подключения к внешнему компьютеру и USB-разъемом 23 для передачи результатов ПЦР на внешний Flash-накопитель даёт возможность расширить его функции. The radiation of the fluorescent dye of the test sample is captured by a system of lenses 17 with an interference filter 18 with transmission spectra corresponding to the emission spectra of fluorescent dyes. The signal recorded by the photodetector 16 of the optical system enters the signal processing board, and the built-in computer processes the data and displays them on the display 5 in the form of a graph (not shown in the figure) or, for example, in the form of a PCR curve graph. If the front panel provides RGB light indication of 21 different operating modes of the device, such as the thermal cycling process, the presence of a chip-cartridge 4, detection of a pathogen, signaling the appearance of various malfunctions in operation, etc., then with a slight complication of the device, control is greatly facilitated his work. Equipping the device with a USB connector 22 for connecting to an external computer and a USB connector 23 for transferring PCR results to an external Flash drive makes it possible to expand its functions.

Повышению эффективности исследования с помощью вышеописанного компактного портативного прибора для проведения амплификации нуклеиновых кислот, в том числе и ПЦР (полимеразной цепной реакции) в режиме реального времени, способствует материал чипа-картриджа 4 с высокой биоинертностью, низкой автофлуоресценцией и высоким уровнем прохождения пучка света, обеспечивающий возможность использования узкополосных светодиодов 14 с боковых торцов чипа-картриджа 4. Что, в свою очередь, дает возможность значительно уменьшить габариты прибора в целом. Горизонтальное расположение чипа-картриджа 4 в процессе проведения исследований способствует повышению равномерности прогревания и охлаждения образцов, исключает стекание жидкости в реакционных лунках 9 в одну сторону. Торцевое возбуждение флуорофоров даёт возможность при уменьшении габаритов оптической системы повысить отношение сигнал/шум (ОСШ) фотоприёмного устройства 16. An increase in the efficiency of the study using the above-described compact portable device for carrying out amplification of nucleic acids, including PCR (polymerase chain reaction) in real time, is facilitated by the material of the chip-cartridge 4 with high bioinertness, low autofluorescence and a high level of light beam transmission, which provides the possibility of using narrow-band LEDs 14 from the side ends of the chip-cartridge 4. This, in turn, makes it possible to significantly reduce the overall dimensions of the device. The horizontal arrangement of the chip-cartridge 4 in the course of the research helps to increase the uniformity of heating and cooling of the samples, excludes the liquid drainage in the reaction wells 9 in one direction. The edge excitation of fluorophores makes it possible to increase the signal-to-noise ratio (SNR) of the photodetector 16 with a decrease in the size of the optical system.

Таким образом, технический результат, достигаемый с использованием заявленного изобретения, заключается в повышении компактности, универсальности и быстродействия прибора для проведения амплификации нуклеиновых кислот с увеличением его надежности при проведении различных исследований не только в лаборатории, но и в полевых условиях, например, у постели больного, в том числе проведение ПЦР (полимеразной цепной реакции) в режиме реального времени.Thus, the technical result achieved with the use of the claimed invention is to increase the compactness, versatility and speed of the device for carrying out amplification of nucleic acids with an increase in its reliability when carrying out various studies not only in the laboratory, but also in the field, for example, at the patient's bedside. , including carrying out PCR (polymerase chain reaction) in real time.

Claims

1. A device for carrying out amplification of nucleic acids, consisting of a housing with a hole for installing a chip cartridge on its front panel and a lid located inside the housing of a thermal cycling unit, an optical system consisting of a unit for excitation of fluorescence of reaction wells of a chip cartridge, including a light source and light filters, a fluorescence signal receiving unit and an electronic control system with a display and interfaces for connecting other devices, characterized in that the thermal cycling unit is located horizontally in the lower zone of the device case, and the optical system is located above the thermal cycling unit in such a way that the place for the horizontal position of the chip is cartridge is located in the lower zone of the optical system, while the light source is made in the form of narrow-band light-emitting diodes installed along the side ends of the cartridge chip, and the fluorescence signal receiving unit is located directly above the reaction wells of the cartridge chip, and the Si receiving unit The fluorescence unit is either equipped with multispectral sensors, each of which is located above a separate well, or equipped with separate photodiodes, each of which is located above a separate well, made with single-band and / or multi-band interference filters.

2. The device according to claim 1, characterized in that the fluorescence signal receiving unit is equipped with lenses.

3. The device according to claim 1, characterized in that it is equipped with RGB light indication located on the front panel of the case.

4. The device according to claim 1, characterized in that it is equipped with a USB connector for connecting to an external computer, as well as a USB connector for transferring PCR results to an external Flash-drive, located on the front side of the case.

5. The device according to claim 1, characterized in that the thermal cycling unit is equipped with a radial fan located inside the housing next to the thermal cycling unit.

6. The device according to claim 1, characterized in that the display is located on the cover of the device.