RU2755401C1 - Method for assessing state of a biocell - Google Patents
Method for assessing state of a biocell Download PDFInfo
- Publication number
- RU2755401C1 RU2755401C1 RU2021101310A RU2021101310A RU2755401C1 RU 2755401 C1 RU2755401 C1 RU 2755401C1 RU 2021101310 A RU2021101310 A RU 2021101310A RU 2021101310 A RU2021101310 A RU 2021101310A RU 2755401 C1 RU2755401 C1 RU 2755401C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cadmium sulfide
- disodium salt
- ethylenediaminetetraacetic acid
- biocell
- edta
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для визуализации биологических объектов, в частности для биологических исследований одиночной клетки и различных процессов на внутриклеточном уровне.The invention relates to medicine and can be used to visualize biological objects, in particular for biological studies of a single cell and various processes at the intracellular level.
Известен способ биологической визуализации, включающий мечение анализируемых клеточных компонент, клеток, тканей или органов флуоресцентными зондами, состоящими из биологически распознающих молекул и флуоресцентных красителей, излучающих в инфракрасной области и последующую регистрацию флуоресценцию красителей, в качестве которых используют полупроводниковые нанокристаллы PbS/CdS/ZnS, CuInS2/ZnS, Ag2S (Патент RU 2639125; МПК G01N 21/64, G01N 33/53, B82Y 15/00; 2017 год).A known method of biological imaging, including the labeling of the analyzed cellular components, cells, tissues or organs with fluorescent probes consisting of biologically recognizing molecules and fluorescent dyes emitting in the infrared region and the subsequent registration of the fluorescence of dyes, which are used as semiconductor nanocrystals PbS / CdS / ZnS, CuInS 2 / ZnS, Ag 2 S (Patent RU 2639125; IPC G01N 21/64, G01N 33/53, B82Y 15/00; 2017).
Однако в известном способе визуализации не возможно наблюдение внутренней структуры клетки вследствие значительных размеров зонда, состоящего из распознающей молекулы и флуоресцентного красителя. However, in the known visualization method, observation of the internal structure of the cell is not possible due to the considerable size of the probe, which consists of a recognition molecule and a fluorescent dye.
Известен способ изучения состояния клетки при цитомегаловирусной инфекции с помощью квантовых точек на основе CdS, включающий контакт “клеточных” тест-препаратов с коллоидным раствором квантовых точек (КТ) на основе полупроводниковых нанокристаллов сульфида кадмия (CdS) с концентрацией 1016 наночастиц в 1 см3 раствора (в случае размера наночастиц, равного 3 нм, концентрация CdS равна 12.5 мМ), регистрацию флуоресценции полученных образцов на оптическом флуоресцентном микроскопе с использованием ультрафиолетового фильтра в диапазоне длин волн от 335 до 445 нм, получение микрофотографий и их обработку с помощью стандартных программ. Способ позволяет наблюдать изменения клеточных структур на модели продуктивной цитомегаловирусной инфекции, последовательно обнаруживая изменение веретенообразной формы клеток до округлой, разрыхление монослоя и появление образований «совиный глаз» (Ремпель С.В., Александрова Н.Н., Порываева А.П., Ремпель А.А. «Изучение состояния клетки при цитомегаловирусной инфекции с помощью квантовых точек на основе CdS», Вестник уральской медицинской академической науки, № 2, 2014, с. 190-192).There is a known method for studying the state of a cell during cytomegalovirus infection using quantum dots based on CdS, including contact of "cellular" test preparations with a colloidal solution of quantum dots (QDs) based on semiconductor nanocrystals of cadmium sulfide (CdS) with a concentration of 10 16 nanoparticles in 1 cm 3 solution (in the case of a nanoparticle size of 3 nm, the CdS concentration is 12.5 mM), registration of the fluorescence of the obtained samples on an optical fluorescence microscope using an ultraviolet filter in the wavelength range from 335 to 445 nm, obtaining micrographs and processing them using standard programs. The method allows observing changes in cellular structures on a model of productive cytomegalovirus infection, consistently detecting a change in the spindle-shaped shape of cells to a round one, loosening of the monolayer and the appearance of "owl-eye" formations (Rempel S.V., Aleksandrova N.N., Poryvaeva A.P., Rempel AA "Study of the state of cells in cytomegalovirus infection using quantum dots based on CdS", Bulletin of the Ural Medical Academic Science, No. 2, 2014, pp. 190-192).
Однако известный способ не обеспечивает достаточную достоверность и воспроизводимость наблюдения внутренней структуры клетки, поскольку необходимая для неразрушающей клетки коньюгации концентрация наночастиц устанавливается путем разбавления раствора, без учета диапазона максимальной интенсивности люминесценции и концентрационного тушения. However, the known method does not provide sufficient reliability and reproducibility of observation of the internal structure of the cell, since the concentration of nanoparticles required for non-destructive cell conjugation is established by diluting the solution, without taking into account the range of maximum luminescence intensity and concentration quenching.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ оценки состояния биоклетки путем ее визуализации, включающий получение конъюгата биоклетки и наночастиц сульфида кадмия путем помещения и выдержки клеточной культуры в коллоидный раствор, содержащий наночастицы сульфида кадмия, покрытые оболочкой из динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), нанесение полученного конъюгата на предметное стекло, облучение ультрафиолетовым излучением в диапазоне длин волн 335-425 нм, регистрацию флуоресценции, получение микрофотографий и их последующую обработку с помощью стандартных программ (С.В. Ремпель, Н.С. Кожевникова, Н.Н. Александровна, А.А. Ремпель «Флуоресцентные наночастицы CdS для визуализации структуры клеток», Неорганические материалы, т.47, №3, с. 271-275, 2011).Closest to the proposed invention is a method for assessing the state of a biocell by visualizing it, including obtaining a conjugate of a biocell and nanoparticles of cadmium sulfide by placing and holding the cell culture in a colloidal solution containing cadmium sulfide nanoparticles coated with a disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), applying the resulting conjugate on a glass slide, irradiation with ultraviolet radiation in the wavelength range of 335-425 nm, registration of fluorescence, obtaining micrographs and their subsequent processing using standard programs (S.V. Rempel, N.S. Kozhevnikova, N.N. Aleksandrovna, A. A. Rempel "Fluorescent CdS nanoparticles for visualization of cell structure", Inorganic materials, vol.47, No. 3, pp. 271-275, 2011).
Однако известный способ не обеспечивает достаточной достоверности информации вследствие невысокой чувствительности и точности наблюдения, которые обусловлены высокой концентрацией наночастиц сульфида кадмия в коллоидном растворе и не оптимальным соотношением размеров ядра (CdS) и оболочки (ЭДТА), поскольку излишнее увеличение толщины оболочки затрудняет неразрушающее проникновение флуоресцентной метки в клетку. However, the known method does not provide sufficient information reliability due to the low sensitivity and accuracy of observation, which are due to the high concentration of cadmium sulfide nanoparticles in the colloidal solution and the suboptimal ratio of the sizes of the core (CdS) and the shell (EDTA), since an excessive increase in the thickness of the shell makes it difficult for the non-destructive penetration of the fluorescent label into the cage.
Таким образом, перед авторами стояла задача разработать способ оценки состояния биоклетки, обеспечивающий высокую достоверность получаемой информации за счет повышения чувствительности и точности.Thus, the authors were faced with the task of developing a method for assessing the state of a biocell, providing high reliability of the information obtained by increasing the sensitivity and accuracy.
Поставленная задача решена в способе оценки состояния биоклетки путем ее визуализации, включающем получение конъюгата биоклетки и наночастиц сульфида кадмия путем помещения и выдержки клеточной культуры в коллоидном водном растворе, содержащем наночастицы сульфида кадмия, покрытые оболочкой из динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), нанесение полученного конъюгата на предметное стекло, облучение ультрафиолетовым излучением в диапазоне длин волн 335-425 нм, регистрацию флуоресценции, получение микрофотографий и их последующую обработку с помощью стандартных программ, в котором используют коллоидный водный раствор с концентрацией наночастиц сульфида кадмия, покрытых оболочкой из динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, равной 3,0-3,5 мМ, при этом соотношение сульфида кадмия (ядро) и динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (оболочка) равно, масс.%: сульфид кадмия – 8.78 ÷ 8.92; динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты – 91.08 ÷ 91.22. The problem is solved in a method for assessing the state of a biocell by visualizing it, including obtaining a conjugate of a biocell and nanoparticles of cadmium sulfide by placing and holding the cell culture in a colloidal aqueous solution containing nanoparticles of cadmium sulfide coated with a disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), on a glass slide, irradiation with ultraviolet radiation in the wavelength range of 335-425 nm, registration of fluorescence, obtaining micrographs and their subsequent processing using standard programs, in which a colloidal aqueous solution with a concentration of cadmium sulfide nanoparticles coated with a shell of disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid is used, equal to 3.0-3.5 mM, while the ratio of cadmium sulfide (core) and disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (shell) is equal, wt%: cadmium sulfide - 8.78 ÷ 8.92; disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid - 91.08 ÷ 91.22.
В настоящее время из патентной и научно-технической литературы не известен способ оценки состояния биоклетки путем использования для диагностики состояния биоклетки регистрации свечения конъюгата, образованного клеточной культурой и флуоресцентными метками, покрытым оболочкой, под действием ультрафиолетового излучения, в котором для получения конъюгата используют коллоидный раствор с концентрацией наночастиц сульфида кадмия, покрытых оболочкой из динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, равной 3,0-3,5 мМ, при соотношении сульфид кадмия (ядро) и динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (оболочка) равно, масс.%: сульфид кадмия - 8.78 ÷ 8.92; динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты - 91.08 ÷ 91.22.At present, from the patent and scientific and technical literature, there is no known method for assessing the state of a biocell by using for diagnosing the state of a biocell by registering the luminescence of a conjugate formed by a cell culture and fluorescent labels coated with a membrane under the action of ultraviolet radiation, in which a colloidal solution with concentration of cadmium sulfide nanoparticles coated with a shell of disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid, equal to 3.0-3.5 mM, with a ratio of cadmium sulfide (core) and disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (shell) is equal, wt%: cadmium sulfide - 8.78 ÷ 8.92 ; disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid - 91.08 ÷ 91.22.
Исследования, проведенные авторами, позволили сделать вывод, что для получения максимальной интенсивности свечения флуоресцентной метки, обеспечивающей чувствительность и точность наблюдения, концентрация наночастиц сульфида кадмия в коллоидном растворе должна находиться в оптимальном интервале, не выше и не ниже крайних значений этого интервала. Выполнение этого условия достигается путем использования концентрации сульфида кадмия в растворе, равной 3,0 - 3.5 мМ. При этом получают раствор с полупроводниковыми наночастицами CdS со средним диаметром ядра около 3 нм. Наночастицы CdS такого размера (значение близко к значению радиуса экситона Бора для CdS) обеспечивают режим сильного конфаймента и являются квантовыми точками (КТ) с диапазоном флуоресценции, зависящим от зависящим от размера. При исследовании оптических свойств водных коллоидных растворов авторами обнаружено, что концентрация наночастиц значительно влияет на интенсивность флуоресценции, а, следовательно, и чувствительность и точность определения мишени при визуализации. С одной стороны, недостаточная концентрация наночастиц CdS снижает интенсивность резонансной передачи энергии возбуждения от наночастиц к биологическим структурам клетки (белки, митохондрии и т.п.) для последующего высвечивания. С другой стороны, превышение некоторой концентрации наночастиц CdS в растворе приводит к передаче энергии от наночастицы к наночастицы при столкновениях (за счет безизлучательного и излучательного механизма) с дальнейшей безизлучательной релаксацией внутри наночастицы. Такое явление способствует тушению флуоресценции и снижению чувствительности анализа. Выбранная концентрация наночастиц сульфида кадмия обеспечивает неразрушающий способ подготовки конъюгатов клеток с флуоресцентными метками (наночастицами сульфида кадмия), отсутствие концентрационного тушения, и, как следствие, максимальную интенсивность флуоресценции. The studies carried out by the authors led to the conclusion that to obtain the maximum luminescence intensity of the fluorescent label, which ensures the sensitivity and accuracy of observation, the concentration of cadmium sulfide nanoparticles in the colloidal solution should be in the optimal range, not higher or lower than the extreme values of this range. The fulfillment of this condition is achieved by using a concentration of cadmium sulfide in solution equal to 3.0 - 3.5 mM. This produces a solution with semiconductor CdS nanoparticles with an average core diameter of about 3 nm. CdS nanoparticles of this size (the value is close to the value of the Bohr exciton radius for CdS) provide a strong confinement regime and are quantum dots (QDs) with a size-dependent fluorescence range. When studying the optical properties of aqueous colloidal solutions, the authors found that the concentration of nanoparticles significantly affects the fluorescence intensity and, consequently, the sensitivity and accuracy of target determination during visualization. On the one hand, insufficient concentration of CdS nanoparticles reduces the intensity of resonant transfer of excitation energy from nanoparticles to biological structures of the cell (proteins, mitochondria, etc.) for subsequent emission. On the other hand, exceeding a certain concentration of CdS nanoparticles in solution leads to energy transfer from nanoparticle to nanoparticle during collisions (due to the nonradiative and radiative mechanism) with further nonradiative relaxation inside the nanoparticle. This phenomenon contributes to quenching fluorescence and reducing the sensitivity of the assay. The selected concentration of cadmium sulfide nanoparticles provides a non-destructive method for preparing conjugates of cells with fluorescent labels (cadmium sulfide nanoparticles), the absence of concentration quenching, and, as a consequence, the maximum fluorescence intensity.
Для получения стабильного водного раствора наночастиц сульфида кадмия в качестве стабилизатора используют динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Ионы ЭДТА адсорбируются на поверхности наночастиц сульфида кадмия, образуя координационные связи с поверхностными атомами кадмия, и предотвращают агломерацию частиц. Однако, как показали исследования, проведенные авторами, существенное значение имеет соотношение наночастиц сульфида кадмия и количество вводимой в коллоидный раствор динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Исходя из того, что средний диаметр ядра (CdS) равен ~ 3 нм, оптимальная толщина стабилизирующей оболочки должна быть равной 2 - 3 нм. Это условие соблюдается при использовании в водном коллоидном растворе соотношения, масс.%: сульфид кадмия - 8.78 ÷ 8.92; динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты - 91.08 ÷ 91.22. Уменьшение содержания сульфида кадмия и увеличение содержания ЭДТА ведет к увеличению толщины оболочки. Это приводит к снижению интенсивности процессов поглощения падающей световой энергии и передачи ее наблюдаемому объекту. При увеличении содержания сульфида кадмия и уменьшении содержания ЭДТА возможна агломерация некоторой части наночастиц сульфида кадмия, что снижает интенсивность излучения а, следовательно, точность и чувствительность анализа. Таким образом, предлагаемое авторами соотношение между наночастицами сульфида кадмия и стабилизатором ЭДТА обеспечивает неразрушающее проникновение флуоресцентной метки в клетку, максимальную интенсивность флуоресценции и, как следствие, повышение достоверности получаемой информации за счет повышения точности.To obtain a stable aqueous solution of cadmium sulfide nanoparticles, a disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) is used as a stabilizer. EDTA ions are adsorbed on the surface of cadmium sulfide nanoparticles, forming coordination bonds with surface cadmium atoms and preventing particle agglomeration. However, as shown by the studies carried out by the authors, the ratio of cadmium sulfide nanoparticles and the amount of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt introduced into the colloidal solution is of great importance. Based on the fact that the average core diameter (CdS) is ~ 3 nm, the optimal thickness of the stabilizing shell should be 2 - 3 nm. This condition is met when using in an aqueous colloidal solution the ratio, wt.%: Cadmium sulfide - 8.78 ÷ 8.92; disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid - 91.08 ÷ 91.22. A decrease in the cadmium sulfide content and an increase in the EDTA content lead to an increase in the shell thickness. This leads to a decrease in the intensity of the processes of absorption of incident light energy and its transfer to the observed object. With an increase in the content of cadmium sulfide and a decrease in the content of EDTA, agglomeration of some part of cadmium sulfide nanoparticles is possible, which reduces the radiation intensity and, consequently, the accuracy and sensitivity of the analysis. Thus, the ratio between cadmium sulfide nanoparticles and EDTA stabilizer, proposed by the authors, provides non-destructive penetration of a fluorescent label into the cell, maximum fluorescence intensity and, as a consequence, an increase in the reliability of the information obtained by increasing the accuracy.
Таким образом, авторами предлагается способ определения состояния биоклетки, обеспечивающий повышения достоверности получаемой информации за счет увеличения чувствительности и точности наблюдений, что в свою очередь позволяет с максимальной вероятностью констатировать наличие здоровых клеток в биоматериале или клеток с разрушенной цитоплазмой и ядром под воздействием вирусов. В предлагаемом способе возможность наблюдения отдельных деталей клетки реализуется за счет безизлучательного переноса энергии от наночастиц CdS к белкам и другим молекулам, составляющим клетку. Перенос энергии по механизму Фёрстера (за счет диполь-дипольного взаимодействия) на расстояниях от 2 до 5 нм может осуществляться при условиях, что наночастицы CdS и молекула расположены близко друг от друга, спектры излучения наночастиц CdS и поглощения молекулы перекрываются, время переноса энергии от наночастицы CdS к молекуле должно быть меньше времени жизни возбуждённого состояния наночастицы CdS, приводящего к излучательной релаксации. Проведенные эксперименты и расчеты времени, необходимого для излучательной релаксации возбужденного экситона в CdS показали, что в предлагаемом способе все условия выполняются.Thus, the authors propose a method for determining the state of a biocell, providing an increase in the reliability of the information obtained by increasing the sensitivity and accuracy of observations, which in turn makes it possible to ascertain with the maximum probability the presence of healthy cells in a biomaterial or cells with destroyed cytoplasm and nucleus under the influence of viruses. In the proposed method, the possibility of observing individual details of the cell is realized due to non-radiative energy transfer from CdS nanoparticles to proteins and other molecules that make up the cell. Energy transfer by the Förster mechanism (due to dipole-dipole interaction) at distances from 2 to 5 nm can be carried out under the conditions that the CdS nanoparticles and the molecule are located close to each other, the emission spectra of CdS nanoparticles and the absorption of the molecule overlap, the time of energy transfer from the nanoparticle CdS to the molecule should be shorter than the lifetime of the excited state of the CdS nanoparticle, which leads to radiative relaxation. The experiments and calculations of the time required for the radiative relaxation of an excited exciton in CdS showed that in the proposed method all conditions are met.
Предлагаемый способ может быть осуществлен следующим образом. The proposed method can be implemented as follows.
В пробирку с коллоидным водным раствором с концентрацией наночастиц сульфида кадмия, покрытых оболочкой из динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), равной 3,0-3,5 мМ, при этом соотношение сульфида кадмия (ядро) и динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (оболочка) равно, масс.%: сульфид кадмия - 8.78 ÷ 8.92; динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты - 91.08 ÷ 91.22, помещают клеточные культуры на покровных стеклах и выдерживают в течение определенного времени (30 – 40 мин.). После этого покровные стекла с конъюгатами клеток и флуоресцента вынимают и высушивают на воздухе. Подготовленные конъюгаты используют для визуального анализа на флуоресцентном микроскопе. Возбуждение флуоресценции проводят облучением УФ светом в диапазоне 335 – 425 нм. Благодаря высокой фотостабильности наночастиц не накладывается ограничений на время наблюдения под действием УФ. Регистрацию необходимых изображений производят с помощью цифровой камеры микроскопа с последующей обработкой (в случае необходимости) с помощью стандартных программ. После наблюдения подготовленные образцы не требуют специальных условий хранения и пригодны для повторного анализа в течение неограниченного времени. Предлагаемый способ можно применять для цитологических исследований жизнедеятельности клеток, изучения патогенеза вирусных инфекций и противовирусного действия различных препаратов на модели клеточных культур, в методах иммуно-флуоресцентного анализа. Into a test tube with a colloidal aqueous solution with a concentration of cadmium sulfide nanoparticles coated with a disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), equal to 3.0-3.5 mM, while the ratio of cadmium sulfide (core) and disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid (shell) is equal to , wt%: cadmium sulfide - 8.78 ÷ 8.92; disodium salt of ethylenediaminetetraacetic acid - 91.08 ÷ 91.22, place the cell cultures on cover glasses and incubate for a certain time (30-40 minutes). Thereafter, the coverslips with the conjugates of cells and fluorescent are removed and dried in air. The prepared conjugates are used for visual analysis under a fluorescence microscope. Excitation of fluorescence is carried out by irradiation with UV light in the range of 335 - 425 nm. Due to the high photostability of nanoparticles, there are no restrictions on the observation time under the influence of UV. Registration of the required images is performed using a digital microscope camera with subsequent processing (if necessary) using standard programs. After observation, the prepared samples do not require special storage conditions and are suitable for repeated analysis for an unlimited time. The proposed method can be used for cytological studies of the vital activity of cells, the study of the pathogenesis of viral infections and the antiviral action of various drugs on the model of cell cultures, in the methods of immunofluorescence analysis.
На фиг. 1 представлена микрофотография здоровых клеток суточной линии ФЛЕЧ, конъюгированных с КТ CdS стабилизированных с помощью оболочки из ЭДТА.FIG. 1 shows a micrograph of healthy cells of the daily FLESH line conjugated with CdS QDs stabilized with an EDTA shell.
На фиг. 2 представлена микрофотография здоровых клеток VERO, конъюгированных с КТ CdS стабилизированных с помощью оболочки из ЭДТА.FIG. 2 shows a micrograph of healthy VERO cells conjugated to CdS QDs stabilized with an EDTA shell.
На фиг. 3 представлена микрофотография клеток VERO, заражённых ВПГ, конъюгированных с КТ CdS стабилизированных с помощью оболочки из ЭДТА. FIG. 3 shows a micrograph of VERO cells infected with HSV, conjugated to CdS QDs, stabilized with an EDTA shell.
Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.The proposed method is illustrated by the following examples.
Пример 1.Example 1.
Готовили по 100 мл растворов Na2S и CdCl2 и EDTA. Для этого брали 0.336; 0. 319 и 0.521 г. гидратированных солей Na2S, CdCl2 и EDTA, соответственно. Растворы Na2S и CdCl2 смешивали в равных объемах, с немедленным добавлением ЭДТА. Далее раствор обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут. Получали водный коллоидный раствор наночастиц CdS с оболочкой из ЭДТА с концентрацией сульфида кадмия 3.5 mM при соотношении, масс.%: сульфид кадмия – 8.92; ЭДТА – 91.08. В пробирку с полученным раствором помещали клеточную культуру ФЛЕЧ на покровном стекле, инкубировали 30 мин. В пробирку с полученным раствором помещали клеточную культуру ФЛЕЧ на покровном стекле, инкубировали 30 мин. Штамм диплоидных клеток ФЛЭЧ получен в лаборатории клеточных культур ЕНИИВИ (Екатеринбуржский НИИ вирусных инфекций). Среда поддержания Игла МЕМ + ГЛА. Покровное стекло вынимали и высушивали. Конъюгаты на покровном стекле наблюдали во флуоресцентном микроскопе Leica 2500М, облучая УФ с длиной волны около 425 нм. Микрофотографии получали с помощью цифровой камеры Leica DFC 320. Наблюдали здоровую клетку правильной формы, с хорошо выраженной структурой, просматривались неоднородности цитоплазмы, клеточное ядро правильной овальной формы (см. фиг. 1). Prepared in 100 ml solutions of Na 2 S and CdCl 2 and EDTA. For this we took 0.336; 0.319 and 0.521 g of hydrated salts of Na 2 S, CdCl 2 and EDTA, respectively. The Na 2 S and CdCl 2 solutions were mixed in equal volumes, with the immediate addition of EDTA. Then the solution was treated with ultrasound for 5 minutes. Received an aqueous colloidal solution of CdS nanoparticles with a shell of EDTA with a concentration of cadmium sulfide 3.5 mM at a ratio, wt.%: Cadmium sulfide - 8.92; EDTA - 91.08. In a test tube with the resulting solution, a FLECH cell culture was placed on a coverslip and incubated for 30 min. In a test tube with the resulting solution, a FLECH cell culture was placed on a coverslip and incubated for 30 min. The strain of diploid cells FLEC was obtained in the laboratory of cell cultures of the ENIIVI (Yekaterinburg Research Institute of Viral Infections). Maintenance environment Needle MEM + GLA. The cover glass was removed and dried. The conjugates on a coverslip were observed under a Leica 2500M fluorescence microscope, irradiating with UV at a wavelength of about 425 nm. Micrographs were obtained using a Leica DFC 320 digital camera. A healthy cell of regular shape, with a well-defined structure was observed, inhomogeneities of the cytoplasm, a cell nucleus of a regular oval shape were observed (see Fig. 1).
Пример 2.Example 2.
Готовили по 100 мл растворов Na2S и CdCl2 и EDTA. Для этого брали 0.307; 0. 292 и 0.476 г. гидратированных солей Na2S, CdCl2 и EDTA, соответственно. Растворы Na2S и CdCl2 смешивали в равных объемах, сразу добавляли ЭДТА. Далее раствор обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут. Получали водный коллоидный раствор наночастиц CdS с оболочкой из ЭДТА с концентрацией сульфида кадмия 3.2 mM при соотношении, масс.%: сульфид кадмия – 8.81; ЭДТА – 91.19. В пробирку с полученным раствором помещали перевиваемые клетки VERO, культивированные на покровных стеклах, инкубировали 40 мин. В пробирку с полученным раствором помещали перевиваемые клетки почек обезьяны Vero, культивированные на покровных стеклах, инкубировали 40 мин. Перевиваемые клетки культивировали на покровных стеклах в питательной среде RPMJ, содержащей глютамин и 10% сыворотку крупного рогатого скота при 37°С. Концентрация суспензии составляла 100000 клеток на миллилитр. Покровное стекло вынимали и высушивали. Конъюгаты на покровном стекле наблюдали во флуоресцентном микроскопе Leica 2500М, облучая УФ с длиной волны около 335 нм. Микрофотографии получали с помощью цифровой камеры Leica DFC 320. Наблюдали здоровую клетку правильной формы, с хорошо выраженной структурой, просматривались неоднородности цитоплазмы, клеточное ядро правильной овальной формы со светящимися скоплениями внутри ядра (см. фиг. 2). Prepared in 100 ml solutions of Na 2 S and CdCl 2 and EDTA. For this we took 0.307; 0.292 and 0.476 g of hydrated salts of Na 2 S, CdCl 2 and EDTA, respectively. Solutions of Na 2 S and CdCl 2 were mixed in equal volumes, EDTA was added immediately. Then the solution was treated with ultrasound for 5 minutes. Received an aqueous colloidal solution of CdS nanoparticles with an EDTA shell with a cadmium sulfide concentration of 3.2 mM at a ratio, wt%: cadmium sulfide - 8.81; EDTA - 91.19. Continuous VERO cells cultured on cover slips were placed in a test tube with the resulting solution and incubated for 40 min. In a test tube with the resulting solution, the transplantable kidney cells of the monkey Vero, cultivated on cover slips, were placed and incubated for 40 min. The transplanted cells were cultured on coverslips in RPMJ nutrient medium containing glutamine and 10% bovine serum at 37 ° C. The concentration of the suspension was 100,000 cells per milliliter. The cover glass was removed and dried. The conjugates on a coverslip were observed under a Leica 2500M fluorescence microscope, irradiating with UV at a wavelength of about 335 nm. Micrographs were obtained using a Leica DFC 320 digital camera. A healthy cell of regular shape with a well-defined structure was observed, heterogeneity of the cytoplasm, a cell nucleus of a regular oval shape with luminous clusters inside the nucleus were observed (see Fig. 2).
Пример 3.Example 3.
Готовили по 100 мл растворов Na2S и CdCl2 и EDTA. Для этого брали 0.288; 0. 274 и 0.447 г. гидратированных солей Na2S, CdCl2 и EDTA, соответственно. Растворы Na2S и CdCl2 смешивали в равных объемах, с немедленным добавлением ЭДТА. Далее раствор обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут. Получали водный коллоидный раствор наночастиц CdS с оболочкой из ЭДТА с концентрацией сульфида кадмия 3.0 mM при соотношении, масс.%: сульфид кадмия – 8.78; ЭДТА – 91.22. В пробирку с полученным раствором помещали клетки VERO на третьи сутки после заражения вирусом простого герпеса, инкубировали 30 мин. Инфекционный титр вируса составлял 4,5 lg ТЦП50/мл в 0,02 мл. Покровное стекло вынимали и высушивали. Конъюгаты на покровном стекле наблюдали во флуоресцентном микроскопе Leica 2500М, облучая УФ с длиной волны около 400 нм. Микрофотографии получали с помощью цифровой камеры Leica DFC 320. Наблюдали светящиеся неоднородные деструктурированные скопления, четкой структуры клетки и ядра не наблюдалось (см. фиг. 3). Prepared in 100 ml solutions of Na 2 S and CdCl 2 and EDTA. For this we took 0.288; 0.274 and 0.447 g of hydrated salts of Na 2 S, CdCl 2 and EDTA, respectively. The Na 2 S and CdCl 2 solutions were mixed in equal volumes, with the immediate addition of EDTA. Then the solution was treated with ultrasound for 5 minutes. Received an aqueous colloidal solution of CdS nanoparticles with an EDTA shell with a cadmium sulfide concentration of 3.0 mM at a ratio, wt%: cadmium sulfide - 8.78; EDTA - 91.22. VERO cells were placed in a test tube with the resulting solution on the third day after infection with the herpes simplex virus, incubated for 30 min. The infectious titer of the virus was 4.5 lg TCP50 / ml in 0.02 ml. The cover glass was removed and dried. The conjugates on a coverslip were observed under a Leica 2500M fluorescence microscope, irradiating with UV at a wavelength of about 400 nm. Micrographs were obtained using a Leica DFC 320 digital camera. Luminous, inhomogeneous, destructured clusters were observed; a clear structure of the cell and nucleus was not observed (see Fig. 3).
Таким образом, авторами предлагается способ оценки состояния биоклетки, обеспечивающий высокую степень достоверности получаемой информации за счет повышения чувствительности и точности наблюдений, что позволяет с высокой степенью достоверности оценить состояние биоклетки: является ли она здоровой или заражена вирусом.Thus, the authors propose a method for assessing the state of a biocell, which provides a high degree of reliability of the information obtained by increasing the sensitivity and accuracy of observations, which makes it possible with a high degree of reliability to assess the state of a biocell: whether it is healthy or infected with a virus.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021101310A RU2755401C1 (en) | 2021-01-22 | 2021-01-22 | Method for assessing state of a biocell |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021101310A RU2755401C1 (en) | 2021-01-22 | 2021-01-22 | Method for assessing state of a biocell |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2755401C1 true RU2755401C1 (en) | 2021-09-15 |
Family
ID=77745630
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021101310A RU2755401C1 (en) | 2021-01-22 | 2021-01-22 | Method for assessing state of a biocell |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2755401C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110237942A1 (en) * | 2010-03-25 | 2011-09-29 | Tamotsu Zako | Bioimaging method using near-infrared (nir) fluorescent material |
| RU2639125C1 (en) * | 2016-12-14 | 2017-12-19 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский ядерный университет МИФИ" (НИЯУ МИФИ) | Method for biological visualization |
| CN105891170B (en) * | 2015-02-16 | 2019-07-05 | 北京大学 | Living animal two-photon excitation delay detection fluorescence imaging analysis method and apparatus |
-
2021
- 2021-01-22 RU RU2021101310A patent/RU2755401C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110237942A1 (en) * | 2010-03-25 | 2011-09-29 | Tamotsu Zako | Bioimaging method using near-infrared (nir) fluorescent material |
| CN105891170B (en) * | 2015-02-16 | 2019-07-05 | 北京大学 | Living animal two-photon excitation delay detection fluorescence imaging analysis method and apparatus |
| RU2639125C1 (en) * | 2016-12-14 | 2017-12-19 | федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский ядерный университет МИФИ" (НИЯУ МИФИ) | Method for biological visualization |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| С.В. РЕМПЕЛЬ, Н.С. КОЖЕВНИКОВА, Н.Н. АЛЕКСАНДРОВНА, А.А. РЕМПЕЛЬ "ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ CDS ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ СТРУКТУРЫ КЛЕТОК", НЕОРГАНИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ, Т.47, N3, С. 271-275, 2011. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Fluorescent carbon dots and nanodiamonds for biological imaging: preparation, application, pharmacokinetics and toxicity | |
| Parak et al. | Cell motility and metastatic potential studies based on quantum dot imaging of phagokinetic tracks | |
| Chen et al. | Fluorescent CdSe/ZnS nanocrystal− peptide conjugates for long-term, nontoxic imaging and nuclear targeting in living cells | |
| Berlier et al. | Quantitative comparison of long-wavelength Alexa Fluor dyes to Cy dyes: fluorescence of the dyes and their bioconjugates | |
| Bergman et al. | Phycomyces | |
| JP2573757B2 (en) | Preserving cells as controls or standards in cell analysis | |
| US8110407B2 (en) | Fluorescent semiconductor microparticle assembly, fluorescent labeling agent assembly for biological substance, and bioimaging method and biological substance analysis method using the assemblies | |
| Zhang et al. | A CCD-based reader combined quantum dots-labeled lateral flow strips for ultrasensitive quantitative detection of anti-HBs antibody | |
| US20030113709A1 (en) | Semiconductor nanocrystal-based cellular imaging | |
| JP2009523447A (en) | Rapid detection and evaluation of cultured cell proliferation | |
| CN104977277B (en) | It is a kind of to detect the nano vesicle of intracellular wild type and variation p53 albumen simultaneously | |
| CA2640551C (en) | Apparatus and methods for imaging and modification of biological samples | |
| CN108548798A (en) | With structure and the application of the relevant large biological molecule optical detecting method of intracellular colloid osmotic pressure and its related drugs screening technique | |
| US20130123145A1 (en) | Methods. particles, and assay kits for identifying presence of biological parameters | |
| Rempel et al. | Fluorescent CdS nanoparticles for cell imaging | |
| RU2755401C1 (en) | Method for assessing state of a biocell | |
| Mathew et al. | Nanoparticle imaging and diagnostic of Caenorhabditis elegans intracellular pH | |
| Pramanik et al. | Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications | |
| CN111122529B (en) | Application of gold nanoclusters in detection of protein amyloid fibrosis in biological sample and screening of inhibitor | |
| RU2702000C2 (en) | Herpes simplex virus diagnostics method | |
| Rempel et al. | Fluorescent CdS nanoparticles for biology and medicine. | |
| Chomoucká et al. | Synthesis and modification of quantum dots for medical applications | |
| Herz et al. | Fluorescent core-shell silica nanoparticles: an alternative radiative materials platform | |
| Neupauer | Analýza senzorů založených na Foerstrově rezonančním energetickém přenosu pomocí kapilární elektroforézy a časově rozlišené fluorescence | |
| Pospíšilová et al. | Distinguishing Healthy and Carcinoma Cell Cultures Using Fluorescence Spectra Decomposition with a Genetic-Algorithm-Based Code |