RU2754368C1

RU2754368C1 - Method for cleaning bacterial cellulose

Info

Publication number: RU2754368C1
Application number: RU2021106227A
Authority: RU
Inventors: Вадим Владимирович Коньшин; Вадим Алексеевич Крахмалев; Лев Александрович Коршунов; Константин Павлович Ваганник; Татьяна Александровна Книсс; Валерия Александровна Костинская
Priority date: 2021-03-10
Filing date: 2021-03-10
Publication date: 2021-09-01

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention relates to biotechnology. A method for cleaning bacterial cellulose is proposed, which includes the removal of bacterial cells and components of the culture medium by treatment in a solution of potassium permanganate with a concentration of 0.1-10.0% at 90°C for 5-30 minutes, followed by washing with a solution of oxalic acid and water until a neutral reaction to the acid.EFFECT: invention provides an expansion of the arsenal of methods for cleaning bacterial cellulose with a reduction in the duration of the cleaning process.1 cl, 4 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для очистки бактериальной целлюлозы на основе штаммов различных бактерий от остатков культуральной жидкости и для удаления белка клеток.The invention relates to biotechnology and can be used to purify bacterial cellulose based on strains of various bacteria from the remnants of the culture fluid and to remove cell protein.

Известен способ очистки бактериальной целлюлозы, получаемой культивированием симбиотической культуры Medusomycesgisevii на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата мискантуса, или плодовых оболочек овса, или соломы льна-межеумка. Процесс очистки химически чистой бактериальной целлюлозы включает удаление клеток бактерий путем выдерживания образцов пленок бактериальной целлюлозы в течение 24 ч в растворе NaOH концентрацией 0,5% для удаления клеток бактерий, промывание в дистиллированной воде до нейтральной реакции, отбелку бактериальной целлюлозы от красящих компонентов питательной среды путем выдерживания в течение 24 ч в растворе HCl концентрацией 0,5%, промывание дистиллированной водой, сушку при комнатной температуре в расправленном состоянии (патент RU 2597291, МПК C12N 1/22 (2016.01), С12Р 19/04 (2016.01)).A known method for purifying bacterial cellulose obtained by cultivating a symbiotic culture of Medusomycesgisevii on a liquid nutrient medium of an enzymatic hydrolyzate of miscanthus, or oat fruit shells, or flax straw. The process of purification of chemically pure bacterial cellulose includes the removal of bacteria cells by keeping samples of bacterial cellulose films for 24 h in a NaOH solution with a concentration of 0.5% to remove bacteria cells, washing in distilled water until neutral, bleaching bacterial cellulose from the coloring components of the nutrient medium by holding for 24 hours in a HCl solution with a concentration of 0.5%, washing with distilled water, drying at room temperature in a straightened state (patent RU 2597291, IPC C12N 1/22 (2016.01), С12Р 19/04 (2016.01)).

Основными недостатками описанного способа являются повышенная трудоемкость и продолжительность очистки. Кроме того, данный способ предусматривает очистку только бактериальной целлюлозы, получаемой культивированием симбиотической культуры Medusomycesgisevii, что сужает сферу его использования.The main disadvantages of the described method are the increased complexity and duration of cleaning. In addition, this method provides for the purification of only bacterial cellulose obtained by cultivating a symbiotic culture of Medusomycesgisevii, which narrows the scope of its use.

Наиболее близким к заявляемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату (прототипом) является способ очистки бактериальной целлюлозы, получаемой на основе штамма бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans Н-110, выращенных на нативной молочной сыворотке в течение 3-5 суток при температуре 28-30°С. При этом культивирование бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans Н-110 осуществляют на нативной молочной сыворотке при температуре 28-30°С в течение 3-5 суток, после чего гель-пленку бактериальной целлюлозы или хлопья отделяют от культуральной среды. Процесс очистки бактериальной целлюлозы включает удаление клеток бактерий и компонентов культуральной среды путем обработки 0,1 Н раствором NaOH при 90°С в течение 30 минут, последующей промывки дистиллированной водой, 0,5% водным раствором уксусной кислоты и снова водой до нейтральной реакции. Процесс очистки бактериальной целлюлозы повторяют 3 раза (патент RU 2536257, МПК C12N 1/20 (2006.01), C12R 1/01 (2006.01)).The closest to the claimed invention in terms of the technical essence and the achieved result (prototype) is a method for purifying bacterial cellulose obtained on the basis of a bacterial strain Gluconacetobacter sucrofermentans H-110 grown on native milk whey for 3-5 days at a temperature of 28-30 ° C. In this case, the cultivation of bacteria Gluconacetobacter sucrofermentans H-110 is carried out on native milk whey at a temperature of 28-30 ° C for 3-5 days, after which the gel film of bacterial cellulose or flakes is separated from the culture medium. The process of purification of bacterial cellulose includes the removal of bacteria cells and components of the culture medium by treatment with 0.1 N NaOH solution at 90 ° C for 30 minutes, followed by washing with distilled water, 0.5% aqueous acetic acid solution and again with water until neutral. The process of cleaning bacterial cellulose is repeated 3 times (patent RU 2536257, IPC C12N 1/20 (2006.01), C12R 1/01 (2006.01)).

Основными недостатками описанного способа являются продолжительность очистки, а также энергоемкость процесса очистки бактериальной целлюлозы, связанная с трехкратной обработкой при 90°С раствором щелочи с последующими промывками кислотой и водой до нейтральной реакции. Кроме того, данный способ предусматривает очистку именно бактериальной целлюлозы, получаемой на основе штамма бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans Н-110, что сужает сферу его использования.The main disadvantages of the described method are the duration of the purification, as well as the energy consumption of the bacterial cellulose purification process, associated with three times treatment at 90 ° C with an alkali solution followed by washing with acid and water until neutral. In addition, this method provides for the purification of precisely the bacterial cellulose obtained on the basis of the bacterial strain Gluconacetobacter sucrofermentans H-110, which narrows the scope of its use.

Техническая проблема, решение которой обеспечивается при осуществлении изобретения, заключается в создании способа очистки бактериальной целлюлозы, характеризующегося пониженной энергоемкостью и длительностью при расширенной сфере использования.The technical problem, the solution of which is provided in the implementation of the invention, is to provide a method for purifying bacterial cellulose, characterized by a reduced energy consumption and duration with an extended field of use.

Решение настоящей технической проблемы достигается тем, что в способе очистки бактериальной целлюлозы, включающем удаление клеток бактерий и компонентов культуральной среды путем обработки в заданном растворе при 90°С, последующей промывки кислотой и водой до нейтральной реакции, согласно изобретению в качестве заданного раствора используют раствор перманганата калия концентрацией 0,1-10,0%, обработку производят в течение 5-30 минут, а промывку ведут сначала раствором щавелевой кислоты до нейтральной реакции на перманганат-ион, диоксид марганца и белок, затем водой до нейтральной реакции на кислоту.The solution to this technical problem is achieved by the fact that in the method of purifying bacterial cellulose, including the removal of bacteria cells and components of the culture medium by treatment in a given solution at 90 ° C, followed by washing with acid and water until neutral, according to the invention, a solution of permanganate is used as a given solution potassium concentration of 0.1-10.0%, processing is carried out for 5-30 minutes, and washing is carried out first with a solution of oxalic acid until neutral reaction to permanganate ion, manganese dioxide and protein, then with water until neutral reaction to acid.

Снижение энергоемкости и длительности процесса очистки бактериальной целлюлозы обусловлены одновременным неэнергоемким удалением клеток бактерий и компонентов культуральной среды путем однократного выдерживания в растворе перманганата калия в течение 5-30 минут.A decrease in the energy intensity and duration of the bacterial cellulose purification process is due to the simultaneous non-energy-intensive removal of bacteria cells and components of the culture medium by a single exposure in a solution of potassium permanganate for 5-30 minutes.

Расширение сферы использования предлагаемого способа обусловлено реализацией очистки приведенной совокупностью операций любой бактериальной целлюлозы, получаемой на основе штаммов различных бактерий.The expansion of the scope of the proposed method is due to the implementation of the purification of the given set of operations of any bacterial cellulose obtained on the basis of strains of various bacteria.

Известно, что перманганат калия является антисептическим медпрепаратом, обладающим противомикробными свойствами. Образующийся при восстановлении препарата оксид образует с белками растворимые комплексные соединения - альбуминаты. Использование перманганата калия концентрацией менее 0,1% менее 5 минут нецелесообразно ввиду неполного окисления белка клеток бактерий и компонентов культуральной среды. Использование перманганата калия концентрацией более 10,0% более 30 минут способствует окислению и разрушению бактериальной целлюлозы.It is known that potassium permanganate is an antiseptic medication with antimicrobial properties. The oxide formed during the reduction of the drug forms soluble complex compounds with proteins - albuminates. The use of potassium permanganate with a concentration of less than 0.1% less than 5 minutes is impractical due to incomplete oxidation of the protein of bacterial cells and components of the culture medium. The use of potassium permanganate with a concentration of more than 10.0% for more than 30 minutes promotes the oxidation and destruction of bacterial cellulose.

Использование щавелевой кислоты способствует растворению и удалению как остатка, не прореагировавшего перманганата марганца:The use of oxalic acid promotes the dissolution and removal of unreacted manganese permanganate as a residue:

так и диоксида марганца, образующегося при окислении перманганатом марганца белка клеток бактерий и компонентов культуральной среды и адсорбируемого на поверхности бактериальной целлюлозы, за счет образования растворимых в воде комплексов (Изучение кинетики растворения диоксида марганца в растворах лимонной и щавелевой кислот / Артамонова И.В. [и др.] // Известия МГТУ «МАМИ» - 2010. - №2. - С. 157-161.). Образующийся при взаимодействии с перманганатом калия нерастворимый осадок оксалата марганца (реакция 1) растворяется в избытке щавелевой кислоты.and manganese dioxide, formed during the oxidation of the protein of bacteria cells and components of the culture medium by manganese permanganate, and adsorbed on the surface of bacterial cellulose, due to the formation of water-soluble complexes (Study of the kinetics of dissolution of manganese dioxide in solutions of citric and oxalic acids / Artamonova IV [ and others] // Izvestia MSTU "MAMI" - 2010. - No. 2. - S. 157-161.). The insoluble precipitate of manganese oxalate formed upon interaction with potassium permanganate (reaction 1) dissolves in an excess of oxalic acid.

Способ очистки бактериальной целлюлозы заключается в удалении клеток бактерий и компонентов культуральной среды путем однократной обработки при 90°С растворами перманганата калия концентрацией 0,1-10,0% в течение 5-30 минут с последующей промывкой раствором щавелевой кислоты сначала до отрицательной реакции на перманганат-ион, диоксид марганца, белок, затем водой до нейтральной реакции на кислоту.The method of purifying bacterial cellulose consists in removing bacteria cells and components of the culture medium by a single treatment at 90 ° C with solutions of potassium permanganate with a concentration of 0.1-10.0% for 5-30 minutes, followed by washing with a solution of oxalic acid first until a negative reaction to permanganate -ion, manganese dioxide, protein, then water until neutral to acid.

Примеры конкретного выполнения способа.Examples of specific execution of the method.

Пример 1. Образцы пленок бактериальной целлюлозы, получаемой культивированием симбиотической культуры Medusomycesgisevii на жидкой питательной среде ферментативного гидролизата мискантуса, или плодовых оболочек овса, или соломы льна-межеумка, очищают следующим образом: в течение 30 минут пленку обрабатывают при 90°С раствором перманганата калия концентрацией 0,1%, промывают раствором щавелевой кислоты до отрицательной реакции на перманганат-ион, диоксид марганца, белок, затем водой до нейтральной реакции на кислоту.Example 1. Samples of films of bacterial cellulose obtained by cultivating a symbiotic culture of Medusomycesgisevii on a liquid nutrient medium of an enzymatic hydrolyzate of miscanthus, or fruit shells of oats, or straw of flax-flax, are cleaned as follows: for 30 minutes, the film is treated at 90 ° C with a solution of potassium permanganate concentration 0.1%, washed with a solution of oxalic acid until a negative reaction to permanganate ion, manganese dioxide, protein, then with water until a neutral reaction to acid.

Отсутствие перманганат-ионов обуславливается отсутствием малиновой окраски исследуемой субстанции. Диоксид марганца контролируют по отсутствию темно-коричневого осадка.The absence of permanganate ions is due to the absence of a crimson color of the test substance. Manganese dioxide is monitored for the absence of a dark brown precipitate.

Качественная реакция на белок: к 0,1 мл субстанции прибавляют 0,2 мл серной кислоты, разведенной 16%, 2 мл эфира, 0,2 мл 5% раствора калия дихромата и взбалтывают; эфирный слой при наличии белка должен окраситься в синий цвет.Qualitative reaction to protein: 0.2 ml of sulfuric acid diluted with 16%, 2 ml of ether, 0.2 ml of 5% potassium dichromate solution are added to 0.1 ml of the substance and shaken; the ether layer should turn blue in the presence of protein.

Отсутствие щавелевой кислоты проверяют по универсальному индикатору.The absence of oxalic acid is checked using a universal indicator.

Таким образом, получается бактериальная целлюлоза, очищенная от клеток бактерий и компонентов культуральной среды.Thus, bacterial cellulose is obtained, purified from bacterial cells and components of the culture medium.

Пример 2. Очистка бактериальной целлюлозы осуществляется по примеру 1, отличие заключается в обработке при 90°С раствором перманганата калия концентрацией 0,25% в течение 15 минут.Example 2. Purification of bacterial cellulose is carried out according to example 1, the difference lies in the treatment at 90 ° C with a solution of potassium permanganate with a concentration of 0.25% for 15 minutes.

Результаты, полученные в примере 2, показывают, что бактериальную целлюлозу можно очистить от клеток бактерий и компонентов культуральной среды при меньшем времени обработки раствором перманганата калия - 15 минут, по сравнению с примером 1, но при использовании большей концентрации перманганата калия - 0,25%.The results obtained in example 2 show that bacterial cellulose can be purified from bacterial cells and components of the culture medium with a shorter treatment time with a potassium permanganate solution - 15 minutes, compared to example 1, but when using a higher concentration of potassium permanganate - 0.25% ...

Пример 3. Очистка бактериальной целлюлозы осуществляется по примеру 1, отличие заключается в обработке при 90°С раствором перманганата калия концентрацией 10,0% в течение 5 минут.Example 3. Purification of bacterial cellulose is carried out according to example 1, the difference lies in the treatment at 90 ° C with a solution of potassium permanganate with a concentration of 10.0% for 5 minutes.

Результаты, полученные в примере 3, показывают, что бактериальную целлюлозу можно очистить от клеток бактерий и компонентов культуральной среды при минимальном времени обработки раствором перманганата калия - 5 минут, по сравнению с примером 1, однако в данном случае необходимо использовать максимальную концентрации перманганата калия - 10,0%.The results obtained in example 3 show that bacterial cellulose can be purified from bacterial cells and components of the culture medium with a minimum treatment time with a potassium permanganate solution - 5 minutes, compared to example 1, but in this case it is necessary to use the maximum concentration of potassium permanganate - 10 , 0%.

Пример 4. Очистка бактериальной целлюлозы осуществляется по примеру 2, отличие заключается в использовании образцов пленок целлюлозы, получаемой на основе штамма бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans Н-110.Example 4. Purification of bacterial cellulose is carried out according to example 2, the difference lies in the use of samples of cellulose films obtained on the basis of the bacterial strain Gluconacetobacter sucrofermentans H-110.

Результаты, полученные в примере 4, позволяют утверждать, что данным способом может быть очищена бактериальная целлюлоза, получаемая на основе использования разных штаммов бактерий.The results obtained in example 4 suggest that this method can be purified bacterial cellulose, obtained on the basis of the use of different strains of bacteria.

Таким образом, описанный способ очистки бактериальной целлюлозы позволяет сократить продолжительность очистки и уменьшить энергозатраты.Thus, the described method for purifying bacterial cellulose makes it possible to shorten the purification time and reduce energy consumption.

Claims

A method for purifying bacterial cellulose, including the removal of bacterial cells and components of the culture medium by treatment in a given solution at 90 ° C, followed by washing with acid and water until neutral, characterized in that a solution of potassium permanganate with a concentration of 0.1-10 is used as a given solution , 0%, the treatment is carried out for 5-30 minutes, and the washing is carried out first with a solution of oxalic acid until neutral reaction to permanganate ion, manganese dioxide and protein, then with water until neutral reaction to acid.