RU2754005C1

RU2754005C1 - Strain of histophilus somni bacteria intended for production of mono- and polyvalent immunogenic compositions aimed at specific prevention of histophilosis (herd infertility) in cattle

Info

Publication number: RU2754005C1
Application number: RU2020135638A
Authority: RU
Inventors: Алексей Иванович Лаишевцев; Андрей Владимирович Капустин; Эльвира Алексеевна Якимова; Павел Николаевич Шастин; Алексей Михайлович Гулюкин; Евгений Валерьевич Иванов; Василий Александрович Савинов; Андрей Владимирович Алешкин; Эльдар Ринатович Зулькарнеев
Priority date: 2020-10-29
Filing date: 2020-10-29
Publication date: 2021-08-25

Abstract

FIELD: animal husbandry.SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology, veterinary microbiology and immunology. A strain of Histophilus somni bacteria B-1654 is deposited in the “All-Russian State Collection of Pathogenic and Vaccine Strains of Microorganisms-Pathogens of Animals’ Infectious Diseases” (Federal Research Center: All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after K. I. Scriabin and Ya. R. Kovalenko, the Russian Academy of Sciences) under the number B-1654. The strain can be used to produce mono- and polyvalent immunogenic compositions aimed at specific prevention of cattle histophylosis.EFFECT: invention makes it possible to expand the arsenal of strains intended for the production of mono- and polyvalent vaccines aimed at the specific prevention of infectious diseases of farm animals, with high stability, antigenic, immunogenic and protective activity.1 cl, 1 tbl, 15 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии и иммунологии, и может быть использовано при производстве инактивированных иммунобиологических средств (в виде моно- и поливалентных препаратов), предназначенных для специфической профилактики инфекции рогатого скота, вызванной Histophilus somni. Штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных Федерального научного центра - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук под номером В-1654.The invention relates to the field of biotechnology, veterinary microbiology and immunology, and can be used in the production of inactivated immunobiological agents (in the form of mono- and polyvalent drugs) intended for the specific prevention of cattle infection caused by Histophilus somni. The strain was deposited in the All-Russian state collection of pathogenic and vaccine strains of microorganisms-causative agents of infectious animal diseases of the Federal Scientific Center - All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after V.I. K.I. Scriabin and Ya.R. Kovalenko of the Russian Academy of Sciences under the number B-1654.

Гистофилез - инфекционное заболевание преимущественно жвачных видов животных, проявляющееся поражением органов респираторной и/или репродуктивной систем, а также сепсисом [Markey, В. Haemophilus and Histophilus species. / В. Markey, F. Leonard, M. Archambault, A. DM. Cullinane // In: Clinical Veterinary Microbiology. 2013. p. 349-54]. Согласно современной классификации, возбудителем гистофилеза является вид микроорганизм Histophilus somni, относящийся к семейству Pasteurellaceae. Впервые Н. somni был выделен от быков с инфекционным менингоэнцефалитом в Калифорнии в 1960 году и описан как «Haemophilus - подобный микроорганизм». Поэтому в ранней литературе этот вид имеет синонимичное название Haemophilus somnus [Harris, F.W. The Haemophilus somnus disease complex (hemophilosis): a review. / F.W. Harris, E.D. Janzen // Can Vet J. 1989. №30(10). P.816-22].Histophilia is an infectious disease of predominantly ruminant animal species, manifested by damage to the organs of the respiratory and / or reproductive systems, as well as sepsis [Markey, B. Haemophilus and Histophilus species. / B. Markey, F. Leonard, M. Archambault, A. DM. Cullinane // In: Clinical Veterinary Microbiology. 2013. p. 349-54]. According to the modern classification, the causative agent of histophilia is a species of microorganism Histophilus somni, belonging to the Pasteurellaceae family. H. somni was first isolated from bulls with infectious meningoencephalitis in California in 1960 and described as "Haemophilus-like microorganism." Therefore, in the early literature, this species has a synonymous name Haemophilus somnus [Harris, F.W. The Haemophilus somnus disease complex (hemophilosis): a review. / F.W. Harris, E.D. Janzen // Can Vet J. 1989. No. 30 (10). P.816-22].

Histophilus somni - это неподвижная аэробная грамотрицательная коккобацилла, не обладающая способностью образовывать споры и капсулу. В соответствии с научной литературой, Н. somni является комменсалом нижних и верхних дыхательных путей, а также органов репродуктивной системы рогатого скота. При этом возбудитель способен вызывать широкий спектр заболеваний, среди которых менингоэнцефалит, миокардит, отит, мастит, орхит, заболевания кишечного тракта у крупного рогатого скота, овец и американского бизона, а также эндометриты и сальпингиты у коров в послеродовой период [Andrews, J.J. Microscopic lesions associated with the isolation of Haemophilus somnus from pneumonic bovine lungs. / J.J. Andrews, T.D. Anderson, L.N. Slife, G.W. Stevenson // Vet Pathol. 1985. №22(2). Р. 131-6].Histophilus somni is an immobile aerobic gram-negative coccobacillus that does not have the ability to form spores and capsules. According to the scientific literature, N. somni is a commensal of the lower and upper respiratory tract, as well as the organs of the reproductive system of cattle. In this case, the pathogen can cause a wide range of diseases, including meningoencephalitis, myocarditis, otitis media, mastitis, orchitis, diseases of the intestinal tract in cattle, sheep and American bison, as well as endometritis and salpingitis in cows in the postpartum period [Andrews, J.J. Microscopic lesions associated with the isolation of Haemophilus somnus from pneumonic bovine lungs. / J.J. Andrews, T.D. Anderson, L.N. Slife, G.W. Stevenson // Vet Pathol. 1985. No. 22 (2). R. 131-6].

К гистофилезу восприимчив крупный рогатый скот всех возрастных групп, но наибольший процент заболеваемости и летальности наблюдается у телят в возрасте 1-2 месяцев. У молодняка этой возрастной группы заболевание протекает в респираторной форме и проявляется пневмониями с переменной лихорадкой, кашлем и т.д. Аналогичное течение гистофилеза может быть и у более взрослых животных на откорме. Источником Histophilus somni являются больные животные, а также бактерионосители, которые выделяют патоген с биологическими жидкостями. Возбудителя способен длительное время персистировать в организме, постепенно распространяясь по всему стаду восприимчивых животных. При этом распространение инфекции в стаде часто происходит без проявления явных клинических признаков, что затрудняет диагностику заболевания, основанную на клинико-морфологическом проявлении [Капустин, А.В. Гистофилез крупного рогатого скота / А.В. Капустин, Н.В. Моисеева, А.И. Лаишевцев, М.А. Лучко, СП. Яцентюк, Н.С.Горбачева // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2017. №10 (70). C. 319-26].Cattle of all age groups are susceptible to histophilia, but the highest percentage of morbidity and mortality is observed in calves at the age of 1-2 months. In young animals of this age group, the disease proceeds in the respiratory form and manifests itself as pneumonia with variable fever, cough, etc. A similar course of histophilia can be observed in older fattening animals. The source of Histophilus somni is sick animals, as well as bacteria carriers that excrete the pathogen with biological fluids. The pathogen can persist for a long time in the body, gradually spreading throughout the herd of susceptible animals. At the same time, the spread of infection in the herd often occurs without the manifestation of obvious clinical signs, which makes it difficult to diagnose the disease based on the clinical and morphological manifestation [Kapustin, A.V. Histophilia of cattle / A.V. Kapustin, N.V. Moiseeva, A.I. Laishevtsev, M.A. Luchko, SP. Yatsentyuk, N.S. Gorbacheva // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2017. No. 10 (70). S. 319-26].

На фоне быстрого развития и широкого распространения антибиотикорезистентности микроорганизмов, борьба с гистофилезом в первую очередь должна ориентироваться на его специфическую профилактику [Моисеева, Н.В. Антибиотикорезистентность возбудителя гистофилеза крс - Histophilus somni, изолированного на территории РФ / Н.В. Моисеева, А.В. Капустин // В сборнике: Актуальные вопросы биологии, биотехнологии, ветеринарии, зоотехнии, товароведения и переработки сырья животного и растительного происхождения Материалы национальной научно-практической конференции. 2019. С. 49-51]. Именно на решение этой задачи направленно данное изобретение.Against the background of the rapid development and widespread dissemination of antibiotic resistance of microorganisms, the fight against histophilia should primarily focus on its specific prevention [Moiseeva, N.V. Antibiotic resistance of the pathogen of cattle histophilosis - Histophilus somni, isolated on the territory of the Russian Federation / N.V. Moiseeva, A.V. Kapustin // In the collection: Topical issues of biology, biotechnology, veterinary medicine, animal science, commodity science and processing of raw materials of animal and vegetable origin Materials of the national scientific and practical conference. 2019.S. 49-51]. It is to this problem that the present invention is directed.

Уровень техникиState of the art

В настоящее время известны следующие штаммы Histophilus somni, предназначенные, в том числе, для получения иммуногенных композиций и профилактики гистофилеза животных:Currently, the following strains of Histophilus somni are known, intended, inter alia, for the production of immunogenic compositions and the prevention of histophilia in animals:

Белки внешней мембраны Histophilus somni и способ их получения (Outer membrane proteins of Histophilus somni and methods thereof) [патент - US 9597386 B2, опубл. 2017.03.21, США]. Изобретение относится к иммунобиологическим композициям на основе белков внешней мембраны, которые предназначены для специфической профилактики респираторных инфекций крупного рогатого скота, вызванных Histophilus somni. При получении обозначенной антигенной композиции используются штаммы Histophilus somni Lg2-OK08 и LgD1-TN08. Недостатком данного изобретения, на наш взгляд, является тот факт, что при получении вакцины на основе белков внешней мембраны (ОМР), не используются иные иммуногенные факторы вирулентности Histophilus somni, которые являются антигенами и, следовательно, также способны обладать высокой протективной эффективностью.Outer membrane proteins of Histophilus somni and methods thereof [patent - US 9597386 B2, publ. 2017.03.21, USA]. The invention relates to immunobiological compositions based on proteins of the outer membrane, which are intended for the specific prevention of respiratory infections in cattle caused by Histophilus somni. When obtaining the indicated antigenic composition, Histophilus somni strains Lg2-OK08 and LgD1-TN08 are used. The disadvantage of this invention, in our opinion, is the fact that when obtaining a vaccine based on outer membrane proteins (OMP), other immunogenic factors of Histophilus somni virulence are not used, which are antigens and, therefore, are also capable of having high protective efficacy.

Иммунобиологические композиции, содержащие аттенуированные культуры Histophilus somni (Immunological compositions containing attenuated Histophilus somni) [патент - CA 2943786 A1, опубл. 2015.10.01, Канада]. Изобретение отражает аттенуированные штаммы Histophilus, а также способы их получения и применения. Аттенуированные штаммы могут экспрессировать более низкие уровни различных ассоциированных с вирулентностью генов или не экспрессировать их вообще по сравнению с соответствующими патогенными бактериями. Препараты на основе аттенуированных штаммов могут вводиться перорально, интраназально, интратрахеально или подкожно. В патенте приведены характеристики следующих аттенуированных штаммов: РТА-121029 и РТА-121030. Недостатком данного изобретения является то, что препараты изготовленные из аттенуированных живых штаммов, сложно сочетать с другими антигенами, например для получения ассоциированных вакцин. При этом ассоциированные вакцины удобнее моновалентных, поскольку минимизируют затраты на проведение профилактических обработок и одновременно позволяю профилактировать несколько инфекционных заболеваний.Immunological compositions containing attenuated Histophilus somni [patent - CA 2943786 A1, publ. 2015.10.01, Canada]. The invention reflects attenuated Histophilus strains, as well as methods for their preparation and use. Attenuated strains may express lower levels of various virulence-associated genes, or none at all, compared to the corresponding pathogenic bacteria. Preparations based on attenuated strains can be administered orally, intranasally, intratracheally, or subcutaneously. The patent describes the characteristics of the following attenuated strains: PTA-121029 and PTA-121030. The disadvantage of this invention is that preparations made from attenuated live strains are difficult to combine with other antigens, for example, to obtain associated vaccines. At the same time, associated vaccines are more convenient than monovalent ones, since they minimize the costs of preventive treatments and simultaneously allow the prevention of several infectious diseases.

Белковый экстракт наружной мембраны Haemophilus somnus, обогащенный железо-регулирующими белками (Haemophilus somnus outer membrane protein extract enriched with iron-regulated proteins) [патент CA 2099707 C, опубл. 2006.09.05, Канада]. Изобретение ориентировано на создании новой субъединичной вакцины против Haemophilus somnus, включающий экстракт белков внешней мембраны клеток возбудителя, дополнительно обогащенный железо-регулирующими белками. В качестве производственного штамма предложена культура HS25. Недостатком данного изобретения является то, что при производстве препарата, не используются иные антигенные компоненты бактериальной клетки, что снижает иммунный ответ у животных.Haemophilus somnus outer membrane protein extract enriched with iron-regulated proteins [patent CA 2099707 C, publ. 2006.09.05, Canada]. The invention is focused on the creation of a new subunit vaccine against Haemophilus somnus, including the extract of proteins of the outer membrane of the cells of the pathogen, additionally enriched with iron-regulating proteins. As a production strain, the proposed culture HS25. The disadvantage of this invention is that in the manufacture of the drug, other antigenic components of the bacterial cell are not used, which reduces the immune response in animals.

Помимо вышеобозначенных композиций известен штамм Histophilus somni АТСС 700025, широко используемый в качестве положительного контроля при оценке ростовых свойств питательных сред, а также для контроля специфичности диагностических наборов биохимической идентификации и наборов для определения антибиотикорезистентности бактерий [Bhatt, K., Timsit, Ε., Rawlyk, Ν., Potter, Α., & Liljebjelke, K. (2018). Integrative Conjugative Element ICEHsl Encodes for Antimicrobial Resistance and Metal Tolerance in Histophilus somni. Frontiers in veterinary science, 5, 153. https://doi.org/10.3389/fvets.2018.00153]. Недостатком данного штамма можно считать его не подтвержденные антигенные и иммуногенные свойства, необходимые при конструировании иммунобиологических средств.In addition to the above compositions, the Histophilus somni ATCC 700025 strain is known, widely used as a positive control in assessing the growth properties of nutrient media, as well as to control the specificity of diagnostic kits for biochemical identification and kits for determining the antibiotic resistance of bacteria [Bhatt, K., Timsit, Ε., Rawlyk , Ν., Potter, Α., & Liljebjelke, K. (2018). Integrative Conjugative Element ICEHsl Encodes for Antimicrobial Resistance and Metal Tolerance in Histophilus somni. Frontiers in veterinary science, 5, 153. https://doi.org/10.3389/fvets.2018.00153]. The disadvantage of this strain can be considered its unconfirmed antigenic and immunogenic properties, which are necessary in the design of immunobiological agents.

Известны штаммы Histophilus somni Р-51 и Oklahoma, используемые при производстве вакцины Elite 9 HS (Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.). Гистофилезный компонент входит в состав ассоциированного средства совместно с инактивированными вирусами ринотрахеита крупного рогатого скота (штамм Mckercher), парагриппа-3 (штамм SF-4), вирусной диареи (штамм Singer), респираторно-синцитиальной инфекции (штамм Tennessee), Leptospira canicola (штамм NADL), L. Grippotyphosa (штамм SC201), L. Hardjo (штамм hardjoprajitno), L. Icterohaemorrhagiae (штамм NADL) и L. pomona (штамм T-262) с добавлением 10% раствора алюмо-калиевых квасцов (1,25 мл) в качестве адъюванта, 14% раствора ЭДТА (0,0067 мл), 1,5% раствора неомицина (0,0042 мл), 2,5% раствора тимеросала (0,0084 мл), раствора едкого натрия и физиологического раствора до 5 мл. В одной иммунизирующей дозе содержится не менее 3,1*10⁸ бактериальных клеток Histophilus somni штамм Р-51 и не менее 3,1*10⁸ бактериальных клеток Histophilus somni штамм Oklahoma [https://galen.vetrf.ru/files/54e268d3-c3c0-4c35-allb-36eef51ef935]. Указанные штаммы рассматриваются нами как прототип предлагаемого изобретения. Важно отметить, что не смотря на наличие приведенных примеров, использования белков наружной мембраны для создания вакцины, или живых вакцин на основе аттенуированных культур, или субъединичных вакцин, на основе одного из фактора вирулентности Histophilus somni, во всем мире, наиболее широкое распространение нашли инактивированные вакцины, такие как: Bar Somnus 2Р (Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.), Bar Vac 7/Somnus (Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.), Elite 9 HS (Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.), Express 5-HS (Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.), Somnu Shield (Elanco Europe Ltd), Ultrabac 7/Somubac (Zoetis Inc.), Vira Shield 6+L5 HB Somnus (Elanco Europe Ltd), Vision 7 Somnus (w/Spur) (Merck & Co., Inc.), Vision 8 Somnus (w/Spur) (Merck & Co., Inc.), что в свою очередь говорит об достаточном уровне их протективной эффективности.Known strains Histophilus somni P-51 and Oklahoma used in the production of the vaccine Elite 9 HS (Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.). The histophilous component is part of the associated agent together with inactivated viruses of bovine rhinotracheitis (strain Mckercher), parainfluenza-3 (strain SF-4), viral diarrhea (strain Singer), respiratory syncytial infection (strain Tennessee), Leptospira canicola (strain NADL), L. Grippotyphosa (strain SC201), L. Hardjo (hardjoprajitno strain), L. Icterohaemorrhagiae (NADL strain) and L. pomona (T-262 strain) with the addition of 10% potassium alum solution (1.25 ml ) as an adjuvant, 14% EDTA solution (0.0067 ml), 1.5% neomycin solution (0.0042 ml), 2.5% thimerosal solution (0.0084 ml), sodium hydroxide solution and physiological solution up to 5 ml. One immunizing dose contains not less than 3.1 * ¹⁰ August bacterial cells Histophilus somni strain F-51 and not less than 3.1 * ¹⁰ August bacterial cells Histophilus somni strain Oklahoma [https://galen.vetrf.ru/files/54e268d3 -c3c0-4c35-allb-36eef51ef935]. These strains are considered by us as a prototype of the present invention. It is important to note that despite the presence of the above examples, the use of outer membrane proteins to create a vaccine, or live vaccines based on attenuated cultures, or subunit vaccines, based on one of the Histophilus somni virulence factor, inactivated vaccines are most widely used throughout the world. such as: Bar Somnus 2P (Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.), Bar Vac 7 / Somnus (Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.), Elite 9 HS (Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.), Express 5-HS ( Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.), Somnu Shield (Elanco Europe Ltd), Ultrabac 7 / Somubac (Zoetis Inc.), Vira Shield 6 + L5 HB Somnus (Elanco Europe Ltd), Vision 7 Somnus (w / Spur) (Merck & Co., Inc.), Vision 8 Somnus (w / Spur) (Merck & Co., Inc.), which in turn indicates a sufficient level of their protective efficacy.

Технической проблемой, на решение которой направлено данное изобретение, является получение новых культур Histophilus somni, отвечающих требованиям, предъявляемым к производственным штаммам (по культуральным, ростовым, морфологическим, тинкториальным, биологическим, антигенным, иммуногенным и т.д. свойствам) и пригодных для конструирования и производства высокоэффективных иммунобиологических средств, в частности моно и поливалентных вакцин против гистофилеза (стадного бесплодия) рогатого скота.The technical problem to be solved by this invention is to obtain new cultures of Histophilus somni that meet the requirements for industrial strains (for cultural, growth, morphological, tinctorial, biological, antigenic, immunogenic, etc. properties) and suitable for construction and the production of highly effective immunobiological agents, in particular mono and polyvalent vaccines against histophilia (herd infertility) in cattle.

Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention

Технический результат изобретения заключается в стандартизации технологии производства иммунобиологических средств специфической профилактики гистофилеза рогатого скота за счет использования изученного и охарактеризованного штамма Histophilus somni, отвечающего требованиям, предъявляемым к производственным культурам (по культуральным, ростовым, морфологическим, тинкториальным, биологическим, антигенным, иммуногенным и т.д. свойствам). Изобретение служит средством расширения арсенала штаммов, предназначенных для получения моно и поливалентных вакцин, направленных на специфическую профилактику инфекционных болезней сельскохозяйственных животных, с высокой стабильностью, антигенной, иммуногенной и протективной активностью.The technical result of the invention consists in standardizing the technology for the production of immunobiological agents for the specific prevention of histophilosis in cattle through the use of the studied and characterized Histophilus somni strain that meets the requirements for industrial crops (in terms of cultural, growth, morphological, tinctorial, biological, antigenic, immunogenic, etc.) properties). The invention serves as a means of expanding the arsenal of strains intended for obtaining mono and polyvalent vaccines aimed at specific prevention of infectious diseases of farm animals, with high stability, antigenic, immunogenic and protective activity.

Для производства иммунобиологических средств против гистофилеза рогатого скота предлагается новый хорошо изученный и охарактеризованный штамм Histophilus somni, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером В-1654. Использование предложенного штамма при производстве иммунобиологических средств позволит повысить уровень эпизоотического благополучия по гистофилезу рогатого скота на территории страны.For the production of immunobiological agents against histophilia in cattle, a new well-studied and characterized strain Histophilus somni is proposed, deposited in the All-Russian State Collection of Pathogenic and Vaccine Microorganisms-Pathogenic Strains of Animal Infectious Diseases FGBNU FSC VIEV RAS under number B-1654. The use of the proposed strain in the production of immunobiological agents will increase the level of epizootic well-being in cattle histophilia on the territory of the country.

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и тем самым не ограничивают рамки настоящего изобретения.The examples below are illustrative and thus do not limit the scope of the present invention.

Пример №1. Авторский штамм микроорганизма Histophilus somni В-1654.Example # 1. The author's strain of the microorganism Histophilus somni B-1654.

1. Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1654.1. The number of the strain in the "All-Russian state collection of pathogenic and vaccine strains of microorganisms-causative agents of infectious animal diseases": B-1654.

2. Дата депонирования: 15.07.2020.2. Date of deposit: 15.07.2020.

3. Вид микроорганизма: Histophilus somni.3. Type of microorganism: Histophilus somni.

4. Основание для депонирования: предназначен для изготовления и контроля вакцин против гистофилеза рогатого скота.4. Basis for deposit: intended for the manufacture and control of vaccines against histophilosis in cattle.

5. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактерия вида Histophilus somni не относится ни одной из четырех групп патогенности.5. Pathogenicity: in accordance with the classification of microorganisms - causative agents of human infectious diseases, protozoa, helminths and poisons of biological origin according to pathogenicity groups of sanitary rules 1.3.2322-08 "Safety of work with microorganisms of III-IV groups of pathogenicity (danger) and causative agents of parasitic diseases" the bacterium Histophilus somni does not belong to any of the four pathogenicity groups.

6. Дата, источник и место выделения: выделен из абсцесса легких свиней, на свиноводческом предприятии Свердловской области в 2018 г.6. Date, source and place of isolation: isolated from a pig lung abscess, at a pig breeding enterprise in the Sverdlovsk region in 2018

7. Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.7. Where the culture was identified: the laboratory of microbiology with the museum of type cultures of the Federal State Budgetary Scientific Institution FSC VIEW RAS.

8. Методы идентификации: культурально-морфологические, биохимические и молекулярно-генетические методы, масс-спектрометрические.8. Methods of identification: cultural-morphological, biochemical and molecular-genetic methods, mass spectrometry.

9. Морфологические признаки: в мазках окрашенных по Грому обнаруживаются неподвижные грамотрицательные коккобациллы, короткие палочки или нити.9. Morphological signs: motionless gram-negative coccobacilli, short rods or threads are found in smears stained according to Thunder.

10. Культуральные особенности: на кровяном агаре микроорганизм формирует гладкие, выпуклые колонии размером 0,5-1,0 мм спустя 24 часа культивирования при температуре +37°С в условиях поддержания 5-10% углекислого газа. Через 72 часа культивирования размер колоний может достигать 1-2 мм. Штамм не растет на агаре Мак-Конки. Не требует присутствия в питательной среде V и X факторов.10. Cultural features: on blood agar, the microorganism forms smooth, convex colonies 0.5-1.0 mm in size after 24 hours of cultivation at a temperature of + 37 ° C under conditions of maintaining 5-10% carbon dioxide. After 72 hours of cultivation, the size of the colonies can reach 1-2 mm. The strain does not grow on McConkey agar. Does not require the presence of V and X factors in the nutrient medium.

11. Биохимические свойства: культура оксидазоположителъная, но каталазоотрицательная, аргининдекарбоксилаза, лизиндекарбоксилаза и орнитиндекарбоксилаза отрицательны, восстанавливает нитрат, продуцирует индол, кислота продуцируется при ферментации глюкозы, ксилозы, маннита, сорбита, фруктозы, маннозы, мальтозы, трегалозы, но не грицерина, рамнозы, целлобиозы, лактозы, мелибиозы, сахарозы, раффинозы, инулина, эскулина.11. Biochemical properties: the culture is oxidase-positive, but catalase-negative, arginine decarboxylase, lysine decarboxylase and ornithine decarboxylase are negative, reduces nitrate, produces indole, acid is produced during the fermentation of glucose, xylose, mannitol, sorbitol, fructose, no mannose, gryzaltose, gryzaltose cellobiose, lactose, melibiose, sucrose, raffinose, inulin, esculin.

12. Вирулентность для лабораторных животных: вызывает гибель белых мышей, Ld₅₀ - 2,09*10⁸ м.к.12. Virulence for laboratory animals: causes the death of white mice, Ld ₅₀ - 2.09 * 10 ⁸ m.k.

13. Условия культивирования: растет на сердечно-мозговом бульоне, триптон-соевом бульоне, а также на агаризированных питательных средах с добавлением 10% крови крупного или мелкого рогатого скота в присутствии 5-10% углекислого газа.13. Cultivation conditions: grows on brain-heart broth, tryptone-soy broth, as well as agar nutrient media supplemented with 10% blood of cattle or small ruminants in the presence of 5-10% carbon dioxide.

14. Условия хранения: в лиофилизированном виде в ампулах. Среда высушивания - декстриновый стабилизатор. Объем лиофилизата составляет 1 см³. Температура хранения (4-8)°С. Перезакладка через 5 лет.14. Storage conditions: freeze-dried in ampoules. Drying medium - dextrin stabilizer. The volume of the lyophilisate is 1 cm ³ . Storage temperature (4-8) ° С. Re-bookmark after 5 years.

15. Организация-депозитор: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук», (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН). 109428, г.Москва, Рязанский проспект д. 24, корпус 1. Тел./факс +7 (495) 970-03-69. E-mail: admin@viev.ru15. Organization-depositor: Federal State Budgetary Institution "Federal Scientific Center - All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after K.I. Scriabin and Ya.R. Kovalenko of the Russian Academy of Sciences ”, (FGBNU FSC VIEW RAS). 109428, Moscow, Ryazansky prospect, 24, building 1. Tel./fax +7 (495) 970-03-69. E-mail: admin@viev.ru

16. Авторы: Лаишевцев А.И., Капустин А.В., Якимова Э.А.16. Authors: Laishevtsev A.I., Kapustin A.V., Yakimova E.A.

Пример №2. Получение бульонной культуры Histophilus somni для последующей лиофилизацииExample # 2. Obtaining a broth culture of Histophilus somni for subsequent lyophilization

Для промышленного использования производственного штамма Histophilus somni целесообразно обеспечить его сохранность в лиофилизированном виде. Данный подход позволяет стандартизировать качество производимой продукции и обеспечивать возможность его длительного хранения культуры без пассажа. Для лиофилизации предложенного штамма гистофил предварительно получали бульонную культуру. Для этого с поверхности агара в чашках Петри, на которых поддерживалась живая культура, производился отсев отдельных колоний на пробирки с сердечно-мозговым бульоном (возможно использование триптон соевого бульона или иных ростобеспечивающих сред). После пересева пробирки с бульоном культивировались при 37-38°С в течении 24 часов в присутствия 5-10% СО₂. По окончании культивирования, проводился контроль бульонной культуры на типичность роста, морфологические и тинкториальные свойства клеток гистофил, а также отсутствие роста посторонней микрофлоры. Все обозначенные свойства соответствовали паспортных. В течении 24 часов культивирования в пробирках концентрация клеток достигает 0,5-0,7*10⁹. Следующим этапом работы являлся пересев бульонной культуры из пробирки во флакон с 250 мл сердечно-мозгового или триптон-соевого бульона. Данный этап позволяет одновременно получить большое количество бульонной культуры с идентичными свойствами. Культивирование флаконов производилось при 37-38°С в течении 24 часов, в присутствии 5-10% СО₂. По окончании культивирования, проводился контроль бульонной культуры на типичность роста, морфологические и тинкториальные свойства клеток гистофил, а также отсутствие роста посторонней микрофлоры. Все обозначенные свойства полностью соответствовали паспортным.For industrial use of the production strain of Histophilus somni, it is advisable to ensure its safety in a lyophilized form. This approach makes it possible to standardize the quality of manufactured products and ensure the possibility of its long-term storage of culture without passage. For lyophilization of the proposed histophilic strain, a broth culture was previously obtained. For this, from the surface of the agar in Petri dishes, on which the live culture was maintained, individual colonies were sifted onto test tubes with brain-heart broth (it is possible to use tryptone soy broth or other growth-supporting media). After reseeding, the tubes with the broth were cultured at 37-38 ° C for 24 hours in the presence of 5-10% CO ₂ . At the end of cultivation, the broth culture was monitored for typical growth, morphological and tinctorial properties of histophilous cells, as well as the absence of growth of extraneous microflora. All the indicated properties corresponded to the passport ones. Within 24 hours of cultivation in test tubes, the concentration of cells reaches 0.5-0.7 * 10 ⁹ . The next stage of the work was the reseeding of the broth culture from a test tube into a bottle with 250 ml of brain-heart or tryptone-soy broth. This stage allows you to simultaneously obtain a large amount of broth culture with identical properties. The vials were cultivated at 37-38 ° C for 24 hours, in the presence of 5-10% CO ₂ . At the end of cultivation, the broth culture was monitored for typical growth, morphological and tinctorial properties of histophilous cells, as well as the absence of growth of extraneous microflora. All designated properties are fully consistent with the passport.

Получив бульонную культуру во флаконе, в него вносился декстриновый стабилизатор (или сахаро-желатиновую среду) в объеме 30%. Так, например, к 250 мл бульонной культуры Histophilus somni добавлялся стабилизатор в количестве 75 мл, после чего полученную суспензию тщательно размешивали. Суспензию расфасовывали в ампулы или флаконы в объеме 1-3 мл, в зависимости от типа используемой тары, и подвергали высушиванию.Having received a broth culture in a vial, a dextrin stabilizer (or sugar-gelatin medium) in a volume of 30% was introduced into it. For example, 75 ml of stabilizer was added to 250 ml of Histophilus somni broth culture, after which the resulting suspension was thoroughly stirred. The suspension was filled in ampoules or vials in a volume of 1-3 ml, depending on the type of container used, and dried.

Пример №3. Получение агаровой культуры Histophilus somni для последующей лиофилизацииExample No. 3. Obtaining an agar culture of Histophilus somni for subsequent lyophilization

Для поддержания штаммов гистофилл в лиофилизированном виде помимо бульонной культуры возможно использование агаровой суспензии, предварительно полученной с плотных питательных сред. Получение суспензии проводилось в следующей последовательности: с чашек Петри, на которых поддерживалась живая культура гистофил, отсевались отдельные колонии на чашки Петри с кровяным агаром (основой колумбийского агара с добавление 10% дефибринированной крови барана) для получения свежей суточной культуры. Культивирование посевов проводили при 37-38°С в течении 24 часов, в присутствии 5-10% СО₂. Спустя сутки культивирования проводили оценку типичности роста штамма, оценку морфологических и тинкториальных свойств, а также подтверждалось отсутствие роста посторонней микрофлоры. Все свойства соответствовали паспортным. Полученная агаровая культура смывалась стерильным физиологическим раствором из расчета 15 см³ на одну чашку Петри. В последующем данная суспензия использовалась для засева матрацов (объемом 300 см³) с кровяным агаром (этап необходим для получения большого количества бактериальной суспензии с идентичными свойствами). Засев производился из расчета 5 мл суспензии на 1 матрац. Культивирование матрацов производилось при 37-38°С в течении 24 часов в присутствии 5-10% СО₂. Спустя сутки культивирования проводилась оценка типичности роста штамма, оценка морфологических и тинкториальных свойств, а также подтверждается отсутствие роста посторонней микрофлоры. Все свойства соответствовали паспортным. Полученная культура смывалась с поверхности матрацов стерильным физиологическим раствором в объеме 50 см³ на один матрац. После чего суспензию бактериальных клеток разводили до концентрации 1*10⁹ м.к./см³ физиологическим раствором (возможно использование для лиофилизации суспензии в исходной концентрации, т.е. без дополнительного разведения). В качестве среды высушивания использовалась сахаро-желатиновая среда (возможно использование декстринового стабилизатора) в объеме 30% от объема бактериальной суспензии. Суспензию расфасовывали в ампулы или флаконы в объеме 1-3 мл, в зависимости от типа используемой тары, и подвергали высушиванию.To maintain lyophilized histophyll strains, in addition to broth culture, it is possible to use an agar suspension previously obtained from solid nutrient media. The suspension was obtained in the following sequence: from Petri dishes, on which a live culture of histophile was maintained, individual colonies were seeded on Petri dishes with blood agar (Columbia agar base with the addition of 10% defibrinated ram blood) to obtain a fresh daily culture. Cultivation of crops was carried out at 37-38 ° C for 24 hours, in the presence of 5-10% CO ₂ . After a day of cultivation, the typicality of the growth of the strain was assessed, the morphological and tinctorial properties were assessed, and the absence of the growth of extraneous microflora was confirmed. All properties corresponded to the passport ones. The resulting agar culture was washed off with a sterile saline solution at the rate of 15 cm ³ per one Petri dish. Subsequently, this suspension was used to inoculate mattresses (300 cm ³ ) with blood agar (this step is necessary to obtain a large amount of bacterial suspension with identical properties). Sowing was carried out at the rate of 5 ml of suspension per 1 mattress. Cultivation of mattresses was carried out at 37-38 ° C for 24 hours in the presence of 5-10% CO ₂ . After a day of cultivation, the assessment of the typicality of the growth of the strain, assessment of the morphological and tinctorial properties was carried out, and the absence of growth of extraneous microflora was also confirmed. All properties corresponded to the passport ones. The resulting culture was washed off the surface of the mattresses with a sterile saline solution in a volume of 50 cm ³ per mattress. After that, the suspension of bacterial cells was diluted to a concentration of 1 * 10 ⁹ MC / cm ³ with saline (it is possible to use the suspension for lyophilization in the initial concentration, i.e. without additional dilution). As a drying medium, a sugar-gelatin medium was used (it is possible to use a dextrin stabilizer) in a volume of 30% of the volume of the bacterial suspension. The suspension was filled in ampoules or vials in a volume of 1-3 ml, depending on the type of container used, and dried.

Пример №4. Лиофилизация производственного штамма Histophilus somni Полученную смесь культуры производственного штамма Histophilus somni со стабилизатором (полученные согласно примерам №2 и/или №3) расфасовывали по 1,0 мл в стеклянные флаконы вместимостью 3 мл, по ТУ 10.09.202 и ГОСТ 10782 вручную с использованием автоматических дозаторов. Фасовку проводили в ламинарном потоке стерильного воздуха с соблюдением правил асептики. Емкость с расплодкой перед розливом обтирали салфеткой, смоченной 2%-ным раствором хлорамина. Перед розливом и в его процессе фасуемый материал периодически перемешивался.Example No. 4. Lyophilization of the production strain Histophilus somni The resulting mixture of the culture of the production strain Histophilus somni with a stabilizer (obtained according to examples No. 2 and / or No. 3) was packed in 1.0 ml glass vials with a capacity of 3 ml, according to TU 10.09.202 and GOST 10782 manually using automatic dispensers. The packing was carried out in a laminar flow of sterile air in compliance with the rules of asepsis. Before bottling, the container with the brood was wiped with a napkin moistened with a 2% chloramine solution. Before and during filling, the material to be packed was periodically mixed.

Флаконы с расплодкой штамма укупоривали стерильными резиновыми пробками на ножке до соответствующей риски по ТУ 38-006-108. При розливе в ампулы их горлышко закрывали стерильной ватой. Флаконы и ампулы после фасовки распределялись на специальные металлические кассеты, которые помещали в морозильные камеры с температурой не выше минус 45°С.The vials with the strain brood were sealed with sterile rubber stoppers on the stem to the corresponding risk according to TU 38-006-108. When filled into ampoules, their neck was closed with sterile cotton wool. After filling, the vials and ampoules were distributed on special metal cassettes, which were placed in freezers with a temperature not higher than minus 45 ° C.

После замораживания кассеты помещали в сублимационный аппарат, вынимая поддоны так, чтобы дно флаконов соприкасалось с греющими поверхностями сублиматора. Использовали сублимационные установки модели Christ epsilon 1-4.After freezing, the cassettes were placed in a sublimation apparatus, removing the trays so that the bottom of the vials was in contact with the heating surfaces of the sublimator. Used sublimation machines model Christ epsilon 1-4.

Технология сублимации включает в себя два основных этапа: замораживание и сушку (первичную и вторичную). Сублимационное высушивание проводили в асептических условиях, согласно инструкции к соответствующей сублимационной установке. Управление процессом вели в зависимости от сублимационного аппарата в ручном или автоматическом режиме.Sublimation technology includes two main stages: freezing and drying (primary and secondary). Freeze drying was carried out under aseptic conditions, according to the instructions for the corresponding freeze dryer. The process was controlled, depending on the sublimation apparatus, in manual or automatic mode.

Во время сушки контролировали следующие параметры:During drying, the following parameters were monitored:

а) температуру в материале;a) temperature in the material;

б) температуру греющих поверхностей;b) the temperature of the heating surfaces;

в) температуру конденсатора;c) condenser temperature;

г) давление в сублимационной камере;d) pressure in the sublimation chamber;

д) относительное электрическое сопротивление материала.e) the relative electrical resistance of the material.

Изменение этих параметров во времени фиксировалось на ленте самописца и/или на мониторе компьютера.Changes in these parameters in time were recorded on the recorder tape and / or on the computer monitor.

Основные контрольные точки процесса сублимационной сушки штаммов:The main control points of the freeze drying process of strains are:

а) температура замораживания материала - не выше минус 45°С;a) material freezing temperature - not higher than minus 45 ° С;

б) время достижения температуры полного замораживания для всей партии жидкого материала - не менее 5 часов при скорости охлаждения 1 градус в минуту;b) the time to reach the temperature of complete freezing for the entire batch of liquid material - at least 5 hours at a cooling rate of 1 degree per minute;

в) при сублимации (первичная сушка) длительность поддержания температуры плит на уровне минус 22°С составляет не менее 55 часов, без учета длительности нагрева плит.c) during sublimation (primary drying), the duration of maintaining the temperature of the plates at minus 22 ° C is at least 55 hours, excluding the duration of heating the plates.

Величина массоудаления характеризует качество проведения процесса по показателю удаленной влаги. Стандартность величины этого показателя гарантирует надежное воспроизведение приемлемого уровня влажности в готовом продукте.The value of mass removal characterizes the quality of the process in terms of removed moisture. The standard value of this indicator guarantees reliable reproduction of the acceptable moisture level in the finished product.

Параметры контроля после процесса сублимационной сушки.Control parameters after freeze drying process.

После процесса сушки и укупоривания флаконов оценивали следующие параметры качества сухого препарата:After the process of drying and sealing the vials, the following parameters of the quality of the dry preparation were assessed:

а) внешний вид таблетки;a) the appearance of the tablet;

б) величина массоудаления;b) the amount of mass removal;

в) наличие вакуума;c) the presence of a vacuum;

г) полнота и скорость растворения сухой таблетки;d) completeness and rate of dissolution of a dry tablet;

д) величина остаточной влажности.e) the amount of residual moisture.

Обкатка алюминиевыми колпачками, поклейка этикеток.Rolling in aluminum caps, gluing labels.

После сублимационного высушивания флаконы с сухим компонентом вручную подвергались обкатке алюминиевыми колпачками по ГОСТ Ρ 51314-99.After freeze drying, the vials with the dry component were manually rolled with aluminum caps in accordance with GOST 51314-99.

При изготовлении лиофилизированных ампул в ампулах, их запаивали в день разгрузки в вакуумных коллекторах при остаточном давлении в пределах 0,1-0,25 мкм рт.ст.In the manufacture of lyophilized ampoules in ampoules, they were sealed on the day of unloading in vacuum collectors at a residual pressure in the range of 0.1-0.25 μm Hg.

В запаянных ампулах проверяли наличие вакуума аппаратом типа Д’Арсонваль. Ампулы без вакуума выбраковывали с последующим автоклавированием. Первичный визуальный контроль и отбор брака.In sealed ampoules, the presence of a vacuum was checked using a D'Arsonval apparatus. Ampoules without vacuum were discarded, followed by autoclaving. Primary visual inspection and selection of rejects.

Расфасованную и укупоренную расплодку штамма подвергали визуальному контролю. Отбраковывали флаконы/ампулы с посторонними включениями, трещинами, измененным цветом, несоответствующим объемом фасовки, нарушением укупорки.The packaged and sealed brood of the strain was subjected to visual control. Vials / ampoules with foreign inclusions, cracks, discolored, inappropriate packaging volume, and violation of the closure were rejected.

Этикетированную расплодку укладывали в контейнеры для последующего хранения. Производился визуальный контроль физических свойств и отбирались образцы для проведения контрольных испытаний и закладки в коллекцию ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН на хранение.The labeled brood was placed in containers for subsequent storage. A visual control of physical properties was carried out and samples were taken for control tests and bookmarked into the collection of the Federal State Budgetary Scientific Institution FSC VIEW RAS for storage.

Процесс фасовки и этикетирования материала регистрировали в журнале учета изготовления и движения штаммов, где записывали дату, объем расфасованной продукции, количество флаконов, номер серии.The process of packing and labeling the material was recorded in the register of the production and movement of strains, where the date, the volume of the packaged products, the number of bottles, and the batch number were recorded.

Пример №5. Контроль внешнего вида, цвета, наличия посторонних примесей, полученной расплодки производственного штамма гистофиллExample No. 5. Control of the appearance, color, the presence of impurities, the resulting brood of the production strain Histophyll

Внешний вид, цвет, наличие посторонней примеси, плесени, следов оттаивания, трещин определяли визуально по каждому флакону/ампуле всей серии штамма. Одновременно проверяли качество запайки ампул, наличие во флаконах/ампулах вакуума, правильность маркировки.The appearance, color, presence of foreign matter, mold, traces of thawing, cracks were determined visually for each bottle / ampoule of the entire series of the strain. At the same time, the quality of the ampoule sealing, the presence of vacuum in the vials / ampoules, and the correct labeling were checked.

Лиофилизированные посевные материалы по внешнему виду представляли собой однородную сухую мелкопористую массу белого или светло-желтого цвета с сероватым оттенком без посторонней примеси. Все несоответствующие по данному параметру ампулы/флаконы подвергались выбраковке методом автоклавирования.Lyophilized inoculum in appearance was a homogeneous dry finely porous mass of white or light yellow color with a grayish tint without foreign impurities. All ampoules / vials inadequate for this parameter were rejected by autoclaving.

Пример №6. Определение наличия вакуума в ампулахExample No. 6. Determination of the presence of vacuum in ampoules

Сущность метода испытания заключается в способности высокочастотного электрического тока при большом напряжении вызывать в газах свечение. Для проведения испытания используется аппарат типа «Д’Арсонваль». Перед использованием аппарата его выдерживали в течении 10 минут после включения. Испытуемые ампулы устанавливались в штативе, после чего к ним подводили электроды на расстоянии 1 см, с экспозицией искрового разряда у каждой ампулы не более 1 с.The essence of the test method lies in the ability of a high-frequency electric current at high voltage to cause a glow in gases. A D'Arsonval apparatus is used for testing. Before using the device, it was kept for 10 minutes after turning on. The test ampoules were installed in a tripod, after which the electrodes were brought to them at a distance of 1 cm, with a spark discharge exposure for each ampoule for no more than 1 s.

Наличие вакуума в ампулах подтверждали по наличию свечения внутри ампулы и характерному потрескиванию при подведении к ним электродов. В ходе выполнения данного исследования ампулы, не содержащие вакуум, были выбракованы с последующим автоклавированием.The presence of a vacuum in the ampoules was confirmed by the presence of a glow inside the ampoule and the characteristic crackling when the electrodes were brought to them. In the course of this study, ampoules that did not contain a vacuum were discarded, followed by autoclaving.

Пример №7. Определение растворимости лиофилизатаExample No. 7. Determination of the solubility of the lyophilisate

Для испытания использовали 3 флакона/ампулы с полученным лиофилизатом, в который вносили стерильный физиологический раствор (рН 7,2) в объеме, соответствующем объему культуры штамма до высушивания (1 см³), после чего флаконы/ампулы встряхивали. В течение не более 4 минут должна образоваться равномерная взвесь без хлопьев, комочков и осадка. Произведенная расплодка (полученная согласно примерам №2, №3, №4) соответствовала данному параметру.For testing, 3 vials / ampoules with the obtained lyophilisate were used, into which sterile physiological solution (pH 7.2) was added in a volume corresponding to the volume of the culture of the strain before drying (1 cm ³ ), after which the vials / ampoules were shaken. Within no more than 4 minutes, a uniform suspension should form without flakes, lumps and sediment. Produced brood (obtained according to examples No. 2, No. 3, No. 4) corresponded to this parameter.

Пример №8. Определение массовой доли влаги в ампулеExample No. 8. Determination of the mass fraction of moisture in the ampoule

Исследование данного параметра проводят согласно ГОСТ 24061-2012 «Средства лекарственные биологические лиофилизированные для ветеринарного применения». Сущность метода заключается в определении уменьшения массы пробы препарата после ее высушивания в течение 1 ч при температуре (105±1)°С. Определение массовой доли влаги проводили в трех повторностях, для каждого из которых использовалось по 3 флакона/ампулы. Отобранные пробы помещали в фарфоровые ступки и с помощью пестика их доводили до равномерного порошкообразного состояния, после чего данный порошок помещали ровным слоем в предварительно взвешенные с крышкой бюксы. Бюксы с пробами закрывали крышками, взвешивали, снимали с них крышки и устанавливали в сушильный шкаф на полку. Начало сушки считали с момента достижения 105°С в соответствии с контрольным термометром. Продолжительность сушки составляла 60 минут. После окончания сушки бюксы быстро закрывали крышками и переносили в эксикатор для охлаждения до комнатной температуры в течении 30 минут, после чего бюксы взвешивали, а результаты взвешивания записывали в журнал с точностью до четвертого десятичного знака. Массовая доля влаги в образце должна быть в пределах 1,0-4,0%.The study of this parameter is carried out in accordance with GOST 24061-2012 "Lyophilized biological medicinal products for veterinary use." The essence of the method is to determine the decrease in the mass of the drug sample after drying it for 1 h at a temperature of (105 ± 1) ° C. The determination of the mass fraction of moisture was carried out in three replicates, for each of which 3 vials / ampoules were used. The selected samples were placed in porcelain mortars and with the help of a pestle they were brought to a uniform powdery state, after which this powder was placed in an even layer in weighing buckets preliminarily weighed with a lid. The sample bags were covered with lids, weighed, the lids were removed from them, and placed in the drying cabinet on the shelf. The beginning of drying was counted from the moment of reaching 105 ° C in accordance with the control thermometer. The drying time was 60 minutes. After drying, the bottles were quickly closed with lids and transferred to a desiccator to cool to room temperature for 30 minutes, after which the bottles were weighed, and the weighing results were recorded in a journal with an accuracy of four decimal places. Mass fraction of moisture in the sample should be in the range of 1.0-4.0%.

В результате испытания массовая доля влаги лиофилизированного штамма гистофил, подготовленного согласно примеру №2, составляла 2,6%, примера №3 - 2,3%.As a result of the test, the mass fraction of moisture of the lyophilized strain of histophil, prepared according to example No. 2, was 2.6%, example No. 3 - 2.3%.

Пример №9. Определение контаминации ампул посторонней микрофлорой Контаминацию посторонней микрофлорой определяли в соответствии с ГФ XIV ОФС.1.2.4.0002.15 «Микробиологическая чистота» методом прямого посева.Example No. 9. Determination of contamination of ampoules with extraneous microflora Contamination with extraneous microflora was determined in accordance with GF XIV OFS.1.2.4.0002.15 "Microbiological purity" by direct inoculation.

Для получения первичного разведения использовалось три ампулы лиофилизированной культуры. Содержимое каждого флакона разводили стерильным 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 флакон. Затем объединяли полученную суспензию из 3 флаконов, перемешивали 8-10 раз и получали исходное разведение.To obtain the primary dilution, three ampoules of the lyophilized culture were used. The contents of each vial were diluted with sterile 0.9% sodium chloride solution at the rate of 1 ml per 1 vial. Then the resulting suspension from 3 vials was combined, mixed 8-10 times and the initial dilution was obtained.

Исходное разведение культуры использовалось для посева на агаризированные питательные среды (кровяной агар, мясопептонный агар (ΜΠΑ), агар Эндо, агар Сабуро) методом Дригальского. Для этого чашки Петри с питательной средой визуально делили на 4 сектора, посев из исходного разведения испытуемого образца начинали в первом секторе, тщательно втирая взвесь петлей в агар. Затем этой же петлей продолжали посевы во втором и последующих секторах. Данная манипуляция позволяла получать в последних секторах изолированные колонии Histophilus somni, и зафиксировать возможные контаминирующие виды микроорганизмов. Инкубировании посевов на ΜΠΑ и агаре Эндо производили в течении 72 часов при температуре 37°С в аэробных условиях. Культивирование посевов на кровяном агаре проводилось в СО₂ инкубаторе, при 5-10% уровне углекислого газа. Чашки с агаром Сабуро культивировались в течении 7 дней при 25-28°С. Контроль роста посторонней микрофлоры на всех средах проводился каждые 24 часа.The original culture dilution was used for inoculation on agar nutrient media (blood agar, mesopatamia agar (ΜΠΑ), Endo agar, Sabouraud agar) by the Drygalsky method. For this, Petri dishes with a nutrient medium were visually divided into 4 sectors, inoculation from the initial dilution of the test sample was started in the first sector, carefully rubbing the suspension into agar with a loop. Then the same loop continued sowing in the second and subsequent sectors. This manipulation made it possible to obtain isolated colonies of Histophilus somni in the last sectors, and to fix possible contaminating species of microorganisms. Inoculations were incubated on ΜΠΑ and Endo agar for 72 hours at 37 ° C under aerobic conditions. Cultivation of crops on blood agar was carried out in a CO ₂ incubator, with a 5-10% carbon dioxide level. Sabouraud agar plates were cultured for 7 days at 25-28 ° C. Control of the growth of extraneous microflora on all media was carried out every 24 hours.

В результате проведения обозначенного испытания было определено, что в лиофилизированных ампулах (полученных согласно примерам №2, №3) со штаммами гистофил отсутствует рост посторонней микрофлоры, в том числе грибов.As a result of the designated test, it was determined that in lyophilized ampoules (obtained according to examples No. 2, No. 3) with histophilous strains, there is no growth of extraneous microflora, including fungi.

Пример №10. Определение культуральных и морфологических свойств, а также подтверждение типичности роста на питательных средахExample No. 10. Determination of cultural and morphological properties, as well as confirmation of the typicality of growth on nutrient media

Для подтверждения свойств штамма гистофил после проведенной лиофилизации проводился отбор флаконов/ампул от каждой расплодки. После чего их содержимое ресуспендировали в 9 мл стерильного физиологического раствора, а затем проводили посев методом Дригальского на кровяной агар (основа колумбийского агара, триптон-соевый агар, сердечно-мозговой агар и т.д.). Культивирование посевов проводят в течении 24-72 часов при 37°С в СО₂ инкубаторе при поддержании уровня углекислого газа в диапазоне 5-10%. На кровяном агаре микроорганизм формировал гладкие, выпуклые колонии размером 0,5-1,0 мм спустя 24 часа культивирования. Через 72 часа культивирования размер колоний достигал 1-2 мм. В мазках, окрашенных по Граму, обнаруживались грамотрицательные коккобациллы, короткие палочки или нити, расположенные в мазках одиночно и в виде скоплений клеток.To confirm the properties of the histophil strain, after lyophilization, vials / ampoules were selected from each brood. After that, their contents were resuspended in 9 ml of sterile saline, and then plated by the Drygalsky method on blood agar (Columbia agar base, tryptone soy agar, brain heart agar, etc.). Cultivation of crops is carried out for 24-72 hours at 37 ° C in a CO ₂ incubator while maintaining the level of carbon dioxide in the range of 5-10%. On blood agar, the microorganism formed smooth, convex colonies 0.5-1.0 mm in size after 24 hours of cultivation. After 72 hours of cultivation, the size of the colonies reached 1–2 mm. Gram-stained smears showed gram-negative coccobacilli, short rods or filaments located in smears singly and in the form of cell clusters.

Оценка типичности роста гистофил на бульонных средах проводится путем пересева отдельных суточных колоний с кровяного агара в пробирки с сердечно-мозговым бульоном или триптон-соевым бульоном. Культивирование пробирок проводилось в течении 24-72 часов при 37°С в СО₂ инкубаторе при поддержании уровня углекислого газа в диапазоне 5-10%. В результате культивирования в пробирках образовалась равномерная взвесь бактериальных клеток. Средняя концентрация выращенных клеток при таком культивировании составило 5,0-7,0*10⁸ м.к./см³.Evaluation of the typical growth of histophiles on broth media is carried out by reseeding individual daily colonies from blood agar into tubes with brain heart broth or tryptone-soy broth. Cultivation of tubes was carried out for 24-72 hours at 37 ° C in a CO ₂ incubator while maintaining the level of carbon dioxide in the range of 5-10%. As a result of cultivation in test tubes, a uniform suspension of bacterial cells was formed. The average concentration of cells grown during this cultivation was 5.0-7.0 * 10 ⁸ m.c. / cm ³ .

Пример №11. Определение биохимических свойств штамма Histophilus somni Определение биохимических свойств штаммов гистофил позволяет подтвердить их видовую принадлежность. Данное испытание проводится с использованием рутинных методов бактериологии. Для изучения биохимических свойств культуры Histophilus somni были использованы коммерческие тест системы: API® NH, API® 20Е с сопутствующими расходными принадлежностями и электронной базой для интерпретации полученного результата. Помимо коммерческих биохимических тест-систем были использованы углеводы в дисках для определения сахаролитических свойств: глюкоза, ксилоза, маннит, сорбитол, фруктоза, манноза, мальтоза, трегалоза, грицерина, рамноза, целлобиоза, лактоза, мелибиоза, сахароза, раффиноза, инулин, эскулин производства ООО «Himedia». Испытание проводили согласно инструкции на набор и углеводы.Example No. 11. Determination of the biochemical properties of the Histophilus somni strain Determination of the biochemical properties of Histophilus strains allows confirming their species identity. This test is carried out using routine bacteriological methods. To study the biochemical properties of Histophilus somni culture, commercial test systems were used: API® NH, API® 20E with accompanying consumables and an electronic base for interpreting the result. In addition to commercial biochemical test systems, carbohydrates were used in discs to determine saccharolytic properties: glucose, xylose, mannitol, sorbitol, fructose, mannose, maltose, trehalose, grcerin, rhamnose, cellobiose, lactose, melibiose, sucrose, raffinose, inulin, esculin production LLC "Himedia". The test was carried out according to the instructions for the kit and carbohydrates.

В результате испытания культура предложенного штамма гистофил обладала следующими свойствами: оксидазоположительная, каталазоотрицательная, аргининдекарбоксилаза, лизиндекарбоксилаза и орнитиндекарбоксилаза отрицательная, восстанавливает нитрат, продуцирует индол, кислота продуцируется при ферментации глюкозы, ксилозы, маннита, сорбита, фруктозы, маннозы, мальтозы, трегалозы, но не грицерина, рамнозы, целлобиозы, лактозы, мелибиозы, сахарозы, раффинозы, инулина, эскулина.As a result of the test, the culture of the proposed histophile strain had the following properties: oxidase-positive, catalase-negative, arginine decarboxylase, lysine decarboxylase and ornithine decarboxylase negative, restores nitrate, produces indole, acid is produced during fermentation of glucose, xylose, mannitol, malbitol, fructose. grcerin, rhamnose, cellobiose, lactose, melibiose, sucrose, raffinose, inulin, esculin.

Пример №12. Определение концентрации живых бактерий в 1,0 см³ сухой культуры гистофил после ее лиофилизацииExample No. 12. Determination of the concentration of living bacteria in 1.0 cm ^{3 of a} dry culture of histophil after its lyophilization

Определение количества живых микробных клеток штамма Histophilus somni проводили в трехкратной повторности (использовали по 3 ампулы/флакона). Вскрытие ампул/флаконов проводили в стерильных условиях, в каждую вносили стерильный физиологический раствор до первоначального объема (1,0 см³). После восстановления лиофилизата, суспензию тщательно перемешивали. Из полученных первичных разведений (каждый флакон отдельно) готовили последовательные десятикратные разведения штамма в 8 пробирках от 10^-1 до 10^-8. Для каждого разведения культуры использовалась отдельная пипетка.Determination of the number of living microbial cells of the Histophilus somni strain was carried out in triplicate (3 ampoules / vials were used). The opening of the ampoules / vials was carried out under sterile conditions, each was filled with sterile saline to the original volume (1.0 cm ³ ). After reconstitution of the lyophilisate, the suspension was thoroughly mixed. From the obtained primary dilutions (each bottle separately) were prepared sequential tenfold dilutions of the strain in 8 tubes from 10 ^-1 to 10 ^-8 . A separate pipette was used for each culture dilution.

Для высева использовали три последних разведения штамма: 10^-6, 10^-7, 10^-8. Из каждого разведения проводили посевы по 0,1 см³ на поверхность 3 чашек Петри с кровяным агаром, предварительно выдержанных при температуре 37±1°С в течение часа (для полного удаления конденсата). Для получения равномерного газона культуры использовался шпатель (отдельный на каждую чашку).For seeding, the last three dilutions of the strain were used: 10 ^-6 , 10 ^-7 , 10 ^-8 . From each dilution, inoculations of 0.1 cm ³ were carried out on the surface of 3 Petri dishes with blood agar, previously kept at a temperature of 37 ± 1 ° C for an hour (to completely remove condensate). To obtain a uniform crop lawn, a spatula was used (separate for each dish).

Посевы инкубировали при температуре 37±1°С в течение 72 ч. в условиях 5-10% СО₂, проводя учет результатов каждые 24 часа. Затем подсчитывали количество выросших колоний и определяли концентрацию живых бактерий в 1 см³ по формуле (1):Crops were incubated at 37 ± 1 ° C for 72 hr. Under conditions of 5-10% CO _2, carrying out accounting results every 24 hours. Then the number of grown colonies was counted and the concentration of living bacteria in 1 cm ^{3 was} determined using the formula (1):

0)

Где:Where:

X - число живых бактерий в 1 см³;X is the number of living bacteria in 1 cm ³ ;

Ρ - количество колоний на всех чашках из разведения 10^-6;Ρ - the number of colonies on all plates from a 10 ^-6 dilution;

о - количество чашек с разведением 10^-6;o - the number of cups with a dilution of 10 ^-6 ;

P₁ - количество колоний во всех чашках из разведения 10^-7;P ₁ - the number of colonies in all dishes from a dilution of 10 ^-7 ;

10 - перерасчет на разведение 10^-6;10 - recalculation for dilution 10 ^-6 ;

о₁ - количество чашек с разведением 10^-7;about ₁ - the number of cups with a dilution of 10 ^-7 ;

Р₂ - количество колоний во всех чашках из разведения 10^-8;Р ₂ - the number of colonies in all dishes from a dilution of 10 ^-8 ;

100 - перерасчет на разведение 10^-6;100 - recalculation for breeding 10 ^-6 ;

о₂ - количество чашек с разведением 10^-8;about ₂ - the number of cups with a dilution of 10 ^-8 ;

10 - перерасчет количества живых бактерий на 1 см³;10 - recalculation of the number of living bacteria per 1 cm ³ ;

10^-6 - степень разведения штамма.10 ^-6 - the degree of dilution of the strain.

Количество живых бактерий в 1,0 см³ сухой культуры штамма гистофил должна быть не менее 150 млн микробных клеток. При сравнении результатов исследования, количество живых бактерий в каждом флаконе не должно различаться более чем на 15%.The number of living bacteria in 1.0 cm ^{3 of a} dry culture of the histophil strain must be at least 150 million microbial cells. When comparing the test results, the number of live bacteria in each vial should not differ by more than 15%.

В результате проведенного испытания установлено, что концентрация жизнеспособных клеток во флаконах, полученных согласно примеру №2, составило 5,4*10⁸ м.к./см³, а в ампулах, полученных согласно примеру №3 - 6,7*10⁸ м.к./см³.As a result of the test, it was found that the concentration of viable cells in the vials obtained according to example No. 2 was 5.4 * 10 ⁸ MC / cm ³ , and in the ampoules obtained according to example No. 3 - 6.7 * 10 ⁸ m.c. / cm ³ .

Пример №13. Определение вирулентности штамма Histophilus somni При определении вирулентности культуры гистофил, выраженном в значении показателя LD₅₀, использовали белых мышей массой 22-25 гр. в количестве 40 голов. Для исследования подготавливался ряд десятикратных разведений бактериальной суспензии клеток гистофил на основе физиологического раствора, а именно ~3x10⁹ м.к., ~3х10⁸ м.к., ~3х10⁷ м.к., ~3х10⁶ м.к. Мышей заражали внутрибрюшинно по 0,5 см³, срок наблюдения составлял 10 суток. Таким образом, заражающая доза составляла ~1,5х10⁹ м.к., ~1,5х10⁸м.к., ~1,5x10⁷ м.к., ~1,5x10⁶ м.к. Параллельно, для точного определения дозы (концентрации живых клеток) возбудителя в заражающей культуры проводили раститровку и высев на чашки с ростообеспечивающими средами (чашечный метод Коха) аналогично примеру №12. Срок наблюдения за инфицированными животными составлял 10 дней. Статистическую обработку результатов осуществляли в программах BioStat 2009 («AnalystSoft, Inc.», США) и Microsoft Excel. Расчет LD₅₀ проводили посредством пробит-анализа. Результаты испытаний приведены в таблице №1.Example No. 13. Determination of the virulence of the Histophilus somni strain When determining the virulence of the Histophil culture, expressed as the LD ₅₀ value, white mice weighing 22-25 g were used. in the amount of 40 heads. For the study, a series of tenfold dilutions of the bacterial suspension of histophilic cells based on saline were prepared, namely ~ 3x10 ⁹ m.c., ~ 3x10 ⁸ m.c., ~ 3x10 ⁷ m.c., ~ 3x10 ⁶ m.c. Mice were infected intraperitoneally with 0.5 cm ³ , the observation period was 10 days. Thus, the infecting dose was ~ 1.5x10 ⁹ m.c., ~ 1.5x10 ⁸ m.c., ~ ^{1.5x10 7} m.c., ~ 1.5x10 ^{6 m.c.} In parallel, to accurately determine the dose (concentration of living cells) of the pathogen in the infecting culture, titration and sowing were carried out on plates with growth media (Koch plate method) similar to example No. 12. The observation period for infected animals was 10 days. The results were statistically processed using BioStat 2009 (AnalystSoft, Inc., USA) and Microsoft Excel programs. The calculation of LD ₅₀ was carried out by means of probit analysis. The test results are shown in table 1.

Полученные результаты свидетельствуют, что предлагаемый производственный штамм является вирулентным и способен вызывать гибель лабораторных животных, что в дальнейшем будет использовано для контроля иммуногенной активности средств специфической профилактики гистофилеза.The results obtained indicate that the proposed production strain is virulent and capable of causing the death of laboratory animals, which will later be used to control the immunogenic activity of agents for the specific prophylaxis of histophilia.

После установления величины LD₅₀, дополнительно было проведено заражение белых мышей (n=10) в дозе 5LD₅₀, которое должно было вызвать гибель не менее 80% подопытных животных. Заражение мышей проводили культурой с концентрацией 1,04*10⁹ м.к. Инфицирование мышей данной дозой вызывало 100%-ную смертность лабораторных животных. Сразу после гибели проводили патологоанатомическое вскрытие мышей с последующим бактериологическим исследованием образцов внутренних органов. В ходе исследования из всех исследованных проб были выделены культуры заражающего штамма возбудителя гистофилеза рогатого скота.After establishing the LD ₅₀ value, additionally, white mice (n = 10) were infected at a dose of 5LD ₅₀ , which should have caused the death of at least 80% of the experimental animals. Infection of mice was carried out with a culture with a concentration of 1.04 * 10 ⁹ m.k. Infection of mice with this dose caused 100% mortality in laboratory animals. Immediately after death, post mortem dissection of the mice was performed, followed by bacteriological examination of samples of internal organs. In the course of the study, cultures of the infecting strain of the causative agent of cattle histophilosis were isolated from all the samples examined.

Пример №14. Изготовление экспериментальной серии вакцины против гистофилеза рогатого скотаExample No. 14. Production of an experimental series of a vaccine against histophilia in cattle

Экспериментальная серия вакцины против гистофилеза изготовлена в лабораторных условиях ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН с использованием поверхностного метода культивирования на одноразовых стерильных матрасах. Для культивирования штаммов гистофил использовался триптон-соевый агар («HiMedia Laboratories Pvt Ltd», Индия) и колумбийский агар («Oxoid Ltd», Великобритания) с добавлением 10% дефибринированной крови барана. Культивирование проводилось в течении 48 часов в СО₂ - инкубаторе при постоянном поступлении 5-10% углекислого газа. После культивирования проводили оценку типичности культуральных, морфологических и тинкториальных свойств штамма, при соответствии которых, а также при отсутствии в посевах роста посторонней микрофлоры, бактериальную массу смывали стерильным физиологическим раствором в объеме 15 мл. Концентрация бактериальных клеток возбудителя при снятии бактериальной массы составляла 20-25*10⁹ м.к./см³. Инактивировали культуры путем добавления 0,3% формалина к общему объему бактериальной суспензии. Продолжительность инактивации равна 3 суткам при температуре +37°С. После инактивации проводили составление серии вакцины с использованием 3% геля гидроокиси алюминия (ФКП «Армавирская биофабрика», Россия) в качестве адъюванта в объеме 15% от компонуемой серии. Концентрация бактериальных клеток в вакцине составила 3*10⁹ м.к./см³. Концентрацию водородных ионов полученного лекарственного средства регулировали с использованием раствора щелочи до значения 7,2 ед.An experimental series of the vaccine against histophilia was made in the laboratory of the Federal State Budgetary Scientific Institution FSC VIEW RAS using the surface cultivation method on disposable sterile mattresses. Tryptone soy agar (HiMedia Laboratories Pvt Ltd, India) and Columbia agar (Oxoid Ltd, UK) supplemented with 10% defibrinated ram blood were used to cultivate histophilic strains. Cultivation was performed for 48 hours in a _CO2 - incubator at constant admission 5-10% carbon dioxide. After cultivation, the typicality of the cultural, morphological and tinctorial properties of the strain was assessed, according to which, as well as in the absence of foreign microflora growth in the inoculations, the bacterial mass was washed off with a sterile saline solution in a volume of 15 ml. The concentration of bacterial cells of the pathogen when removing the bacterial mass was 20-25 * 10 ⁹ MC / cm ³ . Cultures were inactivated by adding 0.3% formalin to the total volume of the bacterial suspension. The duration of inactivation is 3 days at a temperature of + 37 ° C. After inactivation, a series of vaccines was compiled using 3% aluminum hydroxide gel (FKP "Armavir Biofabrika", Russia) as an adjuvant in the amount of 15% of the composited series. The concentration of bacterial cells in the vaccine was 3 * 10 ⁹ MC / cm ³ . The concentration of hydrogen ions of the obtained drug was adjusted using an alkali solution to a value of 7.2 units.

Пример №15. Контроль иммуногенной активности экспериментальной серии вакцины против гистофилеза рогатого скотаExample No. 15. Control of the immunogenic activity of the experimental series of the vaccine against histophilia of cattle

Исследование иммуногенной активности экспериментальной вакцины (полученной согласно примеру №14) проводили в условиях вивария опытной базы ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН на о. Лисий Вышневолоцкого района Тверской области с использованием белых мышей. Таким образом была сформирована 1 опытная группа животных (n=10), и 1 контрольная группа (n=10). Иммунизация животных опытной группы проводилась подкожно, в объеме 0,5 мл, двукратно с интервалом 14 дней. Животным контрольных групп подкожно вводился стерильный физиологический раствор в объеме 0,5 мл. Спустя 14 дней после второй вакцинации, животные опытной и контрольной групп были подвергнуты инфицированию штаммом №1654-ВИЭВ в дозе 5LD₅₀. Срок наблюдения за животными составлял 14 дней.The study of the immunogenic activity of the experimental vaccine (obtained according to example No. 14) was carried out in the vivarium of the experimental base of the Federal State Budgetary Scientific Institution FNTs VIEV RAS on the island. Fox of the Vyshnevolotsk district of the Tver region using white mice. Thus, 1 experimental group of animals was formed (n = 10), and 1 control group (n = 10). Immunization of animals of the experimental group was carried out subcutaneously, in a volume of 0.5 ml, twice with an interval of 14 days. Control animals were injected subcutaneously with a sterile saline solution in a volume of 0.5 ml. 14 days after the second vaccination, the animals of the experimental and control groups were infected with the strain No. 1654-VIEW at a dose of 5LD ₅₀ . The observation period for the animals was 14 days.

В результате реализации данного эксперимента было установлено, что вакцинация белых мышей позволяет обеспечить их 100%-ную защиту от инфицирования вирулентным штаммом Histophilus somni в дозе 5LD₅₀, в то время как смертность в контрольной группе составила 100%, что говорит о необходимом уровне иммуногенной активности препарата, изготовленного из штамма, предлагаемого настоящим изобретением.As a result of the implementation of this experiment, it was found that vaccination of white mice allows them to provide 100% protection against infection with the virulent Histophilus somni strain at a dose of 5LD ₅₀ , while the mortality in the control group was 100%, which indicates the required level of immunogenic activity a preparation made from a strain of the present invention.

Claims

The bacterial strain Histophilus somni, intended for the production of mono- and polyvalent immunogenic compositions aimed at the specific prevention of histophilia in cattle, has been deposited in the "All-Russian State Collection of Pathogenic and Vaccine Microorganisms, Causative Agents of Animal Infectious Diseases" (Federal Research Center - All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after K.I.Skriabin and Ya.R. Kovalenko of the Russian Academy of Sciences) under the number B-1654.