RU2753973C2 - Терапевтическое антитело, специфичное к интерлейкину-11, ингибирующее сигналирование через его рецептор, и способ его использования для лечения пациентов - Google Patents

Терапевтическое антитело, специфичное к интерлейкину-11, ингибирующее сигналирование через его рецептор, и способ его использования для лечения пациентов Download PDF

Info

Publication number
RU2753973C2
RU2753973C2 RU2019130673A RU2019130673A RU2753973C2 RU 2753973 C2 RU2753973 C2 RU 2753973C2 RU 2019130673 A RU2019130673 A RU 2019130673A RU 2019130673 A RU2019130673 A RU 2019130673A RU 2753973 C2 RU2753973 C2 RU 2753973C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
ser
seq
tyr
thr
gly
Prior art date
Application number
RU2019130673A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2019130673A3 (ru
RU2019130673A (ru
Inventor
Роман Вячеславович Михайлов
Тажиб Ахмедханович Мирзабеков
Валерий Владимирович Соловьев
Андрей Романович Яковенко
Виктория Александровна Растрыгина
Сергей Евгеньевич Пермяков
Алексей Сергеевич Казаков
Андрей Сергеевич Соколов
Евгений Анатольевич Пермяков
Original Assignee
Акционерное Общество "Р-Фарм"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Акционерное Общество "Р-Фарм" filed Critical Акционерное Общество "Р-Фарм"
Priority to RU2019130673A priority Critical patent/RU2753973C2/ru
Publication of RU2019130673A3 publication Critical patent/RU2019130673A3/ru
Publication of RU2019130673A publication Critical patent/RU2019130673A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2753973C2 publication Critical patent/RU2753973C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и медицины и представляет собой терапевтическое антитело, ингибирующее связывание IL-11 с альфа-субъединицей рецептора IL-11RA и сигналирование через его рецептор и/или связывание комплекса IL-11/IL-11RA с бета-субъединицей рецептора интерлейкина-6, а также его применение для лечения пациентов с онкологическими заболеваниями, при которых наблюдается высокий уровень экспрессии IL-11 и/или IL-11RA. 2 н.п. ф-лы, 7 пр., 23 ил., 6 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и медицины и может найти применение для лечения онкологических заболеваний с использованием моноклональных человеческих антител, специфичных к интерлейкину-11 человека и ингибирующих его связывание с рецептором IL-11RA и/или с рецептором gp130.
Предшествующий уровень техники
Из патента США US 8518888 В2 известен способ лечения онкологических заболеваний желудочно-кишечного тракта при помощи антител, антагонистичных по отношению к рецептору IL-11R. Однако в данном патенте не раскрывается структура антитела, а в самом способе не описывается каких-либо новых, экспериментально подтвержденных данных.
Из патента РФ RU 2318829 С2 известны химерные анти-IL-6-антитела на основе мышиного антитела CLB-8, каждое из которых содержит константную область из одного или нескольких антител человека. Предпочтительными антителами согласно изобретению являются антитела, которые связываются с эпитопами, распознаваемыми CLB-8 и cCLB-8 и включенными в эпитоп gp130. Описаны варианты нуклеиновых кислот, кодирующих анти-IL-6-антитело. Раскрыто применение анти-IL-6-антитела для лечения иммунологического расстройства или заболевания, опосредуемого IL-6, а также применение анти-IL-6-антитела для модуляции злокачественного расстройства или расстройства иммунной системы, опосредуемого IL-6.
Однако описанные в данном патенте антитела не являются специфичными к интерлейкину-11 и не эффективны при лечении онкологических заболеваний.
В патенте США US 7094402 В2 описано антитело, специфичное к белку рецептора IL-11R человеческого интерлейкина-11, в котором белок рецептора человеческого IL-11R состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
(a) аминокислотной последовательности Seq ID NO: 2;
(b) аминокислотной последовательности Seq ID NO: 2 из аминокислот 24-422;
(c) аминокислотной последовательности Seq ID NO: 2 из аминокислот 24-365;
(d) аминокислотной последовательности Seq ID NO: 2 из аминокислот 391-422;
(e) аминокислотной последовательности Seq ID NO: 2 из аминокислот 112-422;
(f) аминокислотной последовательности Seq ID NO: 2 из аминокислот 112-365;
(g) аминокислотной последовательности Seq ID NO: 2 из аминокислот 24-359;
(h) аминокислотной последовательности Seq ID NO: 2 из аминокислот 24-345; и
(i) аминокислотной последовательности Seq ID NO: 2 из аминокислот 24-324.
В данном патенте не раскрывается способность описанного антитела использоваться для лечения онкологических заболеваний.
Краткое описание существа изобретения
Целью настоящего изобретения является устранение вышеуказанных недостатков аналогов путем создания вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей, обладающих в составе полноразмерного антитела или фрагмента антитела, специфичных к интерлейкину-11 человека (IL-11), ингибирующему связывание IL-11 с альфа-субъединицей рецептора интерлейкина-11 (IL-11RA) и/или связывание комплекса IL-11/IL-11RA с бета-субъединицей рецептора интерлейкина-6 (gp130), в котором вариабельные домены тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина содержат следующие комбинации аминокислотных последовательностей гипервариабельных участков (CDRs) или гомологичные им комбинации аминокислотных последовательностей гипервариабельных участков легких и\или тяжелых цепей.
В таблице 1. приведены комбинации аминокислотных последовательностей гипервариабельных участков из п. 1 формулы изобретения, а также два примера гомологов.
Отличие клона U#L1 от клона U#4 заключается в трех аминокислотах HCDR1 во 2-м, 3-ми 7-м положениях; отличие клона U#L2 от клона U#4 заключается в одной аминокислоте HCDR3 в 12-м положении.
Figure 00000001
Figure 00000002
Кроме того, из патента США US 8518888 В2 известен способ использования антитела для лечения пациентов, заключающийся во введении страдающим заболеванием пациентам в составе полноразмерного терапевтического антитела или его фрагмента (Fab-фрагмент, (Fab)2-фрагмент), и обеспечивающие связывание IL-11 и, как следствие, блокирование активации рецептора IL-11RA.
Настоящее изобретение основано на способности IL-11 последовательно связываться с рецепторами IL-11RA и gp130 и тем самым вызывать активацию STAT3 сигналирования. Аномальная активация сигнального белка и фактора транскрипции STAT3 способствует атрофическому гастриту, дисплазии, пролиферации различного рода аденоматозных полипов и пролиферации рака:
Jarnicki, А., Т. Putoczki, and М. Ernst, Stat3: linking inflammation to epithelial cancer - more than a "gut" feeling? Cell Div, 2010. 5: p. 14.;
Guo, X., et al., Induction of innate lymphoid cell-derived interleukin-22 by the transcription factor STAT3 mediates protection against intestinal infection. Immunity, 2014. 40(1): p. 25-39.;
Kortylewski, M., et al., Inhibiting Stat3 signaling in the hematopoietic system elicits multicomponent antitumor immunity. Nat Med, 2005. 11(12): p. 1314-21.;
Schwitalla, S., et al., Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell, 2013. 152(1-2): p. 25-38.;
Bollrath, J., et al., gp130-mediated Stat3 activation in enterocytes regulates cell survival and cell-cycle progression during colitis-associated tumorigenesis. Cancer Cell, 2009. 15(2): p. 91-102.
Putoczki, T.L., et al., Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically. Cancer Cell, 2013. 24(2): p. 257-71.
Заявленное изобретение представляет собой полноразмерное моноклональное человеческое антитело или фрагменты антитела (Fab-фрагмент, (Tab)2-фрагмент), связывающие IL-11 и стерически или аллостерически блокирующие дальнейшее связывание IL-11 с IL-11RA и/или gp130 и дальнейшее STAT3 сигналирование. Такие антитела-антагонисты могут быть применены в лечении ряда онкологических заболеваний, таких как рак кости, молочной железы, толстого кишечника, рака эндометрия, печени, легкого, яичника, поджелудочной железы, простаты, почки и желудка, а также других видов рака, обусловленных усиленным сигналированием через ось IL-11/IL-11/gp130/STAT3, на основе данных гистохимического анализа опухоли.
В настоящем изобретении описывается способ лечения ряда онкозаболеваний, таких как рак костей, молочной железы, толстого кишечника, рак эндометрия, печени, легкого, яичников, поджелудочной железы, простаты, почек и желудка, в которых наблюдается высокий уровень экспрессии IL-11 и/или IL-11RA, причем способ включает введение субъекту эффективного количества антитела-антагониста IL-11.
В заявленном изобретении используется терапевтически эффективное количество антитела, что означает достаточное количество антитела, обеспечивающее желаемый терапевтический или физиологический эффект, включая ингибирование IL-11/IL-11RA сигналирования. Ингибирующий эффект заключается в ингибировании активации сигнальных белков STAT3 и/или STAT1. Кроме того, терапевтический эффект может быть достигнут в виде ингибирования роста раковой опухоли, или рецессии раковой опухоли, блокирования метастазирования опухоли в другие ткани организма пациента. Настоящее изобретение касается использования описанного антитела-антагониста IL-11 (или фрагмента антитела) как в качестве монотерапии, так и совместно с другими лекарственными средствами, в виде интервенционной терапии или адъювантной терапии, как простой, так и неоадъвантной.
Другим аспектом настоящего изобретения является возможность использования приведенного антитела при лечении больных различными онкологическими заболеваниями. При высоких уровнях экспрессии IL-11 и/или IL-11RA у пациента предполагается использование антитела-антагониста IL-11 в таких концентрациях и условиях, чтобы предотвратить дальнейшее развитие раковой опухоли и метастазирование в другие ткани и органы пациента.
Краткое описание чертежей.
Настоящее изобретение иллюстрируется прилагаемыми чертежами, на которых:
Фигура 1 представляет собой изображение аминокислотных последовательностей IL-11 человека и яванской макаки, взятые из записей Р20809 и Р20808 базы данных UniProtKB, соответственно.
Фигура 2 отражает взаимодействие биотинилированных препаратов IL-11 человека и макаки, экспрессированных в различных экспрессионных системах (бактериальная и эукариотическая экспрессия IL-11 лиганда) с внеклеточным доменом IL-11RA человека, иммобилизованном на пластике, по данным иммуноферментного анализа. Данный пример отражает нативную структуру и функциональную активность лиганда и рецептора.
В таблице 2 приведены рассчитанные по данным ИФА из примера 2 величины ЕС50, свидетельствующие об их специфическом взаимодействии и функциональной активности:
Figure 00000003
Эти данные показывают, что белки IL-11 человека и макаки, полученные в бактериальной и эукариотической системах экспрессии, функциональны и способны взаимодействовать с рецептором IL-11, т.е. антитела получены к нативному лиганду.
Фигура 3 отражает гистограмму взаимодействия анти-IL-11 Fab-фрагментов антител с бактериально экспрессированными IL-11 человека и макаки и IL-6 в качестве негативного контроля, согласно данным метода иммуноферментного анализа (ELISA). Лиганды иммобилизованы на поверхности пластика (1 мкг/мл), антитело выступает в качестве аналита.
Фигура 4 отражает взаимодействие анти-IL-11 Fab-фрагмента L#1 с IL-11 человека, ковалентно пришит на поверхность GLH сенсор-чипа за аминогруппы, согласно данным метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Концентрации нанесения Fab-фрагментов в рабочем буфере: 20, 10 нМ. Отображены полученные сенсограммы и теоретические кривые, построенные в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы гетерогенного лиганда.
Фигура 5 отражает взаимодействие анти-IL-11 Fab-фрагмента L#2 с IL-11 человека, ковалентно пришитого на поверхность GLH сенсор-чипа за аминогруппы, согласно данным метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Концентрации нанесения Fab-фрагментов в рабочем буфере: 20, 5, 2.5 нМ. Отображены полученные сенсограммы и теоретические кривые, построенные в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы гетерогенного лиганда.
Фигура 6 отражает взаимодействие анти-IL-11 Fab-фрагмента U#1 с IL-11 человека, ковалентно пришитого на поверхность GLH сенсор-чипа за аминогруппы, согласно данным метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Концентрации нанесения Fab-фрагментов в рабочем буфере: 20, 5, 2.5 нМ. Отображены полученные сенсограммы и теоретические кривые, построенные в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы гетерогенного лиганда.
Фигура 7 отражает взаимодействие анти-IL-11 Fab-фрагмента U#3 с IL-11 человека, ковалентно пришитого на поверхность GLH сенсор-чипа за аминогруппы, согласно данным метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Концентрации нанесения Fab-фрагментов в рабочем буфере: 20, 5, 2.5 нМ. Отображены полученные сенсограммы и теоретические кривые, построенные в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы гетерогенного лиганда.
Фигура 8 отражает взаимодействие анти-IL-11 Fab-фрагмента U#4 с IL-11 человека, ковалентно пришитого на поверхность GLH сенсор-чипа за аминогруппы, согласно данным метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Концентрации нанесения Fab-фрагментов в рабочем буфере: 20, 5, 2.5 нМ. Отображены полученные сенсограммы и теоретические кривые, построенные в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы гетерогенного лиганда.
Фигура 9 отражает взаимодействие анти-IL-11 Fab-фрагмента U#13 с IL-11 человека, ковалентно пришитого на поверхность GLH сенсор-чипа за аминогруппы, согласно данным метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Концентрации нанесения Fab-фрагментов в рабочем буфере: 20, 10, 5, 2.5 нМ. Отображены полученные сенсограммы и теоретические кривые, построенные в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы гетерогенного лиганда.
Фигура 10 отражает взаимодействие анти-IL-11 Fab-фрагмента U#19 с IL-11 человека, ковалентно пришитого на поверхность GLH сенсор-чипа за аминогруппы, согласно данным метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Концентрации нанесения Fab-фрагментов в рабочем буфере: 20, 5, 2.5 нМ. Отображены полученные сенсограммы и теоретические кривые, построенные в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы гетерогенного лиганда.
В таблице 3 приведены константы взаимодействия анти-IL-11 Fab-фрагментов с IL-11 человека. Расчет проводился в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы гетерогенного лиганда.
kon - кинетическая константа ассоциации. koff - кинетическая константа диссоциации. KD - равновесная константа диссоциации.
Figure 00000004
Фигура 11 отражает взаимодействие анти-IL-11 полноразмерного антитела U#1 с IL-11 человека (верхняя панель) и макаки (нижняя панель). Лиганды ковалентно пришиты на поверхности сенсорного чипа GLH за аминогруппы, согласно методике проведения поверхностного плазмонного резонанса (ПГТР). Концентрации нанесения антител в рабочем буфере: 5.71, 2.86, 1.43 нМ. Отображены полученные сенсограммы и теоретические кривые, построенные в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы бивалентного аналита.
Фигура 12 отражает взаимодействие анти-IL-11 полноразмерного антитела U#3 с IL-11 человека (верхняя панель) и макаки (нижняя панель). Лиганды ковалентно пришиты на поверхности сенсорного чипа GLH за аминогруппы, согласно методике проведения поверхностного плазмонного резонанса (ПГТР). Концентрации нанесения антител в рабочем буфере: 3, 2, 1 мкМ. Отображены полученные сенсограммы и теоретические кривые, построенные в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы бивалентного аналита.
Фигура 13 отражает взаимодействие анти-IL-11 полноразмерного антитела U#4 с IL-11 человека (верхняя панель) и макаки (нижняя панель). Лиганды ковалентно пришиты на поверхности сенсорного чипа GLH за аминогруппы, согласно методике проведения поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Концентрации нанесения антител в рабочем буфере: 3,2 мкМ. Отображены полученные сенсограммы и теоретические кривые, построенные в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы бивалентного аналита.
Фигура 14 отражает взаимодействие анти-IL-11 полноразмерного антитела U#13 с IL-11 человека (верхняя панель) и макаки (нижняя панель). Лиганды ковалентно пришиты на поверхности сенсорного чипа GLH за аминогруппы, согласно методике проведения поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Концентрации нанесения антител в рабочем буфере: 15, 12.9, 8.57 нМ. Отображены полученные сенсограммы и теоретические кривые, построенные в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы бивалентного аналита.
Фигура 15 отражает взаимодействие анти-IL-11 полноразмерного антитела U#19 с IL-11 человека (верхняя панель) и макаки (нижняя панель). Лиганды ковалентно пришиты на поверхности сенсорного чипа GLH за аминогруппы, согласно методике проведения поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Концентрации нанесения антител в рабочем буфере: 30, 22.9, 14.4, 5.71 нМ. Отображены полученные сенсограммы и теоретические кривые, построенные в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы бивалентного аналита.
Фигура 16 отражает взаимодействие анти-IL-11 полноразмерного антитела L#1 с IL-11 человека (верхняя панель) и макаки (нижняя панель). Лиганды ковалентно пришиты на поверхности сенсорного чипа GLH за аминогруппы, согласно методике проведения поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Концентрации нанесения антител в рабочем буфере: 10, 8.57, 2.58 нМ. Отображены полученные сенсограммы и теоретические кривые, построенные в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы бивалентного аналита.
Фигура 17 отражает взаимодействие анти-IL-11 полноразмерного антитела L#2 с IL-11 человека (верхняя панель) и макаки (нижняя панель). Лиганды ковалентно пришиты на поверхности сенсорного чипа GLH за аминогруппы, согласно методике проведения поверхностного плазмонного резонанса (ПНР). Концентрации нанесения антител в рабочем буфере: 8.57, 5.71, 2.58 нМ. Отображены полученные сенсограммы и теоретические кривые, построенные в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы бивалентного аналита.
В таблице 4 приведены константы взаимодействия анти-IL-11 полноразмерных антител с IL-11 человека. Расчет проводился в программе ProteOn Manager 3.0 в рамках схемы бивалентного аналита. kon - кинетическая константа ассоциации. koff - кинетическая константа диссоциации. KD - равновесная константа диссоциации.
Figure 00000005
Figure 00000006
Кинетические константы характеризуют временные характеристики взаимодействия. Чем выше кинетическая константа ассоциации (kon), тем быстрее образуется комплекс антитела с IL-11. Чем ниже кинетическая константа диссоциации (koff), тем дольше происходит взаимодействие антитела с IL-11. Равновесная константа диссоциации (KD) характеризует концентрационные параметры взаимодействия. Чем ниже равновесная константа диссоциации, тем более низкий концентрационный диапазон, при котором происходит взаимодействие антитела с IL-11. Таким образом, наиболее быстро комплекс с IL-11 образуется у Fab-фрагментов U#3 и U#13 (таблица 3), а также у антитела U#3 (таблица 4). Наиболее долгоживущие комплексы между IL-11 и Fab-фрагментами образуются с U#3 и U#L2 (таблица 3), а между IL-11 и антителами с U#13 и U#3 (таблица 4). Исходя из равновесных констант диссоциации, наиболее сильное взаимодействие IL-11 происходит с Fab-фрагментом U#3 (таблица 3) и антителами U#13 и U#3 (таблица 4).
Фигура 18. Отображены сводные кинетические константы ассоциации анти-IL-11 полноразмерных антител с IL-11 человека (серый цвет) и макаки (черный цвет), согласно данным метода поверхностного плазмонного резонанса (ПГТР) (см. таблицу 4).
Фигура 19. Отображены сводные кинетические константы диссоциации анти-IL-11 полноразмерных антител с IL-11 человека (серый цвет) и макаки (черный цвет), согласно данным метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (см. таблицу 4).
Фигура 20. Отображены сводные равновесные константы диссоциации анти-IL-11 антител с IL-11 человека (серый цвет) и макаки (черный цвет), согласно данным метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (см. таблицу 4).
Фигура 21. Отображено конкурентное ингибирование анти-IL11 Fab-фрагментов антител связывания бактериально экспрессированного лиганда IL-11 человека с внеклеточным сегментом рецептора IL-11RA (Sino Biological Inc. cat #10252-H08H). методом конкурентного иммуноферментного анализа.
В таблице 5 приведены рассчитанные значения ингибирования от сигнала взаимодействия лиганда IL-11 с IL-11RA рецептором, принятых за 100%.
Figure 00000007
Фигура 22. Отображен график взаимодействия анти-IL-11 полноразмерных IgG1 антител с бактериально экспрессированным IL-11 человека (вверху) и макаки (внизу), согласно данным метода иммуноферментного анализа (ELISA). IL-11 иммобилизован на поверхности пластика (1 мкг/мл), антитело выступает в качестве аналита.
В таблице 6 приведены рассчитанные по графикам фигуры 22 значения эффективной концентрации (ЕС50).
Figure 00000008
На Фигуре 23 отображено ингибирование STAT3 сигналирования в линии клеток HEK-Blue IL-11, созданной на основе реагентного набора HEK-Blue™ IL-6 Cells компании InvivoGen (http://www.invivogen.com/hekblue-il6), и экспрессирующей полноразмерный ген IL-11RA, в присутствии IL-11 лиганда и различных концентраций анти-IL-11 полноразмерных IgG1 антител. В качестве контрольного антитела использовалось коммерческое терапевтическое полноразмерное антитело препарата Авастин®, не связывающееся с IL-11. Концентрация IL-11 человека 1 нг/мл (52 пМ). Каждая точка соответствует величине, усредненной по двум измерениям. Негативный контроль реакции приведен по уровню поглощения среды без добавления IL-11 лиганда.
Настоящее изобретение далее описано с помощью следующих, не ограничивающих его примеров. В примерах использованы следующие методы:
Пример 1.
Получение рекомбинантного IL-11 человека в бактериальной системе экспрессии описано в источнике [Kazakov, A.S., et al., High-affinity interaction between interleukin-11 and S100P protein. Biochem Bibphys Res Commum, 2015]. Рекомбинантный IL-11 человека в эукариотической системе экспрессии нарабатывался в виде гибридного белка с Fc доменом иммуноглобулина IgG1 человека. Белок был продуцирован в суспензионной культуре клеток линии СНО Ebna при помощи временной (транзиентной) системы экспрессии под управлением CMV промотора. Выделение белка из культуральной жидкости проводилось методом хроматографии на аффинном сорбенте ProteinA-sepharose (метод представляет собой стандартную рутинную операцию).
Пример 2.
Препарат рекомбинантного внеклеточного домена IL-11RA человека приобретен у компании Sino Biological Inc. (#10252-Н08Н).
Пример 3. Получение линии клеток млекопитающих (HEK-Blue IL-11), стабильно экспрессирующих IL-11RA, описано в источнике [Kazakov, A.S., et al., High-affinity interaction between interleukin-11 and S100P protein. Biochem Biophys Res Commum, 2015].
Для получение линии клеток млекопитающих HEK-Blue IL-11, стабильно экспрессирующих IL-11RA, ген рецептора IL-11Rα человека (Sino Biological Inc., #HG10252-М) был внесен в вектор pCMV-Script (Agilent Technologies) между сайтами рестрикции NotI и HindIII. Трансфекцию проводили используя TurboFect Transfection Reagent (Thermo Scientific, # R0532) с последующим отбором позитивных клонов с использованием Генетицина.
Пример 4.
Получение Fab-фрагментов антител проводили с использованием технологии фагового дисплея [Bazan, J., I. Calkosinski, and A. Gamian, Phage display-a powerful technique for immunotherapy: 1. Introduction and potential of therapeutic applications. Hum Vaccin Immunother, 2012. 8(12): p. 1817-28] на основе фаговых библиотек ООО «Антерикс», г. Пущино. Из исходного разнообразия 3-х фаговых библиотек, в ходе трех раундов селекции были отобраны фаговые частицы, содержащие на своей поверхности Fab-фрагменты антител, специфически связывающихся с IL-11 человека и макаки. Были использованы синтетические фаговые библиотеки Fab2h-library, Fab5h-library, Fab7h-library с разнообразием 7,2*Е9, 1,4*Е11 и 2,3*10Е11, соответственно) компании ООО «Антерикс», г. Пущино. Использованы две схемы селекции, отличающиеся порядком презентации антигенов (IL-11 человека - IL-11 макаки - IL-11 человека и IL-11 макаки - IL-11 человека - IL-11 человека). Полученный поликлональный фаг был переклонирован в вектор pLL4 для экспрессии в прокариотах Fab-фрагментов, несущих с-myc и 6XHis метки на С-конце. Проведены ИФА-скрининги отобранных Fab-фрагментов, секретированных в клетках Е. coli штамма BL-21(DE3), на предмет их специфичности к IL-11 человека и макаки. Выделение и очистку белка проводили с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии на аффинном сорбенте Profinity IMAC (Bio-Rad Laboratories, Inc.) согласно рекомендациям производителя.
Использованные в работе рутинные методы широко описаны в литературе (Barbas CF, Wagner J (October 1995). "Synthetic Human Antibodies: Selecting and Evolving Functional Proteins". Methods. 8(2): 94-103. doi:10.1006/meth.1995.9997; Barbas CF (August 1995). "Synthetic human antibodies". Nat. Med. 1(8): 837-9. doi: 10.1038/nm0895-837. PMID 7585190)
Пример 5.
Выбор функционально активных антител, блокирующих связывание IL-11 лиганда с внеклеточным доменом рецептора IL-11RA, проводили методом конкурентного ИФА [Wild, D., ed. The Immunbassay Handbook (Fourth edition). Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. 4 ed. 2013, Elsevier.].
Специфичность антитела определяется Fab-фрагментами, их функциональной активностью и специфичностью.
Белок IL11Ra рецептор (2 мкг/мл, 50 мкл/лунку) сорбировался на пластик (96-луночный планшет для иммуноферментного анализа). Меченый биотином лиганд IL-11 (50 нМ=1 мкг/мл) прединкубировался с соответствующим Fab-фрагментом антитела (300 нМ) в течение 30 минут и раствор переносился на Elisa-планшет. В контрольном образце раствор Fab-фрагмента заменен на буферный раствор. Сигнал Elisa взаимодействия лиганда IL-11 с рецептором в контрольном образце (без конкуренции) принимался за 100%. Падение сигнала Elisa в образцах в присутствии Fab-фрагментов антител от контрольного образца было выражено в процентах и отражало ингибирующую активность фрагментов антител (конкурентное связывание IL-11 лиганда фрагментом антитела, блокирующее связывание лиганда с рецептором). После подтверждения функциональной активности (способности блокировать взаимодействие лиганда с рецептором) Fab-фрагменты антител были конвертированы в формат полноразмерного антитела, как описано в примере 6.
Пример 6. Получение полноразмерных антител
Клонирование нуклеотидных последовательностей, кодирующих Fab-фрагменты антител, рассмотренных в Примере 4, проводили отдельно для легкой цепи (Lc) в вектор рТТ по сайтам рестрикции SalI, BsiWI (Pfl23II) и отдельно для тяжелой цепи (Hc) в вектор рТТ IgG1 по сайтам рестрикции NheI, SalI. Наработку антител проводили в системе транзиентной экспрессии в эукариотических клетках линии СНО-3Е7, адаптированных для продукции белков млекопитающих. Клетки СНО-3Е7 трансфицировали соответствующими плазмидами рТТ Lc и рТТ IgG1 Hc с использованием агента LPEI. Выделение и очистку антител из культуральной среды проводили с помощью аффинной хроматографии с использованием сорбента с иммобилизованным белком A (HiTrap Protein А FF, GE Healthcare Life Sciences), имеющим высокое сродство к иммуноглобулину G. Полученные антитела были диализованы и стерилизованы фильтрацией через 0,22 мкм фильтр. Чистота препаратов была оценена с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях. Сродство антител к IL-11 было проверено с помощью ИФА и спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса.
Использованные в работе рутинные методы широко описаны в литературе, в том числе [Wild, D., ed. The Immunoassay Handbook (Fourth edition). Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. 4 ed. 2013, Elsevier. Greenfield, E.A., Antibodies. A laboratory manual. Second edition, in A laboratory manual 2014.
Пример 7.
Исследование способности полноразмерных IgG1 антител подавлять IL-11-индуцированную активацию STAT3 в клетках HEK-Blue IL-11Ra человека, проводили аналогично методу, описанному в инструкции к набору HEK-Blue™ IL-6 Cells компании InvivoGen (http://www.invivogen.com/hekblue-il6).
Была приобретена коммерческая линия клеток HEK-Blue™ IL-6 (InvivoGen), в которых экспресс ируется SEAP репортерный ген, секретирующийся при активации STAT3 системы внутриклеточного сигналирования при активации IL6 рецептора в присутствии IL6 лиганда. Уровень экспрессии SEAP детектируется с помощью QUANTI-Blue™, т.е. при стимуляции клеток рекомбинантным человеческим IL-6 клетки вырабатывают и секретируют белок SEAP, катализирующий образование цветного продукта реакции.
На основе этой линии клеток мы разработали собственную линию клеток, экспрессирующих IL11Ra рецептор. Т.к. механизм внутриклеточного сигналирования у IL-6 и IL-11 рецепторов общий (STAT3 сигналирование), то клетки приобрели способность проявлять активацию обоих рецепторов (вместе или раздельно). В нашем эксперименте была показана активация IL-11 рецептора в присутствии лиганда IL-11 и ингибирование его активации в присутствии полноразмерных антител с аналогичной контрольной концентрации лиганда. Данные результаты демонстрируют способность разработанных антител ингибировать взаимодействие лиганда IL-11 с IL11Ra рецептором и таким образом понижать STAT3 внутриклеточное сигналирование.

Claims (7)

1. Терапевтическое антитело, ингибирующее связывание IL-11 с альфа-субъединицей рецептора интерлейкина-11 (IL-11RA) и сигналирование через его рецептор и связывание комплекса IL-11/IL-11RA с бета-субъединицей рецептора интерлейкина-6 (gpl30), в котором вариабельные домены тяжелой и легкой цепей содержат одну из следующих комбинаций аминокислотных последовательностей гипервариабельных участков:
Клон U#l: HCDR1: Phe Asn Thr Ser Ser Met Ser (SEQ ID NO: 1); HCDR2: Lys Ile Asn Ser Tyr Lys Ser Tyr Thr Asn (SEQ ID NO: 2); HCDR3: Lys Trp Tyr Trp Phe (SEQ ID NO: 3); LCDR1: Gln Ser Val Ser Ser Ser (SEQ ID NO: 4); LCDR2: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEQ ID NO: 5); LCDR3: Tyr Tyr Ser Tyr Pro Ile Thr (SEQ ID NO: 6), или
Клон U#3: HCDR1: Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His (SEQ ID NO: 7); HCDR2: Gly Ile Ala Pro Ala Ala Gly Ala Thr Asp (SEQ ID NO: 8); HCDR3: Glu Phe Trp Met Thr Phe Tyr Gly Phe (SEQ ID NO: 9); LCDR1: Gin Ser Val Ser Ser Ser (SEQ ID NO: 10); LCDR2: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEQ ID NO: 11); LCDR3: Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Pro Ile Thr (SEQ ID NO: 12), или
Клон U#4: HCDR1: Phe Ser Asn Tyr Trp Met Ser (SEQ ID NO: 13); HCDR2: Thr Ile Ala Ser Ser Asn Ser Tyr Thr Asp (SEQ ID NO: 14); HCDR3: Glu Ser Trp Ser Glu Gly Trp Trp Pro Ser Gly Phe (SEQ ID NO: 15); LCDR1: Gln Ser Val Ser Ser Ser (SEQ ID NO: 16); LCDR2: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEQ ID NO: 17); LCDR3: Tyr Glu Thr Ser Pro Ile Thr (SEQ ID NO: 18), или
Клон U#13: HCDR1: Phe Thr Gly Tyr Trp Met Asn (SEQ ID NO: 19); HCDR2: Ser Ile Ser Ser Tyr Gly Gly Gly Thr Tyr (SEQ ID NO: 20); HCDR3: Glu Ser Leu His Gln Leu Phe (SEQ ID NO: 21); LCDR1: Gln Ser Val Ser Ser Ser (SEQ ID NO: 22); LCDR2: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEQ ID NO: 23); LCDR3: Ser Tyr Ser Tyr Ala Pro Ile Thr (SEQ ID NO: 24), или
Клон U#19: HCDR1: Phe Ser Asn Tyr Thr Met Asn (SEQ ID NO: 25); HCDR2: Leu Ile Ser Ser Ser Tyr Ser Thr Thr Tyr (SEQ ID NO: 26); HCDR3: Lys Arg Ser Val Phe (SEQ ID NO: 27); LCDR1: Gln Ser Val Ser Ser Ser (SEQ ID NO. 28); LCDR2: Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEQ ID NO: 29); LCDR3: Tyr Glu Thr Ser Pro Ile Thr (SEQ ID NO: 30).
2. Применение терапевтического антитела по пп.1, 2 для лечения пациентов с онкологическими заболеваниями, при которых наблюдается высокий уровень экспрессии IL-11 и/или IL-11RA, заключающееся во введении страдающим заболеванием пациентам терапевтического антитела, обеспечивающего связывание IL11 лиганда и стерическую или аллостерическую блокировку дальнейшего связывания IL-11 с IL-11RA и/или gp130 и дальнейшего STAT3 сигналирования.
RU2019130673A 2019-09-18 2019-09-18 Терапевтическое антитело, специфичное к интерлейкину-11, ингибирующее сигналирование через его рецептор, и способ его использования для лечения пациентов RU2753973C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019130673A RU2753973C2 (ru) 2019-09-18 2019-09-18 Терапевтическое антитело, специфичное к интерлейкину-11, ингибирующее сигналирование через его рецептор, и способ его использования для лечения пациентов

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019130673A RU2753973C2 (ru) 2019-09-18 2019-09-18 Терапевтическое антитело, специфичное к интерлейкину-11, ингибирующее сигналирование через его рецептор, и способ его использования для лечения пациентов

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2019130673A3 RU2019130673A3 (ru) 2021-03-18
RU2019130673A RU2019130673A (ru) 2021-03-18
RU2753973C2 true RU2753973C2 (ru) 2021-08-25

Family

ID=74874021

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019130673A RU2753973C2 (ru) 2019-09-18 2019-09-18 Терапевтическое антитело, специфичное к интерлейкину-11, ингибирующее сигналирование через его рецептор, и способ его использования для лечения пациентов

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2753973C2 (ru)

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAMERON N.J. et al. Emerging roles for IL-11 signaling in cancer development and progression: Focus on breast cancer, Cytokine & Growth Factor Reviews, 2015, Vol.26, N5, pp.489-498. *
CAMERON N.J. et al. Emerging roles for IL-11 signaling in cancer development and progression: Focus on breast cancer, Cytokine & Growth Factor Reviews, 2015, Vol.26, N5, pp.489-498. PUTOCZKI T. L. et al. IL-11 signaling as a therapeutic target for cancer, Immunotherapy, 2015, Vol.7, N4, pp. 441-453. PUTOCZKI T.L. et al. Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically, Cancer Cell, 2013, Vol.24, N2, pp. 257-271. KORTYLEWSKI M. et al. Inhibiting Stat3 signaling in the hematopoietic system elicits multicomponent antitumor immunity, Nat Med, 2005, Vol.11, N12, pp. 1314-1321. СИНГЕР М. и др. Гены и геномы. М.: "Мир", 1998, т. 1, с. 63-64. *
KORTYLEWSKI M. et al. Inhibiting Stat3 signaling in the hematopoietic system elicits multicomponent antitumor immunity, Nat Med, 2005, Vol.11, N12, pp. 1314-1321. *
PUTOCZKI T. L. et al. IL-11 signaling as a therapeutic target for cancer, Immunotherapy, 2015, Vol.7, N4, pp. 441-453. *
PUTOCZKI T.L. et al. Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically, Cancer Cell, 2013, Vol.24, N2, pp. 257-271. *
СИНГЕР М. и др. Гены и геномы. М.: "Мир", 1998, т. 1, с. 63-64. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2019130673A3 (ru) 2021-03-18
RU2019130673A (ru) 2021-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6783886B2 (ja) 抗ｃｔｌａ４モノクローナル抗体またはその抗原結合断片、医薬組成物および使用
JP7082620B2 (ja) 抗ｐｄ１モノクローナル抗体、その医薬組成物およびその使用
JP7538721B2 (ja) 抗インターロイキン１７ａ抗体、医薬組成物、およびその使用
AU2008346517B2 (en) Anti MIF antibodies
JP2021512592A (ja) 完全ヒト化抗ｂ細胞成熟抗原（ｂｃｍａ）の単鎖抗体およびその応用
CN111182919B (zh) 抗cd137抗体
JP2021536242A (ja) 抗ｐｄ−１／抗ｖｅｇｆａ二官能性抗体、その医薬組成物およびその使用
EP3454903A1 (en) Novel angiopoietin 2, vegf dual antagonists
TWI756621B (zh) 新型雙特異性抗體分子以及同時結合pd-l1和lag-3的雙特異性抗體
KR102531577B1 (ko) Pcsk9 항체, 및 약제학적 조성물 및 이의 용도
TWI793395B (zh) 結合ｐｄ-ｌ１和ｏｘ４０的雙特異性抗體
KR20160021823A (ko) 렉틴-유사 산화된 ldl 수용체1 항체 및 사용 방법
JP2023530003A (ja) 抗Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体およびその使用
CN114539411A (zh) 一种ror1抗体或其抗原结合片段
KR20230079165A (ko) 항-클라우딘18.2 및 cd3 이특이적 항체 및 이의 용도
JP7245358B2 (ja) 抗ｃｄ２５抗体及びその適用
KR20190017740A (ko) 플렉틴-1 결합 항체 및 그의 용도
RU2753973C2 (ru) Терапевтическое антитело, специфичное к интерлейкину-11, ингибирующее сигналирование через его рецептор, и способ его использования для лечения пациентов
JP2024534706A (ja) 二重特異性抗体及びその使用
KR20230124001A (ko) Cd47을 표적으로 하는 항체 및 이의 응용
TW202227504A (zh) 抗ｅｒｂｂ３抗體或其抗原結合片段及其醫藥用途
US20240174741A1 (en) Il-38-specific antibodies
CN113164601B (zh) 一种分离的抗原结合蛋白及其用途
AU2021362977A1 (en) Anti-trop-2 antibody, antigen-binding fragment thereof or mutant thereof, and medical use thereof
CN118475616A (zh) 抗trem2全人源抗体或其抗原结合片段及其应用