RU2752906C2

RU2752906C2 - Nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neuronal progenitor cells under heat shock and method for production thereof

Info

Publication number: RU2752906C2
Application number: RU2019144080A
Authority: RU
Inventors: Вадимович Гольдштейн Дмитрий; Сергей Львович Киселев; Константин Никитич Ярыгин; Татьяна Борисовна Бухарова; Дарья Дмитриевна Наместникова; Олег Владимирович Махнач; Диана Ирековна Салихова; Георгий Евгеньевич Леонов; Виктория Олеговна Мокроусова; Тимур Хайсамудинович Фатхудинов; Андрей Витальевич Макаров; Лариса Петровна Некрасова
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2021-08-11
Also published as: RU2019144080A; RU2019144080A3

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology, particularly to a method for producing a nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neuronal progenitor cells under heat shock. Said composition is characterised by the fact that it contains proteins and polypeptides with a molecular weight from 3 kDa to 250 kDa, 60% whereof have a molecular weight in the range from 10 to 50 kDa, brain-derived neurotrophic factor (BDNF) no less than 120 pg/ml, and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) no less than 40 pg/ml, vascular endothelial growth factor (VEGF) not less than 60 pg/ml, total protein weight no less than 1 mg/ml of the preparation. The cell culture of neuronal progenitor cells therein, wherefrom the composition is produced, demonstrates the expression of a β3-tubulin neuronal marker, a nerve cell adhesion molecule (PSA-NCAM), and consists of 99.5±2.45% TUBB3⁺ cells.

EFFECT: invention allows effectively producing a protein-peptide composition including not only small peptides, but also full-size protein neuronal growth and differentiation factors the effectiveness whereof is invariably higher than in short peptides and immunogenicity is not present.

2 cl, 2 dwg, 4 ex

Description

В лечении заболеваний центральной нервной системы большие надежды возлагают на технологии, основанные на применении индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), которые могут быть получены из зрелой соматической клетки путем трансдукции определенными генами [Некрасов Е.Д. и др., 2011]. Использование данных технологий позволяет получать аутогенные нейрональные и астроглиальные предшественники для применения в комплексном лечении нейродегенеративных заболеваний. Для разработки методов лечения с использованием ИПСК и внедрения продуктов на их основе в клиническую практику необходимы экспериментальные и предклинические исследования, направленные на выяснение молекулярных механизмов действия, определение популяций клеток с наибольшим терапевтическим эффектом, исследование дозозависимых эффектов, кратности введения и др. [Kim S.U. et all, 2009]. Современные протоколы дифференцировки ИПСК позволяют получать как нейроны, так и глиальные клетки [Chambers S.М. et all, 2009; Madhu V. et all, 2016; Wechsler-Reya R.J. et all, 1999; Hughes S.M. et al., 1988; Song M.R., 2004]. До недавних пор основное внимание в терапии нейродегенеративных заболеваний уделялось нейропротекции, поскольку считалось, что в ЦНС не происходит регенерации. Однако в последнее время стали появляться исследования, которые свидетельствуют о репаративных процессах в ЦНС в постнатальном периоде. Выяснилось, что в головном мозге существуют нейральные стволовые клетки (НСК), которые сосредоточены в субвентрикулярной зоне боковых желудочков и зубчатой извилине гиппокампа [Eriksson, P.S. et all 1998]. Повреждение головного мозга оказывает стимулирующее воздействие на пролиферативную активность НСК, их миграцию в зону повреждения и последующую дифференцировку в нейрональные и глиальные клетки, заместительная способность которых составляет только 0,2% от числа погибших клеток [Mattson М.Р. et all, 2000; Kernie S.G. et all, 2010]. Следующим этапом репаративного процесса является реорганизация нейрональной сети за счет пластичности нейронов. Данный процесс характеризуется изменением количества и длины нейрональных отростков и установлением новых синаптических связей [

Et all, 2017]. Неотъемлемыми частью репаративных процессов является также восстановление ГЭБ и неоваскуляризация [Xiong, Y. et all, 2010; Prakash R. et all, 2015]. Данные факты о способности ЦНС к репарации позволяют сделать заключение, что регенерация является важным механизмом неврологического восстановления после повреждения и является новой мишенью терапевтических воздействий. Клеточная терапия, как новое направление в терапии нейродегенеративных заболеваний, послужила основой для активного развития новых терапевтических стратегий лечения инсульта на основе применения стволовых клеток (СК). Однако долгое время клеточные технологии подвергались критике из-за отсутствия единой специфической мишени и понимания механизмов действия клеточного трансплантата. На сегодняшний день существует много данных о применении постнатальных клеток костного мозга, таких как гемопоэтические стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, эндотелиальные клетки-предшественники, а также фетальных стволовых клеток, которые оказывают терапевтическое действие при нейродегенеративных заболеваниях [Quittet М.S. et al., 2015; Giraldi-Guimaraes, et all, 2009; Napoli E. et all, 2016]. В последние годы была продемонстрирована способность стволовых клеток секретировать биологически активные вещества, которые положительно влияют на течение многих нейродегенеративных заболеваний. Кондиционированные среды (КС) являются источником большого количества паракринных факторов, в том числе нейротрофинов (BDNF, GDNF, NGF, NT3-5, CNTF и др), цитокинов [Prospect of Stem Cell Conditioned Medium in Regenerative Medicine. Jeanne Adiwinata Pawitan. BioMed Research International 2014, Article ID 965849], экзосом [Microvesicles from brain-extracttreated mesenchymal stem cells improve neurological functions in a rat model of ischemic stroke. Ji Yong Lee, Eiru Kim, Seong-Mi Choi, Dong-Wook Kim, Kwang Pyo Kim, Insuk Lee & Han-Soo Kim. Scientific Reports. Published: 09 September 2016] и способны оказывать комплексное воздействие при различных патологиях. Существуют результаты многочисленных исследований, свидетельствующие о важности роли нейротрофинов в развитии болезни Альцгеймера, и их способности оказывать нейропротекторное, антиапоптотическое, нейротрофическое воздействие. Цитокины, находящиеся в КС, способны оказывать противовоспалительное действие. Экзосомы, также содержащиеся в КС, могут влиять на элиминацию бета-амилоида из ткани мозга [Exosomes as Carriers of Alzheimer's Amyloid-β. Kohei Yuyama and Yasuyuki Igarashi Front. Neurosci., 25 April 2017]. Показано, что КС нейральных стволовых клеток (НСК) ингибировала апоптоз клеток SH-SY5Y в культуре, а также увеличивала процент дифференцированных клеток при совместном применении с ретиноевой кислотой [Human neural stem cell transplantation improves cognition in a murine model of Alzheimer's disease. Lisa M. McGinley1, Osama N. Kashlan2, Elizabeth S. Bruno1, Kevin S. Chen2, John M. Hayes1, Samy R. Kashlan1, Julia Raykin3, Karl Johe4, Geoffrey G. Murphy5 & Eva L. Feldman1. Scientific Reports, Article number: 14776 (2018)].In the treatment of diseases of the central nervous system, great hopes are placed on technologies based on the use of induced pluripotent stem cells (iPSCs), which can be obtained from a mature somatic cell by transduction with certain genes [Nekrasov E.D. et al., 2011]. The use of these technologies makes it possible to obtain autogenous neuronal and astroglial precursors for use in the complex treatment of neurodegenerative diseases. For the development of treatment methods using iPSCs and the introduction of products based on them into clinical practice, experimental and preclinical studies are needed to elucidate the molecular mechanisms of action, determine the cell populations with the greatest therapeutic effect, study dose-dependent effects, frequency of administration, etc. [Kim SU et all, 2009]. Modern protocols for iPSC differentiation make it possible to obtain both neurons and glial cells [Chambers S.M. et all 2009; Madhu V. et all, 2016; Wechsler-Reya RJ et all, 1999; Hughes SM et al., 1988; Song MR, 2004]. Until recently, the main focus in the treatment of neurodegenerative diseases was on neuroprotection, since it was believed that regeneration does not occur in the central nervous system. Recently, however, studies have begun to appear that indicate reparative processes in the central nervous system in the postnatal period. It was found that the brain contains neural stem cells (NSC), which are concentrated in the subventricular zone of the lateral ventricles and the dentate gyrus of the hippocampus [Eriksson, PS et all 1998]. Brain damage has a stimulating effect on the proliferative activity of NSCs, their migration to the damaged area and subsequent differentiation into neuronal and glial cells, the replacement capacity of which is only 0.2% of the number of dead cells [Mattson M.R. et all, 2000; Kernie SG et all, 2010]. The next stage of the reparative process is the reorganization of the neural network due to the plasticity of neurons. This process is characterized by a change in the number and length of neuronal processes and the establishment of new synaptic connections [

Et all, 2017]. An integral part of the reparative processes is also the restoration of the BBB and neovascularization [Xiong, Y. et all, 2010; Prakash R. et all, 2015]. These facts about the ability of the central nervous system to repair allow us to conclude that regeneration is an important mechanism of neurological recovery after injury and is a new target for therapeutic interventions. Cell therapy, as a new direction in the treatment of neurodegenerative diseases, served as the basis for the active development of new therapeutic strategies for treating stroke based on the use of stem cells (SC). However, for a long time, cell technologies have been criticized due to the lack of a single specific target and understanding of the mechanisms of action of a cell transplant. To date, there is a lot of data on the use of postnatal bone marrow cells, such as hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, endothelial progenitor cells, as well as fetal stem cells, which have a therapeutic effect in neurodegenerative diseases [Quittet M.S. et al., 2015; Giraldi-Guimaraes, et all, 2009; Napoli E. et all, 2016]. In recent years, the ability of stem cells to secrete biologically active substances has been demonstrated, which have a positive effect on the course of many neurodegenerative diseases. Conditioned media (CC) are a source of a large number of paracrine factors, including neurotrophins (BDNF, GDNF, NGF, NT3-5, CNTF, etc.), cytokines [Prospect of Stem Cell Conditioned Medium in Regenerative Medicine. Jeanne Adiwinata Pawitan. BioMed Research International 2014, Article ID 965849], exosomes [Microvesicles from brain-extracttreated mesenchymal stem cells improve neurological functions in a rat model of ischemic stroke. Ji Yong Lee, Eiru Kim, Seong-Mi Choi, Dong-Wook Kim, Kwang Pyo Kim, Insuk Lee & Han-Soo Kim. Scientific Reports. Published: 09 September 2016] and are capable of providing a complex effect for various pathologies. There are the results of numerous studies indicating the importance of the role of neurotrophins in the development of Alzheimer's disease, and their ability to exert neuroprotective, antiapoptotic, neurotrophic effects. Cytokines in the CS are capable of anti-inflammatory effects. Exosomes, also contained in the CS, can influence the elimination of beta-amyloid from brain tissue [Exosomes as Carriers of Alzheimer's Amyloid-β. Kohei Yuyama and Yasuyuki Igarashi Front. Neurosci., 25 April 2017]. It was shown that CS of neural stem cells (NSC) inhibited apoptosis of SH-SY5Y cells in culture, and also increased the percentage of differentiated cells when combined with retinoic acid [Human neural stem cell transplantation improves cognition in a murine model of Alzheimer's disease. Lisa M. McGinley1, Osama N. Kashlan2, Elizabeth S. Bruno1, Kevin S. Chen2, John M. Hayes1, Samy R. Kashlan1, Julia Raykin3, Karl Johe4, Geoffrey G. Murphy5 & Eva L. Feldman1. Scientific Reports, Article number: 14776 (2018)].

Существуют данные, подтверждающие эффективность КС в моделях in vivo при неврологических заболеваниях, таких как ишемический инсульт - при введении КС НСК крысам с моделированным ишемическим инсультом показатели оценки неврологического статуса были выше, чем в контрольной группе, объем инфаркта снижался, по сравнению с контролем, так же были исследованы изменение уровня апоптотической активности методом TUNEL, который так же показал снижение клеточной гибели [Neural Stem Cell-Conditioned Medium Ameliorated Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury in Rats HongNa Yang, Cuilan Wang, Hui Chen, Lan Li, Shuang Ma, Hao Wang, YaRu Fu, and Tingyu Qu. Stem Cells International. Published April 2018]. В модели спинальной травмы изучали действие КС НСК на жизнеспособность нейронов и регенерацию аксонов кортикоспинального тракта. Применение КС приводило к экстенсивному росту аксонов в шейном отделе и более чем утроило образование синаптических контактов между коллатералями кортикоспинального тракта и проприоспинальными интернейронами. КС также уменьшала экспрессию каспазы 3 и снижала гибель нейронов через 6 недель после травмы [Neural Stem Cell-Conditioned Medium Protects Neurons and Promotes Propriospinal Neurons Relay Neural Circuit Reconnection After Spinal Cord Injury. Peng Liang, Jiaren Liu, Jinsheng Xiong, Qing Liu, Jiaxin Zhao, Hongsheng Liang, Liwei Zhao, and Haitao Tang. Cell Transplantation, Vol. 23, Supplement 1, pp. S45-S56, 2014]. Кондиционированная среда мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани в модели подвешивания за хвост восстанавливала сокращенное время неподвижности у трасгенных мышей 5xFAD до нормального уровня, таким образом оказывая антидепрессивное воздействие путем ингибирования Akt-сигнального пути и активации GSK-3β [Adipose-derived stem cell-conditioned medium ameliorates antidepression-related behaviors in the mouse model of Alzheimer's disease. Hiromitsu Yamazaki, Yu Jin, Ayako Tsuchiya, Takeshi Kanno, Tomoyuki Nishizaki. Neuroscience Letters. Available online 17 October 2015]. КС мезенхимальных стволовых клеток пульпы зуба была протестирована на модели экзогенного амилоидоза - интраназальное введение КС этого типа клеток привело к значительному улучшению когнитивных функций. Методом вестерн блотта и ПЦР в реальном времени оценивали маркеры, отвечающие за нейропротекцию, нейритогенез и противоспалительное действие на микроглию [Conditioned medium from the stem cells of human dental pulp improves cognitive function in a mouse model of Alzheimer's disease. Tsuneyuki Mitaa, Yoko Furukawa-Hibib, Hideyuki Takeuchic, Hisashi Hattoria, Kiyofumi Yamadab, Hideharu Hibia, Minoru Uedaa, Akihito Yamamotoa, Behavioural Brain Research. Available online 22 July 2015].There are data confirming the effectiveness of CS in in vivo models for neurological diseases, such as ischemic stroke - when CS NSC was administered to rats with simulated ischemic stroke, the indicators for assessing the neurological status were higher than in the control group, the volume of infarction decreased compared to the control, so the same changes in the level of apoptotic activity were studied by the TUNEL method, which also showed a decrease in cell death [Neural Stem Cell-Conditioned Medium Ameliorated Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury in Rats HongNa Yang, Cuilan Wang, Hui Chen, Lan Li, Shuang Ma, Hao Wang, YaRu Fu, and Tingyu Qu. Stem Cells International. Published April 2018]. In the model of spinal trauma, the effect of CS NSC on the viability of neurons and regeneration of axons of the corticospinal tract was studied. The use of CS led to extensive growth of axons in the cervical spine and more than tripled the formation of synaptic contacts between collaterals of the corticospinal tract and propriospinal interneurons. CS also reduced caspase 3 expression and decreased neuronal death 6 weeks after injury [Neural Stem Cell-Conditioned Medium Protects Neurons and Promotes Propriospinal Neurons Relay Neural Circuit Reconnection After Spinal Cord Injury. Peng Liang, Jiaren Liu, Jinsheng Xiong, Qing Liu, Jiaxin Zhao, Hongsheng Liang, Liwei Zhao, and Haitao Tang. Cell Transplantation, Vol. 23, Supplement 1, pp. S45-S56, 2014]. The conditioned medium of adipose tissue mesenchymal stem cells in the tail suspension model restored the reduced immobility time in 5xFAD transgenic mice to normal levels, thus exerting antidepressant effects by inhibiting the Akt signaling pathway and activating GSK-3β [Adipose-derived stem cell-conditioned medium ameliorates antidepression-related behaviors in the mouse model of Alzheimer's disease. Hiromitsu Yamazaki, Yu Jin, Ayako Tsuchiya, Takeshi Kanno, Tomoyuki Nishizaki. Neuroscience Letters. Available online 17 October 2015]. CS of mesenchymal stem cells of the dental pulp was tested on a model of exogenous amyloidosis - intranasal administration of CS of this type of cells led to a significant improvement in cognitive functions. Western blotting and real-time PCR were used to assess markers responsible for neuroprotection, neuritogenesis and anti-inflammatory effects on microglia [Conditioned medium from the stem cells of human dental pulp improves cognitive function in a mouse model of Alzheimer's disease. Tsuneyuki Mitaa, Yoko Furukawa-Hibib, Hideyuki Takeuchic, Hisashi Hattoria, Kiyofumi Yamadab, Hideharu Hibia, Minoru Uedaa, Akihito Yamamotoa, Behavioral Brain Research. Available online 22 July 2015].

Также проведенные клинические испытания пептидного препарата Церебролизин, содержащего аминокислоты и полипептиды молекулярной массой до 10 кДа, свидетельствуют о его эффективности при сосудистых деменциях [Cerebrolysin for vascular dementia. Chen N, Yang M, Guo J, Zhou M, Zhu C, He L. Cochrane Database Syst Rev. 2013 Jan 31]. Более того, в последнее время появились данные о нейропротекторных свойствах белков теплового шока и возможной их секреции из клеток в окружающую среду. Предположительно, секреция белков теплового шока стволовыми и прогениторными клетками при воздействии повышенной температуры должна усилить нейропротекторное действие.Also, clinical trials of the peptide preparation Cerebrolysin containing amino acids and polypeptides with molecular weight up to 10 kDa indicate its effectiveness in vascular dementia [Cerebrolysin for vascular dementia. Chen N, Yang M, Guo J, Zhou M, Zhu C, He L. Cochrane Database Syst Rev. 2013 Jan 31]. Moreover, recently there have been data on the neuroprotective properties of heat shock proteins and their possible secretion from cells into the environment. Presumably, the secretion of heat shock proteins by stem and progenitor cells when exposed to elevated temperatures should enhance the neuroprotective effect.

В настоящее время ИПСК рассматриваются как самый перспективный источник нейральных предшественников для регенеративной медицины, позволяющий получать клеточные популяции различных типов на разных, заранее запланированных этапах эмбрионального развития. И при этом проблемы дефицита донорского материала и этические вопросы, возникающие при применении эмбрионального материала и культур эмбриональных стволовых клеток, полностью отсутствуют. Получение ИПСК уже стало рутинной задачей, хотя экспериментальные исследования проводятся только последние 10 лет. В результате экспериментов по ретровирусной трансдукции генами различных транскрипционных факторов мышиных фибробластов были идентифицированы 4 гена - Oct-4, Sox2, с-Мус и Klf4, которые переводили их в плюрипотентное состояние. Клетки, полученные таким образом, назвали индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК) [Takahashi K., Yamanaka S. 2006]. Затем ИПСК были успешно получены из фибробластов человека с использованием того же набора транскрипционных факторов [Takahashi K. et al., 2007]. Другой научной группой были получены ИПСК человека с использованием иного набора транскрипционных факторов: Oct4, Sox2, Nanog и Lin28 [Yu J. et al., 2007]. Дальнейшие исследования продемонстрировали возможность получения ИПСК как от различных млекопитающих: крыс [Li W. et al., 2009], макак-резусов [Liu Н. et al., 2008], свиней [Kwon D.-J. et al., 2013]; так и из различных типов соматических клеток человека: кератиноцитов [Aasen Т. et al., 2008], нейрональных клеток [Eminli S. et al., 2008.], клеток печени и клеток желудка [Aoi, 2008], терминально дифференцированных лимфоцитов, а также из эндотелия [Lagarkova М.А. et al., 2010]. Эти исследования продемонстрировали универсальность процесса репрограммирования соматических клеток до плюрипотентного состояния с помощью введения в клетки генов транскрипционных факторов. Целый ряд подходов был разработан для того чтобы доставлять репрограммирующие факторы в соматические клетки. Были также продемонстрированы и другие методы репрограммирования соматических клеток до плюрипотентного состояния без интеграции экзогенной ДНК в геном клетки-хозяина: с использованием piggyBac транспозона [Woltjen K. et al., 2009], синтетической РНК, аденовирусных векторов [Zhou W., Freed C.R., 2009], вируса Сендай [Fusaki N. et al., 2009], эписомных векторов [Yu J. et al., 2009], белков [Kim D. et al., 2009]. Тесты на способность к дифференцировке считают ключевыми в доказательстве плюрипотентности клеток. Для ИПСК человека в качестве основных тестов используются in vitro дифференцировки, формирование тератом при введении иммунодефицитным мышам и способность к образованию эмбриоидных телец. Плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) обладают естественным свойством дифференцироваться во все типы клеток взрослого организма, но важнейшей экспериментальной задачей является осуществление дифференцировки плюрипотентных клеток in vitro в нужном направлении с использованием специальных условий культивирования, биологически активных химических соединений и белковых факторов. Эффективный метод дифференцировки ИПСК в нейральном направлении основан на блокировании BMP и TGF-β сигнальных путей такими молекулами, как Noggin, дорсоморфин, SB431542 и LDN193189 на ранних стадиях дифференцировки [Fingar D.С., et al., 2004]. Такой подход при длительном культивировании позволил получить до 90% клеток, которые экспрессировали маркеры нейроэктодермы РАХ6 и PSA-NCAM (молекула адгезии нервных клеток). Для дальнейшей дифференцировки в нейрональные предшественники необходима активация Shh сигнального пути, а также добавление в среду для культивирования фактора роста фибробластов FGF2. Полученные таким образом предшественники экспрессируют маркер незрелых нейронов β-тубулин III. Рутинный способ получения ИПСК, а также существование известных методов дифференцировки ИПСК в нейральном направлении делают применение нейрональных предшественников наиболее перспективными кандидатами при терапии ИИ. Возможность эффективной экспансии ИПСК позволит решить проблему дефицита донорского материала и снять ряд этических вопрос. На сегодняшний день большое количество научных групп ведут разработки в области нейральной дифференцировке ИПСК. Основными лидерами по данному направлению являются институт генетических болезней и геномных наук, Токио, Япония (Department of Genetic Diseases and Genomic Science, The Jikei University School of Medicine, Tokyo, Japan); Центр исследования и применения ИПСК, Университет Киото, Япония (Centre for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Japan); Центр клеточной биологии, Китай (Department of Cell Biology, Xuanwu Hospital of Capital Medical University, Beijing, China). Данные лаборатории проводят передовые исследования по дифференцировке ИПСК, рационализируют и создают протоколы дифференцировки ИПСК. Кроме того, проводятся экспериментальные разработки по введению дифференцированных в нейральном направлении ИПСК в органы-мишени. В этой связи стоит отметить Лабораторию Института Биоинженерии и нанотехнологии, Сингапур (Institute of Bioengineering and Nanotechnology, 31 Biopolis Way, The Nanos, Singapore 138669, Singapore), осуществляющую инновационные разработки в области дифференцировки ИПСК, и методов целенаправленной доставки в органы-мишени дифференцированных клеток, с использованием 3D микрофиброзных капсул, которые увеличивают эффективность доставки. Европейские лаборатории и лаборатории США, Канады занимают лидирующее положение по общему количеству проведенных исследовательских работ в области нейральной дифференцировки ИПСК. При изучении литературы часто встречаются современные разработки лаборатории Центра Генетики Университета шт. Висконсин совместно с институтом биомедицинских исследований, Кэмбридж (Waisman Center, Genome Center, Department of Anatomy, and Department of Neurology, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin, Madison. Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge). В данных работах можно отметить передовые исследования по поиску новых регуляторных механизмов в области нейральной дифференцировки ИПСК.At present, iPSCs are considered as the most promising source of neural precursors for regenerative medicine, which makes it possible to obtain cell populations of various types at different, pre-planned stages of embryonic development. And at the same time, the problems of shortage of donor material and ethical issues arising from the use of embryonic material and cultures of embryonic stem cells are completely absent. The production of iPSCs has already become a routine task, although experimental studies have been carried out only for the last 10 years. As a result of experiments on retroviral transduction by genes of various transcription factors of mouse fibroblasts, 4 genes, Oct-4, Sox2, c-Myc, and Klf4, were identified, which translated them into a pluripotent state. The cells obtained in this way were called induced pluripotent stem cells (iPSCs) [Takahashi K., Yamanaka S. 2006]. Then iPSCs were successfully obtained from human fibroblasts using the same set of transcription factors [Takahashi K. et al., 2007]. Another scientific group obtained human iPSCs using a different set of transcription factors: Oct4, Sox2, Nanog and Lin28 [Yu J. et al., 2007]. Further studies have demonstrated the possibility of obtaining iPSCs both from various mammals: rats [Li W. et al., 2009], rhesus monkeys [Liu N. et al., 2008], pigs [Kwon D.-J. et al., 2013]; and from various types of human somatic cells: keratinocytes [Aasen T. et al., 2008], neuronal cells [Eminli S. et al., 2008.], liver and stomach cells [Aoi, 2008], terminally differentiated lymphocytes, as well as from the endothelium [Lagarkova MA et al., 2010]. These studies have demonstrated the versatility of the process of reprogramming somatic cells to a pluripotent state by introducing transcription factor genes into cells. A variety of approaches have been developed to deliver reprogramming factors to somatic cells. Were also demonstrated other methods of reprogramming somatic cells to a pluripotent state without integrating exogenous DNA into the host cell genome: using piggyBac transposon [Woltjen K. et al., 2009], synthetic RNA, adenoviral vectors [Zhou W., Freed CR, 2009], Sendai virus [Fusaki N. et al., 2009], episomal vectors [Yu J. et al., 2009], proteins [Kim D. et al., 2009]. Differentiation tests are considered key in proving cell pluripotency. For human iPSCs, in vitro differentiation, the formation of teratomas when administered to immunodeficient mice, and the ability to form embryoid bodies are used as the main tests. Pluripotent stem cells (PSCs) have a natural property to differentiate into all types of adult cells, but the most important experimental task is to differentiate pluripotent cells in vitro in the desired direction using special cultivation conditions, biologically active chemical compounds and protein factors. An effective method of iPSC differentiation in the neural direction is based on blocking BMP and TGF-β signaling pathways by molecules such as Noggin, dorsomorphin, SB431542 and LDN193189 at the early stages of differentiation [Fingar D.C., et al., 2004]. This approach, with long-term cultivation, made it possible to obtain up to 90% of cells that expressed the neuroectoderm markers PAX6 and PSA-NCAM (nerve cell adhesion molecule). Further differentiation into neuronal progenitors requires activation of the Shh signaling pathway, as well as the addition of fibroblast growth factor FGF2 to the culture medium. The precursors thus obtained express the immature neuron marker β-tubulin III. The routine method of producing iPSCs, as well as the existence of known methods for differentiating iPSCs in the neural direction, make the use of neuronal precursors the most promising candidates for IS therapy. The possibility of effective expansion of iPSCs will solve the problem of the shortage of donor material and remove a number of ethical issues. Today, a large number of research groups are developing in the field of neural differentiation of iPSCs. The main leaders in this area are the Institute of Genetic Diseases and Genomic Science, The Jikei University School of Medicine, Tokyo, Japan; Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Japan; Center for Cell Biology, China (Department of Cell Biology, Xuanwu Hospital of Capital Medical University, Beijing, China). These laboratories conduct cutting-edge research on iPSC differentiation, streamline and create iPSC differentiation protocols. In addition, experimental developments are underway to introduce neurally differentiated iPSCs into target organs. In this regard, it is worth noting the Laboratory of the Institute of Bioengineering and Nanotechnology, 31 Biopolis Way, The Nanos, Singapore 138669, Singapore, which carries out innovative developments in the field of iPSC differentiation, and methods of targeted delivery of differentiated cells to target organs. , using 3D microfiber capsules that increase delivery efficiency. European laboratories and laboratories in the USA and Canada occupy a leading position in the total number of research works in the field of neural differentiation of iPSCs. When studying the literature, modern developments of the laboratory of the Genetics Center of the University of St. Wisconsin in collaboration with the Institute for Biomedical Research, Cambridge (Waisman Center, Genome Center, Department of Anatomy, and Department of Neurology, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin, Madison. Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge). In these works, one can note the advanced research on the search for new regulatory mechanisms in the field of neural differentiation of iPSCs.

Основная причина, ограничивающая эффективность и безопасность всех существующих нейропептидных препаратов, полученных из головного мозга млекопитающих - это их ксеногенное происхождение. При выделении нейропептидов из тканей головного мозга животных для снижения их иммуногенности (антигенных свойств) прибегают к кислотному или ферментативному гидролизу белков и высокомолекулярных полипептидов, тем самым уменьшая количество нейротрофических факторов роста белковой и полипептидной природы [Хабриева. У., 2005]. Пептидный препарат, полученный таким способом, содержит денатурированные продукты кислотного гидролиза белков и полипептидов с нарушенной четвертичной и третичной структурой, что снижает его специфичность и биологическую активность, повышает его иммуногенность, вызывая аллергические реакции при применении.The main reason limiting the effectiveness and safety of all existing neuropeptide drugs derived from the mammalian brain is their xenogenic origin. When isolating neuropeptides from brain tissues of animals to reduce their immunogenicity (antigenic properties), they resort to acidic or enzymatic hydrolysis of proteins and high molecular weight polypeptides, thereby reducing the amount of neurotrophic growth factors of protein and polypeptide nature [Khabrieva. U., 2005]. The peptide preparation obtained in this way contains denatured products of acid hydrolysis of proteins and polypeptides with a disturbed quaternary and tertiary structure, which reduces its specificity and biological activity, increases its immunogenicity, causing allergic reactions when applied.

Для решения данной проблемы нами предложено получить белково-пептидную композицию с выраженными ноотропными свойствами из секретома глиальных прогениторных клеток в условиях гипоксии, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Данная композиция характеризуется тем, что в ее состав входят белки и полипептиды с молекулярной массой от 3 кДа до 250 кДа, из которых 65% имеют молекулярную массу в диапазоне от 10 до 60 кДа, содержание белки теплого шока не менее 40% от общей массы белков, мозговой нейротрофический фактор (BDNF) не менее 140 пг/мл и глиального нейротрофического фактора (GDNF) не менее 60 пг/мл, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) не менее 80 пг/мл, суммарная масса белка не менее 1 мг/мл препарата, при этом клеточная культура глиальных прогениторных клеток, из которой получают композицию, демонстрирует экспрессию астроглиальных маркеров S100b, GFAP и состоит из 98±2% S100b⁺ - клеток.To solve this problem, we proposed to obtain a protein-peptide composition with pronounced nootropic properties from the secretome of glial progenitor cells under hypoxic conditions, obtained by the method of directed differentiation of induced human pluripotent stem cells. This composition is characterized by the fact that it contains proteins and polypeptides with a molecular weight from 3 kDa to 250 kDa, of which 65% have a molecular weight in the range from 10 to 60 kDa, the content of warm shock proteins is not less than 40% of the total weight of proteins , brain neurotrophic factor (BDNF) not less than 140 pg / ml and glial neurotrophic factor (GDNF) not less than 60 pg / ml, vascular endothelial growth factor (VEGF) not less than 80 pg / ml, total protein mass not less than 1 mg / ml preparation, while the cell culture of glial progenitor cells, from which the composition is obtained, demonstrates the expression of astroglial markers S100b, GFAP and consists of 98 ± 2% S100b ⁺ - cells.

Наиболее важным направлением современной медицины и биологии является выделение из клеточных культур биологически активных веществ, прежде всего молекул, запускающих каскад процессов регенерации и паракринной индукции репаративных процессов. Применение охарактеризованного и стандартизованного комплекса биологически активных веществ может обладать той же эффективностью, но гораздо большей безопасностью по сравнению с живыми клеточными культурами. Возможность эффективной экспансии ИПСК и их дифференцировки в разных направлениях, в том числе нейрональном, решают проблему дефицита донорского материала и снимают ряд этических вопросов.The most important area of modern medicine and biology is the isolation of biologically active substances from cell cultures, primarily molecules that trigger a cascade of regeneration processes and paracrine induction of reparative processes. The use of a characterized and standardized complex of biologically active substances can have the same efficiency, but much greater safety compared to living cell cultures. The possibility of effective expansion of iPSCs and their differentiation in different directions, including neuronal, solves the problem of lack of donor material and removes a number of ethical questions.

Изобретение осуществляется следующим образом.The invention is carried out as follows.

Пример 1. Получение белково-пептидного комплекса.Example 1. Obtaining a protein-peptide complex.

Забор биоптата кожи (размером от 0,5 до 1 см²) производят за ушной раковиной или с внутренней стороны предплечья. После отсечения с помощью микрохирургического лезвия, биоптат помещают в стерильный флакон, содержащий транспортную среду (F12 с амикацином, 0,5 г/л). Флакон с содержимым маркируют следующими данными: ФИО донора, дата и время забора. Транспортировку производят при температуре 2-6°С.A skin biopsy sample (0.5 to 1 cm ² ) is taken behind the auricle or on the inside of the forearm. After cutting with a microsurgical blade, the biopsy specimen is placed in a sterile vial containing transport medium (F12 with amikacin, 0.5 g / L). The vial with the contents is marked with the following data: name of the donor, date and time of collection. Transportation is carried out at a temperature of 2-6 ° C.

Полученный материал в стерильных условиях переносят в чашки Петри и трижды промывают раствором Хенкса с цефазолином (1 г/л), затем дезагрегируют путем инкубации в растворе Версена с добавлением 0,25% трипсина. В течение 1-1,5 часов при 37°С. После инкубации суспензию интенсивно перемешивают и центрифугируют в течение 10 минут при 1400 об/мин. Осадок разводят культуральной средой (DMEM/F12 1:1 с добавлением 10% сыворотки, 500 мг/л амикацина), перемешивают и переносят в культуральную посуду. Культуральные флаконы помещают в СО₂-инкубатор (37°С, 5% СО₂). Через 2-3 дня осуществляют замену культуральной среды на свежую. Наращивание и пересевы осуществляют раствором Версена с добавлением 0,25% трипсина и переносят в новые чашки Петри. Коэффициент рассева выбирают в зависимости от индивидуальных пролиферативных характеристик фибробластов. Культивируют не более четырех пассажей. Перед программированием необходимо провести контроль стабильности кариотипа и способность фибробластов синтезировать коллаген I типа (с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания).The resulting material under sterile conditions is transferred into Petri dishes and washed three times with Hanks solution with cefazolin (1 g / l), then disaggregated by incubation in Versene solution with the addition of 0.25% trypsin. Within 1-1.5 hours at 37 ° C. After incubation, the suspension is vigorously mixed and centrifuged for 10 minutes at 1400 rpm. The precipitate is diluted with culture medium (DMEM / F12 1: 1 with the addition of 10% serum, 500 mg / l amikacin), mixed and transferred to culture dishes. The culture flasks are placed in a CO ₂ incubator (37 ° C, 5% CO ₂ ). After 2-3 days, the culture medium is replaced with a fresh one. Growing and reseeding is carried out with Versene solution with the addition of 0.25% trypsin and transferred to new Petri dishes. The seeding ratio is selected depending on the individual proliferative characteristics of fibroblasts. No more than four passages are cultivated. Before programming, it is necessary to control the stability of the karyotype and the ability of fibroblasts to synthesize type I collagen (using immunofluorescent staining).

При необходимости длительного хранения полученные фибробласты подвергают криоконсервации. В боксе на ледяной бане (при 4°С) готовят криозащитный раствор, состоящий из 10%) ДМСО (диметилсульфоксид) и 90% аутогенной сыворотки. Клеточную культуру дезагрегируют раствором Версена с добавлением 0,25% трипсина, подсчитывают количество клеток с помощью счетчика и осаждают клетки центрифугированием (1400 об/мин, 10 мин). К осадку добавляют свежеприготовленный криозащитный раствор из расчета 1 мл на 5 млн. клеток, перемешивают и помещают полученную суспензию в криопробирки. Маркируют, указывая ФИО донора, номер пассажа, количество клеток, дату криозамораживания, данные ответственного исполнителя.If long-term storage is required, the resulting fibroblasts are cryopreserved. In a box in an ice bath (at 4 ° C), a cryoprotective solution is prepared, consisting of 10%) DMSO (dimethyl sulfoxide) and 90% autogenous serum. The cell culture is disaggregated with a Versene solution with the addition of 0.25% trypsin, the number of cells is counted using a counter and the cells are pelleted by centrifugation (1400 rpm, 10 min). A freshly prepared cryoprotective solution is added to the sediment at the rate of 1 ml per 5 million cells, mixed and the resulting suspension is placed in cryovials. They mark, indicating the name of the donor, the passage number, the number of cells, the date of cryofreezing, the data of the responsible executor.

Образцы замораживают до - 80°C с помощью программного замораживателя, а затем помещают в сосуды Дьюара с жидким азотом и хранят при - 196°С.Samples are frozen to -80 ° C using a software freezer and then placed in Dewar flasks with liquid nitrogen and stored at -196 ° C.

Для разморозки криопробирки извлекают из сосуда Дьюара и размораживают при температуре 37°С на водяной бане. Клеточную суспензию из криопробирки переносят в центрифужную пробирку с культуральной средой, наполненной до десятикратного объема и центрифугируют при 1400 об/мин в течение 10 мин. Клеточный осадок переносят в культуральную посуду с полной ростовой средой.For defrosting, cryovials are removed from the Dewar flask and thawed at 37 ° C in a water bath. The cell suspension from the cryotube is transferred into a centrifuge tube with a culture medium filled to ten times its volume and centrifuged at 1400 rpm for 10 minutes. The cell pellet is transferred to a culture dish with complete growth medium.

Перед процедурой репрограммирования культуру фибробластов переводят на среду, не содержащую компоненты животного происхождения. Для этого, согласно протоколу, фибробласты 1-2 пассажа промывают фосфатно-солевым буфером и обрабатывают раствором Трипсин/Версен 1:1 в течение 3-5 минут для открепления клеток от подложки. Суспензию клеток центрифугируют 5 минут при 1100 об/мин, после чего отбирают супернатант, а к осадку добавляют среду DMEM с содержанием 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 mM L-глутамина, пенициллина-стрептомицина 100 мг/л и рассаживают в количестве 1500-2000 клеток/см² на чашки Петри диаметром 60 мм, покрытые коллагеном Coating Matrix Kit (Corning, США). Через 24 часа прикрепившиеся клетки промывают дважды фосфатно-солевым буфером и добавляют среду, состоящую из DMEM/F12, HEPES, натрия бикарбоната 4,8 г/мл, 10% заменителя сыворотки Knockout SR, фактора роста фибробластов человека bFGF 10 мкг/мл, эпидермального фактора роста человека EGF 1 мг/мл, 2 мкМ гидрокортизона. Для адаптации клеток к новой среде культивирование проводят в течение 1-2 пассажей.Before the reprogramming procedure, the culture of fibroblasts is transferred to a medium that does not contain components of animal origin. For this, according to the protocol, fibroblasts 1-2 passages are washed with phosphate-buffered saline and treated with Trypsin / Versene 1: 1 solution for 3-5 minutes to detach the cells from the substrate. The cell suspension is centrifuged for 5 minutes at 1100 rpm, after which the supernatant is removed, and DMEM medium containing 10% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin 100 mg / l is added to the sediment and seated in an amount of 1500-2000 cells / cm ² on Petri dishes 60 mm in diameter coated with the Coating Matrix Kit collagen (Corning, USA). After 24 hours, the adherent cells are washed twice with phosphate-buffered saline and a medium consisting of DMEM / F12, HEPES, sodium bicarbonate 4.8 g / ml, 10% serum substitute Knockout SR, human fibroblast growth factor bFGF 10 μg / ml, epidermal human growth factor EGF 1 mg / ml, 2 μM hydrocortisone. To adapt cells to a new environment, cultivation is carried out for 1-2 passages.

Для репрограммирования фибробластов используют коммерческий набор для репрограммирования клеток человека «CTS CytoTune-iPS 2.1 Sendai Reprogramming Kit» (Invitrogen, США) на основе вируса Сендай. За день до репрограммирования фибробласты высевают в количестве 200 тысяч на лунку 6-луночного планшета, предварительно покрыв коллагеном, и культивируют в 2,5 мл среды без экзогенных компонентов. На следующий день добавляют вектора, несущие гены Oct4 и Sox2 (KOS), L-Myc (hL-Myc), Klf-4 (hKlf4) в количестве вирусных частиц на клетку (MOI) - 5, 5 и 3 соответственно. Через сутки производят замену среды для фибробластов без экзогенных компонентов, далее смена среды происходит ежедневно в течение 6 дней. На 7-ой день после репрограммирования клетки промывают дважды фосфатно-солевым буфером, открепляют их реагентом TrypLE Select и центрифугируют при 1100 об/мин в течение 5 минут. Полученный супернатант отбирают, а клеточный осадок пересаживают в количестве 100 тысяч на чашку Петри диаметром 60 мм, предварительно покрыв витронектином в концентрации 10 мкг/мл. Через 24 часа после посева производят замену среды на Essential 8 Medium для культивирования плюрипотентных клеток человека. Смену среды осуществляют каждый день.For reprogramming fibroblasts, a commercial kit for reprogramming human cells "CTS CytoTune-iPS 2.1 Sendai Reprogramming Kit" (Invitrogen, USA) based on the Sendai virus is used. The day before reprogramming, fibroblasts are seeded in an amount of 200 thousand per well of a 6-well plate, previously covered with collagen, and cultured in 2.5 ml of medium without exogenous components. The next day, vectors are added carrying the genes Oct4 and Sox2 (KOS), L-Myc (hL-Myc), Klf-4 (hKlf4) in the number of viral particles per cell (MOI) - 5, 5 and 3, respectively. A day later, the medium for fibroblasts is replaced without exogenous components, then the medium is changed daily for 6 days. On the 7th day after reprogramming, cells are washed twice with PBS, detached with TrypLE Select reagent and centrifuged at 1100 rpm for 5 minutes. The resulting supernatant is removed, and the cell pellet is transplanted in the amount of 100 thousand per Petri dish 60 mm in diameter, previously coated with vitronectin at a concentration of 10 μg / ml. 24 hours after seeding, the medium is changed to Essential 8 Medium for the cultivation of human pluripotent cells. The medium is changed every day.

Отбор образовавшихся колоний проводят по результатам прижизненного иммуноцитохимического окрашивания антителами к поверхностному маркеру плюрипотентных клеток - протеогликану TRA-1-60 с помощью коммерческого набора «TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit» (ThermoFisher Scientific, США). Колонии ИПСК, в которых визуализировалась высокая экспрессия протеогликана TRA-1-60 отбирают механически наконечником, предварительно обработав раствором Версена, далее сажают на 6-ти луночные планшеты, покрытые витронектином, и культивируют в среде Essential 8 Medium. Дальнейшие пересевы проводят только с помощью раствора Версена и с добавлением в среду ROCK-ингибитора Y27632 в концентрации 5 мкМ в течение суток.The selection of the formed colonies is carried out according to the results of in vivo immunocytochemical staining with antibodies to the surface marker of pluripotent cells - proteoglycan TRA-1-60 using a commercial set "TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit" (ThermoFisher Scientific, USA). Colonies of iPSCs, in which high expression of the proteoglycan TRA-1-60 was visualized, are selected mechanically with a tip, pretreated with a Versene solution, then planted on 6-well plates coated with vitronectin and cultured in Essential 8 Medium. Further subcultures are carried out only with the Versene solution and with the addition of the ROCK inhibitor Y27632 to the medium at a concentration of 5 μM during the day.

При культивировании ИПСК ведется визуальный контроль за морфологическими характеристиками культур. ИПСК растут плотными колониями с ровными краями. Клетки мелкие, с крупными ядрышками. Культивирование осуществляют в чашках Петри диаметром 35 мм, используя культуральную среду Essential 8™ (Е8).During the cultivation of iPSCs, visual control over the morphological characteristics of the cultures is carried out. IPSCs grow in dense colonies with smooth edges. The cells are small, with large nucleoli. Culturing is carried out in 35 mm Petri dishes using Essential 8 ™ culture medium (E8).

Клетки рассаживают по достижении плотности 50-70% монослоя. Из чашек удаляют культуральную среду и промывают 2 мл DPBS. Для дезинтеграции добавляют 1 мл раствора Версена и инкубируют 5-8 мин при комнатной температуре. Затем удаляют раствор Версена, добавляют 2 мл среды, взбалтывают и переносят клеточную суспензию на чашки, предварительно покрытые витронектином, и добавляют среды до 2 мл. Замену среды на свежую проводят каждый день.The cells are planted when a density of 50-70% of the monolayer is reached. The culture medium is removed from the plates and washed with 2 ml DPBS. For disintegration add 1 ml of Versene solution and incubate for 5-8 min at room temperature. Then the Versene solution is removed, 2 ml of the medium is added, shaken and the cell suspension is transferred to the dishes previously coated with vitronectin, and the medium is added to 2 ml. The medium is replaced with a fresh one every day.

Стандартизацию ИПСК проводят по экспрессии генов, специфичных для эмбриональных стволовых клеток ОСТ4, SOX2, NANOG, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60 иммуноцихимическим методом и ПЦР с обратной транскрипцией и.Standardization of iPSCs is carried out by the expression of genes specific for embryonic stem cells OCT4, SOX2, NANOG, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60 by the immunocychemical method and PCR with reverse transcription, etc.

ИПСК подвергают криоконсервации. Готовят на льду криозащитный раствор из расчета на 1 чашку: 900 мкл среды Е8, 100 мкл DMSO и 1 мкл ингибитора Rho-киназы (сток 5 мМ). Из каждой чашки удаляют среду и промывают 2 мл DPBS. Добавляют 1 мл Версена и инкубируют 5-8 мин при комнатной температуре. Затем удаляют раствор Версена и добавляют 1 мл криозащитного раствора. Клетки снимают с поверхности чашки, перемешивают и переносят в криопробирку объемом 1,8 мл (1 мл на 1 пробирку). Образцы замораживают до - 80°C с помощью программного замораживателя, а затем помещают в сосуды Дьюара с жидким азотом и хранят при - 196°С.IPSCs are cryopreserved. A cryoprotective solution is prepared on ice at the rate of 1 dish: 900 μl of E8 medium, 100 μl of DMSO and 1 μl of Rho-kinase inhibitor (5 mM stock). Medium is removed from each plate and washed with 2 ml DPBS. Add 1 ml of Versene and incubate for 5-8 min at room temperature. Then the Versene solution is removed and 1 ml of cryoprotective solution is added. The cells are removed from the plate surface, mixed and transferred to a 1.8 ml cryovial (1 ml per tube). Samples are frozen to -80 ° C using a software freezer and then placed in Dewar flasks with liquid nitrogen and stored at -196 ° C.

Криопробирки с клеточным материалом извлекают из сосуда Дьюара и размораживают при температуре 37°С на водяной бане.Cryotubes with cellular material are removed from the Dewar flask and thawed at 37 ° C in a water bath.

Клеточную суспензию из криопробирки (1 мл) по каплям переносят в центрифужную пробирку, доливают 9 мл теплой культуральной среды DMEM/F12 до десятикратного объема и центрифугируют при 800 об/мин в течение 5 мин.The cell suspension from a cryovial (1 ml) is transferred dropwise into a centrifuge tube, 9 ml of warm DMEM / F12 culture medium is added to a tenfold volume and centrifuged at 800 rpm for 5 minutes.

Отмытые от криоконсерванта клетки переносят на чашки Петри, предварительно покрытые витронектином, с культуральной средой Е8, содержащей ингибитор Rho-киназы. При переносе сохраняют целостность колоний. Адаптация клеток после криоконсервации продолжается от 1 до 3 недель.The cells washed from the cryopreservative are transferred to Petri dishes, previously coated with vitronectin, with the E8 culture medium containing the Rho kinase inhibitor. During the transfer, the integrity of the colonies is preserved. Cell adaptation after cryopreservation lasts from 1 to 3 weeks.

Для дифференцировки в нейрональном направлении ИПСК обрабатывают раствором Версена, центрифугируют при 800 об/мин в течение 5 минут. Супернатант удаляют, а клеточный осадок переносят в новые чашки Петри диаметром 60 мм, покрытые поли-1-орнитином 20 мкг/мл (Sigma-Aldrich, США) и ламинином 2,5 мкг/мл (Gibco, США). По достижению культуры 80% конфлюэнтности среду Essential 8 Medium меняли на DMEM/F12 с 1% N2, 2 мМ глутамина, пенициллин-стрептомицина 100 мг/л, 10 мкМ SB431542, 2 мкМ дорсоморфина. Среду меняют через день. Через 10-14 дней в культуре появляются розеткоподобные структуры. Полученную культуру пересевают на чашки Петри, покрытые поли-1-орнитином 20 мкг/мл и ламинином 2,5 мкг/мл, в плотности 250-400 тысяч клеток/см² и культивировали в среде DMEM/F12 (Панэко, РФ), 2% добавки В27 (Gibco, США), 2 мМ глутамина (Панэко, РФ), пенициллин-стрептомицина 100 мг/л (Панэко, РФ), 10 нг/мл FGF-2 (ProSpec, Великобритания), 1 мкМ пурморфамина (Stemcell Technologies, США) в течение 14 суток, производя замену среды каждые 2 суток.For differentiation in the neuronal direction, iPSCs are treated with Versene solution, centrifuged at 800 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed, and the cell pellet was transferred to new 60 mm Petri dishes coated with 20 μg / ml poly-1-ornithine (Sigma-Aldrich, USA) and 2.5 μg / ml laminin (Gibco, USA). When the culture reached 80% confluence, Essential 8 Medium was changed to DMEM / F12 with 1% N2, 2 mM glutamine, penicillin-streptomycin 100 mg / L, 10 μM SB431542, 2 μM dorsomorphin. Wednesday is changed every other day. After 10-14 days, rosette-like structures appear in the culture. The resulting culture is subcultured on Petri dishes coated with poly-1-ornithine 20 μg / ml and laminin 2.5 μg / ml, at a density of 250-400 thousand cells / cm ² and cultured in DMEM / F12 medium (Paneko, RF), 2 % B27 supplement (Gibco, USA), 2 mM glutamine (Paneco, RF), penicillin-streptomycin 100 mg / L (Paneco, RF), 10 ng / ml FGF-2 (ProSpec, UK), 1 μM purmorphamine (Stemcell Technologies , USA) within 14 days, changing the medium every 2 days.

Стандартизацию нейральных клеток проводят по экспрессии генов РАХ6, FOXP2, NCAM1, ENO2, Nestin, TUBB3, SOX2.Neural cells are standardized by the expression of the PAX6, FOXP2, NCAM1, ENO2, Nestin, TUBB3, SOX2 genes.

Для моделирования теплового шока нейрональные предшественники культивируют в течение часа при 40°С, после чего производят замену среды на DMEM/F12 и культивируют в течение 6 часов. После чего кондиционированную среду собирают и центрифугируют при 300 об/мин в течение 5 минут. Супернатант отбирают и концентрируют в 24 раза с помощью 3 кДа мембран Amicon Ultra (Sigma-Aldrich, США). Полученный концентрат подвергают стерилизующей фильтрации. Композиция включает в себя белки и пептиды молекулярной массой в пределах от 3 до 250 кДа, средняя молекулярная фракция находится в пределах от 10 до 50 кДа не менее 60%.To simulate heat shock, neuronal progenitors are cultured for one hour at 40 ° C, after which the medium is replaced with DMEM / F12 and cultured for 6 hours. Then the conditioned medium is collected and centrifuged at 300 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed and concentrated 24-fold using 3 kDa Amicon Ultra membranes (Sigma-Aldrich, USA). The resulting concentrate is subjected to sterilizing filtration. The composition includes proteins and peptides with a molecular weight in the range from 3 to 250 kDa, the average molecular fraction is in the range from 10 to 50 kDa, not less than 60%.

Пример 2. Характеристика нейрональных прогениторных клеток.Example 2. Characterization of neuronal progenitor cells.

Для подтверждения фенотипа, полученных культур нейрональных прогениторных клеток проводят иммуноцитохимическое окрашивание на нейральные маркеры. Клетки фиксировали 4% раствором формальдегида (Merck KGaA, Германия) 10 минут при комнатной температуре, затем промывали фосфатно-солевым буфером, инкубировали в фосфатно-солевом буфере с 0,25% Triton Х-100 (Sigma-Aldrich, США) и 1% бычьим сывороточным альбумином (AppliChem, Германия) 30 минут, а затем обрабатывали первичными антителами ночь при +4°С. Для нейральных стволовых клеток использовались антитела к белкам Рах6, Tubulin-IIIβ, Nestin и SOX2. Затем клетки промывали фосфатно-солевым буфером и инкубировали с вторичными антителами, меченными флуорохромами Alexa Fluor 488 anti-rabbit, Alexa Fluor 555 anti-mouse (Invitrogen, США) в темноте 60 минут. Ядра красили раствором DAPI (4,6-диамино-2-фенилиндол дигидрохлорид) 1 мкг/мл (Sigma-Aldrich, США) в фосфатно-солевом буфере. Для анализа использовали люминесцентный инвертированный микроскоп Axio Observer.D1с камерой AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия).To confirm the phenotype of the obtained cultures of neuronal progenitor cells, immunocytochemical staining for neural markers is performed. The cells were fixed with 4% formaldehyde solution (Merck KGaA, Germany) for 10 minutes at room temperature, then washed with phosphate-buffered saline, incubated in phosphate-buffered saline with 0.25% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, USA) and 1% bovine serum albumin (AppliChem, Germany) for 30 minutes, and then treated with primary antibodies overnight at + 4 ° C. Antibodies to Pax6, Tubulin-IIIβ, Nestin and SOX2 proteins were used for neural stem cells. Then the cells were washed with phosphate-buffered saline and incubated with secondary antibodies labeled with fluorochromes Alexa Fluor 488 anti-rabbit, Alexa Fluor 555 anti-mouse (Invitrogen, USA) in the dark for 60 minutes. The nuclei were stained with a solution of DAPI (4,6-diamino-2-phenylindole dihydrochloride) 1 μg / ml (Sigma-Aldrich, United States) in phosphate buffered saline. For the analysis, we used an Axio Observer D1 inverted luminescence microscope with an AxioCam HRc camera (Carl Zeiss, Germany).

Количественную оценку проводят с помощью проточной цитометрии. Культуру снимали с помощью раствора Версена (Панэко, РФ) в случае НП или 0,05% раствора трипсина (Панэко, РФ) в случае ГП, центрифугируют 1600 об/мин в течение 5 минут, супернатант отбирают, а осадок промывают раствором Хенкса. После осаждения клетки 10 минут фиксируют 4%-ым раствором параформальдегида, затем клетки промывают фосфатно-солевым раствором. Пермеабилизацию проводят 70% метанолом на льду в течение 10 минут, после чего клетки промывают дважды в фосфатно-солевом растворе и осаждали центрифугированием 1800 об/мин 5 минут. Далее клетки окрашивают первичными антителами против β3-тубулина (разведение 1:500, Abcam), инкубация проходила при +4°С в течение 12 часов. Затем промывали фосфатно-солевым буфером, центрифугируют 1800 об/мин 5 минут и инкубируют с вторичными антителами, меченными флюорохромом Alexa Fluor 555 anti-mouse (разведение 1:600, Invitrogen, США) в темноте 60 минут. Полученную суспензию анализируют, используя проточный цитофлюориметр CyFlow ML, а количество TUBB3+ - клеток считали с помощью програмного обеспечения FloMax. По данным проточной цитометрии культуры нейрональных прогениторных клеток должна состоять не менее 99,5±2,45% TUBB3⁺ - клеток.Quantification is carried out using flow cytometry. The culture was removed using a Versene solution (Paneko, RF) in the case of NP or 0.05% trypsin solution (Paneko, RF) in the case of HP, centrifuged at 1600 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, and the precipitate was washed with Hanks solution. After sedimentation, the cells are fixed with 4% paraformaldehyde solution for 10 minutes, then the cells are washed with phosphate-saline solution. Permeabilization is carried out with 70% methanol on ice for 10 minutes, after which the cells are washed twice in phosphate-saline solution and pelleted by centrifugation at 1800 rpm for 5 minutes. Then the cells are stained with primary antibodies against β3-tubulin (dilution 1: 500, Abcam), incubation took place at + 4 ° C for 12 hours. Then it was washed with phosphate-buffered saline, centrifuged at 1800 rpm for 5 minutes and incubated with secondary antibodies labeled with Alexa Fluor 555 anti-mouse fluorochrome (dilution 1: 600, Invitrogen, USA) in the dark for 60 minutes. The resulting suspension was analyzed using a CyFlow ML flow cytometer, and the number of TUBB3 + cells was counted using the FloMax software. According to flow cytometry, the culture of neuronal progenitor cells should consist of at least 99.5 ± 2.45% TUBB3 ⁺ cells.

Для анализа экспрессии нейрональных генов маркеров проводят ПЦР. мРНК выделяли с помощью коммерческого набора «RNeasy Mini Kit» согласно инструкции производителя. Далее проводили синтез кДНК набором «RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit» по протоколу, приложенному в инструкции. Для ПЦР в реальном времени использовали готовую реакционную смесь с интеркалирующим красителем Sybr Green, амплификацию ставили в термоциклере BioRad iQ cycler. Схема реакции: первичная денатурация 95°С, 5 мин.; денатурация 95°С, 20 сек; отжиг праймеров 55-63°С, 20 сек; элонгация 72°С, 20 секунд (40 циклов). Уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к усредненным данным амплификации двух генов домашнего хозяйства GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа) и ActB (β-актин). Относительное количество мРНК рассчитывали с помощью ΔС (Т) метода.To analyze the expression of neuronal marker genes, PCR is performed. mRNA was isolated using a commercial RNeasy Mini Kit according to the manufacturer's instructions. Next, cDNA synthesis was performed using the RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit according to the protocol attached to the instructions. For real-time PCR, a ready-made reaction mixture with an intercalating dye Sybr Green was used; amplification was performed in a BioRad iQ cycler thermal cycler. Reaction scheme: primary denaturation 95 ° С, 5 min; denaturation 95 ° C, 20 sec; annealing of primers 55-63 ° С, 20 sec; elongation 72 ° C, 20 seconds (40 cycles). The mRNA level of the analyzed genes was leveled with respect to the average amplification data of two housekeeping genes GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) and ActB (β-actin). The relative amount of mRNA was calculated using the ΔC (T) method.

В результате дифференцировки нейрональные прогениторные клетки демонстрируют экспрессию маркерных генов РАХ6, TUBB3, МАР2, ENO2, Nestin (Рисунок 1) как на уровне транскрипции, так и трансляции. Анализ показал, что до 95% полученных клеток экспрессировали нейрональный маркер TUBB3 (Рисунок 2).As a result of differentiation, neuronal progenitor cells demonstrate the expression of marker genes PAX6, TUBB3, MAP2, ENO2, Nestin (Figure 1) both at the level of transcription and translation. The analysis showed that up to 95% of the obtained cells expressed the neuronal marker TUBB3 (Figure 2).

Пример 3. Характеристика композицииExample 3. Characteristics of the composition

Композицию характеризуют по количеству в 1 мл общего белка и таких факторов, как мозговой нейротрофический фактор (Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и количества белков теплового шока. Для этого используют твердофазный иммуноферментный анализ. 1 мл суспензии центрифугируют, полученные в результате центрифугирования супернатанты апплицировали в лунки планшета с предварительно адсорбированными первичными антителами к BDNF, GDNF, VEGF и белкам теплового шока (Hsp60, Hsp70 и Hsp90) далее анализ проводят согласно инструкции производителя. Содержание факторов выражают в пг/мл композиции. Всего было исследовано 10 образцов композиции, получены результаты по содержанию BDNF не менее 120 пг/мл, GDNF не менее 40 пг/мл, VEGF не менее 60 пг/мл, Hsp60 не менее 15 нг/мл, Hsp70 не менее 10 нг/мл и Hsp90 не менее 2 нг/мл. Суммарная масса белка не менее 1 мг/мл препарата. Общий белок в 1 мл суспензии определяют методом Бредфорда.The composition is characterized by the amount in 1 ml of total protein and factors such as Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), glial neurotrophic factor (GDNF), vascular endothelial growth factor (VEGF) and the amount of heat shock proteins. For this, an enzyme-linked immunosorbent assay is used. 1 ml of the suspension is centrifuged, the supernatants obtained as a result of centrifugation were applied to the wells of the plate with pre-adsorbed primary antibodies to BDNF, GDNF, VEGF and heat shock proteins (Hsp60, Hsp70 and Hsp90), then the analysis is carried out according to the manufacturer's instructions. The content of the factors is expressed in pg / ml of the composition. In total, 10 samples of the composition were examined, the results were obtained on the content of BDNF at least 120 pg / ml, GDNF at least 40 pg / ml, VEGF at least 60 pg / ml, Hsp60 at least 15 ng / ml, Hsp70 at least 10 ng / ml and an Hsp90 of at least 2 ng / ml. The total mass of protein is not less than 1 mg / ml of the drug. Total protein in 1 ml of suspension is determined by the Bradford method.

Пример 4. Оценка эффективности использования композиции на in vitro модели химической гипоксии на клеточной линии SHSY-5YExample 4. Evaluation of the effectiveness of using the composition in an in vitro model of chemical hypoxia on the SHSY-5Y cell line

Для изучения нейротрофического и нейропротекторного действия ноотропных композиций на основе среды НП, полученных в стандартных условиях 1) и подвергнутых тепловому шоку (2) была, выбрана линия нейробластомы SHSY-5Y, широко используемая в качестве in vitro модели в нейробиологии. Клетки линии SHSY-5Y (АТСС, США) культивировали в среде DMEM/F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). За неделю до эксперимента клетки пересевали в 12-луночные планшеты, покрытые раствором коллагена I типа в количестве 90 тысяч клеток на лунку и затем инкубировали в среде Opti-MEM, содержащей 10 мМ ретиноевой кислоты и 0,5% ФБС в течение двух дней. Далее среду меняли на DMEM/F12 с добавлением 50 нг/мл нейротрофического фактора BDNF и 2% В27. За 72 часа до моделирования гипоксии из среды убирали нейротрофический фактор BDNF.To study the neurotrophic and neuroprotective effects of nootropic compositions based on the NP medium obtained under standard conditions 1) and subjected to heat shock (2), the SHSY-5Y neuroblastoma line was chosen, which is widely used as an in vitro model in neurobiology. SHSY-5Y cells (ATCC, USA) were cultured in DMEM / F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). One week before the experiment, the cells were subcultured into 12-well plates coated with type I collagen solution in the amount of 90 thousand cells per well and then incubated in Opti-MEM medium containing 10 mM retinoic acid and 0.5% PBS for two days. Then the medium was changed to DMEM / F12 with the addition of 50 ng / ml of the neurotrophic factor BDNF and 2% B27. The neurotrophic factor BDNF was removed from the medium 72 hours before the simulation of hypoxia.

В работе использовали модель химической гипоксии, которая является адекватной и взаимозаменяемой с моделью на основе применения газовой инкубационной камеры с пониженным содержанием кислорода. Для моделирования гипоксии был протестирован дихлорид кобальта CoCl₂ в концентрациях от 150 до 300 мкМ. Клетки нейробластомы SHSY-5Y культивировали в 12 - луночных планшетах с CoCl₂ в течение 4 часов, после чего промывали раствором Хенкса и добавляли среду DMEM/F12 с 2% В27. Для изучения протекторного действия ноотропных композиции (1,2), производили их добавление в среду культивирование (5% от объема лунки, раствор с концентрацией общего белка 0.5 мг/мл) за 24 часа до моделирования гипоксии.We used a model of chemical hypoxia, which is adequate and interchangeable with the model based on the use of a gas incubation chamber with a reduced oxygen content. To simulate hypoxia, cobalt dichloride CoCl ₂ was tested at concentrations from 150 to 300 μM. SHSY-5Y neuroblastoma cells were cultured in 12-well plates with CoCl ₂ for 4 hours, after which they were washed with Hanks solution and DMEM / F12 medium with 2% B27 was added. To study the protective effect of nootropic compositions (1,2), they were added to the cultivation medium (5% of the well volume, a solution with a total protein concentration of 0.5 mg / ml) 24 hours before hypoxia modeling.

Для определения жизнеспособности клеточной линии SHSY-5Y спустя 24 часа сокультивирования добавляли МТТ (3-[4,5диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолийбромид, ПанЭко, РФ) в концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали в темноте при 37°С в течение 2 часов с последующим растворением кристаллов формазана ДМСО и измерением оптической плотности при 590 нм с помощью планшетного ридера. Все МТТ анализы были выполнены в трех повторах.To determine the viability of the SHSY-5Y cell line, after 24 hours of co-cultivation, MTT (3- [4,5dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, PanEco, RF) was added at a concentration of 0.5 mg / ml and incubated in darkness at 37 ° C for 2 hours, followed by dissolution of crystals of formazan DMSO and measuring the optical density at 590 nm using a plate reader. All MTT analyzes were performed in triplicate.

Для оценки нейритогенеза рассчитывали среднее значение площади клетки с использованием программы ImageJ. Для этого определяли общую площадь клеток, окрашенных антителами против β3-тубулина, и делили на общее количество ядер, меченных красителем DAPI, используя параметры цветового диапозона.To assess neuritogenesis, the mean cell area was calculated using the ImageJ software. For this, the total area of cells stained with antibodies against β3-tubulin was determined and divided by the total number of nuclei labeled with DAPI dye using the color range parameters.

В результате инкубация с ноотропной композицией, полученной в стандартных условиях (1) увеличивает число живых клеток SH-SY5Y на 7,58±3,2% по сравнению с контролем. Добавление ноотропной композиции, полученной с применением моделирования теплового (2) шока увеличивает число живых клеток SH-SY5Y на 11,58±3,2%, при этом оказывая более выраженное действие на стимулирование роста нейритов у клеток нейробластомы, площадь которых превышает в 1,23 раза площадь группы 1.As a result, incubation with the nootropic composition obtained under standard conditions (1) increases the number of living SH-SY5Y cells by 7.58 ± 3.2% compared to the control. The addition of a nootropic composition obtained using heat shock simulation (2) increases the number of living SH-SY5Y cells by 11.58 ± 3.2%, while exerting a more pronounced effect on stimulating neurite growth in neuroblastoma cells whose area exceeds 1, 23 times the area of group 1.

Список использованных источниковList of sources used

1. Некрасов Е.Д., Лебедева О.С., Честков И.В., Сюсина М.А., Федотова Е.Ю., Лагарькова М.А., Киселев С.Л., Гривенников И.А., Иллариошкин С.Н. Получение и характеристика индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека из фибробластов кожи пациентов с нейродегенеративными заболеваниями // Гены и клетки. 2011. №4.1.Nekrasov E.D., Lebedeva O.S., Chestkov I.V., Syusina M.A., Fedotova E.Yu., Lagarkova M.A., Kiselev S.L., Grivennikov I.A., Illarioshkin S.N. Obtaining and characterization of induced pluripotent human stem cells from skin fibroblasts of patients with neurodegenerative diseases // Genes and cells. 2011. No. 4.

2. Kim S.U., Lee Н.J. Human Neural Stem Cell-Based Cell-and Gene-Therapy for Neurological Diseases // Stem Cells and Cell Therapy. - Springer, Dordrecht, 2014. - C. 21-48.2. Kim S.U., Lee H.J. Human Neural Stem Cell-Based Cell-and Gene-Therapy for Neurological Diseases // Stem Cells and Cell Therapy. - Springer, Dordrecht, 2014. - C. 21-48.

3. Chambers S.M. et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling // Nature biotechnology. - 2009. - T. 27. - №. 3. - P. 275.3. Chambers S.M. et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling // Nature biotechnology. - 2009. - T. 27. - No. 3. - P. 275.

4. Madhu V. et al. Dual inhibition of activin/nodal/TGF-β and BMP signaling pathways by SB431542 and dorsomorphin induces neuronal differentiation of human adipose derived stem cells // Stem Cells International. - 2016. - T. 2016.4. Madhu V. et al. Dual inhibition of activin / nodal / TGF-β and BMP signaling pathways by SB431542 and dorsomorphin induces neuronal differentiation of human adipose derived stem cells // Stem Cells International. - 2016. - T. 2016.

5. Wechsler-Reya R.J., Scott M.P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog // Neuron. - 1999. - T. 22. - №. 1. - P. 103-114.5. Wechsler-Reya R.J., Scott M.P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog // Neuron. - 1999. - T. 22. - No. 1. - P. 103-114.

6. Hughes, S.M. et al. Ciliary neurotrophic factor induces type-2 astrocyte differentiation in culture // Nature. - 1988. - V. 335. №. 6185. p. 70.6. Hughes, S.M. et al. Ciliary neurotrophic factor induces type-2 astrocyte differentiation in culture // Nature. - 1988. - V. 335. No. 6185. p. 70.

7. Song M.R., Ghosh A. FGF2-induced chromatin remodeling regulates the CNTF-mediated gene expression and astrocyte differentiation // Nature neuroscience. - 2004. - V. 7. - №. 3. - P. 229.7. Song M.R., Ghosh A. FGF2-induced chromatin remodeling regulates the CNTF-mediated gene expression and astrocyte differentiation // Nature neuroscience. - 2004. - V. 7. - no. 3. - P. 229.

8. Eriksson, P.S. Neurogenesis in the adult human hippocampus / P.S. Eriksson, E. Perfilieva, T. Bjork-Eriksson et al. // Nat Med. - 1998. - Vol. 4. - P. 1313-1317.8. Eriksson, P.S. Neurogenesis in the adult human hippocampus / P.S. Eriksson, E. Perfilieva, T. Bjork-Eriksson et al. // Nat Med. - 1998. - Vol. 4. - P. 1313-1317.

9. Mattson, M.P. Apoptotic and antiapoptotic mechanisms in stroke / M.P. Mattson, C. Culmsee, Z.F. Yu // Cell Tissue Res. - 2000. - Vol. 301. - P. 173-187.9. Mattson, M.P. Apoptotic and antiapoptotic mechanisms in stroke / M.P. Mattson, C. Culmsee, Z.F. Yu // Cell Tissue Res. - 2000. - Vol. 301. - P. 173-187.

10. Kernie, S.G. Forebrain neurogenesis after focal ischemic and traumatic brain injury / S.G. Kernie, J.M. Parent // Neurobiol Dis. - 2010. - Vol. 37. - P. 267-274.10. Kernie, S.G. Forebrain neurogenesis after focal ischemic and traumatic brain injury / S.G. Kernie, J.M. Parent // Neurobiol Dis. - 2010. - Vol. 37. - P. 267-274.

11.

, Antila H. Neuronal plasticity and neurotrophic factors in drug responses // Molecular psychiatry. - 2017. - T. 22. - №. 8. - P. 1085.eleven.

, Antila H. Neuronal plasticity and neurotrophic factors in drug responses // Molecular psychiatry. - 2017. - T. 22. - No. 8. - P. 1085.

12. Xiong, Y. Angiogenesis, neurogenesis and brain recovery of function following injury // Curr Opin Investig Drugs. - 2010. - Vol. 11. - P. 298-308.12. Xiong, Y. Angiogenesis, neurogenesis and brain recovery of function following injury // Curr Opin Investig Drugs. - 2010. - Vol. 11. - P. 298-308.

13. Prakash R., Carmichael S.T. Blood-brain barrier breakdown and neovascularization processes after stroke and traumatic brain injury // Current opinion in neurology. - 2015. - Т. 28. - №. 6. - P. 556.13. Prakash R., Carmichael S.T. Blood-brain barrier breakdown and neovascularization processes after stroke and traumatic brain injury // Current opinion in neurology. - 2015. - T. 28. - No. 6. - P. 556.

14. Quittet M.S. et al. Effects of mesenchymal stem cell therapy, in association with pharmacologically active microcarriers releasing VEGF, Acta biomaterialia. - 2015. - T. 15. - p. 77-88.14. Quittet M.S. et al. Effects of mesenchymal stem cell therapy, in association with pharmacologically active microcarriers releasing VEGF, Acta biomaterialia. - 2015. - T. 15. - p. 77-88.

15. Giraldi-Guimaraes A., Rezende-Lima M., F.P. Bruno, R. Mendez-Otero // Brain Res. - 2009. - 1266. - P. 108-120.15. Giraldi-Guimaraes A., Rezende-Lima M., F.P. Bruno, R. Mendez-Otero // Brain Res. - 2009. - 1266. - P. 108-120.

16. Napoli E., Borlongan С.V. Recent advances in stem cell-based therapeutics for stroke. – 2016.16. Napoli E., Borlongan C.V. Recent advances in stem cell-based therapeutics for stroke. - 2016.

17. Prospect of Stem Cell Conditioned Medium in Regenerative Medicine. Jeanne Adiwinata Pawitan. BioMed Research International 2014, Article ID 965849.17. Prospect of Stem Cell Conditioned Medium in Regenerative Medicine. Jeanne Adiwinata Pawitan. BioMed Research International 2014, Article ID 965849.

18. Human neural stem cell transplantation improves cognition in a murine model of Alzheimer's disease. Lisa M. McGinley1, Osama N. Kashlan2, Elizabeth S. Bruno1, Kevin S. Chen2, John M. Hayes1, Samy R. Kashlan1, Julia Raykin3, Karl Johe4, Geoffrey G. Murphy5 & Eva L. Feldman1. Scientific Reports, Article number: 14776 (2018).18. Human neural stem cell transplantation improves cognition in a murine model of Alzheimer's disease. Lisa M. McGinley1, Osama N. Kashlan2, Elizabeth S. Bruno1, Kevin S. Chen2, John M. Hayes1, Samy R. Kashlan1, Julia Raykin3, Karl Johe4, Geoffrey G. Murphy5 & Eva L. Feldman1. Scientific Reports, Article number: 14776 (2018).

19. Microvesicles from brain-extracttreated mesenchymal stem cells improve neurological functions in a rat model of ischemic stroke. Ji Yong Lee, Eiru Kim, Seong-Mi Choi, Dong-Wook Kim, Kwang Pyo Kim, Insuk Lee & Han-Soo Kim. Scientific Reports. Published: 09 September 2016.19. Microvesicles from brain-extracttreated mesenchymal stem cells improve neurological functions in a rat model of ischemic stroke. Ji Yong Lee, Eiru Kim, Seong-Mi Choi, Dong-Wook Kim, Kwang Pyo Kim, Insuk Lee & Han-Soo Kim. Scientific Reports. Published: 09 September 2016.

20. Exosomes as Carriers of Alzheimer's Amyloid-β. Kohei Yuyama and Yasuyuki Igarashi Front. Neurosci., 25 April 2017.20. Exosomes as Carriers of Alzheimer's Amyloid-β. Kohei Yuyama and Yasuyuki Igarashi Front. Neurosci., 25 April 2017.

21. Human neural stem cell transplantation improves cognition in a murine model of Alzheimer's disease. Lisa M. McGinley, Osama N. Kashlan, Elizabeth S. Bruno, Kevin S. Chen, John M. Hayes, Samy R. Kashlan, Julia Raykin, Karl Johe, Geoffrey G. Murphy & Eva L. Feldman. ScientificReports, Article number: 14776 (2018).21. Human neural stem cell transplantation improves cognition in a murine model of Alzheimer's disease. Lisa M. McGinley, Osama N. Kashlan, Elizabeth S. Bruno, Kevin S. Chen, John M. Hayes, Samy R. Kashlan, Julia Raykin, Karl Johe, Geoffrey G. Murphy & Eva L. Feldman. Scientific Reports, Article number: 14776 (2018).

22. Neural Stem Cell-Conditioned Medium Ameliorated Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury in Rats HongNa Yang, Cuilan Wang, Hui Chen, Lan Li, Shuang Ma, Hao Wang, YaRu Fu, and Tingyu Qu. Stem Cells International. Published April 2018.22. Neural Stem Cell-Conditioned Medium Ameliorated Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury in Rats HongNa Yang, Cuilan Wang, Hui Chen, Lan Li, Shuang Ma, Hao Wang, YaRu Fu, and Tingyu Qu. Stem Cells International. Published April 2018.

23. Neural Stem Cell-Conditioned Medium Protects Neurons and Promotes Propriospinal Neurons Relay Neural Circuit Reconnection After Spinal Cord Injury. Peng Liang, Jiaren Liu, Jinsheng Xiong, Qing Liu, Jiaxin Zhao, Hongsheng Liang, Liwei Zhao, and Haitao Tang. Cell Transplantation, Vol. 23, Supplement 1, pp. S45-S56, 2014.23. Neural Stem Cell-Conditioned Medium Protects Neurons and Promotes Propriospinal Neurons Relay Neural Circuit Reconnection After Spinal Cord Injury. Peng Liang, Jiaren Liu, Jinsheng Xiong, Qing Liu, Jiaxin Zhao, Hongsheng Liang, Liwei Zhao, and Haitao Tang. Cell Transplantation, Vol. 23, Supplement 1, pp. S45-S56, 2014.

24. Adipose-derived stem cell-conditioned medium ameliorates antidepression-related behaviors in the mouse model of Alzheimer's disease. Hiromitsu Yamazaki, Yu Jin, Ayako Tsuchiya, Takeshi Kanno, Tomoyuki Nishizaki. Neuroscience Letters. Available online 17 October 2015.24. Adipose-derived stem cell-conditioned medium ameliorates antidepression-related behaviors in the mouse model of Alzheimer's disease. Hiromitsu Yamazaki, Yu Jin, Ayako Tsuchiya, Takeshi Kanno, Tomoyuki Nishizaki. Neuroscience Letters. Available online 17 October 2015.

25. Conditioned medium from the stem cells of human dental pulp improves cognitive function in a mouse model of Alzheimer's disease. Tsuneyuki Mitaa, Yoko Furukawa-Hibib, Hideyuki Takeuchic, Hisashi Hattoria, Kiyofumi Yamadab, Hideharu Hibia, Minoru Uedaa, Akihito Yamamotoa, Behavioural Brain Research. Available online 22 July 2015.25. Conditioned medium from the stem cells of human dental pulp improves cognitive function in a mouse model of Alzheimer's disease. Tsuneyuki Mitaa, Yoko Furukawa-Hibib, Hideyuki Takeuchic, Hisashi Hattoria, Kiyofumi Yamadab, Hideharu Hibia, Minoru Uedaa, Akihito Yamamotoa, Behavioral Brain Research. Available online 22 July 2015.

26. Cerebrolysin for vascular dementia. Chen N, Yang M, Guo J, Zhou M, Zhu C, He L. Cochrane Database Syst Rev. 2013 Jan 31.26. Cerebrolysin for vascular dementia. Chen N, Yang M, Guo J, Zhou M, Zhu C, He L. Cochrane Database Syst Rev. 2013 Jan 31.

27. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse factors and adult fibroblast by defined factors. // Cell. 2006. Vol. 126, No. 4. P. 663-67.27. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse factors and adult fibroblast by defined factors. // Cell. 2006. Vol. 126, No. 4. P. 663-67.

28. Takahashi K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. // Cell. 2007. Vol. 131, No 5. P. 861-872.28. Takahashi K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. // Cell. 2007. Vol. 131, No 5.P. 861-872.

29. Yu J. et al. Induced pluripotent cell lines lines derived from human somatic cells. // Science. 2007. Vol. 318, No. 5858. P. 1917-1920.29. Yu J. et al. Induced pluripotent cell lines lines derived from human somatic cells. // Science. 2007. Vol. 318, No. 5858. P. 1917-1920.

30. Li W. et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells in the absence of exogenous Sox2. // Stem Cells. 2009. Vol. 27, No 12. P. 2992-3000.30. Li W. et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells in the absence of exogenous Sox2. // Stem Cells. 2009. Vol. 27, No 12.P. 2992-3000.

31. Liu H. et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. // Cell Stem Cell. 2008. Vol. 3, No 6. P. 587-590.31. Liu H. et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. // Cell Stem Cell. 2008. Vol. 3, No 6.P. 587-590.

32. Kwon D.-J. et al. Generation of leukemia inhibitory factor-dependent induced pluripotent stem cells from the Massachusetts General Hospital miniature pig. // Biomed Res. Int. 2013. Vol. 2013. P. 140639.32. Kwon D.-J. et al. Generation of leukemia inhibitory factor-dependent induced pluripotent stem cells from the Massachusetts General Hospital miniature pig. // Biomed Res. Int. 2013. Vol. 2013. P. 140639.

33. Aasen T. et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. // Nat. Biotechnol. 2008. Vol. 26, No 11. P. 1276-1284.33. Aasen T. et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. // Nat. Biotechnol. 2008. Vol. 26, No. 11.P. 1276-1284.

34. Eminli S. et al. Reprogramming of neural progenitor cells in the inducible stem cells of the exogenous Sox2 expression. // Stem Cells. 2008. Vol. 26, No. 10. P. 2467-2474.34. Eminli S. et al. Reprogramming of neural progenitor cells in the inducible stem cells of the exogenous Sox2 expression. // Stem Cells. 2008. Vol. 26, No. 10.P. 2467-2474.

35. Aoi T. et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. // Science. 2008. Vol. 321, No 5889. P. 699-702.35. Aoi T. et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. // Science. 2008. Vol. 321, No 5889. P. 699-702.

36. Lagarkova M.A. et al. Induction of pluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale. // Cell Cycle. 2010. Vol. 9, No 5. P. 937-946.36. Lagarkova M.A. et al. Induction of pluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale. // Cell Cycle. 2010. Vol. 9, No 5.P. 937-946.

37. Woltjen K. et al. piggyBac transposition reprograms of fibroblasts to induced pluripotent stem cells. // Nature. 2009. Vol. 458, No. 7239. p. 766-770.37. Woltjen K. et al. piggyBac transposition reprograms of fibroblasts to induced pluripotent stem cells. // Nature. 2009. Vol. 458, No. 7239. p. 766-770.

38. Zhou W., Freed C.R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. // Stem Cells. 2009. Vol. 27, No. 11. P. 2667-2674.38. Zhou W., Freed C.R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. // Stem Cells. 2009. Vol. 27, No. 11.P. 2667-2674.

39. Zhou W., Freed C.R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. // Stem Cells. 2009. Vol. 27, No 11. P. 2667-2674.39. Zhou W., Freed C.R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. // Stem Cells. 2009. Vol. 27, No. 11.P. 2667-2674.

40. Fusaki N. et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. // Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 2009. Vol. 85, No 8. P. 348-362.40. Fusaki N. et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. // Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 2009. Vol. 85, No 8.P. 348-362.

41. Yu J. et al. Induced pluripotent cell lines lines derived from human somatic cells. // Science. 2007. Vol. 318, No. 5858. P. 1917-1920.41. Yu J. et al. Induced pluripotent cell lines lines derived from human somatic cells. // Science. 2007. Vol. 318, No. 5858. P. 1917-1920.

42. Kim D. et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. // Cell Stem Cell. 2009. Vol. 4, No 6. P. 472-476.42. Kim D. et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. // Cell Stem Cell. 2009. Vol. 4, No 6.P. 472-476.

43. Fingar d. C., blenis j. 2004. Target of rapamycin (tor): an integrator of cycle progression. Oncogene. 23: 3151-3171.43. Fingar d. C., blenis j. 2004. Target of rapamycin (tor): an integrator of cycle progression. Oncogene. 23: 3151-3171.

44. Chow, Ari M., et al. "Induction of heat shock proteins in cerebral cortical cultures by celastrol." Cell Stress and Chaperones 18.2 (2013): 155-160.44. Chow, Ari M., et al. "Induction of heat shock proteins in cerebral cortical cultures by celastrol." Cell Stress and Chaperones 18.2 (2013): 155-160.

45. Kim, Jong Youl, et al. "70-kDa heat shock protein downregulates dynamin in experimental stroke: a new therapeutic target?." Stroke 47.8 (2016): 2103-2111.45. Kim, Jong Youl, et al. "70-kDa heat shock protein downregulates dynamin in experimental stroke: a new therapeutic target ?." Stroke 47.8 (2016): 2103-2111.

46. De Maio, Antonio. "Extracellular Hsp70: export and function." Current Protein and Peptide Science 15.3 (2014): 225-231.46. De Maio, Antonio. "Extracellular Hsp70: export and function." Current Protein and Peptide Science 15.3 (2014): 225-231.

47. Kim, Jong Youl, and Midori A. Yenari. "The immune modulating properties of the heat shock proteins after brain injury." Anatomy & cell biology 46.1 (2013): 1-7.47. Kim, Jong Youl, and Midori A. Yenari. "The immune modulating properties of the heat shock proteins after brain injury." Anatomy & cell biology 46.1 (2013): 1-7.

48. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: capturing tumor complexity in vitro/ex vivo.48. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: capturing tumor complexity in vitro / ex vivo.

49. Hickman JA, Graeser R, de Hoogt R, Vidic S, Brito C, Gutekunst M, van der Kuip H, Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Consortium Biotechnol J. 2014 Sep; 9(9): 1115-28.49. Hickman JA, Graeser R, de Hoogt R, Vidic S, Brito C, Gutekunst M, van der Kuip H, Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: capturing tumor complexity in vitro / ex vivo. Consortium Biotechnol J. 2014 Sep; 9 (9): 1115-28.

50. Bozkurt A, et al. In vitro assessment of axonal growth using dorsal root ganglia explants in a novel three-dimensional collagen matrix. Tissue Eng. 2007; 13:2971-2979.50. Bozkurt A, et al. In vitro assessment of axonal growth using dorsal root ganglia explants in a novel three-dimensional collagen matrix. Tissue Eng. 2007; 13: 2971-2979.

51. Levenberg S, et al. Differentiation of human embryonic stem cells on three-dimensional polymer scaffolds. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100:12741-12746. doi: 10.1073/pnas. 1735463100.51. Levenberg S, et al. Differentiation of human embryonic stem cells on three-dimensional polymer scaffolds. Proc Natl Acad Sci USA. 2003; 100: 12741-12746. doi: 10.1073 / pnas. 1735463100.

52.

, et al. Enhanced neuronal differentiation in a three-dimensional collagen-hyaluronan matrix. J Neurosci Res. 2007; 85:2138-2146.52.

, et al. Enhanced neuronal differentiation in a three-dimensional collagen-hyaluronan matrix. J Neurosci Res. 2007; 85: 2138-2146.

53. Bozza A, et al. Neural differentiation of pluripotent cells in 3D alginate-based cultures. Biomaterials. 2014; 35:4636-4645.53. Bozza A, et al. Neural differentiation of pluripotent cells in 3D alginate-based cultures. Biomaterials. 2014; 35: 4636-4645.

54. Daud MF, Pawar KC, Claeyssens F, Ryan AJ, Haycock JW. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 2012; 33:5901-5913.54. Daud MF, Pawar KC, Claeyssens F, Ryan AJ, Haycock JW. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 2012; 33: 5901-5913.

55. Du J, et al. Comparative evaluation of chitosan, cellulose acetate, and polyethersulfone nanofiber scaffolds for neural differentiation. Carbohydr Polym. 2014; 99:483-490.55. Du J, et al. Comparative evaluation of chitosan, cellulose acetate, and polyethersulfone nanofiber scaffolds for neural differentiation. Carbohydr Polym. 2014; 99: 483-490.

56. Kallos MS, Behie LA. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol Bioeng. 1999; 63:473-483.56. Kallos MS, Behie LA. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol Bioeng. 1999; 63: 473-483.

Claims

1. A method of obtaining a nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neuronal progenitor cells under heat shock conditions, including: taking a biopsy of the skin, obtaining a culture of fibroblasts, cryopreservation of a culture of fibroblasts, thawing a culture of fibroblasts, adapting a culture of fibroblasts to xeno free conditions of culture of fibroblasts, reprogramming for the production of induced pluripotent stem cells (iPSCs), culturing iPSCs, cryopreservation of iPSCs, thawing iPSCs, neuronal differentiation of iPSCs, culturing neuronal progenitor cells under heat shock conditions, collecting the conditioned medium and obtaining a protein-peptide complex,

where, to simulate heat shock, neuronal progenitor cells are cultured for an hour at 40 ° C in a growth medium containing DMEM / F12, 2% B27 additive, 10 ng / ml FGF-2, 1 μM purmorphamine, after which the medium is replaced with DMEM / F12 and cultured for 6 hours, after which the conditioned medium is collected and centrifuged at 300 rpm for 5 minutes, the supernatant is removed and concentrated 24 times using 3 kDa Amicon Ultra membranes, then the resulting concentrate is subjected to sterilizing filtration to obtain a nootropic composition ...

2. Nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neuronal progenitor cells under heat shock conditions, characterized by the fact that it contains proteins and polypeptides with a molecular weight of 3 kDa to 250 kDa, of which 60% have a molecular weight in the range from 10 to 50 kDa, brain neurotrophic factor (BDNF) not less than 120 pg / ml and glial neurotrophic factor (GDNF) not less than 40 pg / ml, vascular endothelial growth factor (VEGF) not less than 60 pg / ml, total protein mass not less 1 mg / ml of the drug, while the cell culture of neuronal progenitor cells from which the composition is obtained demonstrates the expression of the neuronal marker β3-tubulin, the nerve cell adhesion molecule (PSA-NCAM) and consists of 99.5 ± 2.45% TUBB3 ⁺ - cells.