RU2732600C1 - Nootropic composition based on polypeptide complexes recovered from neuronal progenitor cells under hypoxic conditions, and a method for production thereof - Google Patents

Nootropic composition based on polypeptide complexes recovered from neuronal progenitor cells under hypoxic conditions, and a method for production thereof Download PDF

Info

Publication number
RU2732600C1
RU2732600C1 RU2019144078A RU2019144078A RU2732600C1 RU 2732600 C1 RU2732600 C1 RU 2732600C1 RU 2019144078 A RU2019144078 A RU 2019144078A RU 2019144078 A RU2019144078 A RU 2019144078A RU 2732600 C1 RU2732600 C1 RU 2732600C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
progenitor cells
cells
neuronal
ipscs
neuronal progenitor
Prior art date
Application number
RU2019144078A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Вадимович Гольдштейн Дмитрий
Сергей Львович Киселев
Константин Никитич Ярыгин
Татьяна Борисовна Бухарова
Дарья Дмитриевна Наместникова
Олег Владимирович Махнач
Диана Ирековна Салихова
Георгий Евгеньевич Леонов
Виктория Олеговна Мокроусова
Тимур Хайсамудинович Фатхудинов
Андрей Витальевич Макаров
Лариса Петровна Некрасова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова" filed Critical Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова"
Priority to RU2019144078A priority Critical patent/RU2732600C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2732600C1 publication Critical patent/RU2732600C1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Abstract

FIELD: biochemistry.
SUBSTANCE: invention relates to biochemistry, in particular to a method for preparing a nootropic composition based on polypeptide complexes recovered from neuronal progenitor cells under hypoxic conditions, as well as to a nootropic composition based on polypeptide complexes recovered from neuronal progenitor cells under hypoxic conditions. Said composition is characterized by that it contains proteins and polypeptides with molecular weight from 5 kDa to 250 kDa, cerebral neurotrophic factor (BDNF) of at least 130 pg/ml and a glial neurotrophic factor (GDNF) of at least 30 pg/ml, vascular endothelium growth factor (VEGF) of not less than 90 pg/ml, total protein weight of not less than 1 mg/ml of the preparation. Cell culture of neuronal progenitor cells from which the composition is produced demonstrates neuronal expression β-tubulin III, molecules of adhesion of nerve cells (PSA-NCAM) and consists of 95±5 % TUBB3+ cells.
EFFECT: invention enables to efficiently obtain a protein-peptide composition, which includes not only small peptides, but also full-length protein neuronal growth and differentiation factors, the effectiveness of which is certainly higher than that of short peptides, and immunogenicity is absent.
2 cl, 4 ex, 2 dwg

Description

Заболевания центральной нервной системы, такие как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, обычно приводят к необратимому повреждению структур нервной ткани, что часто сопровождается серьезными когнитивными или моторными нарушениями. Помимо ограниченного потенциала эндогенной регенерации в центральной нервной системе, методы лечения таких расстройств в значительной степени являются симптоматическими и лишь временно улучшают качество жизни пациентов [Song CG, Zhang YZ, Wu HN, et al. 2018]. Поэтому необходим поиск новых способов лечения заболеваний центральной нервной системы. В 2006 году Яманака продемонстрировал, что соматические клетки можно репрограммировать в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Это позволило к настоящему времени получать различные типы клеток, в том числе нейроны и глию, от взрослых доноров [Takahashi, Kazutoshi, and Shinya Yamanaka. 2006].Diseases of the central nervous system, such as Alzheimer's disease and Parkinson's disease, usually result in permanent damage to the structures of the nervous tissue, which is often accompanied by severe cognitive or motor impairment. In addition to the limited potential of endogenous regeneration in the central nervous system, treatments for such disorders are largely symptomatic and only temporarily improve the quality of life of patients [Song CG, Zhang YZ, Wu HN, et al. 2018]. Therefore, it is necessary to search for new ways to treat diseases of the central nervous system. In 2006, Yamanaka demonstrated that somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells. This has made it possible to date to obtain a variety of cell types, including neurons and glia, from adult donors [Takahashi, Kazutoshi, and Shinya Yamanaka. 2006].

Терапия стволовыми клетками является многообещающей возможностью для лечения неврологических расстройств, обоснованность такого подхода была подтверждена в последние годы во множестве исследований на животных [Zakrzewski W,

Figure 00000001
Szymonowicz М, Rybak Z. 2019] Механизмы, лежащие в основе положительных эффектов, многообразны и включают в себя: непосредственную замену погибших клеток, восстановление поврежденной ткани путем слияния с эндогенными клетками, паракринный и иммуномодулирующий эффект. В частности, паракринный эффект может быть обусловлен секрецией факторов роста (FGF, EGF, VEGF), нейротрофинов (BDNF, GDNF, NGF, NT3-5, CNTF), экзосом. [Kwak KA, Lee SP, Yang JY, Park YS. 2018] Для практического использования паракринного эффекта стволовых клеток возможно применение кондиционированных сред стволовых клеток (КС). Существуют данные, подтверждающие эффективность КС в моделях in vivo при неврологических заболеваниях, таких как ишемический инсульт - при введении КС нейральных стволовых клеток (НСК) крысам с моделированным ишемическим инсультом показатели оценки неврологического статуса были выше, чем в контрольной группе, объем инфаркта снижался по сравнению с контролем, так же были исследованы изменение уровня апоптотической активности методом TUNEL, который также показал снижение клеточной гибели. В модели спинальной травмы изучалось действие КС НСК на жизнеспособность нейронов и регенерацию аксонов кортикоспинального тракта. Применение КС приводило к экстенсивному росту аксонов в шейном отделе и более чем утроило образование синаптических контактов между коллатералями кортикоспинального тракта и проприоспинальными интернейронами. КС также уменьшала экспрессию каспазы 3 и снижала гибель нейронов через 6 недель после травмы [Peng Liang, Jiaren Liu et al. 2014].Stem cell therapy is a promising opportunity for the treatment of neurological disorders, the validity of this approach has been confirmed in recent years in many animal studies [Zakrzewski W,
Figure 00000001
Szymonowicz M, Rybak Z. 2019] The mechanisms underlying the positive effects are diverse and include: direct replacement of dead cells, restoration of damaged tissue by fusion with endogenous cells, paracrine and immunomodulatory effects. In particular, the paracrine effect may be due to the secretion of growth factors (FGF, EGF, VEGF), neurotrophins (BDNF, GDNF, NGF, NT3-5, CNTF), exosomes. [Kwak KA, Lee SP, Yang JY, Park YS. 2018] For the practical use of the paracrine effect of stem cells, it is possible to use conditioned stem cell (CS) media. There are data confirming the effectiveness of CS in in vivo models for neurological diseases, such as ischemic stroke - when the CS of neural stem cells (NSC) was injected into rats with simulated ischemic stroke, the indicators of the neurological status assessment were higher than in the control group, the volume of the infarction decreased compared to with control, changes in the level of apoptotic activity were also investigated by the TUNEL method, which also showed a decrease in cell death. In the model of spinal trauma, the effect of CS NSC on the viability of neurons and regeneration of axons of the corticospinal tract was studied. The use of CS led to extensive growth of axons in the cervical spine and more than tripled the formation of synaptic contacts between collaterals of the corticospinal tract and propriospinal interneurons. CS also decreased caspase 3 expression and decreased neuronal death 6 weeks after injury [Peng Liang, Jiaren Liu et al. 2014].

Также проведенные клинические испытания пептидного препарата Церебролизин, содержащего аминокислоты и полипептиды молекулярной массой до 10 кДа, свидетельствуют о его эффективности при сосудистых деменциях [Chen N, et al. 2013]. Более того, в последнее время появились данные о нейропротекторных свойствах белков теплового шока и возможной их секреции из клеток в окружающую среду. Предположительно, секреция белков теплового шока стволовыми и прогениторными клетками при воздействии повышенной температуры должна усилить нейропротекторное действие.Also, clinical trials of the peptide preparation Cerebrolysin containing amino acids and polypeptides with molecular weight up to 10 kDa indicate its effectiveness in vascular dementia [Chen N, et al. 2013]. Moreover, recently there have been data on the neuroprotective properties of heat shock proteins and their possible secretion from cells into the environment. Presumably, the secretion of heat shock proteins by stem and progenitor cells when exposed to elevated temperatures should enhance the neuroprotective effect.

В настоящее время ИПСК рассматриваются как самый перспективный источник нейральных предшественников для регенеративной медицины, позволяющий получать клеточные популяции различных типов на разных, заранее запланированных этапах эмбрионального развития. И при этом проблемы дефицита донорского материала и этические вопросы, возникающие при применении эмбрионального материала и культур эмбриональных стволовых клеток, полностью отсутствуют. Получение ИПСК уже стало рутинной задачей, хотя экспериментальные исследования проводятся только последние 10 лет. В результате экспериментов по ретровирусной трансдукции генами различных транскрипционных факторов мышиных фибробластов были идентифицированы 4 гена - Oct-4, Sox2, с-Мус и Klf4, которые переводили их в плюрипотентное состояние. Клетки, полученные таким образом, назвали индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК) [Takahashi K., Yamanaka S. 2006]. Затем ИПСК были успешно получены из фибробластов человека с использованием того же набора транскрипционных факторов [Takahashi K. et al., 2007]. Другой научной группой были получены ИПСК человека с использованием иного набора транскрипционных факторов: Oct4, Sox2, Nanog и Lin28 [Yu J. et al., 2007]. Дальнейшие исследования продемонстрировали возможность получения ИПСК как от различных млекопитающих: крыс [Li W. et al., 2009], макак-резусов [Liu Н. et al., 2008], свиней [Kwon D.-J. et al., 2013]; так и из различных типов соматических клеток человека: кератиноцитов [Aasen Т. et al., 2008], нейрональных клеток [Eminli S. et al., 2008.], клеток печени и клеток желудка [Aoi, 2008], терминально дифференцированных лимфоцитов, а также из эндотелия [Lagarkova М.А. et al., 2010]. Эти исследования продемонстрировали универсальность процесса репрограммирования соматических клеток до плюрипотентного состояния с помощью введения в клетки генов транскрипционных факторов. Целый ряд подходов был разработан для того чтобы доставлять репрограммирующие факторы в соматические клетки. Были также продемонстрированы и другие методы репрограммирования соматических клеток до плюрипотентного состояния без интеграции экзогенной ДНК в геном клетки-хозяина: с использованием piggyBac транспозона [Woltjen K. et al., 2009], синтетической РНК, аденовирусных векторов [Zhou W., Freed C.R., 2009], вируса Сендай [Fusaki N. et al., 2009], эписомных векторов [Yu J. et al., 2009], белков [Kim D. et al., 2009]. Тесты на способность к дифференцировке считают ключевыми в доказательстве плюрипотентности клеток. Для ИПСК человека в качестве основных тестов используются in vitro дифференцировки, формирование тератом при введении иммунодефицитным мышам и способность к образованию эмбриоидных телец. Плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) обладают естественным свойством дифференцироваться во все типы клеток взрослого организма, но важнейшей экспериментальной задачей является осуществление дифференцировки плюрипотентных клеток in vitro в нужном направлении с использованием специальных условий культивирования, биологически активных химических соединений и белковых факторов. Эффективный метод дифференцировки ИПСК в нейральном направлении основан на блокировании BMP и TGF-β сигнальных путей, такими молекулами как Noggin, дорсоморфин, SB431542 и LDN193189 на ранних стадиях дифференцировки [Fingar D.С, et al., 2004]. Такой подход при длительном культивировании позволил получить до 90% клеток, которые экспрессировали маркеры нейроэктодермы РАХ6 и PSA-NCAM (молекула адгезии нервных клеток). Для дальнейшей дифференцировки в нейрональные предшественники необходима активация Shh сигнального пути, а также добавление в среду для культивирования фактора роста фибробластов FGF2. Полученные таким образом предшественники экспрессируют маркер незрелых нейронов β-тубулин III. Рутинный способ получения ИПСК, а также существование известных методов дифференцировки ИПСК в нейральном направлении делают применение нейрональных предшественников наиболее перспективными кандидатами при терапии ИИ. Возможность эффективной экспансии ИПСК позволит решить проблему дефицита донорского материала и снять ряд этических вопрос. На сегодняшний день большое количество научных групп ведут разработки в области нейральной дифференцировке ИПСК. Основными лидерами по данному направлению являются институт генетических болезней и геномных наук, Токио, Япония (Department of Genetic Diseases and Genomic Science, The Jikei University School of Medicine, Tokyo, Japan); Центр исследования и применения ИПСК, Университет Киото, Япония (Centre for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Japan); Центр клеточной биологии, Китай (Department of Cell Biology, Xuanwu Hospital of Capital Medical University, Beijing, China). Данные лаборатории проводят передовые исследования по дифференцировке ИПСК, рационализируют и создают международно признанные протоколы дифференцировки ИПСК, более того проводятся экспериментальные разработки по введению дифференцированных нейральных ИПСК в органы-мишени. В этой связи стоит отметить Лабораторию Института Биоинженерии и нанотехнологии, Сингапур (Institute of Bioengineering and Nanotechnology, 31 Biopolis Way, The Nanos, Singapore 138669, Singapore), осуществляющую инновационные разработки в области дифференцировки ИПСК, и методов целенаправленной доставки в органы-мишени дифференцированных клеток, с использованием 3D микрофиброзных капсул, которые увеличивают эффективность доставки. Европейские лаборатории и лаборатории США, Канады занимают лидирующее положение по общему количеству проведенных исследовательских работ в области нейральной дифференцировки ИПСК. При изучении литературы часто встречаются современные разработки лаборатории Центра Генетики Университета шт. Висконсин совместно с институтом биомедицинских исследований, Кэмбридж (Waisman Center, Genome Center, Department of Anatomy, and Department of Neurology, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin, Madison. Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge). В данных работах можно отметить передовые исследования по поиску новых регуляторных механизмов в области нейральной дифференцировки ИПСК.At present, iPSCs are considered as the most promising source of neural precursors for regenerative medicine, which makes it possible to obtain cell populations of various types at different, pre-planned stages of embryonic development. And at the same time, the problems of shortage of donor material and ethical issues arising from the use of embryonic material and cultures of embryonic stem cells are completely absent. The production of iPSCs has already become a routine task, although experimental studies have been carried out only for the last 10 years. As a result of experiments on retroviral transduction by genes of various transcription factors of mouse fibroblasts, 4 genes - Oct-4, Sox2, c-Myc, and Klf4 - were identified, which transferred them to a pluripotent state. The cells obtained in this way were called induced pluripotent stem cells (iPSCs) [Takahashi K., Yamanaka S. 2006]. Then iPSCs were successfully obtained from human fibroblasts using the same set of transcription factors [Takahashi K. et al., 2007]. Another scientific group obtained human iPSCs using a different set of transcription factors: Oct4, Sox2, Nanog and Lin28 [Yu J. et al., 2007]. Further studies have demonstrated the possibility of obtaining iPSCs both from various mammals: rats [Li W. et al., 2009], rhesus monkeys [Liu N. et al., 2008], pigs [Kwon D.-J. et al., 2013]; and from various types of human somatic cells: keratinocytes [Aasen T. et al., 2008], neuronal cells [Eminli S. et al., 2008.], liver and stomach cells [Aoi, 2008], terminally differentiated lymphocytes, as well as from the endothelium [Lagarkova MA et al., 2010]. These studies demonstrated the versatility of the process of reprogramming somatic cells to a pluripotent state by introducing transcription factor genes into cells. A variety of approaches have been developed to deliver reprogramming factors to somatic cells. Were also demonstrated other methods of reprogramming somatic cells to a pluripotent state without integrating exogenous DNA into the genome of the host cell: using piggyBac transposon [Woltjen K. et al., 2009], synthetic RNA, adenoviral vectors [Zhou W., Freed CR, 2009], Sendai virus [Fusaki N. et al., 2009], episomal vectors [Yu J. et al., 2009], proteins [Kim D. et al., 2009]. Differentiation tests are considered key in proving cell pluripotency. For human iPSCs, in vitro differentiation, the formation of teratomas when administered to immunodeficient mice, and the ability to form embryoid bodies are used as the main tests. Pluripotent stem cells (PSCs) naturally differentiate into all types of adult cells, but the most important experimental task is to differentiate pluripotent cells in vitro in the desired direction using special cultivation conditions, biologically active chemical compounds, and protein factors. An effective method of iPSC differentiation in the neural direction is based on blocking BMP and TGF-β signaling pathways, by such molecules as Noggin, dorsomorphin, SB431542 and LDN193189 at the early stages of differentiation [Fingar D.C, et al., 2004]. This approach, during long-term cultivation, made it possible to obtain up to 90% of cells that expressed the neuroectoderm markers PAX6 and PSA-NCAM (nerve cell adhesion molecule). For further differentiation into neuronal progenitors, activation of the Shh signaling pathway is required, as well as the addition of fibroblast growth factor FGF2 to the culture medium. The precursors thus obtained express the immature neuron marker β-tubulin III. The routine method of obtaining iPSCs, as well as the existence of known methods for differentiating iPSCs in the neural direction, make the use of neuronal precursors the most promising candidates for IS therapy. The possibility of effective expansion of iPSCs will solve the problem of the lack of donor material and remove a number of ethical issues. Today, a large number of research groups are developing in the field of neural differentiation of iPSCs. The main leaders in this area are the Institute of Genetic Diseases and Genomic Science, The Jikei University School of Medicine, Tokyo, Japan; Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Japan; Center for Cell Biology, China (Department of Cell Biology, Xuanwu Hospital of Capital Medical University, Beijing, China). These laboratories conduct cutting-edge research on the differentiation of iPSCs, rationalize and create internationally recognized protocols for iPSC differentiation; moreover, experimental developments are underway to introduce differentiated neural iPSCs into target organs. In this regard, it is worth noting the Laboratory of the Institute of Bioengineering and Nanotechnology, 31 Biopolis Way, The Nanos, Singapore 138669, Singapore, which carries out innovative developments in the field of iPSC differentiation, and methods of targeted delivery of differentiated cells to target organs. , using 3D microfiber capsules that increase delivery efficiency. European laboratories and laboratories in the USA and Canada occupy a leading position in the total number of research works in the field of neural differentiation of iPSCs. When studying the literature, modern developments of the laboratory of the Genetics Center of the University of St. Wisconsin in collaboration with the Institute for Biomedical Research, Cambridge (Waisman Center, Genome Center, Department of Anatomy, and Department of Neurology, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin, Madison. Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge). In these works, one can note the advanced research on the search for new regulatory mechanisms in the field of neural differentiation of iPSCs.

Однако активность клеток зависит от условий окружающей среды и некоторые воздействия, в частности тепловой шок, гипоксия, наличие экзогенных факторов, введение новых генов или увеличение их копийности путем трансдукции или трансфекции, может влиять на синтетическую активность клеток, тем самым увеличивая или уменьшая их секреторную функцию [Mazzio ЕА, Soliman KF. 2012]. Гипоксия - пониженное содержание кислорода в организме или отдельных органах и тканях. На молекулярном уровне гипоксия вызывает высоко скоординированные клеточные реакции, направленные на обеспечение жизнеспособности клеток. Семенза и его коллеги обнаружили фактор, индуцируемый гипоксией, HIF-1, при изучении регуляции экспрессии гена эритропоэтина (ЕРО) во время гипоксического стресса [Ramakrishnan S, Anand V, Roy S. 2014]. HIF представляют собой семейство гетеродимерных белков, состоящих из альфа-субъединицы и бета-субъединицы. Альфа-субъединица экспрессируется во время гипоксии, тогда как бета-субъединица конститутивна. Бета-субъединица называется ядерным транслокатором арильных углеводородных рецепторов (ARNT). Последующие исследования показали, что HIF-1 связывается с консенсусной последовательностью NCGTG, называемой элементом ответа на гипоксию (HRE). HRE-сайты присутствуют в промоторе сотен генов, которые функционально связаны с гипоксической адаптацией. Например, HIF индуцирует экспрессию GLUT-1, переносчика глюкозы, который увеличивает внутриклеточные уровни гликолитического субстрата. В то же время многие ферменты необходимы для повышенного расщепления сахара, гексокиназы-1, глюкозо-6-фосфат-изомеразы, фосфофруктокиназы, PFK1, фермента, ограничивающего скорость гликолиза, фосфоглицерат-мутазы-1 (PGAM1), пируваткиназы типа М- 2 (PKM2), лактатдегидрогеназа (LDHA) увеличивается с помощью HIF-1-опосредованной трансактивации. [Kihira, Yoshitaka, et al. 2015]. В дополнение к поддержанию энергетического гомеостаза, HIF также непосредственно ответственен за увеличение производства ЕРО, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), необходимого для ангиогенеза. Три основных системы лиганд-рецептор активируются при гипоксическом стрессе, VEGF-VEGFR, Angiopoietins-Tie-1 / Tie-2 и Delta-Notch. Скоординированный выход этих сигнальных систем определяет ангиогенез, кровоток, перфузию тканей, экстравазацию воспалительных клеток, ремоделирование и восстановление тканей. [Pham, Isabelle, et al. 2002]. Гипоксия усиливает синтез и секрецию BDNF посредством механизмов мобилизации внутриклеточного кальция через инозитол 1,4,5-трифосфат (IP3) - и рианодин-чувствительные каналы [Hartman W, Helan М, Smelter D, et al. 2015]. Влияние гипоксии на секрецию других нейротрофинов и изменения состава секретируемых экзосом и цитокинов является активно исследуемым вопросом. Создание условий кислородного голодания возможно двумя основными путями - непосредственным изменением газового состава окружающий среды (смесь газов с содержанием кислорода от 1 до 2%.) с помощью герметичной камеры инкубатора или использования химического агента (наиболее часто используемым является хлоридом кобальта - CoCl2). Газовая камера и химические модели используются взаимозаменяемо. [Calvo-Anguiano G, Lugo-Trampe JJ, Camacho A, et al. 2018].However, the activity of cells depends on environmental conditions and some influences, in particular heat shock, hypoxia, the presence of exogenous factors, the introduction of new genes or an increase in their copy number by transduction or transfection, can affect the synthetic activity of cells, thereby increasing or decreasing their secretory function. [Mazzio EA, Soliman KF. 2012]. Hypoxia is a low oxygen content in the body or individual organs and tissues. At the molecular level, hypoxia induces highly coordinated cellular responses to promote cell viability. Semenza and colleagues discovered the hypoxia-inducible factor, HIF-1, when studying the regulation of erythropoietin (EPO) gene expression during hypoxic stress [Ramakrishnan S, Anand V, Roy S. 2014]. HIFs are a family of heterodimeric proteins composed of an alpha subunit and a beta subunit. The alpha subunit is expressed during hypoxia, while the beta subunit is constitutive. The beta subunit is called the aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT). Subsequent studies showed that HIF-1 binds to an NCGTG consensus sequence called hypoxia response element (HRE). HRE sites are present in the promoter of hundreds of genes that are functionally associated with hypoxic adaptation. For example, HIF induces the expression of GLUT-1, a glucose transporter that increases intracellular levels of glycolytic substrate. At the same time, many enzymes are required for increased breakdown of sugar, hexokinase-1, glucose-6-phosphate isomerase, phosphofructokinase, PFK1, glycolysis rate limiting enzyme, phosphoglycerate mutase-1 (PGAM1), pyruvate kinase type M-2 (PKM2 ), lactate dehydrogenase (LDHA) is increased by HIF-1-mediated transactivation. [Kihira, Yoshitaka, et al. 2015]. In addition to maintaining energy homeostasis, HIF is also directly responsible for increasing the production of EPO, a vascular endothelial growth factor (VEGF) required for angiogenesis. Three major ligand-receptor systems are activated under hypoxic stress, VEGF-VEGFR, Angiopoietins-Tie-1 / Tie-2, and Delta-Notch. The coordinated output of these signaling systems determines angiogenesis, blood flow, tissue perfusion, extravasation of inflammatory cells, and tissue remodeling and repair. [Pham, Isabelle, et al. 2002]. Hypoxia enhances the synthesis and secretion of BDNF through the mechanisms of intracellular calcium mobilization through inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) - and ryanodine-sensitive channels [Hartman W, Helan M, Smelter D, et al. 2015]. The effect of hypoxia on the secretion of other neurotrophins and changes in the composition of secreted exosomes and cytokines is an actively investigated issue. The creation of conditions for oxygen starvation is possible in two main ways - by directly changing the gas composition of the environment (a mixture of gases with an oxygen content of 1 to 2%) using a sealed incubator chamber or using a chemical agent (the most commonly used is cobalt chloride - CoCl2). The gas chamber and chemistry models are used interchangeably. [Calvo-Anguiano G, Lugo-Trampe JJ, Camacho A, et al. 2018].

Основная причина, ограничивающая эффективность и безопасность всех существующих нейропептидных препаратов, полученных из головного мозга млекопитающих - это их ксеногенное происхождение. При выделении нейропептидов из тканей головного мозга животных для снижения их иммуногенности (антигенных свойств) прибегают к кислотному или ферментативному гидролизу белков и высокомолекулярных полипептидов, тем самым уменьшая количество нейротрофических факторов роста белковой и полипептидной природы [Хабриева. У., 2005]. Пептидный препарат, полученный таким способом, содержит денатурированные продукты кислотного гидролиза белков и полипептидов с нарушенной четвертичной и третичной структурой, что снижает его специфичность и биологическую активность, повышает его иммуногенность, вызывая аллергические реакции при применении.The main reason limiting the effectiveness and safety of all existing neuropeptide drugs derived from the mammalian brain is their xenogenic origin. When isolating neuropeptides from the brain tissues of animals to reduce their immunogenicity (antigenic properties), they resort to acidic or enzymatic hydrolysis of proteins and high molecular weight polypeptides, thereby reducing the amount of neurotrophic growth factors of protein and polypeptide nature [Khabrieva. U., 2005]. The peptide preparation obtained in this way contains denatured products of acidic hydrolysis of proteins and polypeptides with a disturbed quaternary and tertiary structure, which reduces its specificity and biological activity, increases its immunogenicity, causing allergic reactions when applied.

Для решения данной проблемы нами предложено получить белково-пептидную композицию с выраженными ноотропными свойствами из секретома нейрональных прогениторных клеток в условиях гипоксии, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Данная композиция характеризуется тем, что в ее состав входят белки и полипептиды с молекулярной массой от 5 кДа до 250 кДа, мозговой нейротрофический фактор (BDNF) не менее 130 пг/мл и глиального нейротрофического фактора (GDNF) не менее 30 пг/мл, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) не менее 90 пг/мл, суммарная масса белка не менее 1 мг/мл препарата, при этом клеточная культура нейрональных прогениторных клеток, из которой получают композицию, демонстрирует экспрессию нейронального β-тубулина III, молекулы адгезии нервных клеток (PSA-NCAM) и состоит из 95±5% TUBB3+ - клеток.To solve this problem, we proposed to obtain a protein-peptide composition with pronounced nootropic properties from the secretome of neuronal progenitor cells under hypoxic conditions, obtained by the method of directed differentiation of induced human pluripotent stem cells. This composition is characterized by the fact that it contains proteins and polypeptides with molecular weights from 5 kDa to 250 kDa, brain neurotrophic factor (BDNF) not less than 130 pg / ml and glial neurotrophic factor (GDNF) not less than 30 pg / ml, factor vascular endothelial growth (VEGF) not less than 90 pg / ml, the total protein mass not less than 1 mg / ml of the drug, while the cell culture of neuronal progenitor cells from which the composition is obtained demonstrates the expression of neuronal β-tubulin III, a nerve cell adhesion molecule ( PSA-NCAM) and consists of 95 ± 5% TUBB3 + - cells.

Наиболее важным направлением современной медицины и биологической науки является выделение из клеточных культур биологически активных веществ, прежде всего молекул, запускающих каскад процессов регенерации и паракринной индукции репаративных процессов. Применение охарактеризованного и стандартизованного комплекса биологически активных веществ может обладать той же эффективностью, но гораздо большей безопасностью по сравнению с живыми клеточными культурами. Возможность эффективной экспансии ИПСК и их дифференцировки в разных направлениях, в том числе нейрональном, решают проблему дефицита донорского материала и снимают ряд этических вопросов.The most important area of modern medicine and biological science is the isolation of biologically active substances from cell cultures, primarily molecules that trigger a cascade of regeneration processes and paracrine induction of reparative processes. The use of a characterized and standardized complex of biologically active substances can have the same efficiency, but much greater safety compared to living cell cultures. The possibility of effective expansion of iPSCs and their differentiation in different directions, including neuronal, solves the problem of lack of donor material and removes a number of ethical issues.

Изобретение осуществляется следующим образом:The invention is carried out as follows:

Пример 1. Получение белково-пептидного комплекса.Example 1. Obtaining a protein-peptide complex.

Забор биоптата кожи (размером от 0,5 до 1 см2) производят за ушной раковиной или с внутренней стороны предплечья. После отсечения с помощью микрохирургического лезвия, биоптат помещают в стерильный флакон, содержащий транспортную среду (F12 с амикацином, 0,5 г/л). Флакон с содержимым маркируют следующими данными: ФИО донора, дата и время забора. Транспортировку производят при температуре 2-6°С.A skin biopsy sample (0.5 to 1 cm 2 ) is taken behind the auricle or on the inside of the forearm. After cutting with a microsurgical blade, the biopsy specimen is placed in a sterile vial containing a transport medium (F12 with amikacin, 0.5 g / L). The vial with the contents is marked with the following data: name of the donor, date and time of collection. Transportation is carried out at a temperature of 2-6 ° C.

Полученный материал в стерильных условиях переносят в чашки Петри и трижды промывают раствором Хенкса с цефазолином (1 г/л), затем дезагрегируют путем инкубации в растворе Версена с добавлением 0,25% трипсина. В течение 1-1,5 часов при 37°С. После инкубации суспензию интенсивно перемешивают и центрифугируют в течение 10 мин при 1400 об/мин. Осадок разводят культуральной средой (DMEM/F12 1:1 с добавлением 10% сыворотки, 500 мг/л амикацина), перемешивают и переносят в культуральную посуду. Культуральные флаконы помещают в CO2-инкубатор (37°С, 5% CO2). Через 2-3 дня осуществляют замену культуральной среды на свежую. Наращивание и пересевы осуществляют раствором Версена с добавлением 0,25% трипсина и переносят в новые чашки Петри. Коэффициент рассева выбирают в зависимости от индивидуальных пролиферативных характеристик фибробластов. Культивируют не более четырех пассажей. Перед программированием необходимо провести контроль стабильности кариотипа и способность фибробластов синтезировать коллаген I типа (с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания).The resulting material is transferred under sterile conditions into Petri dishes and washed three times with Hanks solution with cefazolin (1 g / l), then disaggregated by incubation in Versene solution with the addition of 0.25% trypsin. Within 1-1.5 hours at 37 ° C. After incubation, the suspension is vigorously mixed and centrifuged for 10 min at 1400 rpm. The precipitate is diluted with culture medium (DMEM / F12 1: 1 with the addition of 10% serum, 500 mg / l amikacin), mixed and transferred to culture dishes. The culture flasks are placed in a CO2 incubator (37 ° C, 5% CO2). After 2-3 days, the culture medium is replaced with a fresh one. Growing and reseeding is carried out with Versene solution with the addition of 0.25% trypsin and transferred to new Petri dishes. The seeding ratio is selected depending on the individual proliferative characteristics of fibroblasts. No more than four passages are cultivated. Before programming, it is necessary to control the stability of the karyotype and the ability of fibroblasts to synthesize type I collagen (using immunofluorescent staining).

При необходимости длительного хранения полученные фибробласты подвергают криоконсервации. В боксе на ледяной бане (при 4°С) готовят криозащитный раствор, состоящий из 10% ДМСО (диметилсульфоксид) и 90% аутогенной сыворотки. Клеточную культуру дезагрегируют раствором Версена с добавлением 0,25% трипсина, подсчитывают количество клеток с помощью счетчика и осаждают клетки центрифугированием (1400 об/мин, 10 мин). К осадку добавляют свежеприготовленный криозащитный раствор из расчета 1 мл на 5 млн. клеток, перемешивают и помещают полученную суспензию в криопробирки. Маркируют, указывая ФИО донора, номер пассажа, количество клеток, дату криозамораживания, данные ответственного исполнителя.If long-term storage is required, the resulting fibroblasts are cryopreserved. In a box in an ice bath (at 4 ° C), a cryoprotective solution is prepared, consisting of 10% DMSO (dimethyl sulfoxide) and 90% autogenous serum. The cell culture is disaggregated with a Versene solution with the addition of 0.25% trypsin, the number of cells is counted using a counter and the cells are pelleted by centrifugation (1400 rpm, 10 min). A freshly prepared cryoprotective solution is added to the sediment at the rate of 1 ml per 5 million cells, mixed and the resulting suspension is placed in cryovials. Mark, indicating the name of the donor, the passage number, the number of cells, the date of cryofreezing, the data of the responsible executor.

Образцы замораживают до - 80°С с помощью программного замораживателя, а затем помещают в сосуды Дьюара с жидким азотом и хранят при - 196°С.Samples are frozen to -80 ° C using a software freezer, and then placed in Dewar flasks with liquid nitrogen and stored at -196 ° C.

Для разморозки криопробирки извлекают из сосуда Дьюара и размораживают при температуре 37°С на водяной бане. Клеточную суспензию из криопробирки переносят в центрифужную пробирку с культуральной средой, наполненной до десятикратного объема и центрифугируют при 1400 об/мин в течение 10 мин. Клеточный осадок переносят в культуральную посуду с полной ростовой средой.For defrosting, cryotubes are removed from the Dewar flask and thawed at 37 ° C in a water bath. The cell suspension from the cryotube is transferred into a centrifuge tube with a culture medium filled to ten times its volume and centrifuged at 1400 rpm for 10 minutes. The cell pellet is transferred to a culture dish with complete growth medium.

Перед процедурой репрограммирования культуру фибробластов переводят на среду, не содержащую компоненты животного происхождения. Для этого, согласно протоколу фибробласты 1-2 пассажа промывают фосфатно-солевым буфером и открепляют раствором Трипсин/Версен 1:1 в течение 3-5 мин. Суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 1100 об/мин, после чего отбирают супернатант, а к осадку добавляют среду DMEM с содержанием 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 mM L-глутамина, пенициллина-стрептомицина 100 мг/л и рассаживают в количестве 1500-2000 клеток/см2 на чашки Петри диаметром 60 мм, покрытые коллагеном Coating Matrix Kit (Corning, США). Через 24 часа прикрепившиеся клетки промывают дважды фосфатно-солевым буфером и производили замену среды, состоящую из DMEM/F12, HEPES, натрия бикарбоната 4,8 г/мл, 10% заменителя сыворотки Knockout SR, фактора роста фибробластов человека bFGF 10 мкг/мл, эпидермального фактора роста человека EGF 1 мг/мл, 2 мкМ гидрокортизона. Для адаптации клеток к новой среде культивирование проводят в течение 1-2 пассажей.Before the reprogramming procedure, the culture of fibroblasts is transferred to a medium that does not contain components of animal origin. For this, according to the protocol, fibroblasts 1-2 passages are washed with phosphate-buffered saline and detached with Trypsin / Versene 1: 1 solution for 3-5 minutes. The cell suspension is centrifuged for 5 min at 1100 rpm, after which the supernatant is removed, and DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, penicillin-streptomycin 100 mg / l is added to the sediment and seated in an amount of 1500-2000 cells / cm 2 on Petri dishes 60 mm in diameter coated with the Coating Matrix Kit collagen (Corning, USA). After 24 hours, the adherent cells were washed twice with phosphate-buffered saline and the medium was replaced, consisting of DMEM / F12, HEPES, sodium bicarbonate 4.8 g / ml, 10% serum substitute Knockout SR, human fibroblast growth factor bFGF 10 μg / ml, human epidermal growth factor EGF 1 mg / ml, 2 μM hydrocortisone. To adapt cells to a new environment, cultivation is carried out for 1-2 passages.

Для репрограммирования фибробластов используют коммерческий набор для репрограммирования клеток человека «CTS CytoTune-iPS 2.1 Sendai Reprogramming Kit» (Invitrogen, США) на основе вируса Сендай. За день до репрограммирования фибробласты высевают в количестве 200 тысяч на лунку 6-луночного планшета, предварительно покрыв коллагеном, и культивировали в 2,5 мл среды без экзогенных компонентов. На следующий день добавляют вектора, несущие гены Oct4 и Sox2 (KOS), L-Myc (hL-Myc), Klf-4 (hKlf4) в количестве вирусных частиц на клетку (MOI) - 5, 5 и 3 соответственно. Через сутки производят замену среды для фибробластов без экзогенных компонентов, далее смена среды происходит ежедневно в течение 6 дней. На 7-ой день после репрограммирования клетки промывают дважды фосфатно-солевым буфером, открепляют их реагентом TrypLE Select и центрифугируют при 1100 об/мин в течение 5 мин. Полученный супернатант отбирают, а клеточный осадок пересаживают в количестве 100 тысяч на чашку Петри диаметром 60 мм, предварительно покрыв витронектином в концентрации 10 мкг/мл. Через 24 часа после посева производят замену среды на Essential 8 Medium для культивирования плюрипотентных клеток человека. Смену среды осуществляют каждый день.For reprogramming fibroblasts, a commercial kit for reprogramming human cells "CTS CytoTune-iPS 2.1 Sendai Reprogramming Kit" (Invitrogen, USA) based on the Sendai virus is used. The day before reprogramming, fibroblasts are seeded in an amount of 200 thousand per well of a 6-well plate, previously covered with collagen, and cultured in 2.5 ml of medium without exogenous components. The next day, vectors are added carrying the genes Oct4 and Sox2 (KOS), L-Myc (hL-Myc), Klf-4 (hKlf4) in the number of viral particles per cell (MOI) - 5, 5 and 3, respectively. A day later, the medium for fibroblasts is replaced without exogenous components, then the medium is changed daily for 6 days. On the 7th day after reprogramming, cells are washed twice with PBS, detached with TrypLE Select reagent, and centrifuged at 1100 rpm for 5 minutes. The resulting supernatant was removed, and the cell pellet was transplanted in the amount of 100 thousand per Petri dish 60 mm in diameter, previously coated with vitronectin at a concentration of 10 μg / ml. 24 hours after seeding, the medium is replaced with Essential 8 Medium for the cultivation of human pluripotent cells. The medium is changed every day.

Отбор образовавшихся колоний проводят по результатам прижизненного иммуноцитохимического окрашивания антителами к поверхностному маркеру плюрипотентных клеток - протеогликану TRA-1-60 с помощью коммерческого набора «TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit» (ThermoFisher Scientific, США). Колонии ИПСК, в которых визуализируется высокая экспрессия протеогликана TRA-1-60 отбирают механически наконечником, предварительно обработав раствором Версена, далее сажают на 6-ти луночные планшеты, покрытые витронектином, и культивировали в среде Essential 8 Medium. Дальнейшие пересевы проводят только с помощью раствора Версена и с добавлением в среду ROCK-ингибитора Y27632 в концентрации 5 мкМ в течение суток.The selection of the formed colonies is carried out according to the results of in vivo immunocytochemical staining with antibodies to the surface marker of pluripotent cells - proteoglycan TRA-1-60 using a commercial set "TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit" (ThermoFisher Scientific, USA). Colonies of iPSCs, in which high expression of the proteoglycan TRA-1-60 is visualized, are selected mechanically with a tip, pretreated with a Versene solution, then planted on 6-well plates coated with vitronectin and cultured in Essential 8 Medium. Further subcultures are carried out only with the Versene solution and with the addition of the ROCK inhibitor Y27632 to the medium at a concentration of 5 μM during the day.

При культивировании ИПСК ведется визуальный контроль за морфологическими характеристиками культур. ИПСК растут плотными колониями с ровными краями. Клетки мелкие, с крупными ядрышками. Культивирование осуществляют в чашках Петри диаметром 35 мм, используя культуральную среду Essential 8™ (Е8).During the cultivation of iPSCs, visual control over the morphological characteristics of the cultures is carried out. IPSCs grow in dense colonies with smooth edges. The cells are small, with large nucleoli. Culturing is carried out in 35 mm Petri dishes using Essential 8 ™ culture medium (E8).

Клетки рассаживают по достижении плотности 50-70% монослоя. Из чашек удаляют культуральную среду и промывают 2 мл DPBS. Для дезагрегации добавляют 1 мл раствора Версена и инкубируют 5-8 мин при комнатной температуре. Затем удаляют раствор Версена, добавляют 2 мл среды, взбалтывают и переносят клеточную суспензию на чашки, предварительно покрытые витронектином, и добавляют среды до 2 мл. Замену среды на свежую проводят каждый день.The cells are planted after reaching a density of 50-70% of the monolayer. The culture medium is removed from the plates and washed with 2 ml DPBS. For disaggregation, add 1 ml of Versene solution and incubate for 5-8 min at room temperature. Then remove the Versene solution, add 2 ml of medium, shake and transfer the cell suspension to dishes previously coated with vitronectin, and add the medium to 2 ml. The medium is replaced with a fresh one every day.

Стандартизацию ИПСК проводят по экспрессии генов, специфичных для эмбриональных стволовых клеток ОСТ4, SOX2, NANOG, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60 иммуноцихимическим методом и ПЦР с обратной транскрипцией и.Standardization of iPSCs is carried out by the expression of genes specific for embryonic stem cells OCT4, SOX2, NANOG, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60 by immunocychemistry and PCR with reverse transcription

ИПСК подвергают криоконсервации. Готовят на льду криозащитный раствор из расчета на 1 чашку: 900 мкл среды Е8, 100 мкл DMSO и 1 мкл ингибитора Rho-киназы (сток 5 мМ). Из каждой чашки удаляют среду и промывают 2 мл DPBS. Добавляют 1 мл Версена и инкубируют 5-8 мин при комнатной температуре. Затем удаляют раствор Версена и добавляют 1 мл криозащитного раствора. Клетки снимают с поверхности чашки, перемешивают и переносят в криопробирку объемом 1,8 мл (1 мл на 1 пробирку). Образцы замораживают до - 80°С с помощью программного замораживателя, а затем помещают в сосуды Дьюара с жидким азотом и хранят при - 196°С.IPSCs are cryopreserved. A cryoprotective solution is prepared on ice at the rate of 1 dish: 900 μl of E8 medium, 100 μl of DMSO and 1 μl of Rho-kinase inhibitor (5 mM stock). Remove medium from each plate and wash with 2 ml DPBS. Add 1 ml of Versene and incubate for 5-8 min at room temperature. Then remove the Versene solution and add 1 ml of cryoprotective solution. The cells are removed from the surface of the plate, mixed and transferred to a 1.8 ml cryovial (1 ml per tube). Samples are frozen to -80 ° C using a software freezer, and then placed in Dewar flasks with liquid nitrogen and stored at -196 ° C.

Криопробирки с клеточным материалом извлекают из сосуда Дьюара и размораживают при температуре 37°С на водяной бане.Cryotubes with cellular material are removed from the Dewar flask and thawed at 37 ° C in a water bath.

Клеточную суспензию из криопробирки (1 мл) по каплям переносят в центрифужную пробирку, доливают 9 мл теплой культуральной среды DMEM/F12 до десятикратного объема и центрифугируют при 800 об/мин в течение 5 мин.The cell suspension from a cryovial (1 ml) is transferred dropwise into a centrifuge tube, 9 ml of warm DMEM / F12 culture medium is added to tenfold volume and centrifuged at 800 rpm for 5 minutes.

Отмытые от криоконсерванта клетки переносят на чашки Петри, предварительно покрытые витронектином, с культуральной средой Е8, содержащей ингибитор Rho-киназы. При переносе сохряняют целостность колоний. Адаптация клеток после криоконсервации продолжается от 1 до 3 недель.The cells washed from the cryopreservative are transferred onto Petri dishes, previously coated with vitronectin, with the E8 culture medium containing the Rho kinase inhibitor. During the transfer, the integrity of the colonies is preserved. Cell adaptation after cryopreservation lasts from 1 to 3 weeks.

Для дифференцировки в нейрональном направлении ИПСК обрабатывают раствором Версена, центрифугировали при 800 об/мин в течение 5 мин. Супернатант удаляют, а клеточный осадок переносят в новые чашки Петри диаметром 60 мм, покрытые поли-1-орнитином 20 мкг/мл (Sigma-Aldrich, США) и ламинином 2,5 мкг/мл (Gibco, США). По достижению культуры 80% конфлюэнтности среду Essential 8 Medium меняют на DMEM/F12 с 1% N2, 2 мМ глутамина, пенициллин-стрептомицина 100 мг/л, 10 мкМ SB431542, 2 мкМ дорсоморфина. Среду меняют через день. Через 10-14 дней в культуре начинают появляться розеткоподобные структуры. После, полученную культуру пересевают на чашки Петри, покрытые поли-1-орнитином 20 мкг/мл и ламинином 2,5 мкг/мл, в плотности 250-400 тысяч клеток/см2 и культивировали в среде DMEM/F12 (Панэко, РФ), 2% добавки В27 (Gibco, США), 2 мМ глутамина (Панэко, РФ), пенициллин-стрептомицина 100 мг/л (Панэко, РФ), 10 нг/мл FGF-2 (ProSpec, Великобритания), 1 мкМ пурморфамина (Stemcell Technologies, США) в течение 14 суток, производя замену среды каждые 2 суток.For differentiation in the neuronal direction, iPSCs are treated with Versene solution, centrifuged at 800 rpm for 5 min. The supernatant was removed, and the cell pellet was transferred to new 60 mm Petri dishes coated with 20 μg / ml poly-1-ornithine (Sigma-Aldrich, USA) and 2.5 μg / ml laminin (Gibco, USA). When the culture reaches 80% confluency, Essential 8 Medium is changed to DMEM / F12 with 1% N2, 2 mM glutamine, penicillin-streptomycin 100 mg / l, 10 μM SB431542, 2 μM dorsomorphin. Wednesday is changed every other day. After 10-14 days, rosette-like structures begin to appear in the culture. After that, the resulting culture is subcultured onto Petri dishes coated with poly-1-ornithine 20 μg / ml and laminin 2.5 μg / ml, at a density of 250-400 thousand cells / cm 2 and cultured in DMEM / F12 medium (Paneko, RF) , 2% B27 supplement (Gibco, USA), 2 mM glutamine (Paneco, RF), penicillin-streptomycin 100 mg / L (Paneco, RF), 10 ng / ml FGF-2 (ProSpec, UK), 1 μM purmorphamine ( Stemcell Technologies, USA) within 14 days, changing the medium every 2 days.

Стандартизацию нейральных клеток проводили по экспрессии генов РАХ6, FOXP2, NCAM1, ENO2, Nestin, TUBB3, SOX2.Neural cells were standardized according to the expression of the PAX6, FOXP2, NCAM1, ENO2, Nestin, TUBB3, SOX2 genes.

Для моделирования гипоксии нейрональные предшественники культивируют в течение 3 часов в газовой камере с содержанием кислорода 2%, после чего производят замену среды на DMEM/F12 и культивируют в течение 6 часов. После чего кондиционированную среду собирают и центрифугируют при 300 об/мин в течение 5 мин. Супернатант отбирают и концентрируют в 24 раза с помощью 3 кДа мембран Amicon Ultra (Sigma-Aldrich, США). Полученный концентрат подвергают стерилизующей фильтрации. Композиция включает в себя белки и пептиды молекулярной массой в пределах от 3 до 250 кДа.To simulate hypoxia, neuronal precursors are cultured for 3 hours in a gas chamber with an oxygen content of 2%, after which the medium is replaced with DMEM / F12 and cultured for 6 hours. Then the conditioned medium is collected and centrifuged at 300 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed and concentrated 24-fold using 3 kDa Amicon Ultra membranes (Sigma-Aldrich, USA). The resulting concentrate is subjected to sterilizing filtration. The composition includes proteins and peptides with molecular weights ranging from 3 to 250 kDa.

Пример 2. Характеристика нейрональных прогениторных клеток.Example 2. Characterization of neuronal progenitor cells.

Для подтверждения фенотипа, полученных культур нейрональных прогениторных клеток проводили иммуноцитохимическое окрашивание на нейральные маркеры. Клетки фиксировали 4% раствором формальдегида (Merck KGaA, Германия) 10 мин при комнатной температуре, затем промывали фосфатно-солевым буфером, инкубировали в фосфатно-солевом буфере с 0,25% Triton Х-100 (Sigma-Aldrich, США) и 1% бычьим сывороточным альбумином (AppliChem, Германия) 30 мин, а затем обрабатывали первичными антителами ночь при +4°С. Для нейральных стволовых клеток использовались антитела к белкам Pax6, Tubulin-IIIβ, Nestin и SOX2. Затем клетки промывали фосфатно-солевым буфером и инкубировали с вторичными антителами, меченными флуорохромами Alexa Fluor 488 anti-rabbit, Alexa Fluor 555 anti-mouse (Invitrogen, США) в темноте 60 мин. Ядра красили раствором DAPI (4,6-диамино-2-фенилиндол дигидрохлорид) 1 мкг/мл (Sigma-Aldrich, США) в фосфатно-солевом буфере. Для анализа использовали люминесцентный инвертированный микроскоп Axio Observer.D1 с камерой AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия).To confirm the phenotype of the obtained cultures of neuronal progenitor cells, immunocytochemical staining for neural markers was performed. The cells were fixed with 4% formaldehyde solution (Merck KGaA, Germany) for 10 min at room temperature, then washed with phosphate-buffered saline, incubated in phosphate-buffered saline with 0.25% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, USA) and 1% bovine serum albumin (AppliChem, Germany) for 30 min, and then treated with primary antibodies overnight at + 4 ° C. For neural stem cells, antibodies to Pax6, Tubulin-IIIβ, Nestin, and SOX2 proteins were used. Then the cells were washed with phosphate-buffered saline and incubated with secondary antibodies labeled with Alexa Fluor 488 anti-rabbit and Alexa Fluor 555 anti-mouse fluorochromes (Invitrogen, USA) in the dark for 60 min. The nuclei were stained with a solution of DAPI (4,6-diamino-2-phenylindole dihydrochloride) 1 μg / ml (Sigma-Aldrich, United States) in phosphate-buffered saline. An Axio Observer D1 inverted luminescence microscope with an AxioCam HRc camera (Carl Zeiss, Germany) was used for the analysis.

Количественную оценку проводят с помощью проточной цитометрии. Культуру снимали с помощью раствора Версена (Панэко, РФ) в случае НП или 0,05% раствора трипсина (Панэко, РФ) в случае ГП, центрифугируют 1600 об/мин в течение 5 мин, супернатант отбирают, а осадок промывают раствором Хенкса. После осаждения клетки 10 мин фиксируют 4%-ым раствором параформальдегида, затем клетки промывают фосфатно-солевым раствором. Пермеабилизацию проводят 70% метанолом на льду в течение 10 мин, после чего клетки промывают дважды в фосфатно-солевом растворе и осаждали центрифугированием 1800 об/мин 5 мин. Далее клетки окрашивают первичными антителами против β3-тубулина (разведение 1:500, Abcam), инкубация проходила при +4°С в течение 12 часов. Затем промывали фосфатно-солевым буфером, центрифугируют 1800 об/мин 5 мин и инкубируют с вторичными антителами, меченными флюорохромом Alexa Fluor 555 anti-mouse (разведение 1:600, Invitrogen, США) в темноте 60 мин. Полученную суспензию анализируют, используя проточный цитофлюориметр CyFlow ML, а количество TUBB3+ - клеток считали с помощью программного обеспечения FloMax. По данным проточной цитометрии культуры нейрональных прогениторных клеток должна состоять не менее 99,5±2,45% TUBB3+ - клеток.Quantification is carried out using flow cytometry. The culture was removed using a Versene solution (Paneco, RF) in the case of NP or 0.05% trypsin solution (Paneko, RF) in the case of HP, centrifuged at 1600 rpm for 5 min, the supernatant was removed, and the precipitate was washed with Hanks solution. After sedimentation, the cells are fixed for 10 min with 4% paraformaldehyde solution, then the cells are washed with phosphate-saline solution. Permeabilization is carried out with 70% methanol on ice for 10 min, after which the cells are washed twice in phosphate-saline solution and pelleted by centrifugation at 1800 rpm for 5 min. Then the cells are stained with primary antibodies against β3-tubulin (dilution 1: 500, Abcam), incubation took place at + 4 ° C for 12 hours. Then it was washed with phosphate-buffered saline, centrifuged at 1800 rpm for 5 min, and incubated with secondary antibodies labeled with Alexa Fluor 555 anti-mouse fluorochrome (dilution 1: 600, Invitrogen, USA) in the dark for 60 min. The resulting suspension was analyzed using a CyFlow ML flow cytometer, and the number of TUBB3 + cells was counted using the FloMax software. According to flow cytometry data, the culture of neuronal progenitor cells should consist of at least 99.5 ± 2.45% TUBB3 + - cells.

Для анализа экспрессии нейрональных генов маркеров проводили ПЦР. мРНК выделяли с помощью коммерческого набора «RNeasy Mini Kit» согласно инструкции производителя. Далее проводили синтез кДНК набором «RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit» по протоколу, приложенному в инструкции. Для ПЦР в реальном времени использовали готовую реакционную смесь с интеркалирующим красителем Sybr Green, амплификацию ставили в термоциклере BioRad iQ cycler. Схема реакции: первичная денатурация 95°С, 5 мин.; денатурация 95°С, 20 сек.; отжиг праймеров 55-63°С, 20 сек.; элонгация 72°С, 20 секунд (40 циклов). Уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к усредненным данным амплификации двух генов домашнего хозяйства GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа) и ActB (β-актин). Относительное количество мРНК рассчитывали с помощью ΔС (Т) метода.To analyze the expression of neuronal marker genes, PCR was performed. mRNA was isolated using a commercial RNeasy Mini Kit according to the manufacturer's instructions. Next, cDNA synthesis was carried out using the RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit according to the protocol attached to the instructions. For real-time PCR, a ready-made reaction mixture with an intercalating dye Sybr Green was used; amplification was performed in a BioRad iQ cycler thermal cycler. Reaction scheme: primary denaturation 95 ° С, 5 min; denaturation 95 ° С, 20 sec .; annealing of primers 55-63 ° С, 20 sec .; elongation 72 ° C, 20 seconds (40 cycles). The mRNA level of the analyzed genes was leveled with respect to the averaged data of amplification of two housekeeping genes GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) and ActB (β-actin). The relative amount of mRNA was calculated using the ΔC (T) method.

В результате дифференцировки нейрональные прогениторные клетки демонстрировали экспрессию маркерных генов PAX6, TUBB3, МАР2, ENO2, Nestin (рисунок 1) как на уровне транскрипции, так и трансляции. Анализ показал, что до 95% полученных клеток экспрессировали нейрональный маркер TUBB3 (рис. 2).As a result of differentiation, neuronal progenitor cells showed expression of the marker genes PAX6, TUBB3, MAP2, ENO2, Nestin (Figure 1) both at the level of transcription and translation. The analysis showed that up to 95% of the obtained cells expressed the neuronal marker TUBB3 (Fig. 2).

Пример 3. Характеристика ноотропной композицииExample 3. Characteristics of the nootropic composition

Композицию характеризовали по количеству в 1 мл общего белка и таких факторов, как мозговой нейротрофический фактор (Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Для этого использовали твердофазный иммуноферментный анализ. 1 мл суспензии центрифугировали, полученные в результате центрифугирования супернатанты апплицировали в лунки планшета с предварительно адсорбированными первичными антителами к BDNF, GDNF, VEGF, далее анализ проводили согласно инструкции производителя. Содержание факторов выражали в пг/мл композиции. Всего было исследовано 10 образцов композиции, получены результаты по содержанию BDNF не менее 130 пг/мл, GDNF не менее 30 пг/мл, VEGF не менее 90 пг/мл. Суммарная масса белка не менее 1 мг/мл препарата. Общий белок в 1 мл суспензии определяли методом Бредфорда.The composition was characterized by the amount in 1 ml of total protein and factors such as Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), glial neurotrophic factor (GDNF), and vascular endothelial growth factor (VEGF). For this, an enzyme-linked immunosorbent assay was used. 1 ml of the suspension was centrifuged, the supernatants obtained as a result of centrifugation were applied to the wells of the plate with pre-adsorbed primary antibodies to BDNF, GDNF, VEGF, then the analysis was performed according to the manufacturer's instructions. The content of factors was expressed in pg / ml of the composition. In total, 10 samples of the composition were examined, the results were obtained on the content of BDNF at least 130 pg / ml, GDNF at least 30 pg / ml, VEGF at least 90 pg / ml. The total mass of protein is not less than 1 mg / ml of the drug. Total protein in 1 ml of suspension was determined by the Bradford method.

Пример 4. Оценка эффективности использования композиции на in vitro модели глутаматной токсичности на клеточной линии РС-12.Example 4. Evaluation of the effectiveness of using the composition in an in vitro model of glutamate toxicity on the PC-12 cell line.

Для изучения нейротрофического и нейропротекторного действия ноотропных композиций на основе среды НП, полученных в стандартных условиях (1) и подвергнутых гипоксии (2) была, выбрана линия феохромоцитомы крысы РС-12, широко используемая в качестве in vitro модели в нейробиологии. Клетки линии РС-12 (АТСС, США) культивировали в среде DMEM/F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). За 12 часов до эксперимента клетки пересевали в 48-луночные планшеты, покрытые раствором полли-DL-лизина в количестве 20 тысяч клеток на лунку и затем инкубировали в среде Opti-MEM, содержащей 0,5% ФБС. Далее добавляли БПК 1 и БПК 2 (5% от объема лунки, раствор с концентрацией общего белка 0.5 мг/мл), и инкубировали в течение 6 дней, меняя среду каждые 2 дня. Для оценки нейритогенеза рассчитывали среднее значение длины нейритов с использованием программы ImageJ.To study the neurotrophic and neuroprotective effects of nootropic compositions based on the NP medium, obtained under standard conditions (1) and subjected to hypoxia (2), the rat pheochromocytoma line PC-12, which is widely used as an in vitro model in neurobiology, was selected. PC-12 cells (ATCC, USA) were cultured in DMEM / F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). 12 hours before the experiment, the cells were subcultured into 48-well plates coated with a Polly-DL-lysine solution in the amount of 20 thousand cells per well and then incubated in Opti-MEM medium containing 0.5% PBS. Then BOD 1 and BOD 2 were added (5% of the well volume, a solution with a total protein concentration of 0.5 mg / ml), and they were incubated for 6 days, changing the medium every 2 days. To assess neuritogenesis, the mean value of neurite length was calculated using the ImageJ software.

В работе использовали модель глутаматной токсичности, воспроизводящий условия повышенного содержания активных форм кислорода. Клетки феохромоцитомы РС-12 культивировали в 96 - луночных планшетах. Для изучения протекторного действия ноотропных композиции (1, 2), производили их добавление в среду культивирование (5% от объема лунки, раствор с концентрацией общего белка 0.5 мг/мл) за 24 часа до моделирования глутаматной токсичности (добавляли глутамат до концентрации 30 мМ).We used a model of glutamate toxicity, which reproduces the conditions of an increased content of reactive oxygen species. PC-12 pheochromocytoma cells were cultured in 96-well plates. To study the protective effect of nootropic compositions (1, 2), they were added to the culture medium (5% of the well volume, a solution with a total protein concentration of 0.5 mg / ml) 24 hours before the modeling of glutamate toxicity (glutamate was added to a concentration of 30 mM) ...

Для определения жизнеспособности клеточной линии SHSY-5Y спустя 24 часа сокультивирования добавляли МТТ (3-[4,5диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолийбромид, ПанЭко, РФ) в концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали в темноте при 37°С в течение 2 часов с последующим растворением кристаллов формазана ДМСО и измерением оптической плотности при 590 нм с помощью планшетного ридера. Все МТТ анализы были выполнены в трех повторах.To determine the viability of the SHSY-5Y cell line, after 24 hours of co-cultivation, MTT (3- [4,5dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, PanEco, RF) was added at a concentration of 0.5 mg / ml and incubated in darkness at 37 ° C for 2 hours, followed by dissolution of crystals of formazan DMSO and measuring the optical density at 590 nm using a plate reader. All MTT analyzes were performed in triplicate.

В результате инкубация с ноотропной композицией, полученной в стандартных условиях(1) увеличивает число живых клеток РС-12 на 9,58±3,2% по сравнению с контролем. Добавление ноотропной композиции, полученной с применением моделирования гипоксии (2) число живых клеток РС-12 на 16,58±3,2%, при этом оказывая более выраженное действие на стимулирование роста нейритов, средняя длина нейритов больше в 1,47 раза больше в сравнении с группы 1.As a result, incubation with a nootropic composition obtained under standard conditions (1) increases the number of living PC-12 cells by 9.58 ± 3.2% compared to the control. The addition of a nootropic composition obtained with the use of hypoxia modeling (2) the number of living cells PC-12 by 16.58 ± 3.2%, while exerting a more pronounced effect on stimulating neurite growth, the average length of neurites is 1.47 times more comparison with group 1.

Список использованных источниковList of sources used

1. Song CG, Zhang YZ, Wu HN, et al. Stem cells: a promising candidate to treat neurological disorders. Neural Regen Res. 2018; 13(7):1294-1304. doi: 10.4103/1673-5374.235085.1. Song CG, Zhang YZ, Wu HN, et al. Stem cells: a promising candidate to treat neurological disorders. Neural Regen Res. 2018; 13 (7): 1294-1304. doi: 10.4103 / 1673-5374.235085.

2. Takahashi, Kazutoshi, and Shinya Yamanaka. "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors." cell 126.4 (2006): 663-676.2. Takahashi, Kazutoshi, and Shinya Yamanaka. "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors." cell 126.4 (2006): 663-676.

3. Zakrzewski W,

Figure 00000001
Szymonowicz M, Rybak Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther. 2019; 10(1):68. Published 2019 Feb 26. doi: 10.1186/s 13287-019-1165-5.3. Zakrzewski W,
Figure 00000001
Szymonowicz M, Rybak Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther. 2019; 10 (1): 68. Published 2019 Feb 26. doi: 10.1186 / s 13287-019-1165-5.

4. Kwak KA, Lee SP, Yang JY, Park YS. Current Perspectives regarding Stem Cell-Based Therapy for Alzheimer's Disease. Stem Cells Int. 2018; 2018:6392986. Published 2018 Mar 1. doi:10.1155/2018/6392986.4. Kwak KA, Lee SP, Yang JY, Park YS. Current Perspectives regarding Stem Cell-Based Therapy for Alzheimer's Disease. Stem Cells Int. 2018; 2018: 6392986. Published 2018 Mar 1.doi: 10.1155 / 2018/6392986.

5. Neural Stem Cell-Conditioned Medium Protects Neurons and Promotes Propriospinal Neurons Relay Neural Circuit Reconnection After Spinal Cord Injury. Peng Liang, Jiaren Liu, Jinsheng Xiong, Qing Liu, Jiaxin Zhao, Hongsheng Liang, Liwei Zhao, and Haitao Tang. Cell Transplantation, Vol.23, Supplement 1, pp. S45-S56, 2014.5. Neural Stem Cell-Conditioned Medium Protects Neurons and Promotes Propriospinal Neurons Relay Neural Circuit Reconnection After Spinal Cord Injury. Peng Liang, Jiaren Liu, Jinsheng Xiong, Qing Liu, Jiaxin Zhao, Hongsheng Liang, Liwei Zhao, and Haitao Tang. Cell Transplantation, Vol. 23, Supplement 1, pp. S45-S56, 2014.

6. Cerebrolysin for vascular dementia. Chen N, Yang M, Guo J, Zhou M, Zhu C, He L. Cochrane Database Syst Rev. 2013 Jan 31.6. Cerebrolysin for vascular dementia. Chen N, Yang M, Guo J, Zhou M, Zhu C, He L. Cochrane Database Syst Rev. 2013 Jan 31.

7. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors // cell. - 2006. - T. 126. - №. 4. - C. 663-676.7. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors // cell. - 2006. - T. 126. - No. 4. - S. 663-676.

8. Takahashi K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors // cell. - 2007. - T. 131. - №. 5. - C. 861-872.8. Takahashi K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors // cell. - 2007. - T. 131. - No. 5. - C. 861-872.

9. Yu J. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells // science. - 2007. - T. 318. - №5858. - C. 1917-1920.9. Yu J. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells // science. - 2007. - T. 318. - No. 5858. - C. 1917-1920.

10. Liu H. et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts // Cell stem cell. - 2008. - T. 3. - №6. - C. 587-590.10. Liu H. et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts // Cell stem cell. - 2008. - T. 3. - No. 6. - S. 587-590.

11. West F.D. et al. Porcine induced pluripotent stem cells produce chimeric offspring // Stem cells and development. - 2010. - T. 19. - №8. - C. 1211-1220.11. West F.D. et al. Porcine induced pluripotent stem cells produce chimeric offspring // Stem cells and development. - 2010. - T. 19. - No. 8. - C. 1211-1220.

12. Aasen T. et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes // Nature biotechnology. - 2008. - T. 26. - №11. - C. 1276.12. Aasen T. et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes // Nature biotechnology. - 2008. - T. 26. - No. 11. - C. 1276.

13. Eminli S. et al. Reprogramming of neural progenitor cells into induced pluripotent stem cells in the absence of exogenous Sox2 expression // Stem cells. - 2008. - T. 26. - №10. - C. 2467-2474.13. Eminli S. et al. Reprogramming of neural progenitor cells into induced pluripotent stem cells in the absence of exogenous Sox2 expression // Stem cells. - 2008. - T. 26. - No. 10. - S. 2467-2474.

14. Shi Y. et al. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic fibroblasts by Oct4 and Klf4 with small-molecule compounds // Cell stem cell. - 2008. - T. 3. - №5. - C. 568-574.14. Shi Y. et al. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic fibroblasts by Oct4 and Klf4 with small-molecule compounds // Cell stem cell. - 2008. - T. 3. - No. 5. - S. 568-574.

15. Lagarkova M.A. et al. Induction of pluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale // Cell cycle. - 2010. - T. 9. - №5. - C. 937-946.15. Lagarkova M.A. et al. Induction of pluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale // Cell cycle. - 2010. - T. 9. - No. 5. - C. 937-946.

16. Woltjen K. et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells // Nature. - 2009. - T. 458. - №7239. - C. 766.16. Woltjen K. et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells // Nature. - 2009. - T. 458. - No. 7239. - C. 766.

17. Zhou W., Freed C.R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells // Stem cells. - 2009. - T. 27. - №11. - C. 2667-2674.17. Zhou W., Freed C.R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells // Stem cells. - 2009. - T. 27. - No. 11. - S. 2667-2674.

18. Fusaki N. et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome // Proceedings of the Japan Academy, Series B. - 2009. - T. 85. - №8. - C. 348-362.18. Fusaki N. et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome // Proceedings of the Japan Academy, Series B. - 2009. - T. 85. - No. 8. - S. 348-362.

19. Yu J. et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences // Science. - 2009. - T. 324. - №5928. - C. 797-801.19. Yu J. et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences // Science. - 2009. - T. 324. - No. 5928. - S. 797-801.

20. Zhou H. et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins // Cell stem cell. - 2009. - T. 4. - №. 5. - C. 381-384.20. Zhou H. et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins // Cell stem cell. - 2009. - T. 4. - No. 5. - C. 381-384.

21. Mazzio EA, Soliman KF. Basic concepts of epigenetics: impact of environmental signals on gene expression. Epigenetics. 2012;7(2): 119-130. doi:10.4161/epi.7.2.18764.21. Mazzio EA, Soliman KF. Basic concepts of epigenetics: impact of environmental signals on gene expression. Epigenetics. 2012; 7 (2): 119-130. doi: 10.4161 / epi.7.2.18764.

22. Ramakrishnan S, Anand V, Roy S. Vascular endothelial growth factor signaling in hypoxia and inflammation. J Neuroimmune Pharmacol. 2014;9(2):142-160. doi:10.1007/s11481-014-9531-7.22. Ramakrishnan S, Anand V, Roy S. Vascular endothelial growth factor signaling in hypoxia and inflammation. J Neuroimmune Pharmacol. 2014; 9 (2): 142-160. doi: 10.1007 / s11481-014-9531-7.

23. Kihira, Yoshitaka, et al. "Hypoxia decreases glucagon-like peptide-1 secretion from the GLUTag cell line." Biological and Pharmaceutical Bulletin 38.4 (2015): 514-521.23. Kihira, Yoshitaka, et al. "Hypoxia decreases glucagon-like peptide-1 secretion from the GLUTag cell line." Biological and Pharmaceutical Bulletin 38.4 (2015): 514-521.

24. Pham, Isabelle, et al. "Hypoxia upregulates VEGF expression in alveolar epithelial cells in vitro and in vivo." American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology 283.5 (2002): L1133-L1142.24. Pham, Isabelle, et al. "Hypoxia upregulates VEGF expression in alveolar epithelial cells in vitro and in vivo." American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology 283.5 (2002): L1133-L1142.

25. Hartman W, Helan M, Smelter D, et al. Role of Hypoxia-Induced Brain Derived Neurotrophic Factor in Human Pulmonary Artery Smooth Muscle. PLoS One. 2015; 10(7):e0129489. Published 2015 Jul 20. doi: 10.1371/journal.pone.0129489.25. Hartman W, Helan M, Smelter D, et al. Role of Hypoxia-Induced Brain Derived Neurotrophic Factor in Human Pulmonary Artery Smooth Muscle. PLoS One. 2015; 10 (7): e0129489. Published 2015 Jul 20. doi: 10.1371 / journal.pone.0129489.

26. Calvo-Anguiano G, Lugo-Trampe JJ, Camacho A, et al. Comparison of specific expression profile in two in vitro hypoxia models. Exp Ther Med. 2018;15(6):4777-4784. doi:10.3892/etm.2018.6048.26. Calvo-Anguiano G, Lugo-Trampe JJ, Camacho A, et al. Comparison of specific expression profile in two in vitro hypoxia models. Exp Ther Med. 2018; 15 (6): 4777-4784. doi: 10.3892 / etm.2018.6048.

27. Хабриев P.У. и др. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - Открытое акционерное общество Издательство Медицина, 2005.27. Khabriev P.U. and other Guidelines for experimental (preclinical) study of new pharmacological substances. - Open Joint Stock Company Publishing House Medicine, 2005.

28. Song CG, Zhang YZ, Wu HN, et al. Stem cells: a promising candidate to treat neurological disorders. Neural Regen Res. 2018; 13(7): 1294-1304. doi:10.4103/1673-5374.235085.28. Song CG, Zhang YZ, Wu HN, et al. Stem cells: a promising candidate to treat neurological disorders. Neural Regen Res. 2018; 13 (7): 1294-1304. doi: 10.4103 / 1673-5374.235085.

29. Takahashi, Kazutoshi, and Shinya Yamanaka. "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors." cell 126.4 (2006): 663-676.29. Takahashi, Kazutoshi, and Shinya Yamanaka. "Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors." cell 126.4 (2006): 663-676.

30. Zakrzewski W,

Figure 00000001
Szymonowicz M, Rybak Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther. 2019;10(1):68. Published 2019 Feb 26. doi: 10.1186/s13287-019-1165-5.30. Zakrzewski W,
Figure 00000001
Szymonowicz M, Rybak Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther. 2019; 10 (1): 68. Published 2019 Feb 26.doi: 10.1186 / s13287-019-1165-5.

31. Kwak KA, Lee SP, Yang JY, Park YS. Current Perspectives regarding Stem Cell-Based Therapy for Alzheimer's Disease. Stem Cells Int. 2018; 2018:6392986. Published 2018 Mar 1. doi:10.1155/2018/6392986.31. Kwak KA, Lee SP, Yang JY, Park YS. Current Perspectives regarding Stem Cell-Based Therapy for Alzheimer's Disease. Stem Cells Int. 2018; 2018: 6392986. Published 2018 Mar 1.doi: 10.1155 / 2018/6392986.

32. Neural Stem Cell-Conditioned Medium Protects Neurons and Promotes Propriospinal Neurons Relay Neural Circuit Reconnection After Spinal Cord Injury. Peng Liang, Jiaren Liu, Jinsheng Xiong, Qing Liu, Jiaxin Zhao, Hongsheng Liang, Liwei Zhao, and Haitao Tang. Cell Transplantation, Vol. 23, Supplement 1, pp. S45-S56, 2014.32. Neural Stem Cell-Conditioned Medium Protects Neurons and Promotes Propriospinal Neurons Relay Neural Circuit Reconnection After Spinal Cord Injury. Peng Liang, Jiaren Liu, Jinsheng Xiong, Qing Liu, Jiaxin Zhao, Hongsheng Liang, Liwei Zhao, and Haitao Tang. Cell Transplantation, Vol. 23, Supplement 1, pp. S45-S56, 2014.

33. Cerebrolysin for vascular dementia. Chen N, Yang M, Guo J, Zhou M, Zhu C, He L. Cochrane Database Syst Rev. 2013 Jan 31.33. Cerebrolysin for vascular dementia. Chen N, Yang M, Guo J, Zhou M, Zhu C, He L. Cochrane Database Syst Rev. 2013 Jan 31.

34. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors //cell. - 2006. - T. 126. - №4. - C. 663-676.34. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors // cell. - 2006. - T. 126. - No. 4. - S. 663-676.

35. Takahashi K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors // cell. - 2007. - T. 131. - №5. - C. 861-872.35. Takahashi K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors // cell. - 2007. - T. 131. - No. 5. - C. 861-872.

36. Yu J. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells // science. - 2007. - T. 318. - №5858. - C. 1917-1920.36. Yu J. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells // science. - 2007. - T. 318. - No. 5858. - C. 1917-1920.

37. Liu H. et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts // Cell stem cell. - 2008. - T. 3. - №6. - C. 587-590.37. Liu H. et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts // Cell stem cell. - 2008. - T. 3. - No. 6. - S. 587-590.

38. West F.D. et al. Porcine induced pluripotent stem cells produce chimeric offspring // Stem cells and development. - 2010. - T. 19. - №8. - C. 1211-1220.38. West F.D. et al. Porcine induced pluripotent stem cells produce chimeric offspring // Stem cells and development. - 2010. - T. 19. - No. 8. - C. 1211-1220.

39. Aasen T. et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes // Nature biotechnology. - 2008. - T. 26. - №11. - C. 1276.39. Aasen T. et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes // Nature biotechnology. - 2008. - T. 26. - No. 11. - C. 1276.

40. Eminli S. et al. Reprogramming of neural progenitor cells into induced pluripotent stem cells in the absence of exogenous Sox2 expression // Stem cells. - 2008. - T. 26. - №10. - C. 2467-2474.40. Eminli S. et al. Reprogramming of neural progenitor cells into induced pluripotent stem cells in the absence of exogenous Sox2 expression // Stem cells. - 2008. - T. 26. - No. 10. - S. 2467-2474.

41. Shi Y. et al. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic fibroblasts by Oct4 and Klf4 with small-molecule compounds //Cell stem cell. - 2008. - T. 3. - №5. - C. 568-574.41. Shi Y. et al. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic fibroblasts by Oct4 and Klf4 with small-molecule compounds // Cell stem cell. - 2008. - T. 3. - No. 5. - S. 568-574.

42. Lagarkova M.A. et al. Induction of pluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale // Cell cycle. - 2010. - T. 9. - №5. - C. 937-946.42. Lagarkova M.A. et al. Induction of pluripotency in human endothelial cells resets epigenetic profile on genome scale // Cell cycle. - 2010. - T. 9. - No. 5. - C. 937-946.

43. Woltjen K. et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells // Nature. - 2009. - T. 458. - №7239. - C. 766.43. Woltjen K. et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells // Nature. - 2009. - T. 458. - No. 7239. - C. 766.

44. Zhou W., Freed C.R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells // Stem cells. - 2009. - T. 27. - №11. - C. 2667-2674.44. Zhou W., Freed C.R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells // Stem cells. - 2009. - T. 27. - No. 11. - S. 2667-2674.

45. Fusaki N. et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome // Proceedings of the Japan Academy, Series B. - 2009. - T. 85. - №8. - C. 348-362.45. Fusaki N. et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome // Proceedings of the Japan Academy, Series B. - 2009. - T. 85. - No. 8. - S. 348-362.

46. Yu J. et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences // Science. - 2009. - T. 324. - №5928. - C. 797-801.46. Yu J. et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences // Science. - 2009. - T. 324. - No. 5928. - S. 797-801.

47. Zhou H. et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins // Cell stem cell. - 2009. - T. 4. - №5. - C. 381-384.47. Zhou H. et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins // Cell stem cell. - 2009. - T. 4. - No. 5. - S. 381-384.

48. Mazzio EA, Soliman KF. Basic concepts of epigenetics: impact of environmental signals on gene expression. Epigenetics. 2012; 7(2): 119-130. doi: 10.416l/epi.7.2.18764.48. Mazzio EA, Soliman KF. Basic concepts of epigenetics: impact of environmental signals on gene expression. Epigenetics. 2012; 7 (2): 119-130. doi: 10.416l / epi.7.2.18764.

49. Ramakrishnan S, Anand V, Roy S. Vascular endothelial growth factor signaling in hypoxia and inflammation. J Neuroimmune Pharmacol. 2014; 9(2): 142-160. doi: 10.1007/s11481-014-9531 -7.49. Ramakrishnan S, Anand V, Roy S. Vascular endothelial growth factor signaling in hypoxia and inflammation. J Neuroimmune Pharmacol. 2014; 9 (2): 142-160. doi: 10.1007 / s11481-014-9531-7.

50. Kihira, Yoshitaka, et al. "Hypoxia decreases glucagon-like peptide-1 secretion from the GLUTag cell line." Biological and Pharmaceutical Bulletin 38.4 (2015): 514-521.50. Kihira, Yoshitaka, et al. "Hypoxia decreases glucagon-like peptide-1 secretion from the GLUTag cell line." Biological and Pharmaceutical Bulletin 38.4 (2015): 514-521.

51. Pham, Isabelle, et al. "Hypoxia upregulates VEGF expression in alveolar epithelial cells in vitro and in vivo." American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology 283.5 (2002): L1133-L1142.51. Pham, Isabelle, et al. "Hypoxia upregulates VEGF expression in alveolar epithelial cells in vitro and in vivo." American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology 283.5 (2002): L1133-L1142.

52. Hartman W, Helan M, Smelter D, et al. Role of Hypoxia-Induced Brain Derived Neurotrophic Factor in Human Pulmonary Artery Smooth Muscle. PLoS One. 2015; 10(7):e0129489. Published 2015 Jul 20. doi: 10.1371/jouraal.pone.0129489.52. Hartman W, Helan M, Smelter D, et al. Role of Hypoxia-Induced Brain Derived Neurotrophic Factor in Human Pulmonary Artery Smooth Muscle. PLoS One. 2015; 10 (7): e0129489. Published 2015 Jul 20. doi: 10.1371 / jouraal.pone.0129489.

53. Calvo-Anguiano G, Lugo-Trampe JJ, Camacho A, et al. Comparison of specific expression profile in two in vitro hypoxia models. Exp Ther Med. 2018; 15(6):4777-4784. doi:10.3892/etm.2018.6048.53. Calvo-Anguiano G, Lugo-Trampe JJ, Camacho A, et al. Comparison of specific expression profile in two in vitro hypoxia models. Exp Ther Med. 2018; 15 (6): 4777-4784. doi: 10.3892 / etm.2018.6048.

54. Хабриев P.У. и др. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - Открытое акционерное общество Издательство Медицина, 2005.54. Khabriev P.U. et al. Guidelines for experimental (preclinical) study of new pharmacological substances. - Open Joint Stock Company Publishing House Medicine, 2005.

Claims (3)

1. Способ получения ноотропной композиции на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейрональных прогениторных клеток в условиях гипоксии, включающий: забор биоптата кожи, получение культуры фибробластов, криоконсервацию культуры фибробластов, размораживание культуры фибробластов, адаптирование культуры фибробластов к xeno free условиям культивирования, репрограммирование фибробластов для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), культивирование ИПСК, криоконсервацию ИПСК, размораживание ИПСК, дифференцировку ИПСК в глиальные прогениторные клетки, культивирование нейрональных прогениторных клеток в условиях гипоксии, сбор кондиционированной среды и получение белково-пептидного комплекса,1. A method of obtaining a nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neuronal progenitor cells under hypoxic conditions, including: taking a biopsy of the skin, obtaining a culture of fibroblasts, cryopreservation of a culture of fibroblasts, thawing of a culture of fibroblasts, adapting a culture of fibroblasts to xeno free conditions of fibroblasts, reprogramming obtaining induced pluripotent stem cells (iPSCs), culturing iPSCs, cryopreservation of iPSCs, thawing iPSCs, differentiating iPSCs into glial progenitor cells, culturing neuronal progenitor cells under hypoxic conditions, collecting conditioned medium and obtaining a protein-peptide complex, где для моделирования гипоксии нейрональные прогениторные клетки культивируют в течение 3 ч в газовой камере с содержанием кислорода 2%, после чего производят замену среды на DMEM/F12 и культивируют в течение 6 ч, после чего кондиционированную среду собирают и центрифугируют при 300 об/мин в течение 5 мин, супернатант отбирают и концентрируют в 24 раза с помощью 3 кДа мембран Amicon Ultra, полученный концентрат подвергают стерилизующей фильтрации и получают ноотропную композицию.where, to simulate hypoxia, neuronal progenitor cells are cultured for 3 hours in a gas chamber with an oxygen content of 2%, after which the medium is replaced with DMEM / F12 and cultured for 6 hours, after which the conditioned medium is collected and centrifuged at 300 rpm for for 5 min, the supernatant was taken and concentrated 24 times using 3 kDa Amicon Ultra membranes, the resulting concentrate was subjected to sterilizing filtration to obtain a nootropic composition. 2. Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейрональных прогениторных клеток в условиях гипоксии, характеризующаяся тем, что в ее состав входят белки и полипептиды с молекулярной массой от 5 кДа до 250 кДа, мозговой нейротрофический фактор (BDNF) не менее 130 пг/мл и глиального нейротрофического фактора (GDNF) не менее 30 пг/мл, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) не менее 90 пг/мл, суммарная масса белка не менее 1 мг/мл препарата, при этом клеточная культура нейрональных прогениторных клеток, из которой получают композицию, демонстрирует экспрессию нейронального β - тубулина III, молекулы адгезии нервных клеток (PSA-NCAM) и состоит из 95±5% TUBB3+ - клеток.2. Nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neuronal progenitor cells under hypoxic conditions, characterized by the fact that it contains proteins and polypeptides with molecular weights from 5 kDa to 250 kDa, brain neurotrophic factor (BDNF) not less than 130 pg / ml and glial neurotrophic factor (GDNF) not less than 30 pg / ml, vascular endothelial growth factor (VEGF) not less than 90 pg / ml, total protein mass not less than 1 mg / ml of the preparation, while the cell culture of neuronal progenitor cells, from which get a composition, demonstrates the expression of neuronal β - tubulin III, a neural cell adhesion molecule (PSA-NCAM) and consists of 95 ± 5% TUBB3 + - cells.
RU2019144078A 2019-12-26 2019-12-26 Nootropic composition based on polypeptide complexes recovered from neuronal progenitor cells under hypoxic conditions, and a method for production thereof RU2732600C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019144078A RU2732600C1 (en) 2019-12-26 2019-12-26 Nootropic composition based on polypeptide complexes recovered from neuronal progenitor cells under hypoxic conditions, and a method for production thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019144078A RU2732600C1 (en) 2019-12-26 2019-12-26 Nootropic composition based on polypeptide complexes recovered from neuronal progenitor cells under hypoxic conditions, and a method for production thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2732600C1 true RU2732600C1 (en) 2020-09-21

Family

ID=72922295

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019144078A RU2732600C1 (en) 2019-12-26 2019-12-26 Nootropic composition based on polypeptide complexes recovered from neuronal progenitor cells under hypoxic conditions, and a method for production thereof

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2732600C1 (en)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001088104A2 (en) * 2000-05-17 2001-11-22 Geron Corporation Neural progenitor cell populations
US6455277B1 (en) * 1996-04-22 2002-09-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding human glial cell line-derived neurotrophic factor receptor polypeptides
RU2690498C1 (en) * 2018-05-17 2019-06-04 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр" Method for preparing a nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neurons and glial cells obtained by directional differentiation of induced human pluripotent stem cells
RU2690846C1 (en) * 2018-05-17 2019-06-06 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр" Nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neurons and glial cells obtained by directed differentiation of induced human pluripotent stem cells

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6455277B1 (en) * 1996-04-22 2002-09-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding human glial cell line-derived neurotrophic factor receptor polypeptides
WO2001088104A2 (en) * 2000-05-17 2001-11-22 Geron Corporation Neural progenitor cell populations
RU2690498C1 (en) * 2018-05-17 2019-06-04 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр" Method for preparing a nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neurons and glial cells obtained by directional differentiation of induced human pluripotent stem cells
RU2690846C1 (en) * 2018-05-17 2019-06-06 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр" Nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neurons and glial cells obtained by directed differentiation of induced human pluripotent stem cells

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11542471B2 (en) Method for producing ciliary marginal zone-like structure
CN105683366B (en) Method for producing retinal tissue and retinal-associated cells
US9249390B2 (en) Method for producing polarized retinal progenitor cells from pluripotent stem cells and their differentiation into retinal pigment epithelium cells
Sharma et al. Generation of functional neurons from feeder-free, keratinocyte-derived equine induced pluripotent stem cells
US20190169570A1 (en) Method for manufacturing ciliary marginal zone-like structure
US20140271584A1 (en) Methods and Compositions for Direct Reprogramming of Somatic Cells to Stem Cells, and Uses of these Cells
RU2690846C1 (en) Nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neurons and glial cells obtained by directed differentiation of induced human pluripotent stem cells
Bilousova et al. Generation of functional multipotent keratinocytes from mouse induced pluripotent stem cells
Akter et al. Generation of highly pure motor neurons from human induced pluripotent stem cells
RU2690498C1 (en) Method for preparing a nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neurons and glial cells obtained by directional differentiation of induced human pluripotent stem cells
RU2732600C1 (en) Nootropic composition based on polypeptide complexes recovered from neuronal progenitor cells under hypoxic conditions, and a method for production thereof
Kingham et al. Stem cell and neuron co-cultures for the study of nerve regeneration
RU2752906C2 (en) Nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from neuronal progenitor cells under heat shock and method for production thereof
RU2732599C1 (en) Nootropic composition based on polypeptide complexes isolated from glial progenitor cells under conditions of heat shock, and a method for production thereof
US20210315938A1 (en) Methods and Compositions for Retinal Neuron Generation in Carrier-Free 3D Sphere Suspension Culture
KR20140072676A (en) Preparation Method of Transgenic Chickin Induced Pluripotent Stem Cell
Auletta et al. Native extracellular matrix promotes human neuromuscular organoid morphogenesis and function
US20170191031A1 (en) Systems and methods for stem cell differentiation
TWI769410B (en) New induced pluripotent stem cells (ipscs) and applications thereof
WO2022102787A1 (en) Method of producing astrocytes from pluripotent stem cells
Hariharan In vitro nephrogenesis from human pluripotent stem cells
Gutierrez et al. iPSC-derived models gonadal cell
Marani Tissue engineering strategies for the development of a human 3D model of the neuromuscular junction
Gillett The effect of in vitro culture on the stability, expansion and neuronal differentiation of human pluripotent cell lines
パルハティ,パルヴェン Development of genetically engineered PA6 feeder cells for neural differentiation of mouse and human iPS cells

Legal Events

Date Code Title Description
PC41 Official registration of the transfer of exclusive right

Effective date: 20201223