RU2750408C1 - Method for identifying ethyl glucuronide in blood - Google Patents
Method for identifying ethyl glucuronide in blood Download PDFInfo
- Publication number
- RU2750408C1 RU2750408C1 RU2020126919A RU2020126919A RU2750408C1 RU 2750408 C1 RU2750408 C1 RU 2750408C1 RU 2020126919 A RU2020126919 A RU 2020126919A RU 2020126919 A RU2020126919 A RU 2020126919A RU 2750408 C1 RU2750408 C1 RU 2750408C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sample
- blood
- biosubstrate
- identification
- mcl
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
- A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
- G01N33/492—Determining multiple analytes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/98—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving alcohol, e.g. ethanol in breath
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Surgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к хроматографическому анализу химических соединений и может быть использовано для идентификации и выявления наркотических и психоактивных веществ, в частности, определения в трупной крови или в крови, отобранной у живого человека, этилглюкуронида - прямого метаболита/маркера алкоголя для диагностики факта употребления алкоголя и степени опьянения.The invention relates to chromatographic analysis of chemical compounds and can be used to identify and detect narcotic and psychoactive substances, in particular, to determine in cadaveric blood or in blood taken from a living person, ethyl glucuronide - a direct metabolite / marker of alcohol for diagnosing the fact of alcohol consumption and the degree intoxication.
При интерпретации результатов определения этилглюкуронида (EtG) следует учитывать, что этанол элиминируется в кровь с определенной скоростью, а этилглюкуронид начинает накапливаться только через некоторое время после появления этанола в крови. В то же время, EtG определяется в биологических средах в течение нескольких часов после того, как этанол уже не определяется в крови. Поэтому результаты определения EtG используется для установления ретроспективы употребления этилового спирта, что крайне необходимо при судебно-медицинской экспертизе живых лиц и трупов, но не применимы для оперативного установления состояния опьянения.When interpreting the results of the determination of ethyl glucuronide (EtG), it should be taken into account that ethanol is eliminated into the blood at a certain rate, and ethyl glucuronide begins to accumulate only some time after the appearance of ethanol in the blood. At the same time, EtG is detected in biological media for several hours after ethanol is no longer detected in blood. Therefore, the results of the EtG determination are used to establish a retrospective view of the consumption of ethyl alcohol, which is extremely necessary in the forensic examination of living persons and corpses, but is not applicable for the prompt determination of the state of intoxication.
Известен способ выявления и определения происхождения неизвестных веществ в спиртных напитках [RU 2392616, C1, G01N 30/02, 20.06.2010], при котором готовят пробу исследуемого напитка, подвергают ее ГХ/МС анализу, регистрируют масс-спектры и ассоциированные с ними хроматограммы и проводят распознавание компонентов сравнением с базой данных эталонных аналитических характеристик объекта, при этом, дополнительно готовят смесь стандартных веществ, и на ее основе готовят ряд модельных образцов путем введения стандартной смеси в интактный образец в разных концентрациях и анализируют образцы с известным введенным содержанием компонентов при температуре узла ввода 180°С, 250°С и 310°С, и при обнаружении в модельном образце неизвестное вещество квалифицируют как артефакт, образующийся при анализе, а при отсутствии его в модельных образцах готовят контрольный образец путем объединения всего ряда модельных образцов, анализируют его также при температуре узла ввода 180°С, 250°С и 310°С, регистрируют масс-спектры и ассоциированные с ними хроматограммы и при отсутствии в контрольном образце найденного неизвестного вещества его квалифицируют как маркер идентификации.There is a known method for detecting and determining the origin of unknown substances in alcoholic beverages [RU 2392616, C1, G01N 30/02, 20.06.2010], in which a sample of the test drink is prepared, subjected to GC / MS analysis, mass spectra and associated chromatograms are recorded and recognition of components is carried out by comparison with the database of reference analytical characteristics of the object, while, additionally, a mixture of standard substances is prepared, and on its basis a number of model samples are prepared by introducing a standard mixture into an intact sample at different concentrations and samples with a known introduced content of components are analyzed at a temperature input node 180 ° C, 250 ° C and 310 ° C, and if it is detected in the model sample, an unknown substance is qualified as an artifact formed during the analysis, and if it is absent in the model samples, a control sample is prepared by combining the entire series of model samples, it is also analyzed at an inlet temperature of 180 ° C, 250 ° C and 310 ° C, register m mass spectra and associated chromatograms, and in the absence of a detected unknown substance in the control sample, qualify it as an identification marker.
Недостатком способа является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен, преимущественно, для выявления и определения происхождения неизвестных веществ в суррогатных спиртсодержащих жидкостях или биологических объектах, содержащих летучие яды.The disadvantage of this method is its relatively narrow field of application, since it is intended primarily for identifying and determining the origin of unknown substances in surrogate alcohol-containing liquids or biological objects containing volatile poisons.
Известен также способ выявления неизвестных веществ в биологических жидкостях пациентов, принимавших наркотические или психотропные вещества [RU 241788, С2, G01N 30/02, 27.09.2010], при котором готовят пробу исследуемого образца, подвергают ее ГХ/МС анализу, регистрируют масс-спектры образца, и ассоциированные с ними хроматограммы и проводят распознавание вещества сравнением с базой данных эталонных аналитических характеристик веществ, при этом, готовят три пробы исследуемого образца биологической жидкости - первую путем экстракции с перерастворением, вторую путем кислотного гидролиза и третью путем ферментативного гидролиза, причем, первую пробу подвергают ГХ/МС анализу в режиме градиента температуры 15°С/мин и данные анализируют путем сравнения с базой данных, по которой выявляют признаки неизвестного вещества (НВ), а именно - спектры с m/z, совпадающими с базовыми ионами наркотического или психотропного вещества или метаболитов, и содержание (НВ) в пробе, вторую пробу подвергают ГХ/МС анализу в режиме градиента температуры 25°С/мин и третью пробу подвергают ГХ/МС анализу также в режиме градиента температуры 15°С/мин и при увеличении содержания НВ в последних двух пробах по сравнению с первой, подвергают ГХ/МС анализу также в режиме градиента температуры 15°С/мин базовое наркотическое или психотропное вещество на присутствие в нем НВ, и при его отсутствии в базовом веществе, проверяют присутствие НВ в интактной биологической жидкости, для чего пробу ее готовят путем кислотного гидролиза и подвергают ГХ/МС анализу в режимах градиента температуры 15°С/мин и 25°С/мин и в случае обнаружения НВ в интактной биологической жидкости его квалифицируют как эндогенное, а при отсутствии признаков аликвоту первой пробы смешивают с пробой интактной биологической жидкости, готовят пробу путем кислотного гидролиза смеси, подвергают пробу ГХ/МС анализу в режимах градиента температуры 15°С/мин и 25°С/мин, определяют содержание НВ по результатам обоих режимов анализа и сравнивают его с содержанием НВ в первой пробе и при совпадающих значениях содержания НВ в указанных трех пробах квалифицируют НВ как новый, ранее неизвестный продукт метаболизма базового наркотического или психотропного вещества.There is also known a method for detecting unknown substances in biological fluids of patients taking narcotic or psychotropic substances [RU 241788, C2, G01N 30/02, 09/27/2010], in which a sample of the test sample is prepared, subjected to GC / MS analysis, and mass spectra are recorded the sample, and associated chromatograms and carry out the recognition of the substance by comparing it with the database of the reference analytical characteristics of the substances, while preparing three samples of the test sample of the biological fluid - the first by extraction with reconstitution, the second by acid hydrolysis and the third by enzymatic hydrolysis, and the first the sample is subjected to GC / MS analysis in a temperature gradient mode of 15 ° C / min and the data is analyzed by comparison with a database, which reveals signs of an unknown substance (IR), namely, spectra with m / z coinciding with the base ions of a narcotic or psychotropic substances or metabolites, and the content (HB) in the sample, the second sample is subjected to GC / MS analysis in a temperature gradient mode of 25 ° C / min and the third sample is subjected to GC / MS analysis also in a temperature gradient mode of 15 ° C / min and with an increase in the HB content in the last two samples compared to the first one, GC / MS analysis is also performed in in the temperature gradient mode of 15 ° C / min, the base narcotic or psychotropic substance for the presence of HB in it, and in its absence in the base substance, the presence of HB in the intact biological fluid is checked, for which the sample is prepared by acid hydrolysis and subjected to GC / MS analysis in modes of
Недостатком этого способа также является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен, преимущественно, для выявления и определения происхождения неизвестных веществ в биологических жидкостях пациентов.The disadvantage of this method is also its relatively narrow field of application, since it is intended mainly for identifying and determining the origin of unknown substances in biological fluids of patients.
Кроме того, известен способ идентификации наркотических и психоактивных веществ в биологических жидкостях [RU 2390771, С12, G01N 30/86, 27.05.2010], при котором готовят пробу исследуемого образца, пропускают ее через хроматографическую колонку с неподвижной жидкой фазой и регистрируют сигналы детектора в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу сравнением с эталонными аналитическими характеристиками вещества, при этом готовят две аликвоты пробы исследуемого образца - нативную и дериватизированную и каждую из них пропускают через колонку, по меньшей мере, в двух режимах кондиционирования параметров изменением градиента температуры, и, дополнительно, каждую из указанных аликвот пропускают через колонку с разделением потока при тех же режимах кондиционирования, далее регистрируют сигналы детектора на хроматограммах, выбирают на них пики со значениями асимметрии на 0,1, 0,5 и 0,6 высоты пика от основания ≤1,05, как наиболее соответствующие биномиальному распределению плотности вероятности и недеформированные влиянием фоновых компонентов, и идентифицируют определяемые вещества по отобранным пикам сопоставлением с эталонными аналитическими характеристиками определяемых веществ.In addition, there is a known method for identifying narcotic and psychoactive substances in biological fluids [RU 2390771, C12, G01N 30/86, 05/27/2010], in which a sample of the test sample is prepared, passed through a chromatographic column with a stationary liquid phase and the detector signals are recorded in the form of the profile of the peaks of the analyzed substances on the chromatogram with the subsequent determination of the belonging of each peak to the analyte by comparison with the reference analytical characteristics of the substance, while preparing two aliquots of the sample of the test sample - native and derivatized, and each of them is passed through the column in at least two conditioning modes parameters by changing the temperature gradient, and, additionally, each of these aliquots is passed through the column with flow separation under the same conditioning modes, then the detector signals are recorded on chromatograms, peaks with asymmetry values of 0.1, 0.5 and 0 are selected on them, 6 peak heights from bases ≤1.05, as the most consistent with the binomial probability density distribution and not deformed by the influence of background components, and identify the analytes by the selected peaks by comparing them with the reference analytical characteristics of the analytes.
Недостатком этого технического решения является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен, преимущественно, для выявления и определения неизвестных веществ в организме человека на основе исследований его биологических жидкостей. Это сужает арсенал технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека или в условиях отсутствия его биологических жидкостей.The disadvantage of this technical solution is its relatively narrow field of application, since it is intended primarily for the detection and determination of unknown substances in the human body based on studies of its biological fluids. This narrows the arsenal of technical means that can be used to identify narcotic and psychoactive substances in the human body or in the absence of its biological fluids.
Помимо указанных выше, способ идентификации наркотических и психоактивных веществ в сложных биологических матрицах организма человека [RU 2705932, C1, G01N 30/86, 12.11.2019], согласно которому готовят образец биосубстрата человека в виде срезов волос или ногтевых пластин и осуществляют его первое предварительное масс-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала детектора масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу сравнением с эталонными аналитическими характеристиками вещества, при этом, после проведения первого предварительного масс-спектрометрического исследования последовательно проводят еще N последующих предварительных масс-спектрометрических исследований, перед каждым из которых образец биосубстрата промывают метанолом, при этом после проведения предварительных масс-спектрометрических исследований измельчают образец биосубстрата человека до состояния пудры до долей миллиметров и проводят заключительное масс-спектрометрическое исследование, причем если при последовательном проведении предварительных масс-спектрометрических исследований наблюдается последовательное уменьшение массы анализируемых веществ и существенное увеличение их массы при заключительном масс-спектрометрическом исследовании, то принимают решение об идентификации этих веществ в биосубстрате человека.In addition to the above, a method for identifying narcotic and psychoactive substances in complex biological matrices of the human body [RU 2705932, C1, G01N 30/86, 12.11.2019], according to which a sample of a human biosubstrate is prepared in the form of hair sections or nail plates and its first preliminary mass spectrometric study with the registration of the signal of the detector of the mass spectrometer in the form of a profile of the peaks of the analytes on the chromatogram, followed by the determination of the belonging of each peak to the analyte by comparison with the reference analytical characteristics of the substance, while after the first preliminary mass spectrometric study, N more subsequent preliminary mass spectrometric studies, before each of which the biosubstrate sample is washed with methanol, while after preliminary mass spectrometric studies, the human biosubstrate sample is ground to a powder state to fractions of a millimeter and conduct a final mass spectrometric study, and if, in the course of sequential preliminary mass spectrometric studies, there is a consistent decrease in the mass of the analyzed substances and a significant increase in their mass during the final mass spectrometric study, then a decision is made on the identification of these substances in the human biosubstrate.
Особенностью этого технического решения является то, что, число (N+1) предварительных масс-спектрометрических исследований равно 6, при масс-спектрометрическом анализе используют один пластиковый флакон емкостью 50 мл, а при промывке образца биосубстрата внесение и отбор метанола из пластикового флакона используют разовые дозаторы, при предварительном масс-спектрометрическом анализе принимают во внимание принадлежность каждого пика анализируемого вещества при сравнении с эталонной аналитической характеристикой этого вещества при уменьшения его массы при последующем предварительном анализе относительно предыдущего предварительного анализа не менее 10%, о существенном увеличении массы анализируемого вещества при заключительном масс-спектрометрическом анализе судят относительно того вещества, масса которого при заключительном масс-спектрометрическом анализе превышает массу при последнем предварительном анализе не менее чем на 100%.A feature of this technical solution is that, the number (N + 1) of preliminary mass spectrometric studies is 6, in the mass spectrometric analysis one plastic bottle with a capacity of 50 ml is used, and when washing the biosubstrate sample, the introduction and selection of methanol from the plastic bottle is used one-time dispensers, in the preliminary mass spectrometric analysis, take into account the belonging of each peak of the analyte when compared with the reference analytical characteristic of this substance when its mass decreases in the subsequent preliminary analysis relative to the previous preliminary analysis of at least 10%, on a significant increase in the mass of the analyte during the final mass - spectrometric analysis is judged relative to the substance, the mass of which in the final mass spectrometric analysis exceeds the mass in the last preliminary analysis by at least 100%.
Недостатком этого технического решения является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен, преимущественно, для выявления и определения неизвестных веществ в организме человека через биосубстрат в виде срезов волос или ногтевых пластин.The disadvantage of this technical solution is its relatively narrow field of application, since it is intended mainly for the detection and determination of unknown substances in the human body through a biosubstrate in the form of hair slices or nail plates.
Это сужает арсенал технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека, например, через образцы органов или мышечных тканей при отсутствии биологического материала другого вида.This narrows the arsenal of technical means that can be used to identify narcotic and psychoactive substances in the human body, for example, through samples of organs or muscle tissues in the absence of other biological material.
Известен также идентификации наркотических и психоактивных веществ в биологических объектах [RU 2723907, C1, G01N 30/86, 18.06.2020], согласно которому образец биосубстрата человека в виде органа или фрагмента мышечной ткани измельчают до состояния гомогената и осуществляют его хромато-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу и сравнением с эталонными аналитическими характеристиками искомого вещества, при этом, образец биосубстрата человека в виде гомогената перед хромато-спектрометрическим исследованием подвергают щелочному гидролизу и экстрагируют неполярным растворителем из щелочной среды для обеспечения оптимального соотношения сигнал/шум для целевых аналитов, затем полученный экстракт упаривают и при образовании вязкого маслянистого осадка его реэкстрагируют водным кислым раствором и далее целевые вещества извлекают из полученного водного раствора неполярным растворителем при щелочных значениях рН, а хромато-спектрометрическое исследование проводят в режиме регистрации SIM-спектров, причем, набор ионов для SIM-регистрации выбирают из условия выбора всех фрагментов масс-спектра с интенсивностью более 1%.It is also known to identify narcotic and psychoactive substances in biological objects [RU 2723907, C1, G01N 30/86, 06/18/2020], according to which a sample of a human biosubstrate in the form of an organ or a fragment of muscle tissue is crushed to a homogenate state and its chromatographic spectrometric study is carried out with registration of the signal of the mass spectrometer in the form of a profile of the peaks of the analytes on the chromatogram, followed by the determination of the belonging of each peak to the analyte and comparison with the reference analytical characteristics of the desired substance, while the sample of the human biosubstrate in the form of a homogenate is subjected to alkaline hydrolysis before the chromatography-spectrometric study and extracted by non-polar solvent from an alkaline medium to ensure the optimal signal-to-noise ratio for the target analytes, then the obtained extract is evaporated and, when a viscous oily precipitate is formed, it is re-extracted with an aqueous acidic solution, and then the target substances are extracted They are taken from the obtained aqueous solution with a non-polar solvent at alkaline pH values, and the chromatography-spectrometric study is carried out in the mode of registration of SIM-spectra, moreover, the set of ions for SIM-registration is selected from the condition of selecting all fragments of the mass spectrum with an intensity of more than 1%.
Недостатком наиболее близкого технического решения является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен для выявления и определения в организме человека через биосубстрат в виде органа или фрагмента мышечной ткани преимущественно фентанила, являющимся опиоидным анальгетикоми и мощным агонист μ-опиоидным рецептором, а также близких к нему по химическому строению и свойствам (слабополярных, устойчивых к щелочному гидролизу) 3-метилфенанила, карфентанила, ЛСД, трамадола, кетамина, промедола, диазепама и т.п.The disadvantage of the closest technical solution is its relatively narrow field of application, since it is intended for the detection and determination in the human body through a biosubstrate in the form of an organ or a fragment of muscle tissue, mainly fentanyl, which is an opioid analgesic and a powerful agonist of the μ-opioid receptor, as well as those close to it. by chemical structure and properties (weakly polar, resistant to alkaline hydrolysis) 3-methylphenanyl, carfentanil, LSD, tramadol, ketamine, promedol, diazepam, etc.
Это сужает арсенал технических средств, которые могут быть использованы для определения в крови (в трупной крови или крови, отобранной у живого человека) этилглюкуронида - прямого метаболита/маркера алкоголя для диагностики факта употребления алкоголя и степени опьянения.This narrows the arsenal of technical means that can be used to determine in blood (in cadaveric blood or blood taken from a living person) ethyl glucuronide - a direct metabolite / marker of alcohol for diagnosing the fact of alcohol consumption and the degree of intoxication.
Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ идентификации этилглюкуронида в крови, не имеющей гнилостные изменения [Lena Kristoffersen, Veronica Н. Liane, Olav Spigset. EtG and EtS in Autopsy Blood Samples With and Without Putrefaction Using UPLC-MS-MS Solfrid Hegstadl. Published by Oxford University Press. Journal of Analytical Toxicology, 2017; 41:107-113], в соответствии с которым готовят образец биосубстрата и осуществляют его хромато-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу и сравнением с эталонными аналитическими характеристиками искомого вещества, при этом, для подготовки образца биосубстрата в кровь добавляют метанол, производят центрифугирование, отделяют органические фракции, упаривают их и добавляют воду, после чего проводят хромато-спектрометрическое исследование.The closest in technical essence to the proposed is a method for identifying ethyl glucuronide in blood that does not have putrefactive changes [Lena Kristoffersen, Veronica H. Liane, Olav Spigset. EtG and EtS in Autopsy Blood Samples With and Without Putrefaction Using UPLC-MS-MS Solfrid Hegstadl. Published by Oxford University Press. Journal of Analytical Toxicology, 2017; 41: 107-113], in accordance with which a sample of a biosubstrate is prepared and its chromatography-spectrometric study is carried out with the registration of the signal of the mass spectrometer in the form of a profile of the peaks of the analytes on the chromatogram, followed by the determination of the belonging of each peak to the analyte and comparison with the reference analytical characteristics of the desired substances, in this case, to prepare a biosubstrate sample, methanol is added to the blood, centrifugation is performed, organic fractions are separated, evaporated and water is added, after which a chromatography-spectrometric study is carried out.
Недостатком наиболее близкого технического решения является относительно узкая область применения, обусловленная тем, что исходная кровь не должна иметь гнилостных изменений, поскольку при их наличии снижается до недопустимой точность идентификации этилглюкуронида в крови.The disadvantage of the closest technical solution is a relatively narrow area of application, due to the fact that the original blood should not have putrefactive changes, since if they are present, the accuracy of the identification of ethyl glucuronide in the blood is reduced to unacceptable.
Это сужает арсенал технических средств, которые могут быть использованы для определения в крови (в трупной крови или крови, отобранной у живого человека) этилглюкуронида - прямого метаболита/маркера алкоголя для диагностики факта употребления алкоголя и степени опьянения.This narrows the arsenal of technical means that can be used to determine in blood (in cadaveric blood or blood taken from a living person) ethyl glucuronide - a direct metabolite / marker of alcohol for diagnosing the fact of alcohol consumption and the degree of intoxication.
Задачей, которая решается в изобретении, является разработка способа выявления и идентификации в организме человека этилглюкуронида с использованием в качестве объекта исследований трупной крови или крови, отобранной у живого человека, который обладает более высокой точностью идентификации.The problem that is solved in the invention is to develop a method for detecting and identifying ethyl glucuronide in the human body using cadaveric blood or blood taken from a living person as an object of research, which has a higher identification accuracy.
Требуемый технический результат заключается в повышении точности идентификации этилглюкуронида в трупной крови или крови, отобранной у живого человека.The required technical result is to improve the accuracy of identification of ethyl glucuronide in cadaveric blood or blood taken from a living person.
Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что, в способе, согласно которому готовят образец биосубстрата и осуществляют его хромато-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу и сравнением с эталонными аналитическими характеристиками искомого вещества, согласно изобретению, для подготовки образца биосубстрата 200 мкл крови ввводят во флакон с плоским дном (пенициллиновый флакон) и высушивают при 100°С в течение 7 минут с целью денатурации белков и удаления влаги из образца, а затем его охлаждают до комнатной температуры, добавляют 250 мкл метанола, закрывают крышкой, встряхивают на вибромиксере в течение 2 мин, полученный экстракт переносят в виалу и реконструируют 100 мкл деионизированной воды, после чего 5 мкл экстракта вводят в хроматограф.The problem is solved, and the required technical result is achieved by the fact that, in the method according to which a biosubstrate sample is prepared and its chromatography-spectrometric study is carried out with the registration of the mass spectrometer signal in the form of a profile of the peaks of the analyzed substances on the chromatogram, followed by determination of the belonging of each peak to the analyte and comparison with the reference analytical characteristics of the desired substance, according to the invention, to prepare a biosubstrate sample, 200 μl of blood is introduced into a flat-bottomed vial (penicillin vial) and dried at 100 ° C for 7 minutes in order to denature proteins and remove moisture from the sample, and then it is cooled to room temperature, 250 μl of methanol is added, covered with a lid, shaken on a vibrating mixer for 2 min, the resulting extract is transferred into a vial and reconstituted with 100 μl of deionized water, after which 5 μl of the extract is injected into the chromatograph.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что, перед реконструированием 100 мкл деионизированной воды проводят упаривание.In addition, the required technical result is achieved by the fact that, before reconstructing 100 μl of deionized water, evaporation is carried out.
На чертеже представлены:The drawing shows:
- на фиг. 1 - хроматограммы серии градуировочных измерений на приборе Toxtyper Bruker растворов этилглюкуронида, приготовленных на основе цельной крови (колонка Acclaim RSLC 120 С18, 120А 2.1×100 mm, 2.2 urn (Dionex);- in Fig. 1 - chromatograms of a series of calibration measurements on a Toxtyper Bruker instrument of ethyl glucuronide solutions prepared on the basis of whole blood (column Acclaim RSLC 120 С18, 120А 2.1 × 100 mm, 2.2 urn (Dionex);
- на фиг. 2 - хроматографические профили (Toxtyper Bruker, колонка Acclaim RSLC 120 С18, 120А 2.1×100 mm, 2.2 μm) по иону-прекурсору этилглюкуронида m/z 221 (М-Н) - экстракта образца крови от трупа Ш., муж. 6 лет, калибровочного образца EtG 2,0 мкг/мл и крови, положительной по этилглюкурониду (кровь от трупа ФИО_1_), содержание этанола в крови от трупа Ш., 6 лет составило 1,34%, обзорный анализ, проведенный на приборе Toxtyper Bruker, показал отсутствие этилглюкуронида в крови Ш., 6 лет;- in Fig. 2 - chromatographic profiles (Toxtyper Bruker, Acclaim RSLC 120 С18 column, 120А 2.1 × 100 mm, 2.2 μm) according to the ethylglucuronide precursor ion m / z 221 (М-Н) - an extract of a blood sample from the corpse of Sh., Male. 6 years old, a calibration sample EtG 2.0 μg / ml and blood positive for ethyl glucuronide (blood from a corpse FULL NAME_1_), the ethanol content in the blood from the corpse of Sh., 6 years old was 1.34%, a review carried out on a Toxtyper Bruker device , showed the absence of ethyl glucuronide in the blood of Sh., 6 years old;
- на фиг. 3 - хроматографический профиль экстракта крови от живого человека ФИО_2_, употреблявшего этиловый алкоголь на приборе Shimadzu 8050 (хроматографическая колонка Agilent Eclipse С18, 2.1×100 mm 1.8 μm), содержание этанола 0,3 г/л, этилглюкуронида 0.7 мкг/мл, профиль по MRM: m/z 221 - 113, 221 - 129, 221 - 85, 221 - 75 и спектр, соответствующий этилглюкурониду, ион m/z 149 - фоновый, характерен для эфиров фталевой кислоты.- in Fig. 3 - chromatographic profile of a blood extract from a living person FULL NAME_2_ who consumed ethyl alcohol on a Shimadzu 8050 device (chromatographic column Agilent Eclipse C18, 2.1 × 100 mm 1.8 μm), ethanol content 0.3 g / l, ethyl glucuronide 0.7 μg / ml, profile by MRM: m / z 221 - 113, 221 - 129, 221 - 85, 221 - 75 and the spectrum corresponding to ethyl glucuronide, ion m / z 149 - background, is characteristic of phthalic acid esters.
Способ идентификации этилглюкуронида в крови осуществляется следующим образом.The method for identifying ethyl glucuronide in blood is carried out as follows.
200 мкл крови вводят во флакон с плоским дном (пенициллиновый флакон) и высушивают при 100°С в течение 7 минут. При этом происходит денатурация белков и удаление влаги из образца. После охлаждения до комнатной температуры добавляют 250 мкл метанола, закрывают крышкой и встряхивают на вибромиксере 2 мин. Экстракт получается прозрачным и почти бесцветным, его переносят в виалу, упаривают и реконструируют 100 мкл деионизированной воды. 5 мкл экстракта вводят в хроматограф.200 μl of blood is injected into a flat-bottomed vial (penicillin vial) and dried at 100 ° C for 7 minutes. In this case, proteins are denatured and moisture is removed from the sample. After cooling to room temperature, add 250 μl of methanol, close the lid and shake on a vibrating mixer for 2 minutes. The extract is transparent and almost colorless, transferred to a vial, evaporated and reconstituted with 100 μl of deionized water. 5 μl of the extract is injected into the chromatograph.
Допускается вводить в хроматограф непосредственно метанольный экстракт, при этом возможно ухудшение качества хроматографических пиков.It is allowed to directly enter the methanol extract into the chromatograph, while the quality of the chromatographic peaks may deteriorate.
Далее проводят хромато-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме проводят с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу и сравнением с эталонными аналитическими характеристиками искомого вещества.Next, a chromatography-spectrometric study is carried out with the registration of the signal of the mass spectrometer in the form of a profile of the peaks of the analyzed substances on the chromatogram, followed by the determination of the belonging of each peak to the analyte and comparison with the reference analytical characteristics of the desired substance.
Важнейшей операцией, существенно определяющая повышение точности идентификации, является высушивание при 100°С в течение 7 минут, поскольку в этом случае белковая грязь коагулирует и ее влияние на точность идентификации резко снижается.The most important operation, which significantly determines the increase in the identification accuracy, is drying at 100 ° C for 7 minutes, since in this case the protein mud coagulates and its effect on the identification accuracy is sharply reduced.
Таким образом, в предложенном способе достигается требуемый технический результат, который заключается в повышении точности идентификации, с одновременным расширением арсенала технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека с одновременным повышением чувствительности и точности определения этилглюкуронида в крови.Thus, in the proposed method, the required technical result is achieved, which consists in increasing the accuracy of identification, with a simultaneous expansion of the arsenal of technical means that can be used to identify narcotic and psychoactive substances in the human body with a simultaneous increase in the sensitivity and accuracy of determination of ethyl glucuronide in the blood.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020126919A RU2750408C1 (en) | 2020-08-12 | 2020-08-12 | Method for identifying ethyl glucuronide in blood |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020126919A RU2750408C1 (en) | 2020-08-12 | 2020-08-12 | Method for identifying ethyl glucuronide in blood |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2750408C1 true RU2750408C1 (en) | 2021-06-28 |
Family
ID=76823066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020126919A RU2750408C1 (en) | 2020-08-12 | 2020-08-12 | Method for identifying ethyl glucuronide in blood |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2750408C1 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8168402B2 (en) * | 2005-11-03 | 2012-05-01 | Lohocla Research Corporation | Diagnostic tests of substance use disorders |
| EP2671642B1 (en) * | 2012-06-04 | 2016-12-28 | Michael Böttcher | Method for determining the amount of an analyte contained in a sample |
| CN111487329A (en) * | 2019-01-27 | 2020-08-04 | 复旦大学 | Method for simultaneously measuring ethanol non-oxidized metabolites in blood and vitreous humor |
| CN107664664B (en) * | 2016-07-31 | 2020-09-01 | 复旦大学 | Method for simultaneously detecting 4-class ethanol non-oxidized metabolites in human whole blood |
| RU2740269C1 (en) * | 2020-08-04 | 2021-01-12 | Сергей Александрович Савчук | Method for identification of ethyl glucuronid in dry blood stains |
-
2020
- 2020-08-12 RU RU2020126919A patent/RU2750408C1/en active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8168402B2 (en) * | 2005-11-03 | 2012-05-01 | Lohocla Research Corporation | Diagnostic tests of substance use disorders |
| EP2671642B1 (en) * | 2012-06-04 | 2016-12-28 | Michael Böttcher | Method for determining the amount of an analyte contained in a sample |
| CN107664664B (en) * | 2016-07-31 | 2020-09-01 | 复旦大学 | Method for simultaneously detecting 4-class ethanol non-oxidized metabolites in human whole blood |
| CN111487329A (en) * | 2019-01-27 | 2020-08-04 | 复旦大学 | Method for simultaneously measuring ethanol non-oxidized metabolites in blood and vitreous humor |
| RU2740269C1 (en) * | 2020-08-04 | 2021-01-12 | Сергей Александрович Савчук | Method for identification of ethyl glucuronid in dry blood stains |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| S. S. BARSEGYAN and others. Diagnostics of the consumption of narcotic drugs, psychotropic and other toxic substances by methods of immunochromatographic analysis and high-performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry with a linear ion trap. Methodical instructions. Moscow 2016, pp. 1-47. * |
| SAVCHUK S.A. and others. Detection and quantification of volatile toxic substances and glycols in biological objects by gas chromatography and gas chromatography-mass spectrometry. Information mail. Moscow 2019, pp. 1-60. * |
| БАРСЕГЯН С.С. и др. Диагностика потребления наркотических средств, психотропных и других токсических веществ методами иммунохроматографического анализа и высокоэффективной жидкостной хроматографии - тандемной масс-спектрометрии с линейной ионной ловушкой. Методические указания. Москва 2016, стр.1-47. * |
| САВЧУК С.А. и др. Обнаружение и количественное определение летучих токсичных веществ и гликолей в биологических объектах методами газовой хроматографии и хромато-масс-спектрометрии. Информационное письмо. Москва 2019, стр.1-60. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lacalle-Bergeron et al. | Chromatography hyphenated to high resolution mass spectrometry in untargeted metabolomics for investigation of food (bio) markers | |
| Zeki et al. | Integration of GC–MS and LC–MS for untargeted metabolomics profiling | |
| Theodoridis et al. | LC-MS based global metabolite profiling of grapes: solvent extraction protocol optimisation | |
| Yin et al. | Effects of pre-analytical processes on blood samples used in metabolomics studies | |
| Veenstra | Global and targeted quantitative proteomics for biomarker discovery | |
| Mouton-Barbosa et al. | In-depth exploration of cerebrospinal fluid by combining peptide ligand library treatment and label-free protein quantification | |
| Matysik et al. | Metabolomics of fecal samples: a practical consideration | |
| Sangster et al. | A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis | |
| US9816980B2 (en) | Apparatus and corresponding method for sampling and analyzing drugs and respective metabolites in breath air, particularly suitable for performing road drug tests | |
| Schievano et al. | An NMR-based metabolomic approach to identify the botanical origin of honey | |
| Fung et al. | Emerging role of clinical mass spectrometry in pathology | |
| CN101611313A (en) | Mass spectrometry biomarker assay | |
| Versace et al. | Automated DBS extraction prior to Hilic/RP LC–MS/MS target screening of drugs | |
| Sriboonvorakul et al. | Liquid chromatographic–mass spectrometric method for simultaneous determination of small organic acids potentially contributing to acidosis in severe malaria | |
| Zhang et al. | Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC–MS/MS | |
| Diamantidou et al. | Wine and grape marc spirits metabolomics | |
| May et al. | Targeting the untargeted in molecular phenomics with structurally-selective ion mobility-mass spectrometry | |
| CN111562338A (en) | Application of transparent renal cell carcinoma metabolic marker in renal cell carcinoma early screening and diagnosis product | |
| Pérez Antón et al. | Headspace-programmed temperature vaporization-mass spectrometry for the rapid determination of possible volatile biomarkers of lung cancer in urine | |
| CN112083111A (en) | Non-invasive diagnosis marker for chronic drug-induced liver injury related cirrhosis and application thereof | |
| Calò et al. | Validation of a bioanalytical method for the determination of synthetic and natural cannabinoids (new psychoactive substances) in oral fluid samples by means of HPLC-MS/MS | |
| GB2539098B (en) | Free and Total fatty acid determination using desorption ionisation mass spectrometry | |
| Quanico et al. | Combined MALDI mass spectrometry imaging and parafilm-assisted microdissection-based LC-MS/MS workflows in the study of the brain | |
| Cortes et al. | Exploring mass spectrometry suitability to examine human liver graft metabonomic profiles | |
| Chowdhury et al. | NMR-based metabolomics as a significant tool for human nutritional research and health applications |