RU2740269C1

RU2740269C1 - Method for identification of ethyl glucuronid in dry blood stains

Info

Publication number: RU2740269C1
Application number: RU2020125864A
Authority: RU
Inventors: Сергей Александрович Савчук; Андрей Петрович Новиков; Лилия Нажиповна Ризванова; Алексей Константинович Буряк; Николай Юрьевич Шаборшин
Original assignee: Сергей Александрович Савчук
Priority date: 2020-08-04
Filing date: 2020-08-04
Publication date: 2021-01-12

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention relates to medicine and a method of identifying ethyl glucuronid in dry blood stains, according to which a sample of biosubstrate is prepared and performing its chromatography-spectrometric analysis with recording of a mass spectrometer signal in the form of a profile of peaks of analysed substances on a chromatogram with subsequent determination of the affinity of each peak to the analysed substance and comparison with reference analytical characteristics of the desired substance, where to prepare a biosubstrate sample for chromatography-spectrometry analysis from a starting material in the form of a dry blood spot on a soft carrier, a circle with diameter of 1.5 cm is cut, followed by grinding or from the surface of the initial material in the form of a dry blood stain on a solid carrier, a dry blood spot with diameter 1 is scraped, 5 cm, and placing the biosubstrate sample in a vial or a test tube, adding 1.0 ml of methanol, shaking on vibromixer for 2 minutes and transferring the organic layer into a dry clean vial, evaporating to dryness in an air current at 40–60 °C, 100 mcl of deionised water is added to the dry residue, centrifuged for 5 minutes at 14,000 rpm and 5 mcl of the obtained supernatant is introduced into a chromatograph.

EFFECT: invention provides higher sensitivity and accuracy of ethyl glucuronid determination in dry blood stains.

1 cl, 3 dwg, 1 ex

Description

Изобретение относится к хроматографическому анализу химических соединений и может быть использовано для идентификации и выявления наркотических и психоактивных веществ, в частности, определения в сухих пятнах крови этилглюкуронида - прямого метаболита/маркера алкоголя для диагностики факта употребления алкоголя и степени опьянения.The invention relates to chromatographic analysis of chemical compounds and can be used for identification and detection of narcotic and psychoactive substances, in particular, determination of ethyl glucuronide in dry blood spots - a direct metabolite / marker of alcohol for diagnosing the fact of alcohol consumption and the degree of intoxication.

Известен способ выявления и определения происхождения неизвестных веществ в спиртных напитках [RU 2392616, C1, G01N 30/02, 20.06.2010], при котором готовят пробу исследуемого напитка, подвергают ее ГХ/МС анализу, регистрируют масс-спектры и ассоциированные с ними хроматограммы и проводят распознавание компонентов сравнением с базой данных эталонных аналитических характеристик объекта, при этом, дополнительно готовят смесь стандартных веществ, и на ее основе готовят ряд модельных образцов путем введения стандартной смеси в интактный образец в разных концентрациях и анализируют образцы с известным введенным содержанием компонентов при температуре узла ввода 180°С, 250°С и 310°С, и при обнаружении в модельном образце неизвестное вещество квалифицируют как артефакт, образующийся при анализе, а при отсутствии его в модельных образцах готовят контрольный образец путем объединения всего ряда модельных образцов, анализируют его также при температуре узла ввода 180°С, 250°С и 310°С, регистрируют масс-спектры и ассоциированные с ними хроматограммы и при отсутствии в контрольном образце найденного неизвестного вещества его квалифицируют как маркер идентификации.A known method for identifying and determining the origin of unknown substances in alcoholic beverages [RU 2392616, C1, G01N 30/02, 20.06.2010], in which a sample of the test drink is prepared, subjected to GC / MS analysis, mass spectra and associated chromatograms are recorded and recognition of components is carried out by comparison with the database of reference analytical characteristics of the object, while additionally a mixture of standard substances is prepared, and on its basis a number of model samples are prepared by introducing a standard mixture into an intact sample in different concentrations and samples with a known introduced content of components are analyzed at a temperature input node 180 ° C, 250 ° C and 310 ° C, and if it is detected in the model sample, an unknown substance is qualified as an artifact formed during the analysis, and if it is absent in the model samples, a control sample is prepared by combining the entire series of model samples, it is also analyzed at a temperature of the input node 180 ° C, 250 ° C and 310 ° C, register t mass spectra and associated chromatograms, and in the absence of a found unknown substance in the control sample, qualify it as an identification marker.

Недостатком способа является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен, преимущественно, для выявления и определения происхождения неизвестных веществ в суррогатных спиртсодержащих жидкостях или биологических объектах, содержащих летучие яды.The disadvantage of this method is its relatively narrow field of application, since it is intended mainly for identifying and determining the origin of unknown substances in surrogate alcohol-containing liquids or biological objects containing volatile poisons.

Известен также способ выявления неизвестных веществ в биологических жидкостях пациентов, принимавших наркотические или психотропные вещества [RU 241788, С2, G01N 30/02, 27.09.2010], при котором готовят пробу исследуемого образца, подвергают ее ГХ/МС анализу, регистрируют масс-спектры образца, и ассоциированные с ними хроматограммы и проводят распознавание вещества сравнением с базой данных эталонных аналитических характеристик веществ, при этом, готовят три пробы исследуемого образца биологической жидкости -первую путем экстракции с перерастворением, вторую путем кислотного гидролиза и третью путем ферментативного гидролиза, причем, первую пробу подвергают ГХ/МС анализу в режиме градиента температуры 15°С/мин и данные анализируют путем сравнения с базой данных, по которой выявляют признаки неизвестного вещества (НВ), а именно - спектры с m/z, совпадающими с базовыми ионами наркотического или психотропного вещества или метаболитов, и содержание (НВ) в пробе, вторую пробу подвергают ГХ/МС анализу в режиме градиента температуры 25°С/мин и третью пробу подвергают ГХ/МС анализу также в режиме градиента температуры 15°С/мин и при увеличении содержания НВ в последних двух пробах по сравнению с первой, подвергают ГХ/МС анализу также в режиме градиента температуры 15°С/мин базовое наркотическое или психотропное вещество на присутствие в нем НВ, и при его отсутствии в базовом веществе, проверяют присутствие НВ в интактной биологической жидкости, для чего пробу ее готовят путем кислотного гидролиза и подвергают ГХ/МС анализу в режимах градиента температуры 15°С/мин и 25°С/мин и в случае обнаружения НВ в интактной биологической жидкости его квалифицируют как эндогенное, а при отсутствии признаков аликвоту первой пробы смешивают с пробой интактной биологической жидкости, готовят пробу путем кислотного гидролиза смеси, подвергают пробу ГХ/МС анализу в режимах градиента температуры 15°С/мин и 25°С/мин, определяют содержание НВ по результатам обоих режимов анализа и сравнивают его с содержанием НВ в первой пробе и при совпадающих значениях содержания НВ в указанных трех пробах квалифицируют НВ как новый, ранее неизвестный продукт метаболизма базового наркотического или психотропного вещества.There is also known a method for detecting unknown substances in biological fluids of patients who have taken narcotic or psychotropic substances [RU 241788, C2, G01N 30/02, 09/27/2010], in which a sample of a test sample is prepared, subjected to GC / MS analysis, and mass spectra are recorded the sample, and associated chromatograms and carry out the recognition of the substance by comparing it with the database of the reference analytical characteristics of the substances, while preparing three samples of the test sample of the biological fluid - the first by extraction with reconstitution, the second by acid hydrolysis and the third by enzymatic hydrolysis, and the first the sample is subjected to GC / MS analysis in a temperature gradient mode of 15 ° C / min and the data is analyzed by comparison with the database, which reveals the signs of an unknown substance (IR), namely, spectra with m / z coinciding with the base ions of a narcotic or psychotropic substances or metabolites, and the content (HB) in the sample, the second sample is subjected to GC / M With the analysis in the temperature gradient mode of 25 ° C / min and the third sample is subjected to GC / MS analysis also in the temperature gradient mode of 15 ° C / min, and with an increase in the content of HB in the last two samples compared to the first, GC / MS analysis is also performed in in the temperature gradient mode of 15 ° C / min, the base narcotic or psychotropic substance for the presence of HB in it, and in its absence in the base substance, the presence of HB in the intact biological fluid is checked, for which the sample is prepared by acid hydrolysis and subjected to GC / MS analysis in modes of temperature gradient 15 ° C / min and 25 ° C / min and in the case of detection of HB in an intact biological fluid, it is classified as endogenous, and in the absence of signs, an aliquot of the first sample is mixed with a sample of an intact biological fluid, a sample is prepared by acid hydrolysis of the mixture, subjected to GC / MS sample analysis in temperature gradient modes 15 ° C / min and 25 ° C / min, determine the content of HB based on the results of both analysis modes and compare it with the content of HB in the first sample and with the same values of the content of HB in these three samples, the HB is qualified as a new, previously unknown metabolic product of the basic narcotic or psychotropic substance.

Недостатком этого способа также является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен, преимущественно, для выявления и определения происхождения неизвестных веществ в биологических жидкостях пациентов.The disadvantage of this method is also its relatively narrow field of application, since it is intended mainly for identifying and determining the origin of unknown substances in biological fluids of patients.

Кроме того, известен способ идентификации наркотических и психоактивных веществ в биологических жидкостях [RU 2390771, С12, G01N 30/86, 27.05.2010], при котором готовят пробу исследуемого образца, пропускают ее через хроматографическую колонку с неподвижной жидкой фазой и регистрируют сигналы детектора в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу сравнением с эталонными аналитическими характеристиками вещества, при этом готовят две аликвоты пробы исследуемого образца - нативную и дериватизированную и каждую из них пропускают через колонку, по меньшей мере, в двух режимах кондиционирования параметров изменением градиента температуры, и, дополнительно, каждую из указанных аликвот пропускают через колонку с разделением потока при тех же режимах кондиционирования, далее регистрируют сигналы детектора на хроматограммах, выбирают на них пики со значениями асимметрии на 0,1, 0,5 и 0,6 высоты пика от основания ≤1,05, как наиболее соответствующие биномиальному распределению плотности вероятности и недеформированные влиянием фоновых компонентов, и идентифицируют определяемые вещества по отобранным пикам сопоставлением с эталонными аналитическими характеристиками определяемых веществ.In addition, there is a known method for identifying narcotic and psychoactive substances in biological fluids [RU 2390771, C12, G01N 30/86, 05/27/2010], in which a sample of the test sample is prepared, passed through a chromatographic column with a stationary liquid phase and the detector signals are recorded in the form of the profile of the peaks of the analyzed substances on the chromatogram with the subsequent determination of the belonging of each peak to the analyte by comparison with the reference analytical characteristics of the substance, while preparing two aliquots of the sample of the test sample - native and derivatized, and each of them is passed through the column in at least two conditioning modes parameters by changing the temperature gradient, and, additionally, each of these aliquots is passed through the column with flow separation under the same conditioning modes, then the detector signals are recorded on chromatograms, peaks with asymmetry values of 0.1, 0.5 and 0 are selected on them, 6 peak heights from bases ≤1.05, as the most consistent with the binomial probability density distribution and not deformed by the influence of background components, and identifies the analytes by the selected peaks by comparing them with the reference analytical characteristics of the analytes.

Недостатком этого технического решения является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен, преимущественно, для выявления и определения неизвестных веществ в организме человека на основе исследований его биологических жидкостей. Это сужает арсенал технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека или в условиях отсутствия его биологических жидкостей.The disadvantage of this technical solution is its relatively narrow field of application, since it is intended mainly for the detection and determination of unknown substances in the human body based on studies of its biological fluids. This narrows down the arsenal of technical means that can be used to identify narcotic and psychoactive substances in the human body or in the absence of its biological fluids.

Помимо казанных выше, способ идентификации наркотических и психоактивных веществ в сложных биологических матрицах организма человека [RU 2705932, C1, G01N 30/86, 12.11.2019], согласно которому готовят образец биосубстрата человека в виде срезов волос или ногтевых пластин и осуществляют его первое предварительное масс-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала детектора масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу сравнением с эталонными аналитическими характеристиками вещества, при этом, после проведения первого предварительного масс-спектрометрического исследования последовательно проводят еще N последующих предварительных масс-спектрометрических исследований, перед каждым из которых образец биосубстрата промывают метанолом, при этом после проведения предварительных масс-спектрометрических исследований измельчают образец биосубстрата человека до состояния пудры до долей миллиметров и проводят заключительное масс-спектрометрическое исследование, причем если при последовательном проведении предварительных масс-спектрометрических исследований наблюдается последовательное уменьшение массы анализируемых веществ и существенное увеличение их массы при заключительном масс-спектрометрическом исследовании, то принимают решение об идентификации этих веществ в биосубстрате человека.In addition to the above, a method for identifying narcotic and psychoactive substances in complex biological matrices of the human body [RU 2705932, C1, G01N 30/86, 12.11.2019], according to which a sample of a human biosubstrate is prepared in the form of hair sections or nail plates and its first preliminary mass spectrometric study with the registration of the signal of the detector of the mass spectrometer in the form of a profile of the peaks of the analytes on the chromatogram, followed by the determination of the belonging of each peak to the analyte by comparison with the reference analytical characteristics of the substance, while after the first preliminary mass spectrometric study, another N further preliminary mass spectrometric studies, before each of which the biosubstrate sample is washed with methanol, while after preliminary mass spectrometric studies, the human biosubstrate sample is ground to a powder about fractions of millimeters and conduct a final mass spectrometric study, and if, during the sequential preliminary mass spectrometric studies, there is a consistent decrease in the mass of the analyzed substances and a significant increase in their mass during the final mass spectrometric study, then a decision is made to identify these substances in the human biosubstrate.

Особенностью этого технического решения является то, что, число (N+1) предварительных масс-спектрометрических исследований равно 6, при масс-спектрометрическом анализе используют один пластиковый флакон емкостью 50 мл, а при промывке образца биосубстрата внесение и отбор метанола из пластикового флакона используют разовые дозаторы, при предварительном масс-спектрометрическом анализе принимают во внимание принадлежность каждого пика анализируемого вещества при сравнении с эталонной аналитической характеристикой этого вещества при уменьшения его массы при последующем предварительном анализе относительно предыдущего предварительного анализа не менее 10%, о существенном увеличении массы анализируемого вещества при заключительном масс-спектрометрическом анализе судят относительно того вещества, масса которого при заключительном масс-спектрометрическом анализе превышает массу при последнем предварительном анализе не менее чем на 100%.A feature of this technical solution is that, the number (N + 1) of preliminary mass spectrometric studies is 6, in the mass spectrometric analysis one plastic bottle with a capacity of 50 ml is used, and when washing the biosubstrate sample, the introduction and selection of methanol from the plastic bottle is used one-time dispensers, in the preliminary mass spectrometric analysis, take into account the belonging of each peak of the analyte when comparing with the reference analytical characteristic of this substance when its mass decreases in the subsequent preliminary analysis relative to the previous preliminary analysis at least 10%, on a significant increase in the mass of the analyte during the final mass - spectrometric analysis is judged in relation to the substance, the mass of which in the final mass spectrometric analysis exceeds the mass in the last preliminary analysis by at least 100%.

Недостатком этого технического решения является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен, преимущественно, для выявления и определения неизвестных веществ в организме человека через биосубстрат в виде срезов волос или ногтевых пластин.The disadvantage of this technical solution is its relatively narrow field of application, since it is intended mainly for the detection and determination of unknown substances in the human body through a biosubstrate in the form of hair sections or nail plates.

Это сужает арсенал технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека, например, через образцы органов или мышечных тканей при отсутствии биологического материала другого вида.This narrows the arsenal of technical means that can be used to identify narcotic and psychoactive substances in the human body, for example, through samples of organs or muscle tissues in the absence of other biological material.

Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ идентификации наркотических и психоактивных веществ в биологических объектах [RU 2723907, C1, G01N 30/86, 18.06.2020], согласно которому образец биосубстрата человека в виде органа или фрагмента мышечной ткани измельчают до состояния гомогената и осуществляют его хромато-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу и сравнением с эталонными аналитическими характеристиками искомого вещества, при этом, образец биосубстрата человека в виде гомогената перед хромато-спектрометрическим исследованием подвергают щелочному гидролизу и экстрагируют неполярным растворителем из щелочной среды для обеспечения оптимального соотношения сигнал/шум для целевых аналитов, затем полученный экстракт упаривают и при образовании вязкого маслянистого осадка его реэкстрагируют водным кислым раствором и далее целевые вещества извлекают из полученного водного раствора неполярным растворителем при щелочных значениях рН, а хромато-спектрометрическое исследование проводят в режиме регистрации SIM-спектров, причем, набор ионов для SIM-регистрации выбирают из условия выбора всех фрагментов масс-спектра с интенсивностью более 1%.The closest in technical essence to the proposed one is a method for identifying narcotic and psychoactive substances in biological objects [RU 2723907, C1, G01N 30/86, 06/18/2020], according to which a sample of a human biosubstrate in the form of an organ or a fragment of muscle tissue is ground to a state of homogenate and its chromatography-spectrometric study is carried out with the registration of the signal of the mass spectrometer in the form of a profile of the peaks of the analyzed substances on the chromatogram, followed by the determination of the belonging of each peak to the analyte and comparison with the reference analytical characteristics of the desired substance, while a sample of the human biosubstrate in the form of a homogenate before the chromatography-spectrometric the study is subjected to alkaline hydrolysis and extracted with a non-polar solvent from an alkaline medium to ensure the optimal signal-to-noise ratio for the target analytes, then the obtained extract is evaporated and, when a viscous oily precipitate is formed, it is re-extracted is carried out in an aqueous acidic solution and then the target substances are extracted from the resulting aqueous solution with a non-polar solvent at alkaline pH values, and the chromatography-spectrometric study is carried out in the mode of registration of SIM-spectra, and the set of ions for SIM-registration is selected from the condition of selecting all fragments of the mass spectrum with an intensity of more than 1%.

Недостатком наиболее близкого технического решения является его относительно узкая область применения, поскольку он предназначен для выявления и определения в организме человека через биосубстрат в виде органа или фрагмента мышечной ткани преимущественно фентанила, являющимся опиоидным анальгетикоми и мощным агонист μ-опиоидным рецептором, а также близких к нему по химическому строению и свойствам (слабополярных, устойчивых к щелочному гидролизу) 3-метилфенанила, карфентанила, ЛСД, трамадола, кетамина, промедола, диазепама и т.п.The disadvantage of the closest technical solution is its relatively narrow field of application, since it is intended for detection and determination in the human body through a biosubstrate in the form of an organ or a fragment of muscle tissue, predominantly fentanyl, which is an opioid analgesic and a powerful agonist of the μ-opioid receptor, as well as those close to it. by chemical structure and properties (weakly polar, resistant to alkaline hydrolysis) 3-methylphenanyl, carfentanil, LSD, tramadol, ketamine, promedol, diazepam, etc.

Это сужает арсенал технических средств, которые могут быть использованы для определения в сухих пятнах крови этилглюкуронида - прямого метаболита/маркера алкоголя для диагностики факта употребления алкоголя и степени опьянения.This narrows the arsenal of technical means that can be used to determine ethyl glucuronide in dry blood spots - a direct metabolite / marker of alcohol for diagnosing the fact of alcohol consumption and the degree of intoxication.

Задачей, которая решается в изобретении, является разработка способа выявления и идентификации в организме человека этилглюкуронида с использованием в качестве объекта исследований сухих пятен крови на мягких и твердых носителях с целью расширения арсенала технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ.The problem that is solved in the invention is to develop a method for detecting and identifying ethyl glucuronide in the human body using dry blood spots on soft and solid carriers as an object of research in order to expand the arsenal of technical means that can be used to identify narcotic and psychoactive substances.

Требуемый технический результат заключается в расширении арсенала технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека с одновременным повышением чувствительности и точности определения этилглюкуронида в сухих пятнах крови.The required technical result consists in expanding the arsenal of technical means that can be used to identify narcotic and psychoactive substances in the human body with a simultaneous increase in the sensitivity and accuracy of the determination of ethyl glucuronide in dry blood spots.

Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что, в способе, согласно которому готовят образец биосубстрата и осуществляют его хромато-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу и сравнением с эталонными аналитическими характеристиками искомого вещества, согласно изобретению, для подготовки образца биосубстрата для хромато-спектрометрического исследования из исходного материала в виде сухого пятна крови на мягком носителе вырезают круг с диаметром 1,5 см с последующим измельчением или с поверхности исходного материала в виде сухого пятна крови на твердом носителе соскабливают сухое пятно крови диаметром 1,5 см, и помещают образец биосубстрата в виалу или пробирку, добавляют 1,0 мл метанола, встряхивают на вибромиксере 2 минуты и переносят органический слой в сухую чистую виалу, упаривают досуха в токе воздуха при 40-60°С, к сухому остатку добавляют 100 мкл деионизованной воды, центрифугируют 5 минут при 14 000 об/мин и 5 мк полученного супернатанта вводят в хроматограф.The problem is solved, and the required technical result is achieved by the fact that, in the method according to which a sample of the biosubstrate is prepared and its chromatography-spectrometric study is carried out with the registration of the signal of the mass spectrometer in the form of a profile of the peaks of the analytes on the chromatogram, followed by determination of the belonging of each peak to the analyte and comparison with the reference analytical characteristics of the desired substance, according to the invention, to prepare a biosubstrate sample for a chromatography-spectrometric study from the starting material in the form of a dry blood spot on a soft carrier, a circle with a diameter of 1.5 cm is cut out, followed by grinding or from the surface of the starting material in the form dry blood spot on a solid carrier, scraped off a dry blood spot with a diameter of 1.5 cm, and place a sample of the biosubstrate in a vial or test tube, add 1.0 ml of methanol, shake on a vibrating mixer for 2 minutes and transfer the organic layer to a dry clean vial, evaporating They are allowed to dry in a stream of air at 40-60 ° C, 100 μl of deionized water is added to the dry residue, centrifuged for 5 minutes at 14,000 rpm and 5 μl of the resulting supernatant is introduced into the chromatograph.

На чертеже представлены:The drawing shows:

на фиг.1 - сухие пятна крови на различных носителях: (а) - вискоза; (б) - хлопок; (в) - предметы одежды; (г) - шерстяной трикотаж (слева) и джинсовая ткань (справа); (д) - резиновый автомобильный коврик;(е) - обувь из кожзаменителя; (ж) - кожа; (з) - линолеум;figure 1 - dry blood spots on various media: (a) - viscose; (b) cotton; (c) - items of clothing; (d) - wool knitwear (left) and denim (right); (e) - rubber car mat; (f) - leatherette shoes; (g) - skin; (h) - linoleum;

на фиг.2 - представлены хроматографические профили, полученные методом ВЭЖХ-МС/МС, хроматографические профили по MRM: m/z 221 - 113, 221 - 129, 221 - 85, 221 -75 метанольного экстракта сухого пятна из 200 мкл гнилостно измененной трупной крови, этанол 3,1 г/л, положительная по этилглюкурониду, с джинсовой ткани, после 2 дней хранения в помещении при комнатной температуре и естественной влажности, масс-спектр, соответствующий масс-спектру этилглюкуронида, ВЭЖХ-МС/МС система Shimadzu 8050, хроматографическая колонка Agilent Eclipse С18, 2.1×100 mm 1.8 μm. определении этилглюкуронида в сухих пятнах крови на предметах одежды;Fig. 2 shows chromatographic profiles obtained by HPLC-MS / MS, chromatographic profiles by MRM: m / z 221 - 113, 221 - 129, 221 - 85, 221 - 75 of a methanol extract of a dry spot from 200 μl of putrefactive cadaveric blood, ethanol 3.1 g / L, positive for ethyl glucuronide, from denim, after 2 days of storage in a room at room temperature and natural humidity, mass spectrum corresponding to the mass spectrum of ethyl glucuronide, HPLC-MS / MS system Shimadzu 8050, chromatographic column Agilent Eclipse C18, 2.1 × 100 mm 1.8 μm. determination of ethyl glucuronide in dry blood spots on garments;

на фиг.3 - ВЭЖХ-МС/МС исследование метанольных экстрактов сухих пятен трупной крови, хроматографические профили на приборе Shimadzu 8050, хроматографическая колонка Agilent Eclipse С18, 2.1×100 mm 1.8 μm, результаты определения EtG методом ВЭЖХ-МС/МС указывают на то, что этанол не был употреблен прижизненно, (а) - «положительный контроль»: метанольный экстракт сухого пятна из 200 мкл трупной крови, этанол 3,1 г/л, положительной по этилглюкуронид, джинсовая ткань после 5,5 месяцев хранения в закрытом пластиковом пакете при комнатной температуре и естественной влажности, в условиях, аналогичных условиям хранения исследуемых вещественных доказательств, ррофили по MRM: m/z 221-113, 221-129, 221-85, 221-75, (б) - «положительный контроль»: масс-спектр хроматографического пика со временем удерживания 1.2 мин, соответствующий масс-спектру этилглюкуронида, (в) - метанольный экстракт сухого пятна трупной крови С, 7 лет с хлопчатобумажной трикотажной ткани (футболка), до начала исследования вещественные доказательства были на хранении 6 месяцев в закрытом пластиковом пакете при комнатной температуре и естественной влажности, в крови ранее был выявлен этанол в концентрации 0,5 г/л, профили по MRM: m/z 221 - 113, 221 - 129, 221 - 85, 221 - 75 и масс-спектр по времени удерживания 1.2 мин, этилглюкуронид отсутствует, (б) - метанольный экстракт сухого пятна трупной крови С., 7 лет с плащевой ткани (куртка), до начала исследования вещественные доказательства были на хранении 6 месяцев в закрытом пластиковом пакете при комнатной температуре и естественной влажности, в крови ранее был выявлен этанол в концентрации 0,5 г/л, профили по MRM: m/z 221 - 113, 221 - 129, 221 - 85, 221 - 75 и масс-спектр по времени удерживания 1.2 мин, этилглюкуронид отсутствует.Fig. 3 - HPLC-MS / MS study of methanol extracts of dry cadaveric blood spots, chromatographic profiles on a Shimadzu 8050 device, chromatographic column Agilent Eclipse C18, 2.1 × 100 mm 1.8 μm, the results of EtG determination by HPLC-MS / MS indicate that that ethanol was not used in vivo, (a) - "positive control": methanol extract of a dry spot from 200 μl of cadaveric blood, ethanol 3.1 g / l, positive for ethyl glucuronide, denim after 5.5 months of storage in a closed plastic bag at room temperature and natural humidity, under conditions similar to the storage conditions of the investigated material evidence, profiles by MRM: m / z 221-113, 221-129, 221-85, 221-75, (b) - "positive control": mass spectrum of the chromatographic peak with a retention time of 1.2 min, corresponding to the mass spectrum of ethyl glucuronide, (c) - methanol extract of a dry spot of cadaveric blood C, 7 years from a cotton knitted fabric (T-shirt), before the start of the study of substances Evidence was stored for 6 months in a closed plastic bag at room temperature and natural humidity, ethanol was previously detected in the blood at a concentration of 0.5 g / l, MRM profiles: m / z 221 - 113, 221 - 129, 221 - 85, 221 - 75 and mass spectrum by retention time 1.2 min, ethyl glucuronide is absent, (b) - methanol extract of dry spot of cadaveric blood C., 7 years old from raincoat tissue (jacket), before the start of the study material evidence was in storage for 6 months in a closed plastic bag at room temperature and natural humidity, ethanol was previously detected in the blood at a concentration of 0.5 g / l, MRM profiles: m / z 221 - 113, 221 - 129, 221 - 85, 221 - 75 and mass - spectrum by retention time 1.2 min, ethyl glucuronide is absent.

Способ идентификации этилглюкуронида в сухих пятнах крови реализуется следующим образом.The method for identifying ethyl glucuronide in dry blood spots is implemented as follows.

В серии экспериментов, проведенных на значительной выборке материала и на различных носителях: ткань (вискоза, полиэстер, хлопок, шерсть), кожзаменитель, натуральная кожа, бумага, резина, стекло - показана возможность определения этилглюкуронида в сухих пятнах крови на объектах вещественных доказательств. Для исследования использовали четыре образца трупной крови с гнилостными изменениями, содержащие этанол в концентрациях: 3.3, 3.1, 3.1 и 1.5 г/л. Сухие пятна крови, нанесенные на шерстяной трикотаж, резиновый автомобильный коврик, обувь из кожзаменителя, натуральную кожу, линолеум, выдерживали два дня, пять дней и неделю в помещении при комнатной температуре и естественной влажности, после чего анализировали. При повторных анализах не наблюдали значимых потерь этилглюкуронида. Сухое пятно крови диаметром 1,5 см, ориентировочно соответствующее 200-300 мкл, вырезают и при необходимости измельчают (бумага, ткань, кожзаменитель, кожа) или соскабливают с твердой поверхности (стекло, резина, пластмасса). Помещают в виалу или пробирку, добавляют 1,0 мл метанола, встряхивают на вибромиксере 2 минуты. Переносят органический слой в сухую чистую виалу, упаривают досуха в токе воздуха при 40-60°С. К сухому остатку добавляют 100 мкл деионизованной воды, центрифугируют 5 минут при 14 000 об/мин, 5 мкл супернатанта вводят в хроматограф.In a series of experiments carried out on a large sample of material and on various media: fabric (viscose, polyester, cotton, wool), imitation leather, natural leather, paper, rubber, glass, the possibility of determining ethyl glucuronide in dry blood spots on objects of material evidence was shown. For the study, we used four samples of cadaveric blood with putrefactive changes containing ethanol at concentrations: 3.3, 3.1, 3.1, and 1.5 g / L. Dry blood stains applied to woolen knitwear, rubber car mat, leatherette shoes, natural leather, linoleum were kept for two days, five days and a week indoors at room temperature and natural humidity, and then analyzed. Repeated analyzes did not show significant losses of ethyl glucuronide. A dry blood spot with a diameter of 1.5 cm, approximately corresponding to 200-300 μl, is cut out and, if necessary, crushed (paper, cloth, leatherette, leather) or scraped off from a hard surface (glass, rubber, plastic). Place in a vial or test tube, add 1.0 ml of methanol, shake on a vibrating mixer for 2 minutes. Transfer the organic layer into a dry clean vial, evaporate to dryness in a stream of air at 40-60 ° C. To the dry residue, add 100 μl of deionized water, centrifuge for 5 minutes at 14,000 rpm, 5 μl of the supernatant is introduced into the chromatograph.

Допускается вводить в хроматограф непосредственно метанольный экстракт, но при этом возможно ухудшение качества хроматографических пиков.It is allowed to directly enter the methanol extract into the chromatograph, but the quality of the chromatographic peaks may deteriorate.

Сухие пятна крови на сорбенте - носителе вырезают (при необходимости измельчают) и помещают во флаконы для фильтрации/центрифугирования. Диаметр пор фильтра 0.22 μm. К образцам добавляют 60 мкл водного раствора глюконовой кислоты концентрацией 200 ммоль/л. После 1 ч инкубирования при комнатной температуре в течение 10 мин при 1500g отбирают 20 мкл фильтрованного образца и добавляют к нему 5 мкл водного раствора TbCl3, центрифугируют при 10 мин при 10000g, 5 мкл надосадочной жидкости вводят в хроматограф.Dry blood spots on the sorbent-carrier are cut out (if necessary, crushed) and placed in vials for filtration / centrifugation. Filter pore diameter 0.22 μm. To the samples add 60 μl of an aqueous solution of gluconic acid with a concentration of 200 mmol / l. After 1 h of incubation at room temperature for 10 min at 1500g, 20 μl of the filtered sample is taken and 5 μl of an aqueous solution of TbCl3 is added to it, centrifuged for 10 min at 10000g, 5 μl of the supernatant is injected into the chromatograph.

Хромато-спектрометрическое исследование с регистрацией сигнала масс-спектрометра в виде профиля пиков анализируемых веществ на хроматограмме проводят с последующим определением принадлежности каждого пика анализируемому веществу и сравнением с эталонными аналитическими характеристиками искомого вещества.Chromato-spectrometric study with the registration of the signal of the mass spectrometer in the form of the profile of the peaks of the analytes on the chromatogram is carried out with the subsequent determination of the belonging of each peak to the analyte and comparison with the reference analytical characteristics of the desired substance.

Таким образом, в предложенном способе достигается требуемый технический результат, который заключается в расширении арсенала технических средств, которые могут быть использованы для идентификации наркотических и психоактивных веществ в организме человека с одновременным повышением чувствительности и точности определения этилглюкуронида в сухих пятнах крови.Thus, the proposed method achieves the required technical result, which consists in expanding the arsenal of technical means that can be used to identify narcotic and psychoactive substances in the human body with a simultaneous increase in the sensitivity and accuracy of determining ethyl glucuronide in dry blood spots.

Claims

A method for identifying ethyl glucuronide in dry blood spots, according to which a sample of a biosubstrate is prepared and its chromatography-spectrometric study is carried out with the registration of the signal of the mass spectrometer in the form of a profile of the peaks of the analytes on the chromatogram, followed by determining the belonging of each peak to the analyte and comparison with the reference analytical characteristics of the desired substance characterized in that, to prepare a biosubstrate sample for a chromatography-spectrometric study, a circle with a diameter of 1.5 cm is cut out from the starting material in the form of a dry blood spot on a soft carrier, followed by grinding or from the surface of the starting material in the form of a dry blood spot on a solid carrier, a dry a spot of blood 1.5 cm in diameter, and a sample of the biosubstrate is placed in a vial or test tube, 1.0 ml of methanol is added, shaken on a vibrating mixer for 2 minutes and the organic layer is transferred into a dry clean vial, evaporated to dryness in an air stream at 40-60 ° C, to the dry residue is added 100 μl of deionized water, centrifuged for 5 minutes at 14,000 rpm and 5 μl of the resulting supernatant is introduced into the chromatograph.