RU2748023C1

RU2748023C1 - Method for obtaining mass culture of symbiotic bacteria xenorhabdus of entomopathogenic nematodes rhabditida: steinernematidae

Info

Publication number: RU2748023C1
Application number: RU2020137190A
Authority: RU
Inventors: Леонид Григорьевич Данилов; Татьяна Юрьевна Нащекина; Елена Анатольевна Зорина
Priority date: 2020-11-12
Filing date: 2020-11-12
Publication date: 2021-05-19

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention relates to biotechnology. Disclosed is a method for obtaining a mass culture of symbiotic bacteria Xenorhabdus of entomopathogenic nematodes Steinernematidae, including the preparation of a pure culture of symbiotic bacteria and their cultivation on a nutrient medium used for the reproduction of nematode-bacterial complexes and containing egg powder - 6.4%; unrefined sunflower oil - 4.9%; soy flour - 11.6%; brewer's yeast - 0.7%; salt - 0.3%; water - 62.7%; foam rubber - 13.4%; moreover, the nutrient medium is additionally diluted with tap water in a ratio of 12%: 88%.EFFECT: increased yield of culture of entomopathogenic nematodes Steinernematidae and their invasive activity against test insects in the presence of symbiont bacteria.1 cl, 4 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения массовой культуры симбиотических бактерий энтомопатогенных нематод (ЭПН) при промышленном производстве биомассы этих паразитов на искусственных питательных средах (ИПС) и применяемых в качестве биологических средств защиты растений от насекомых вредителей.The invention relates to the microbiological industry, in particular to methods for obtaining a mass culture of symbiotic bacteria of entomopathogenic nematodes (EPN) in the industrial production of the biomass of these parasites on artificial nutrient media (IPA) and used as biological means of protecting plants from insect pests.

При культивировании энтомопатогенных нематод в питательной среде большое значение имеет подготовка чистой культуры симбиотических бактерий, которые встречаются в двух формах: первичной и вторичной. Нематоды размножаются в присутствии первичной формы, тогда как вторичные формы бактерий могут прекращать развитие нематод (1).When cultivating entomopathogenic nematodes in a nutrient medium, it is of great importance to prepare a pure culture of symbiotic bacteria, which occur in two forms: primary and secondary. Nematodes multiply in the presence of the primary form, while the secondary forms of bacteria can stop the development of nematodes (1).

Из известных способов получения и хранения первичных форм является способ, при котором культуру симбиотических бактерий приготавливают и хранят на агаризированных косяках в пробирках. При этом чистые культуры первичных форм симбиотических бактерий получают по методу Г. Пойнара (2) путем заражения нематодами гусениц большой вощинной моли Galeria mellonella, выращенных по методу Датки и др. (3), с последующим отбором бактериальных клеток из гемолимфы насекомых и посевом их на питательный YS агар (NH₄H₂PO₄- 0,5 г; K₂HPO₄- 0,5 г; MgSO₄⋅7H₂O - 0,2 г; NaCl - 5 г; дрожжевой экстракт - 5 г; агар - 12 г; вода - 1 л) (4), содержащий 2,3, 5-трифенил-тетразолиум хлорид (0,004%) и бромтимоловый голубой (0,025%).Among the known methods of obtaining and storing primary forms is a method in which a culture of symbiotic bacteria is prepared and stored on agarized jambs in test tubes. At the same time, pure cultures of primary forms of symbiotic bacteria are obtained by the method of G. Poinar (2) by infecting caterpillars of the large wax moth Galeria mellonella grown by the method of Datka et al. (3) with nematodes, followed by selection of bacterial cells from the hemolymph of insects and sowing them on nutrient YS agar (NH ₄ H ₂ PO ₄ - 0.5 g; K ₂ HPO ₄ - 0.5 g; MgSO ₄ ⋅7H ₂ O - 0.2 g; NaCl - 5 g; yeast extract - 5 g; agar - 12 g; water - 1 l) (4), containing 2,3, 5-triphenyl-tetrazolium chloride (0.004%) and bromothymol blue (0.025%).

Спустя трое суток после выращивания бактерий при 25°С проводят отбор колоний первичных форм по морфологическим признакам колоний и по характеру их окраски. Идентификация первичных форм симбиотических бактерий проводят по методу Акюрста (4). Для получения большого количества культуры симбиотических бактерий при массовом размножении энтомопатогенных нематод чистая культура бактерий хранится 10-15 дней при температуре 5-10°С, и более длительный срок бактерии хранятся в лиофилизированном состоянии (5).Three days after growing bacteria at 25 ° C, colonies of primary forms are selected according to the morphological characteristics of the colonies and the nature of their color. Primary forms of symbiotic bacteria are identified by the Akurst method (4). To obtain a large amount of culture of symbiotic bacteria during mass reproduction of entomopathogenic nematodes, a pure culture of bacteria is stored for 10-15 days at a temperature of 5-10 ° C, and for a longer period the bacteria are stored in a lyophilized state (5).

В процессе массового производства энтомопатогенных нематод одновременно требуется значительный объем культуры их симбиотических бактерий. Наиболее близким, из известных и принятым за прототип, является способ получения массовой культуры симбиотических бактерий с высокой биологической активностью, при котором чистую культуру симбиотических бактерий выращивают в питательном (ГРМ-бульон) бульоне в колбах Эрленмейера на качалке при температуре 25-28°С ГРМ-бульон используется для культивирования различных микроорганизмов и который представляет собой микродисперсный, гигроскопичный порошок светло-желтого цвета. Состав: панкреатический гидролизат рыбной муки, пептон сухой ферментативный, натрия хлорид (ТУ9398-021-78095326-206).In the process of mass production of entomopathogenic nematodes, a significant volume of culture of their symbiotic bacteria is simultaneously required. The closest known and accepted as a prototype is a method for obtaining a mass culture of symbiotic bacteria with high biological activity, in which a pure culture of symbiotic bacteria is grown in a nutritious (GRM broth) broth in Erlenmeyer flasks on a rocking chair at a temperature of 25-28 ° C. - broth is used for the cultivation of various microorganisms and is a microdispersed, hygroscopic powder of light yellow color. Ingredients: pancreatic hydrolyzate of fish meal, dry enzymatic peptone, sodium chloride (TU9398-021-78095326-206).

Недостатки прототипа определяются высокой стоимостью ГРМ-бульона, которая четырехкратно превышает стоимость всех компонентов питательной среды в определенном ее объеме, что существенно отражается на себестоимости промышленного производства биологических препаратов, изготавливаемых на основе энтомопатогенных нематод. Кроме того, компонентные составы бульонов, реализуемые в торговой сети, могут значительно различаться в зависимости от производителя, что может существенно отражаться на биологической активности нематодных препаратов, изготавливаемых на ИПС с использованием таких бульонов, и снижать эффективность способа.The disadvantages of the prototype are determined by the high cost of the timing broth, which four times exceeds the cost of all components of the nutrient medium in a certain volume, which significantly affects the cost of industrial production of biological preparations based on entomopathogenic nematodes. In addition, the component compositions of broths sold in the trade network can vary significantly depending on the manufacturer, which can significantly affect the biological activity of nematode preparations made on IPA using such broths, and reduce the efficiency of the method.

Задача, решаемая изобретением - повышение эффективности способа и снижение себестоимости конечного продукта в условиях промышленного производства биопрепаратов, изготавливаемых на основе энтомопатогенных нематод, за счет нового питательного бульона, используемого при массовой наработке культуры симбиотических бактерий с высокой их биологической активностью.The problem solved by the invention is to increase the efficiency of the method and reduce the cost of the final product in the conditions of industrial production of biological products made on the basis of entomopathogenic nematodes, due to a new nutrient broth used in the mass production of a culture of symbiotic bacteria with their high biological activity.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение эффективности с одновременным снижением стоимости конечного продукта.The technical result of the proposed invention is to increase efficiency while reducing the cost of the final product.

Поставленная задача решается следующим путем. Предлагаемый способ культивирования симбиотических бактерий заключается в том, что за основу нового питательного бульона взяты компоненты ИПС, используемые при приготовлении питательной среды для размножения нематодно-бактериального комплекса, которая дополнительно разбавляется водопроводной водой в соотношении 12% бульона искусственной питательной среды и 88% водопроводной воды.The task is solved in the following way. The proposed method for the cultivation of symbiotic bacteria is that the basis of the new nutrient broth is taken from the components of the IPS used in the preparation of the culture medium for the reproduction of the nematode-bacterial complex, which is additionally diluted with tap water in the ratio of 12% of the broth of the artificial culture medium and 88% of tap water.

При этом компонентный состав ИПС следующий, % от общего объема питательного бульона:In this case, the component composition of the IPA is as follows,% of the total volume of the nutrient broth:

яичный порошокegg powder 7,4 7.4 масло подсолнечное нерафинированноеunrefined sunflower oil 5,65 5.65 соевая мукаsoy flour 13,4 13.4 пивные дрожжиBrewer's yeast 0,8 0.8 сольsalt 0,35 0.35 водаwater 72,4 72.4

Пример 1Example 1

Первоначальный процесс культивирования начинают с приготовления чистой культуры симбиотических бактерий и моноксенной культуры (т.е. культуры инвазионных личинок нематод, с одним видом бактерий - симбиотических) нематод, что также учитывалось при проведении сравнительной оценки качества различных форм питательных бульонов для размножения симбиотических бактерий и последующего развития нематодно-бактериального комплекса на ИПС.The initial cultivation process begins with the preparation of a pure culture of symbiotic bacteria and a monoxenic culture (i.e. culture of invasive nematode larvae, with one type of bacteria - symbiotic) nematodes, which was also taken into account when conducting a comparative assessment of the quality of various forms of nutrient broths for the reproduction of symbiotic bacteria and subsequent development of the nematode-bacterial complex on the IPS.

Моноксенизация нематод осуществлена путем стерилизации инвазионных личинок нематод в 0.1% растворе мертиолата (C₂H₅HgSC₆H₄COONa), с последующим помещением их на питательный агар с чистой культурой симбиотических бактерий. Спустя пять дней на агаре развиваются половозрелые самки нематод, которые подвергались стерилизации путем проводки через мертиолат и набор антибиотиков (6). Полученных от самок аксенные личинки нематод первого возраста переносили на липидный агар (7) с симбиотическими бактериями. Спустя 15-20 дней после завершения цикла развития нематод проводили сбор моноксенной культуры инвазионных личинок нематод и инокулировали их в конические колбы (500 см³) с питательной средой, нанесенной на поролоновую губку с предварительно размноженными на ней симбиотическими бактериями Xenorhabdus bovienii (1,8 и 9).Monoxenization of nematodes was carried out by sterilizing invasive nematode larvae in a 0.1% solution of merthiolate (C ₂ H ₅ HgSC ₆ H ₄ COONa), followed by placing them on nutrient agar with a pure culture of symbiotic bacteria. Five days later, mature female nematodes develop on the agar, which were sterilized by passage through merthiolate and a set of antibiotics (6). The first instar nematode larvae obtained from females were transferred onto lipid agar (7) with symbiotic bacteria. 15-20 days after the completion of the nematode development cycle, a monoxenic culture of invasive nematode larvae was collected and inoculated into conical flasks (500 cm ³ ) with a nutrient medium applied to a foam sponge with symbiotic bacteria Xenorhabdus bovienii (1.8 and nine).

Колбы содержали при температуре 25°С в течение 15 дней. После завершения цикла развития нематод в ИПС, полученных моноксенных инвазионных личинок использовали в качестве посевного материала по вариантам опытов.The flasks were kept at 25 ° C for 15 days. After the completion of the developmental cycle of nematodes in IPS, the obtained monoxenous invasive larvae were used as inoculum according to the variants of the experiments.

Процесс культивирования нематодно-бактериального комплекса начинается со смешивания компонентов ИПС в отдельной емкости. Полученной гомогенной массой пропитывается поролоновая крошка, которая затем помещается в емкости и автоклавируется при температуре 121°С и давлении 1 атм. в течение 30 минут. В охлажденную питательную смесь в стерильных условиях инокулируется жидкая чистая двухсуточная культура симбиотических бактерий.The cultivation process of the nematode-bacterial complex begins with mixing the IPA components in a separate container. The resulting homogeneous mass is impregnated with foam rubber, which is then placed in containers and autoclaved at a temperature of 121 ° C and a pressure of 1 atm. within 30 minutes. A liquid, clean, two-day-old culture of symbiotic bacteria is inoculated into the cooled nutrient mixture under sterile conditions.

В процессе культивирования нематодно-бактериального комплекса и в качестве основы, при приготовлении бульонов ИПС, по вариантам опытов использована питательная среда из компонентов: яичный порошок - 6,4%; масло подсолнечное нерафинированное - 4,9%; соевая мука - 11,6%; пивные дрожжи - 0,7%; соль - 0,3%; вода - 62.7%, поролоновая крошка - 13,4%.In the process of cultivation of the nematode-bacterial complex and as a basis for the preparation of IPA broths, according to the variants of the experiments, a nutrient medium was used from the following components: egg powder - 6.4%; unrefined sunflower oil - 4.9%; soy flour - 11.6%; brewer's yeast - 0.7%; salt - 0.3%; water - 62.7%, foam rubber - 13.4%.

Интенсивность роста и развития чистой культуры симбиотических бактерий изучалась с использованием следующих питательных бульонов: 1) ГРМ - бульон питательный (прототип); 2) бульон ИПС без масла; 3) бульон ИПС 12,0 г + 88 мл H₂O; 4) бульон ИПС 6 г + 94 мл Н₂О; 5) бульон ИПС 3 г + 97 мл H₂O.The intensity of growth and development of a pure culture of symbiotic bacteria was studied using the following nutrient broths: 1) GRM - nutritious broth (prototype); 2) IPA broth without oil; 3) IPA broth 12.0 g + 88 ml H ₂ O; 4) IPA broth 6 g + 94 ml H ₂ O; 5) IPA broth 3 g + 97 ml H ₂ O.

При изучении возможности культивирования симбиотических бактерий на различных по составу питательных бульонах использованы колбы объемом 500 см³, которые заполняли питательным бульоном в расчете по 100 мл в каждую. После этого колбы с бульонами автоклавировали при температуре 121°С и давлении 1 атм. в течение 30 минут. В охлажденную питательную среду в стерильных условиях вносили по 5 мл чистой культуры симбиотических бактерий с количеством бактериальных клеток 1,0⋅10⁸ в 1 мл суспензии. После двухсуточной экспозиции при температуре 23-25°С по вариантам опыта определялась численность бактериальных клеток в расчете на 1 мл питательного бульона с использованием камеры Горяева.When studying the possibility of cultivating symbiotic bacteria on nutrient broths of different composition, flasks with a volume of 500 cm ^{3 were used} , which were filled with nutrient broth in the amount of 100 ml each. After that, the flasks with broths were autoclaved at a temperature of 121 ° C and a pressure of 1 atm. within 30 minutes. In a cooled nutrient medium under sterile conditions, 5 ml of a pure culture of symbiotic bacteria were introduced with the number of bacterial cells 1.0⋅10 ⁸ per 1 ml of suspension. After a two-day exposure at a temperature of 23-25 ° C, according to the variants of the experiment, the number of bacterial cells was determined per 1 ml of nutrient broth using a Goryaev chamber.

Изучение эффективности культивирования симбиотических бактерий и нематод на ИПС в присутствии симбиотических бактерий, выращенных на различных питательных бульонах, проведено по одной методике, с использованием колб Эрленмейера объемом 500 см³ и биореакторов (10). Одна колба с 40 г и один биореактор с 400 г ИПС принимались за повторность. Повторность в опытах - 5-ти кратная.The study of the efficiency of cultivation of symbiotic bacteria and nematodes on IPA in the presence of symbiotic bacteria grown in various nutrient broths was carried out according to the same method, using Erlenmeyer flasks with a volume of 500 cm ³ and bioreactors (10). One flask with 40 g and one bioreactor with 400 g of IPA were taken as replicates. Repetition in experiments - 5 times.

После автоклавирования колбы и биореакторы с ИПС охлаждались и в них в стерильных условиях вносили чистую культуру симбиотических бактерий с количеством 1,0⋅10⁸ бактериальных клеток в 1 мл питательного бульона. Количества инокулюмов симбиотических бактерий в опытах выдерживались на следующих уровнях - 5 мл суспензии бактериальных клеток в питательном бульоне в расчете на одну колбу и в биореакторах, соответственно, в расчете на один биореактор - 100 мл суспензии бактериальных клеток.After autoclaving, the flasks and bioreactors with IPA were cooled and a pure culture of symbiotic bacteria was introduced into them under sterile conditions with an amount of 1.0⋅10 ⁸ bacterial cells in 1 ml of nutrient broth. The amounts of inoculums of symbiotic bacteria in the experiments were maintained at the following levels - 5 ml of bacterial cell suspension in a nutrient broth per one flask and in bioreactors, respectively, per one bioreactor - 100 ml of bacterial cell suspension.

Спустя двое суток после развития симбиотических бактерий на ИПС при температуре 23-25°С в каждую колбу с питательной средой в стерильных условиях внесено по 2 млн. стерильной культуры инвазионные личинки нематод в 10 мл дистиллированной воды и, соответственно, в каждый биореактор по 15 млн. нематод в 100 мл воды. Инвазионные личинки нематод перед внесением в емкости с ИПС стерилизовались в течение одного часа в 0,1% растворе формалина с последующей очисткой от химиката путем трехкратной промывки и осаждения в водопроводной воде. Температура в процессе развития симбиотических бактерий и нематодно-бактериального комплекса 23-25°С.Two days after the development of symbiotic bacteria on IPA at a temperature of 23-25 ° C, 2 million sterile cultures of invasive nematode larvae were added to each flask with a nutrient medium under sterile conditions in 10 ml of distilled water and, accordingly, 15 million . nematodes in 100 ml of water. Invasive nematode larvae were sterilized for one hour in 0.1% formalin solution before being introduced into containers with IPA, followed by cleaning from the chemical by three times washing and sedimentation in tap water. The temperature during the development of symbiotic bacteria and nematode-bacterial complex is 23-25 ° С.

Оценку качества бактериальных культур после завершения их развития в питательных бульонах проводили по трем показателям: 1) по титру бактериальных клеток 2) выходу культуры нематод, после завершения процесса развития нематодно-бактериального комплекса на ИПС в присутствии бактерий симбионтов, размноженных на различных питательных бульонах; 3) инвазионной активности нематод после завершения процесса их развития на питательных бульонах в сравнении с прототипом.Evaluation of the quality of bacterial cultures after the completion of their development in nutrient broths was carried out according to three indicators: 1) by the titer of bacterial cells; 2) the yield of nematode culture, after the completion of the development of the nematode-bacterial complex on IPS in the presence of symbiont bacteria propagated in various nutrient broths; 3) the invasive activity of nematodes after the completion of the process of their development on nutrient broths in comparison with the prototype.

После завершения цикла развития нематод в ИПС, полученные культуры нематод оценивали на инвазионную активность по методу Веремчук Г.В. и Данилова Л.Г. (11). Показатель инвазионной активности нематодно-бактериальных комплексов служил критерием окончательной оценки качества бактериальных культур. Гибель насекомых учитывали через каждые 4 часа после начала заражения. Во время учетов погибших насекомых выбирали из чашек, вскрывали в воде на часовом стекле под бинокуляром МБС-10 и определяли причину их гибели. Обнаруженных нематод подсчитывали и, таким образом, устанавливали интенсивность их проникновения в хозяина.After completion of the developmental cycle of nematodes in IPS, the resulting nematode cultures were assessed for invasive activity according to the method of G.V. Veremchuk. and Danilova L.G. (eleven). The indicator of invasive activity of nematode-bacterial complexes served as a criterion for the final assessment of the quality of bacterial cultures. The death of insects was counted every 4 hours after the start of infection. During the counts, the dead insects were selected from cups, opened in water on a watch glass under an MBS-10 binocular microscope, and the cause of their death was determined. The detected nematodes were counted and, thus, the intensity of their penetration into the host was established.

После оценки качества питательных бульонов не установлено существенных различий по интенсивности роста бактериальных клеток Xenorhabdus bovienii между ГРМ-бульон питательный (прототип) и бульоном в составе ИПС 12,0 г + 88 мл H₂O. Титр бактериальных клеток, соответственно, составлял 1,4⋅10¹¹ и 1,7⋅10¹¹. С уменьшением содержания ИПС в питательном бульоне снижался и титр бактериальных клеток до 6,7⋅10⁸ (Таблица 1).After evaluating the quality of the nutrient broths, no significant differences were found in the growth rate of bacterial cells of Xenorhabdus bovienii between the GRM nutrient broth (prototype) and the broth in the composition of IPA 12.0 g + 88 ml H ₂ O. The titer of bacterial cells, respectively, was 1.4 ⋅10 ¹¹ and 1.7⋅10 ¹¹ . With a decrease in the IPA content in the nutrient broth, the titer of bacterial cells also decreased to 6.7⋅10 ⁸ (Table 1).

При оценке качества бактериальных клеток после их развития на различных питательных бульонах по интенсивности развития нематодно-бактериального комплекса на искусственной питательной среде и инвазионной активности его в отношении насекомых-хозяев было установлено, что по выходу инвазионных личинок нематод и инвазионной активности у нематод, в присутствии симбиотических бактерий, развившихся в питательном бульоном в составе ИПС 12,0 г + 88 мл H₂O на 10% эти показатели превышали соответствующие в ГРМ бульоне питательном (Таблицы 1, 2 и 3).When assessing the quality of bacterial cells after their development in various nutrient broths according to the intensity of development of the nematode-bacterial complex on an artificial nutrient medium and its invasive activity against host insects, it was found that the release of invasive nematode larvae and invasive activity in nematodes, in the presence of symbiotic bacteria that developed in the nutrient broth in the composition of IPA 12.0 g + 88 ml H ₂ O 10% higher than those in the GRM nutrient broth (Tables 1, 2 and 3).

Результаты оценки стоимости ГРМ бульона питательного с питательным бульоном в составе ИПС 12,0 г + 88 мл H₂O свидетельствуют о значительном снижении стоимости последнего по сравнению с прототипом (Таблица 4). При этом, например, стоимость компонентов ИПС для приготовления 10 литров ГРМ - питательного бульона без стоимости поролоновой крошки - составляет 918,86 руб., тогда как стоимость питательного бульона в составе ИПС 12,0 г + 88 мл H₂O, соответственно, 148,96 руб., т.е. достигается значительное снижение стоимости ИПС для массового культивирования биологических препаратов, изготавливаемых на основе ЭПН.The results of evaluating the cost of the timing broth nutritious with nutritious broth in the composition of the IPA 12.0 g + 88 ml H ₂ O indicate a significant reduction in the cost of the latter in comparison with the prototype (Table 4). In this case, for example, the cost of IPA components for the preparation of 10 liters of timing belt - a nutritious broth without the cost of foam rubber crumbs - is 918.86 rubles, while the cost of a nutritious broth in the composition of IPA is 12.0 g + 88 ml H ₂ O, respectively, 148 , 96 rubles, i.e. a significant reduction in the cost of IPA is achieved for the mass cultivation of biological preparations based on EPN.

Источники информацииInformation sources

1. Akhurst R.J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp. bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis J. Gen. Microbial. 1980. Vol. 121, №2. P.303-309.1. Akhurst R.J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp. bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis J. Gen. Microbial. 1980. Vol. 121, no. 2. P.303-309.

2. Poinar G.O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neo aplectana sp. Nematologica. 1966. Vol. 12. №1. P.31-35.2. Poinar G.O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neo aplectana sp. Nematologica. 1966. Vol. 12. No. 1. P.31-35.

3. Dutky S.R., Thompson J.V., Cantwel G.E. A technique for the mass propogation oe the DD-136 nematode. J. Insect Pathol. 1964. Vol. 6, №4. P. 417-422.3. Dutky S.R., Thompson J.V., Cantwel G.E. A technique for the mass propogation oe the DD-136 nematode. J. Insect Pathol. 1964. Vol. 6, no. 4. P. 417-422.

4. Dye D.W. A taxonomic study of the genus Eerwinia. The amylovora group. N.Z.J. Sci. 1968. Vol. 11, №4. P. 590-607.4. Dye D.W. A taxonomic study of the genus Eerwinia. The amylovora group. N.Z.J. Sci. 1968. Vol. 11, no. 4. P. 590-607.

5. Данилов Л.Г., Айрапетян В.Г., Нащекина Т.Ю. Способ подготовки симбиотических бактерий рода Xenorhabdus, выделенных из нематод вида Steinernema feltiae protense к хранению.Патент РФ №2053790, 2014.5. Danilov L.G., Airapetyan V.G., Nashchekina T.Yu. A method for preparing symbiotic bacteria of the genus Xenorhabdus isolated from nematodes of the species Steinernema feltiae protense for storage. RF Patent No. 2053790, 2014.

6. Han R., Wouts W.M. Development of Heterorhabditis spp. strains as characteristics of possible Xenorhabdus luminescens subspecies. Rev. Nematol. 1990. Vol. 13. P. 411-415.6. Han R., Wouts W.M. Development of Heterorhabditis spp. strains as characteristics of possible Xenorhabdus luminescens subspecies. Rev. Nematol. 1990. Vol. 13.P. 411-415.

7. Han R., Wouts W.M., Li L. Development and virulence of Heterorhabditis spp. strains associated with different Xenorhabdus luminescens isolates. J. Invertebr. Pathol. 1991. Vol. 57. P. 1-6.7. Han R., Wouts W. M., Li L. Development and virulence of Heterorhabditis spp. strains associated with different Xenorhabdus luminescens isolates. J. Invertebr. Pathol. 1991. Vol. 57. P. 1-6.

8. Bedding R.A. Low cost in vitro mass production of Neoaplectana and Heterorhabditis species (Nematode) for field control of insect pests. Nematologica. 1981. Vol. 27, №1. P. 109-114.8. Bedding R.A. Low cost in vitro mass production of Neoaplectana and Heterorhabditis species (Nematode) for field control of insect pests. Nematologica. 1981. Vol. 27, no. 1. P. 109-114.

9. Wouts W.M. Mass production of the entomogenous Heterorhabditis heliothidis (Nematoda: Heterorhabditidae) on artificial media. Nematol. 1981. Vol. 13, №4. P. 467-469.9. Wouts W.M. Mass production of the entomogenous Heterorhabditis heliothidis (Nematoda: Heterorhabditidae) on artificial media. Nematol. 1981. Vol. 13, no. 4. P. 467-469.

10. Данилов Л.Г. Способ для производства биологических препаратов на основе энтомопатогенных нематод. Патент №2444195. Бюл. №7, 2012.10. Danilov L.G. Method for the production of biological preparations based on entomopathogenic nematodes. Patent No. 2444195. Bul. No. 7, 2012.

11. Веремчук Г.В., Данилов Л.Г. Методические указания по определению инвазионной активности нематодных культур рода Neoaplectana (Steinernematidae). Л., 1978, 7 с.11. Veremchuk G.V., Danilov L.G. Guidelines for determining the invasive activity of nematode cultures of the genus Neoaplectana (Steinernematidae). L., 1978, 7 p.

Claims

A method for obtaining a mass culture of symbiotic bacteria Xenorhabdus entomopathogenic nematodes Steinernematidae, including the preparation of a pure culture of symbiotic bacteria, characterized in that the components of an artificial nutrient medium used for the reproduction of nematode-bacterial complexes,% of the volume, are taken as the basis of the nutrient broth for the cultivation of bacteria:

egg powder 6.4 unrefined sunflower oil 4.9 soy flour 11.6 Brewer's yeast 0.7 salt 0.3 water 62.7 foam crumb 13.4;

which is additionally diluted with tap water in a ratio of 12% artificial culture medium and 88% tap water.