RU2746815C1 - Method for detecting antibodies - class g immunoglobulins in blood serum to pathogens of severe acute respiratory viral infections, including sars-cov-2, with simultaneous prognosis of covid-19 severity, based on hydrogel biochip - Google Patents

Method for detecting antibodies - class g immunoglobulins in blood serum to pathogens of severe acute respiratory viral infections, including sars-cov-2, with simultaneous prognosis of covid-19 severity, based on hydrogel biochip Download PDF

Info

Publication number
RU2746815C1
RU2746815C1 RU2020142796A RU2020142796A RU2746815C1 RU 2746815 C1 RU2746815 C1 RU 2746815C1 RU 2020142796 A RU2020142796 A RU 2020142796A RU 2020142796 A RU2020142796 A RU 2020142796A RU 2746815 C1 RU2746815 C1 RU 2746815C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
elements
coronavirus
cov
biochip
proteins
Prior art date
Application number
RU2020142796A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Владимир Треворович Валуев-Эллистон
Дмитрий Александрович Грядунов
Александр Владимирович Иванов
Арво Тоомасович Лейнсоо
Елена Николаевна Савватеева
Марина Александровна Филиппова
Original Assignee
Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) filed Critical Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран)
Priority to RU2020142796A priority Critical patent/RU2746815C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2746815C1 publication Critical patent/RU2746815C1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/549—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic with antigen or antibody entrapped within the carrier

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

FIELD: virology/immunology.
SUBSTANCE: invention relates to the field of virology and immunology. A method is proposed for multiplex detection of class G antibodies against antigens of the SARS-CoV-2 coronavirus and other viruses of the beta-coronavirus family, influenza A and B viruses, parainfluenza viruses of types II and III, while simultaneously detecting prognostic class G autoantibodies against type I interferons associated with severe course of coronavirus infection COVID-19. The method includes providing a biochip with immobilized viral proteins and markers of the severity of coronavirus infection, interaction of a blood serum sample with a biochip with the formation of specific binary immune complexes of proteins with antibodies in the blood serum sample, detection of formed immune complexes, registration and interpretation of analysis results on a biochip.
EFFECT: invention provides for the simultaneous differentiation of coronavirus infection from influenza and other acute respiratory viral infections and the identification of carriers of autoantibodies to markers of the severity of coronavirus infection among patients infected with COVID-19.
7 cl, 1 tbl, 5 dwg, 3 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention relates

Изобретение относится к области молекулярной биологии, иммунологии и медицины, в частности к средствам диагностики острых респираторных вирусных инфекций. Способ предназначен для мультиплексного обнаружения антител класса G против антигенов коронавируса SARS-CoV-2, других вирусов семейства бета-коронавирусов, вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа II и III типов, с одновременным выявлением прогностических аутоантител класса G против интерферонов I типа, ассоциированных с тяжелым течением коронавирусной инфекции COVID-19.The invention relates to the field of molecular biology, immunology and medicine, in particular to diagnostic tools for acute respiratory viral infections. The method is intended for multiplex detection of class G antibodies against antigens of the SARS-CoV-2 coronavirus, other viruses of the beta-coronavirus family, influenza A and B viruses, parainfluenza viruses of types II and III, with the simultaneous detection of prognostic class G autoantibodies against type I interferons associated with a severe course of coronavirus infection COVID-19.

Уровень техникиState of the art

В настоящее время методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, являются стандартом для диагностики инфекции, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2 в острой фазе заболевания, при которой вирусные частицы присутствуют в клиническом материале больных. Несмотря на быстроту, высокую чувствительность и точность, метод имеет ряд недостатков. Помимо того, что метод является дорогостоящим и трудоемким, ложноотрицательные результаты могут возникать в силу неправильного забора биологического материала и подготовки образцов нуклеиновых кислот, а также из-за относительно узкого "окна" выработки вирионов, поскольку вирусная РНК становится практически не детектируема через 14 дней после начала заболевания. Кроме того, биологическая изменчивость вируса может также повлиять на результат анализа.Currently, methods based on amplification of nucleic acids are the standard for the diagnosis of infection caused by the SARS-CoV-2 coronavirus in the acute phase of the disease, in which viral particles are present in the clinical material of patients. Despite its speed, high sensitivity, and accuracy, the method has a number of disadvantages. In addition to the fact that the method is expensive and time-consuming, false negative results can occur due to improper collection of biological material and preparation of nucleic acid samples, as well as due to a relatively narrow "window" for virion production, since viral RNA becomes practically undetectable 14 days after onset of the disease. In addition, the biological variability of the virus can also affect the test result.

Альтернативным подходом к диагностике коронавирусной инфекции являются серологические методы, основанные на выявлении у пациентов антител к белкам (ангигенам) вируса, наиболее распространенным из которых является метод иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). Такой подход позволяет сократить число неподтвержденных случаев заболевания и выявить пациентов, перенесших заболевание в легкой форме или бессимптомно. Геном вируса SARS-CoV-2 кодирует несколько структурных белков, включая шип (S - spike), белок оболочки (Е - envelope), мембраный белок (М - membrane) и нуклеокапсид (N - nucleocapsid). Белок S состоит из двух отдельных субъединиц, S1 и S2. Субъединица S1 содержит рецептор-связывающий домен (RBD), который связывает рецептор ангиотензин-превращающего фермента 2 (АСЕ2) на поверхности клеток-хозяина. При проведении иммуноанализа в сыворотке крови пациентов выявляют специфические антитела, вырабатываемые иммунной системой к белкам вируса в ответ на проникновение SARS-CoV-2. По данным исследований, специфические иммуноглобулины класса М (IgM) антитела к SARS-CoV-2 появляются в крови пациентов через 3 дня после начала заболевания, достигают своего пика к 2-3 неделям и все еще детектируются после первого месяца заболевания. Как IgA, так и IgG антитела к SARS-CoV-2 появляются на 10 день от начала заболевания, поднимаются до высшего уровня в сыворотке на 14 день заболевания. На настоящий момент мало что известно об антительном ответе против SARS-CoV-2. Данные, полученные различными группами о сероконверсии IgM и IgG в случае с SARS-CoV-2, противоречивы. Возможным объяснением может быть неодинаковая чувствительность тестов (в том числе, невалидированных) к различным классам антител. Неизвестно также, как долго сохраняется приобретенный иммунитет к SARS-CoV-2, и насколько эффективно он защищает от повторного инфицирования. [Lee, С.Y.P., Lin, R.Т.P., Renia, L., & Ng, L.F.P. (2020). Serological Approaches for COVID-19: Epidemiologic Perspective on Surveillance and Control. Frontiers in Immunology, 11, 1-7. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.008791.An alternative approach to the diagnosis of coronavirus infection is serological methods based on the detection of antibodies to virus proteins (angigens) in patients, the most common of which is the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This approach reduces the number of unconfirmed cases of the disease and identifies patients with mild or asymptomatic illness. The genome of the SARS-CoV-2 virus encodes several structural proteins, including the spike (S-spike), envelope protein (E-envelope), membrane protein (M-membrane), and nucleocapsid (N-nucleocapsid). Protein S is composed of two separate subunits, S1 and S2. The S1 subunit contains a receptor binding domain (RBD) that binds to the angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) receptor on the surface of host cells. When carrying out an immunoassay in the blood serum of patients, specific antibodies are produced by the immune system to the proteins of the virus in response to the penetration of SARS-CoV-2. According to studies, specific immunoglobulins of class M (IgM) antibodies to SARS-CoV-2 appear in the blood of patients 3 days after the onset of the disease, reach their peak by 2-3 weeks and are still detected after the first month of the disease. Both IgA and IgG antibodies to SARS-CoV-2 appear on day 10 from the onset of the disease, rise to a higher level in serum on day 14 of illness. To date, little is known about the antibody response against SARS-CoV-2. The data obtained by various groups on IgM and IgG seroconversion in the case of SARS-CoV-2 are conflicting. A possible explanation may be the unequal sensitivity of tests (including unvalidated ones) to different classes of antibodies. It is also unknown how long acquired immunity to SARS-CoV-2 lasts, or how effectively it protects against reinfection. [Lee, C.Y.P., Lin, R.T.P., Renia, L., & Ng, L.F.P. (2020). Serological Approaches for COVID-19: Epidemiologic Perspective on Surveillance and Control. Frontiers in Immunology, 11, 1-7. https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.008791.

Известны способы определения антител разных классов к белкам SARS-CoV-2 (например: CN 111239392 A «Novel coronavirus pneumonia (COVID-19) serological diagnosis kit»; CN 111856027 A «New coronavirus antibody detection kit suitable for examination of patients without obvious symptoms», CN 111505310 A «Application of specific IgA and IgM in early evaluation of COVID-19 disease risk»; RU 2730897 C1 «Method of using recombinant proteins sars-cov-2 as part of a test system for elisa test with determining igm, igg, iga class antibody levels in blood serum/plasma of covid-19 patients»). В области мультиплексного анализа описаны способы одновременного определения как антител IgM и IgG против SARS-CoV-2, так и антигена нового коронавируса (например: CN 111024954 A «Colloidal gold immunochromatography device for combined detection of COVID-19 antigen and antibody and use method thereof», CN 111426847 «A Microfluidic chip, detection kit, microfiuidic detection system and application thereof»). Разработан способ комбинированного измерения в лунках иммунологического планшета уровня IgG антител против 5 антигенов SARS-CoV-2 вируса, а именно против доменов RBD и NTD (N-терминального домена) S-субъединицы, а также против белков N, S1 и S2 [Gillot, Constant et al. 2020. "An Original ELISA-Based Multiplex Method for the Simultaneous Detection of 5 SARS-CoV-2 IgG Antibodies Directed against Different Antigens." Journal of Clinical Medicine 9(11):3752]. Hartog и соавторы разработали мультиплексный количественный анализ на основе микросфер для измерения концентраций антител к SI, RBD и N белкам SARS-CoV-2 [Den Hartog at al 2020. "SARS-CoV-2-Specific Antibody Detection for Seroepidemiology: A Multiplex Analysis Approach Accounting for Accurate Seroprevalence." Journal of Infectious Diseases 222(9):1452-61]. Известен биосенсор на основе плазмонного резонанса для определения антител классов G, М и А к S1, S2 и N белкам SARS-CoV-2 вируса [Cady, Nathaniel С. at al 2021. "Multiplexed Detection and Quantification of Human Antibody Response to COVID-19 Infection Using a Plasmon Enhanced Biosensor Platform." Biosensors and Bioelectronics 171(9):112679]. Также предложен мультиплексный способ выявления IgG к шести циркулирующим в настоящее время коронавирусам, а именно HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-229E, HCoV-NL63, MERS-CoV S1; SARS-CoV-2 S1 и N [van Tol, Sophieet all. 2020. "Accurate Serology for SARS-CoV-2 and Common Human Coronaviruses Using a Multiplex Approach." Emerging Microbes and Infections 9(1):1965-73.] Однако ни один из данных способов не позволяет одновременно выявить IgG против белков не только вируса SARS-CoV-2, но и антигенов других коронавирусов, вирусов гриппа, а также антигенов вирусов, вызывающих ОРВИ.Known methods for the determination of antibodies of different classes to SARS-CoV-2 proteins (for example: CN 111239392 A "Novel coronavirus pneumonia (COVID-19) serological diagnosis kit"; CN 111856027 A "New coronavirus antibody detection kit suitable for examination of patients without obvious symptoms ", CN 111505310 A" Application of specific IgA and IgM in early evaluation of COVID-19 disease risk "; RU 2730897 C1" Method of using recombinant proteins sars-cov-2 as part of a test system for elisa test with determining igm, igg, iga class plasma antibody levels in blood serum / patients "). In the field of multiplex analysis, methods are described for the simultaneous determination of both IgM and IgG antibodies against SARS-CoV-2 and the antigen of the new coronavirus (for example: CN 111024954 A “Colloidal gold immunochromatography device for combined detection of COVID-19 antigen and antibody and use method thereof ", CN 111426847" A Microfluidic chip, detection kit, microfiuidic detection system and application thereof "). A method has been developed for the combined measurement in the wells of an immunological plate of the level of IgG antibodies against 5 antigens of SARS-CoV-2 virus, namely against the RBD and NTD domains (N-terminal domain) of the S-subunit, as well as against the N, S1 and S2 proteins [Gillot, Constant et al. 2020. "An Original ELISA-Based Multiplex Method for the Simultaneous Detection of 5 SARS-CoV-2 IgG Antibodies Directed against Different Antigens." Journal of Clinical Medicine 9 (11): 3752]. Hartog et al. Developed a microsphere-based multiplex quantitative assay for measuring antibodies to the SI, RBD and N proteins of SARS-CoV-2 [Den Hartog at al 2020. "SARS-CoV-2-Specific Antibody Detection for Seroepidemiology: A Multiplex Analysis Approach Accounting for Accurate Seroprevalence. " Journal of Infectious Diseases 222 (9): 1452-61]. Known biosensor based on plasmon resonance for the determination of antibodies of classes G, M and A to S1, S2 and N proteins of SARS-CoV-2 virus [Cady, Nathaniel C. at al 2021. "Multiplexed Detection and Quantification of Human Antibody Response to COVID- 19 Infection Using a Plasmon Enhanced Biosensor Platform. " Biosensors and Bioelectronics 171 (9): 112679]. Also proposed is a multiplex method for detecting IgG to six currently circulating coronaviruses, namely HCoV-OC43, HCoV-HKU1, HCoV-229E, HCoV-NL63, MERS-CoV S1; SARS-CoV-2 S1 and N [van Tol, Sophieet all. 2020. "Accurate Serology for SARS-CoV-2 and Common Human Coronaviruses Using a Multiplex Approach." Emerging Microbes and Infections 9 (1): 1965-73.] However, none of these methods can simultaneously detect IgG against proteins not only of the SARS-CoV-2 virus, but also antigens of other coronaviruses, influenza viruses, as well as antigens of viruses, causing ARVI.

Важной задачей ИФА-диагностики является не только выявление иммуноглобулинов различных классов, но и скрининг в сыворотке крови маркеров, ассоциированных с прогнозом протекания коронавирусной инфекции. Высокий процент скрытого носительства аутоантител к интерферонам I типа был недавно выявлен в когорте пациентов с тяжелым течением коронавирусной инфекции COVID-19 [Bastard, Paul et all. 2020. "Autoantibodies against Type I IFNs in Patients with Life-Threatening COVID-19." (2020) Science (New York, N.Y.) 370(6515). DOI: 10.1126/science.abd4585]. Авторы обнаружили аутоантитела по крайней мере к одному из интерферонов (интерферону-ω, интерферону-α-2) у 13,7% пациентов с тяжелой (жизне-угрожающей) пневмонией, вызванной COVID-инфекцией (n=987), при этом у 10,2% эти антитела были нейтрализующими. Присутствие аутоантител коррелировало с низкой концентрацией IFN-α в сыворотке. Данные аутоантитела не были идентифицированы у пациентов с асиптоматическим или легким течением коронавирусной инфекции COVID-19 (n=987) и были обнаружены только у 0,33% (4/1227) здоровых пациентов, не инфицированных SARS-CoV-2. Аутоантитела против INF-ω и IFN-α-2 предшествовали инфицированию SARS-CoV-2 и были причиной тяжелого течения заболевания у данных пациентов. В связи с этим, предложенный в настоящем изобретении способ может быть использован для оценки уровня аутоантител к интерферонам первого типа среди инфицированных SARS-CoV-2 пациентов.An important task of ELISA diagnostics is not only the detection of immunoglobulins of various classes, but also the screening of markers in the blood serum associated with the prognosis of the course of coronavirus infection. A high percentage of latent carriage of autoantibodies to type I interferons was recently identified in a cohort of patients with severe COVID-19 coronavirus infection [Bastard, Paul et all. 2020. "Autoantibodies against Type I IFNs in Patients with Life-Threatening COVID-19." (2020) Science (New York, N.Y.) 370 (6515). DOI: 10.1126 / science.abd4585]. The authors found autoantibodies to at least one of the interferons (interferon-ω, interferon-α-2) in 13.7% of patients with severe (life-threatening) pneumonia caused by COVID infection (n = 987), while in 10 , 2% of these antibodies were neutralizing. The presence of autoantibodies correlated with low serum IFN-α concentration. These autoantibodies were not identified in patients with an asymptomatic or mild course of coronavirus infection COVID-19 (n = 987) and were found in only 0.33% (4/1227) of healthy patients not infected with SARS-CoV-2. Autoantibodies against INF-ω and IFN-α-2 preceded infection with SARS-CoV-2 and were the cause of severe disease in these patients. In this regard, the proposed in the present invention method can be used to assess the level of autoantibodies to interferons of the first type among patients infected with SARS-CoV-2.

Настоящее изобретение направлено на преодоление недостатков известных из уровня техники способов дифференциальной серодиагностики респираторных вирусных инфекций, в том числе COVID-19, и позволяет в одном анализе выявлять антитела - иммуноглобулины класса G к антигенам различных вирусов - возбудителей тяжелых острых респираторных инфекций, включая SARS-CoV-2, а также прогностические аутоантитела класса G против интерферонов I типа, ассоциированные с тяжелым течением коронавирусной инфекции COVID-19.The present invention is aimed at overcoming the disadvantages known from the prior art methods for differential serodiagnosis of respiratory viral infections, including COVID-19, and allows in one assay to detect antibodies - immunoglobulins of class G to antigens of various viruses - causative agents of severe acute respiratory infections, including SARS-CoV -2, as well as predictive class G autoantibodies against type I interferons associated with severe COVID-19 coronavirus infection.

Раскрытие сущности изобретенияDisclosure of the essence of the invention

В настоящем изобретении предложен способ мультиплексного обнаружения антител - иммуноглобулинов класса G к различным вирусам - возбудителям тяжелых острых респираторных инфекций, включая коронавирус SARS-CoV-2 и вирусы гриппа, с одновременным обнаружением аутоантител к интерферонам I типа, ассоциированных с тяжелым течением коронавирусной инфекции COVID-19, на биочипе, представляющим собой матрицу трехмерных гидрогелевых элементов на подложке. Предложенный способ позволяет одновременно дифференцировать коронавирусную инфекцию от гриппа и других ОРВИ, а также выявлять среди инфицированных COVID-19 пациентов носителей аутоантител к интерферонам I типа - прогностических маркеров тяжелого течения коронавирусной инфекции. Аутоантитела класса G к интерферонам I типа также высокочувствительны (к интерферону-ω (IFN- ω) - 99,4%, к интерферону-α-2 (IFN-α-2) - 95,4%) и высокоспецифичны (к интерферону-ω - 100%; к интерферону-α-2 - 99,9%) для пациентов с редким моногенным заболеванием - аутоиммунный полигландулярньш синдром первого типа [Meloni A, Furcas М, Cetani F, et al. Autoantibodies against Type I Interferons as an Additional Diagnostic Criterion for Autoimmune Polyendocrine Syndrome Type I. 2008;93:4389-4397. doi:10.1210/jc. 2008-0935].The present invention provides a method for multiplex detection of antibodies - immunoglobulins of class G to various viruses - causative agents of severe acute respiratory infections, including SARS-CoV-2 coronavirus and influenza viruses, with the simultaneous detection of autoantibodies to type I interferons associated with a severe course of coronavirus infection COVID- 19, on a biochip, which is a matrix of three-dimensional hydrogel elements on a substrate. The proposed method makes it possible to simultaneously differentiate coronavirus infection from influenza and other acute respiratory viral infections, as well as to identify carriers of autoantibodies to type I interferons, which are prognostic markers of a severe course of coronavirus infection, among patients infected with COVID-19. Class G autoantibodies to type I interferons are also highly sensitive (to interferon-ω (IFN-ω) - 99.4%, to interferon-α-2 (IFN-α-2) - 95.4%) and highly specific (to interferon- ω - 100%; to interferon-α-2 - 99.9%) for patients with a rare monogenic disease - autoimmune polyglandular syndrome of the first type [Meloni A, Furcas M, Cetani F, et al. Autoantibodies against Type I Interferons as an Additional Diagnostic Criterion for Autoimmune Polyendocrine Syndrome Type I. 2008; 93: 4389-4397. doi: 10.1210 / jc. 2008-0935].

Заявленный способ основан на проведении мультиплексного иммуноанализа образца сыворотки крови на гидрогелевом биочипе. Гидрогелевый биочип, согласно настоящему изобретению, представляет собой подложку, на которой нанесена матрица трехмерных гидрогелевых элементов, в каждом из которых по всему объему равномерно распределены иммобилизованые белки. Технология гидрогелевых биочипов разработана в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) и основана на одновременном формировании гидрогелевых ячеек с иммобилизацией молекулярных зондов. Поскольку структура геля предотвращает контакт соединений с гидрофобной подложкой, и обеспечивает нативное водное окружение биологических молекул, иммобилизация белков в геле стабилизирует их нативную структуру и сохраняет биологическую активность, таким образом данный метод по своим характеристикам выгодно отличается от классических методов планарной иммобилизации [Rubina AY, Dementieva EI, Stomakhin AA, Darii EL, Pan'kov SV, Barsky VE, Ivanov SM, Konovalova EV, Mirzabekov AD. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. Biotechniques. 2003 May; 34(5):1008-14, 1016-20, 1022. https://doi.org/10.2144/03345rr01].The claimed method is based on a multiplex immunoassay of a blood serum sample on a hydrogel biochip. The hydrogel biochip, according to the present invention, is a substrate on which a matrix of three-dimensional hydrogel elements is applied, in each of which immobilized proteins are uniformly distributed throughout the entire volume. The technology of hydrogel biochips was developed at the Federal State Budgetary Institution of Science, Institute of Molecular Biology named after V.I. V.A. Engelhardt RAS (IMB RAS) and is based on the simultaneous formation of hydrogel cells with immobilization of molecular probes. Since the structure of the gel prevents the contact of compounds with a hydrophobic substrate, and provides a native aqueous environment for biological molecules, immobilization of proteins in the gel stabilizes their native structure and preserves biological activity, thus, this method compares favorably with classical methods of planar immobilization in its characteristics [Rubina AY, Dementieva EI, Stomakhin AA, Darii EL, Pan'kov SV, Barsky VE, Ivanov SM, Konovalova EV, Mirzabekov AD. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. Biotechniques. 2003 May; 34 (5): 1008-14, 1016-20, 1022. https://doi.org/10.2144/03345rr01].

Согласно настоящему изобретению для одновременного выявления антител и аутоантител проводят последовательно: инкубацию содержащего иммобилизованные белки гидрогелевого биочипа с образцом, инкубацию со смесью меченных вторичных антивидовых антител против иммуноглобулинов человека классов G, регистрацию и обработку флуоресцентных сигналов. Способ включает следующие стадии:According to the present invention, for the simultaneous detection of antibodies and autoantibodies, the following is carried out sequentially: incubation of a hydrogel biochip containing immobilized proteins with a sample, incubation with a mixture of labeled secondary anti-species antibodies against human immunoglobulins G, registration and processing of fluorescent signals. The method includes the following stages:

а) обеспечение биочипа, представляющего собой матрицу элементов, в которых иммобилизованы белки, в том числе рецептор-связывающий домен белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, белок Spike коронавируса HCoV ОС43, белок Spike коронавируса SARS-CoV, белок Spike коронавируса HCoV-HKU1, белок Spike коронавируса MERS-CoV, нуклеопротеин вируса гриппа А, нуклеопротеин вируса гриппа В, смесь вирусных белков инактивированного вируса парагриппа II типа, смесь вирусных белков инактивированного вируса парагриппа III типа, интерферон омега, интерферон альфа-2-a, при этом каждый из белков - в четырех отдельных элементах, контрольных элементов, содержащих человеческие иммуноглобулины классов G, антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека класса G, и контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков;a) providing a biochip, which is a matrix of elements in which proteins are immobilized, including the receptor-binding domain of the Spike protein of the SARS-CoV-2 coronavirus, the Spike protein of the HCoV OS43 coronavirus, the Spike protein of the SARS-CoV coronavirus, the Spike protein of the HCoV-HKU1 coronavirus , Spike protein of coronavirus MERS-CoV, nucleoprotein of influenza A virus, nucleoprotein of influenza B virus, mixture of viral proteins of inactivated parainfluenza virus type II, mixture of viral proteins of inactivated parainfluenza virus type III, interferon omega, interferon alpha-2-a, each of proteins - in four separate elements, control elements containing human immunoglobulins of classes G, anti-species antibodies against human immunoglobulins of class G, and control elements that do not contain immobilized proteins;

б) взаимодействие образца сыворотки крови человека с элементами биочипа с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов белков, иммобилизованных в элементах биочипа, с антителами, находящимися в образце сыворотки крови;b) interaction of a sample of human blood serum with elements of the biochip with the formation of specific binary immune complexes of proteins immobilized in the elements of the biochip with antibodies in the sample of blood serum;

в) детекцию образовавшихся иммунных комплексов;c) detection of the formed immune complexes;

г) регистрацию и интерпретацию результатов анализа.d) registration and interpretation of the analysis results.

В одном из воплощений способ характеризуется тем, что биочип представляет собой подложку с гидрогелевыми элементами, полученными способом химической или фотоиндуцируемой сополимеризации и содержащими иммобилизованные белки. Перечень белков, используемых для изготовления биочипа, приведен в Таблице 1.In one embodiment, the method is characterized in that the biochip is a support with hydrogel elements obtained by a chemical or photoinduced copolymerization method and containing immobilized proteins. The list of proteins used for the manufacture of a biochip is shown in Table 1.

В другом воплощении способ характеризуется тем, что стадию детекции иммунных комплексов в элементах биочипа проводят, добавляя флуоресцентно-меченные антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека класса G, с образованием тройного комплекса «иммобилизованный белок - антитело -антивидовое флуоресцентно-меченное антитело».In another embodiment, the method is characterized in that the step of detecting immune complexes in the biochip elements is carried out by adding fluorescently-labeled anti-species antibodies against human immunoglobulins of class G, with the formation of a ternary complex "immobilized protein - antibody-anti-species fluorescently-labeled antibody".

В следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии регистрации и интерпретации результатов определяют значения флуоресцентных сигналов элементов биочипа с использованием анализатора флуоресценции и программного обеспечения.In another embodiment, the method is characterized in that at the stage of registration and interpretation of the results, the values of the fluorescent signals of the elements of the biochip are determined using a fluorescence analyzer and software.

В следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии регистрации и интерпретации результатов, для каждой группы элементов, содержащих одинаковые белки, результирующее значение сигнала рассчитывают как медиану значений сигналов от четырех соответствующих элементов, а для группы контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков, результирующее значение сигнала рассчитывают как медиану значений от сигналов соответствующих элементов.In another embodiment, the method is characterized in that at the stage of registration and interpretation of the results, for each group of elements containing the same proteins, the resulting signal value is calculated as the median of the signal values from four corresponding elements, and for the group of control elements that do not contain immobilized proteins, the resulting value the signal is calculated as the median of the values from the signals of the corresponding elements.

В следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии регистрации и интерпретации результатов, наличие антитела против соответствующего вирусного антигена в сыворотке крови определяют в случае, если отношение результирующего сигнала группы элементов с соответствующим иммобилизованным белком к результирующему сигналу группы контрольных элементов превышает установленное пороговое значение.In another embodiment, the method is characterized in that at the stage of registration and interpretation of the results, the presence of an antibody against the corresponding viral antigen in the blood serum is determined if the ratio of the resulting signal of a group of elements with the corresponding immobilized protein to the resulting signal of a group of control elements exceeds a predetermined threshold value.

Наконец, в еще одном воплощении способ характеризуется тем, что на стадии регистрации и интерпретации результатов, в случае выявления антител к SARS-CoV-2, проводят анализ групп элементов, содержащих интерферон омега, интерферон альфа-2-а, и в случае, если отношение результирующего сигнала группы элементов с соответствующим иммобилизованным белком к результирующему сигналу группы контрольных элементов превышает пороговое значение, делают заключение о наличии прогностических аутоантител класса G против интерферонов I типа, ассоциированных с тяжелым течением коронавирусной инфекции COVID-19.Finally, in another embodiment, the method is characterized in that at the stage of registration and interpretation of the results, in the case of detecting antibodies to SARS-CoV-2, an analysis of groups of elements containing interferon omega, interferon alpha-2-a is carried out, and if the ratio of the resulting signal of a group of elements with the corresponding immobilized protein to the resulting signal of a group of control elements exceeds the threshold value, it is concluded that there are prognostic class G autoantibodies against type I interferons associated with a severe course of coronavirus infection COVID-19.

Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.Further, the invention will be disclosed in more detail with reference to the figures, which are given solely for the purpose of illustrating and explaining the essence of the claimed invention, but which are not intended to limit the scope of claims.

Краткое описание фигур и таблицBrief Description of Shapes and Tables

Фигура 1. Схема биочипа.Figure 1. Diagram of the biochip.

Схема размещения элементов биочипа для обнаружения антител к различным респираторным вирусам, включая коронавирус SARS-CoV-2 и вирусы гриппа, с одновременным обнаружением аутоантител к интерферонам I типа. Элементы биочипа представлены в виде кругов. Элементы собраны в функциональные и две контрольные группы. Биочип также включает четыре элемента, обозначенных 'М', содержащих флуоресцентный маркер для обработки сигналов элементов биочипа после проведения анализа. Контрольная группа из восьми элементов 'Empty', не содержащих иммобилизованных белков, предназначена для вычисления значения фонового сигнала. Получение флуоресцентных сигналов от элементов контрольной группы 'human IgG' и 'anti-human IgG', включающих иммуноглобулины человека соответствующего класса и антитела к ним, является необходимым условием для контроля соблюдения условий проведения анализа, исключения грубых мануальных ошибок, а также контроля сохранности способности детектирующих антител узнавать свою мишень, а иммобилизованных белков сохранять свою биологическую активность. Функциональные группы включают элементы с иммобилизованными белками (RBD домен белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, белок Spike коронавируса HCoV ОС43, белок Spike коронавируса SARS-CoV, белок Spike коронавируса HCoV-HKU1, белок Spike коронавируса MERS-CoV, нуклеопротеин вируса гриппа A (FluA), нуклеопротеин вируса гриппа В (FluB), смесь вирусных белков инактивированного вируса парагриппа II типа (PIV-2), смесь вирусных белков инактивированного вируса парагриппа III типа (PIV-3), интерферон омега (IFN-ω), интерферон альфа-2-a (IFN-α-2a), каждый из белков - в четырех отдельных элементах. Характеристика белков, иммобилизованных на биочипе, приведена в Таблице 1.Layout of biochip elements for detecting antibodies to various respiratory viruses, including SARS-CoV-2 coronavirus and influenza viruses, with simultaneous detection of autoantibodies to type I interferons. The elements of the biochip are presented in the form of circles. The elements are grouped into functional and two control groups. The biochip also includes four elements, designated 'M', containing a fluorescent marker for processing the signals of the biochip elements after analysis. A control group of eight 'Empty' elements containing no immobilized proteins is designed to calculate the background signal value. Obtaining fluorescent signals from the elements of the control group 'human IgG' and 'anti-human IgG', including human immunoglobulins of the corresponding class and antibodies to them, is a prerequisite for monitoring compliance with the conditions of the analysis, excluding gross manual errors, as well as monitoring the preservation of the ability of detecting antibodies recognize their target, and immobilized proteins retain their biological activity. Functional groups include elements with immobilized proteins (RBD domain of the Spike protein of the SARS-CoV-2 coronavirus, the Spike protein of the HCoV OS43 coronavirus, the Spike protein of the SARS-CoV coronavirus, the Spike protein of the HCoV-HKU1 coronavirus, the Spike protein of the MERS-CoV coronavirus, the nucleoprotein of the influenza virus (FluA), influenza B nucleoprotein (FluB), mixture of viral proteins of inactivated parainfluenza virus type II (PIV-2), mixture of viral proteins of inactivated parainfluenza virus type III (PIV-3), interferon omega (IFN-ω), interferon alpha -2-a (IFN-α-2a), each of the proteins is in four separate elements The characteristics of the proteins immobilized on the biochip are shown in Table 1.

Фигура 2. Флуоресцентные изображения биочипов после анализа образцов сывороток:Figure 2. Fluorescent images of biochips after analysis of serum samples:

A) пациента, переболевшего коронавирусной инфекцией COVID-19. Положительные сигналы элементов чипа соответствуют наличию иммуноглобулинов класса G против RBD белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, белка Spike коронавируса ОС43, белка Spike коронавируса HKU1, нуклеопротеинов вирусов гриппа А и гриппа В;A) a patient who has had a coronavirus infection COVID-19. Positive signals of the chip elements correspond to the presence of class G immunoglobulins against RBD of the Spike protein of the SARS-CoV-2 coronavirus, the Spike protein of the OS43 coronavirus, the Spike protein of the HKU1 coronavirus, the nucleoproteins of the influenza A and influenza B viruses;

Б) пациента без признаков ОРВИ. Положительные сигналы элементов чипа соответствуют наличию иммуноглобулинов класса G против нуклеопротеина вирусов гриппа А и В, вирусных белков инактивированного вируса парагриппа II типа, белка Spike коронавируса ОС43, белка Spike коронавируса HKU1;B) a patient without signs of ARVI. Positive signals of the chip elements correspond to the presence of class G immunoglobulins against the nucleoprotein of influenza A and B viruses, viral proteins of inactivated parainfluenza virus type II, Spike protein of OS43 coronavirus, Spike protein of HKU1 coronavirus;

B) пациента с подтвержденным диагнозом «коронавирусная инфекция COVID-19». Положительные сигналы элементов чипа соответствуют наличию иммуноглобулинов класса G против RBD белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, нуклеопротеинов вируса гриппа А и В, белка Spike коронавируса ОС43, белка Spike коронавируса HKU1, вирусных белков инактивированных вирусов парагриппа II и III типов;B) a patient with a confirmed diagnosis of COVID-19 coronavirus infection. Positive signals of the chip elements correspond to the presence of class G immunoglobulins against RBD protein Spike of SARS-CoV-2 coronavirus, nucleoproteins of influenza A and B viruses, Spike protein of OS43 coronavirus, Spike protein of HKU1 coronavirus, viral proteins of inactivated parainfluenza viruses of types II and III;

Г) пациента с аутоиммунным полигландулярным синдромом I типа без коронавирусной инфекции и ОРВИ. Положительные сигналы элементов чипа соответствуют наличию иммуноглобулинов класса G против ω-интерферона-и α2-интерферона, вирусных белков инактивированного вируса парагриппа II типа, и вирусных белков инактивированного вируса парагриппа III типа, белка Spike коронавируса ОС43, белка Spike коронавируса HKU1.D) a patient with type I autoimmune polyglandular syndrome without coronavirus infection and ARVI. Positive signals of the chip elements correspond to the presence of class G immunoglobulins against ω-interferon and α2-interferon, viral proteins of inactivated parainfluenza virus type II, and viral proteins of inactivated parainfluenza virus type III, Spike protein of OS43 coronavirus, Spike protein of HKU1 coronavirus.

Фигура 3. Сравнение результатов выявления антител класса IgG к SARS-CoV-2, полученных на биочипе, с результатами, полученными с помощью хемилюминесцентного анализатора Mindray CL-2000i. Столбцы, обозначенные «Mindray» (голубая заливка) соответствуют концентрации антител IgG к SARS-CoV-2 в Ед/мл, полученных с помощью хемилюминисценции. Столбцы, обозначенные «Биочип» (светлая заливка) соответствуют нормированным сигналам In/Iref от групп элементов с иммобилизованным на биочипе рецептор-связывающий доменом белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, умноженных на 5 с целью приведения данных, полученных двумя разными методами, к единой шкале.Figure 3. Comparison of the results of detecting IgG antibodies to SARS-CoV-2, obtained on a biochip, with the results obtained using a chemiluminescent analyzer Mindray CL-2000i. Bars marked "Mindray" (blue fill) correspond to the concentration of IgG antibodies to SARS-CoV-2 in U / ml obtained by chemiluminescence. The columns marked "Biochip" (light shading) correspond to the normalized signals I n / I ref from the groups of elements with the receptor-binding domain of the Spike protein of SARS-CoV-2 coronavirus immobilized on the biochip, multiplied by 5 in order to bring the data obtained by two different methods , to a single scale.

Фигура 4. Определение антител класса IgG к SARS-CoV-2 на гидрогелевом биочипе.Figure 4. Determination of antibodies of the IgG class to SARS-CoV-2 on a hydrogel biochip.

А) Значения ISARS-CoV-2/Iref по результатам анализа на биочипе образцов сыворотки крови, с выявленными референсным методом IgG к SARS-CoV-2;A) I SARS-CoV-2 / I ref values based on the results of analysis on a biochip of blood serum samples with IgG to SARS-CoV-2 identified by the reference method;

Б) с отсутствующими IgG к SARS-CoV-2 по результатам анализа референсным методом.B) with missing IgG to SARS-CoV-2 according to the results of the analysis by the reference method.

Фигура 5. Определение антител класса IgG к другим вирусам на гидрогелевом биочипе в образцах сыворотки крови.Figure 5. Determination of IgG antibodies to other viruses on a hydrogel biochip in blood serum samples.

A) Значения ISARS-CoV-2/Iref и IMERS-CoV/Iref по результатам анализа на биочипе образцов сыворотки крови;A) I SARS-CoV-2 / I ref and I MERS-CoV / I ref values based on the results of analysis of blood serum samples on a biochip;

Б) Значения IHCoV OC43/Iref и IHCoV-HKU1/Iref по результатам анализа на биочипе образцов сыворотки крови;B) I HCoV OC43 / I ref and I HCoV-HKU1 / I ref values based on the results of analysis of blood serum samples on a biochip;

B) Значения IFLUA/Iref и IFLUB/Iref по результатам анализа на биочипе образцов сыворотки крови;B) I FLUA / I ref and I FLUB / I ref values based on the results of analysis of blood serum samples on a biochip;

Г) Значения IPIV-2/Iref и IPIV-3/Iref антитела класса IgG против белков вируса парагриппа II и III типов.D) Values I PIV-2 / I ref and I PIV-3 / I ref of IgG antibodies against proteins of parainfluenza virus types II and III.

Таблица 1. Перечень и характеристики белков, иммобилизованных в гидрогелевых элементах биочипаTable 1. List and characteristics of proteins immobilized in the hydrogel elements of the biochip

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

Целью изобретения являлось создание способа выявления антител против белков вирусов - возбудителей острых респираторных вирусных инфекций, включая SARS-CoV-2, с одновременным выявлением аутоантител против интерферонов I типа в сыворотке крови на гидрогелевом биочипе. Схема биочипа представлена на Фигуре1. Биочип для осуществления заявляемого способа представляет собой матрицу трехмерных гидрогелевых элементов на подложке из стекла или пластика [Rubina, А.Y., Filippova, М.A., Feizkhanova, G.U., Shepeliakovskaya, А.О., Sidina, Е.I., Boziev, К.М, °… Grishin, Е.V. (2010). Simultaneous detection of seven staphylococcal enterotoxins: Development of hydrogel biochips for analytical and practical application. Analytical Chemistry, 82(21), 8881-8889. https://doi.org/10.1021/ac10166341. Технология основана на иммобилизации молекул в трехмерных ячейках в виде микрокапель, закрепленных на твердой подложке. Макропористая структура гидрогелевых элементов формируется за счет сополимеризации мономера - производного метакриловой кислоты, бифункционального кроссшивающего агента и иммобилизуемых белков, имеющих в своей структуре соответствующие функциональные группы аминокислот (N-концевые аминогруппы, е-аминогруппы лизинов, сульфгидрильные группы цистеинов и др.).The aim of the invention was to create a method for detecting antibodies against proteins of viruses - causative agents of acute respiratory viral infections, including SARS-CoV-2, with the simultaneous detection of autoantibodies against type I interferons in blood serum on a hydrogel biochip. The biochip diagram is shown in Figure 1. A biochip for implementing the proposed method is a matrix of three-dimensional hydrogel elements on a glass or plastic substrate [Rubina, A.Y., Filippova, M.A., Feizkhanova, GU, Shepeliakovskaya, A.O., Sidina, E.I., Boziev, K.M, ° ... Grishin, E.V. (2010). Simultaneous detection of seven staphylococcal enterotoxins: Development of hydrogel biochips for analytical and practical application. Analytical Chemistry, 82 (21), 8881-8889. https://doi.org/10.1021/ac10166341. The technology is based on the immobilization of molecules in three-dimensional cells in the form of microdroplets, fixed on a solid substrate. The macroporous structure of hydrogel elements is formed due to the copolymerization of a monomer - a derivative of methacrylic acid, a bifunctional cross-linking agent and immobilizable proteins having in their structure the corresponding functional groups of amino acids (N-terminal amino groups, e-amino groups of lysines, sulfhydryl groups of cysteines, etc.).

Для выявления антител против белков вирусов-возбудителей острых респираторных вирусных инфекций, включая SARS-CoV-2, и одновременного выявлением аутоантител против интерферонов I типа в сыворотке крови, проводят последовательно: инкубацию содержащего иммобилизованные белки гидрогелевого биочипа с анализируемой пробой, инкубацию с флуоресцентно-меченными вторичными антивидовыми антителами против иммуноглобулинов человека класса G, регистрацию и интерпретацию флуоресцентного изображения биочипа.To detect antibodies against proteins of viruses causative agents of acute respiratory viral infections, including SARS-CoV-2, and simultaneous detection of autoantibodies against type I interferons in blood serum, the following is carried out: incubation of a hydrogel biochip containing immobilized proteins with an analyzed sample, incubation with fluorescently labeled secondary anti-species antibodies against human immunoglobulins of class G, registration and interpretation of the fluorescent image of the biochip.

Анализируемая проба представляет собой сыворотку крови человека, предварительно разведенную в 100 раз буфером 100 мМ Трис-HCl с 0,1% Triton Х-100. После отмывки непрореагировавших компонентов реакции связавшиеся с иммобилизованными белками антитела детектируют антивидовыми флуоресцентно-меченными антителами против иммуноглобулинов класса G. Во время инкубации ячеек биочипа с антивидовыми флуоресцентно-меченными антителами происходит образование тройных комплексов «иммобилизованный белок - антитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело». После финальной отмывки проводят регистрацию флуоресцентных изображений биочипов, используя анализаторы флуоресценции или сканеры микрочипов со специальным программным обеспечением, позволяющим вычислить значения флуоресцентного сигнала каждого элемента биочипа. Интерпретацию результатов выполняют посредством сравнения интенсивностей сигналов элементов с иммобилизованными белками и интенсивностей сигналов элементов контрольной группы, не содержащих белков. Для каждой функциональной группы элементов п, содержащих одинаковые иммобилизованные белки, результирующее значение сигнала In рассчитывают как медиану значений от четырех соответствующих элементов. В группе из восьми элементов 'Empty', не содержащих иммобилизованных белков, результирующее значение сигнала Iref рассчитывают как медиану значений от 8 соответствующих сигналов элементов. Наличие антитела в сыворотке крови определяют в случае, если отношение результирующего сигнала 1п к результирующему сигналу Iref превышает пороговое значение. Экспериментально были установлены пороговые значения, характеризующие наличие антител в сыворотке крови по результатам анализа с использованием заявленного способа: In/ Iref≥5,0 для элементов, содержащих белок Spike коронавируса HCoV ОС43, белок Spike коронавируса HCoV-HKU1, смесь вирусных белков инактивированного вируса парагриппа II типа, смесь вирусных белков инактивированного вируса парагриппа III типа, IFN-ω и IFN-α-2a и In/Iref≥2,0 для элементов, содержащих RBD белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, белок Spike коронавируса SARS-CoV, белок Spike коронавируса MERS-CoV, нуклеопротеин вируса гриппа А, нуклеопротеин вируса гриппа В.The analyzed sample is human blood serum, previously diluted 100 times with 100 mM Tris-HCl buffer with 0.1% Triton X-100. After washing off the unreacted components of the reaction, the antibodies bound to the immobilized proteins are detected with anti-species fluorescently-labeled antibodies against class G immunoglobulins. During the incubation of the biochip cells with anti-species fluorescently-labeled antibodies, the formation of ternary complexes “immobilized antibody-anti-fluorescent antibody-fluorescently fluorescent antibody” is formed. After the final washing, the fluorescence images of biochips are recorded using fluorescence analyzers or microchip scanners with special software that allows calculating the values of the fluorescent signal of each biochip element. The interpretation of the results is performed by comparing the signal intensities of the elements with immobilized proteins and the signal intensities of the elements of the control group that do not contain proteins. For each functional group of elements n containing the same immobilized proteins, the resulting signal value I n is calculated as the median of values from four corresponding elements. In a group of eight 'Empty' elements that do not contain immobilized proteins, the resulting signal I ref value is calculated as the median of the values from the 8 corresponding element signals. The presence of antibodies in blood serum is determined if the ratio of the resulting signal 1n to the resulting signal I ref exceeds the threshold value. Threshold values were experimentally established that characterize the presence of antibodies in blood serum according to the results of analysis using the claimed method: I n / I ref ≥5.0 for elements containing the Spike protein of the HCoV OC43 coronavirus, the Spike protein of the HCoV-HKU1 coronavirus, a mixture of inactivated viral proteins parainfluenza virus type II, a mixture of viral proteins of inactivated parainfluenza virus type III, IFN-ω and IFN-α-2a and I n / I ref ≥2.0 for elements containing RBD of Spike protein of SARS-CoV-2 coronavirus, Spike protein of coronavirus SARS-CoV, MERS-CoV coronavirus Spike protein, influenza A virus nucleoprotein, influenza B virus nucleoprotein.

Заявленный способ мультиплексного обнаружения антител позволяет одновременно выявлять диагностические антитела класса G против вирусных белков SARS-CoV-2, других вирусов семейства бета-коронавирусов, вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа II и III типов, и выявлять аутоантитела класса G против интерферонов I типа, что позволяет идентифицировать группу пациентов с высоким риском тяжелого течения COVID-инфекции.The claimed method for multiplex detection of antibodies allows the simultaneous detection of diagnostic class G antibodies against SARS-CoV-2 viral proteins, other viruses of the beta-coronavirus family, influenza A and B viruses, parainfluenza viruses of types II and III, and detecting class G autoantibodies against type I interferons , which makes it possible to identify a group of patients at high risk for a severe course of COVID infection.

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретениеHereinafter the invention will be illustrated by examples, which are intended to provide a better understanding of the essence of the claimed invention, but should not be construed as limiting the invention.

Пример 1. Выявление антител в образцах сыворотки крови.Example 1. Detection of antibodies in blood serum samples.

Гидрогелевые биочипы изготавливали методом сополимеризационной иммобилизации по методике, описанной ранее [Rubina, A.Y., Filippova, М.А., Feizkhanova, G.U., Shepeliakovskaya, А.О., Sidina, Е.I., Boziev, К.М, … Grishin, Е.V. (2010). Simultaneous detection of seven staphylococcal enterotoxins: Development of hydrogel biochips for analytical and practical application. Analytical Chemistry, 82(21), 8881-8889. https://doi.org/10.1021/ас1016634]. Схема размещения элементов изготовленного биочипа для выявления антител приведена на Фигуре 1. Образцы сьюороток крови пациентов разводили 1:100 буфером 100 мМ Трис-HCl с 0,1% Triton Х-100 и наносили на ячейки биочипа (120 мкл). После инкубации в течение ночи при +37°С, промежуточной отмывки (PBS с 0,01% Tween 20, 20 мин), ополаскивания и высушивания, биочипы проявляли 50 мкл смеси флуоресцентно-меченных антивидовых антител в рабочей концентрации 5 мкг/мл (F(ab')2-Goat anti-Human IgG Fc gamma Secondary Antibody, 31163, (Invitrogen), меченных Cy5) в буфере PBS с 0,14% поливинилового спирта (50 кДа) и 0,14% поливинилпирролидона (360 кДа). После инкубации (30 мин, +37°С) биочипы отмывали (PBS с 0,01% Tween 20, 30 мин), споласкивали, высушивали центрифугированием. Флуоресцентные изображения биочипов получали с помощью биочип-анализатора с лазерным возбуждением, разработанного в ИМБ РАН, Москва [Lysov, Y., Barsky, V., Urasov, D., Urasov, R., Cherepanov, A., Mamaev, D., … Zasedatelev, A. (2017). Microarray analyzer based on wide field fluorescent microscopy with laser illumination and a device for speckle suppression. Biomedical Optics Express, 8(11), 4798. https://doi.org/10.1364/boe.8.0047981. Вычисление флуоресцентных сигналов осуществляли с помощью программного обеспечения Image Assay (ИМБ РАН, Москва).Hydrogel biochips were made by copolymerization immobilization according to the method described earlier [Rubina, AY, Filippova, MA, Feizkhanova, GU, Shepeliakovskaya, AO, Sidina, E.I., Boziev, K.M, ... Grishin, E.V. (2010). Simultaneous detection of seven staphylococcal enterotoxins: Development of hydrogel biochips for analytical and practical application. Analytical Chemistry, 82 (21), 8881-8889. https://doi.org/10.1021/ac1016634]. The layout of the elements of the manufactured biochip for the detection of antibodies is shown in Figure 1. Samples of the patient's blood sample were diluted 1: 100 with 100 mM Tris-HCl buffer with 0.1% Triton X-100 and applied to the cells of the biochip (120 μL). After incubation overnight at + 37 ° С, intermediate washing (PBS with 0.01% Tween 20, 20 min), rinsing and drying, the biochips developed 50 μl of a mixture of fluorescently labeled anti-species antibodies at a working concentration of 5 μg / ml (F (ab ') 2-Goat anti-Human IgG Fc gamma Secondary Antibody, 31163, (Invitrogen), labeled with Cy5) in PBS buffer with 0.14% polyvinyl alcohol (50 kDa) and 0.14% polyvinylpyrrolidone (360 kDa). After incubation (30 min, + 37 ° C), the biochips were washed (PBS with 0.01% Tween 20, 30 min), rinsed, and dried by centrifugation. Fluorescent images of biochips were obtained using a biochip analyzer with laser excitation, developed at the IMB RAS, Moscow [Lysov, Y., Barsky, V., Urasov, D., Urasov, R., Cherepanov, A., Mamaev, D., ... Zasedatelev, A. (2017). Microarray analyzer based on wide field fluorescent microscopy with laser illumination and a device for speckle suppression. Biomedical Optics Express, 8 (11), 4798. https://doi.org/10.1364/boe.8.0047981. The calculation of fluorescent signals was carried out using the Image Assay software (IMB RAS, Moscow).

Фигура 2 иллюстрирует флуоресцентные изображения биочипов после проведения анализа образцов сывороток крови.Figure 2 illustrates the fluorescence images of biochips after analysis of blood serum samples.

Для образца сыворотки крови пациента, переболевшего коронавирусной инфекцией COVID-19, на длине волны, соответствующей флуоресценции красителя Су5, на биочипе зарегистрированы положительные сигналы от групп элементов с иммобилизованными RBD белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, белками Spike коронавирусов ОС43, HKU1, белками нуклеопротеинов вирусов гриппа А и В (Фигура 2А). Медиана значений сигналов данных групп элементов превышала пороговое значение, т.е. выполнялись условия ISARS-CoV-2/Iref≥2,0; IHCoV OC43/Iref≥5,0; IHCoV-HKU1/Iref≥5,0; IFLUA/Iref≥2,0; IFLUB/Iref≥2,0. Таким образом, у данного пациента были выявлены иммуноглобулины класса G против RBD белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, белка Spike коронавируса ОС43, белка Spike коронавируса HKU1, нуклеопротеинов вирусов гриппа А и В.For a blood serum sample of a patient who has had a coronavirus infection COVID-19, at a wavelength corresponding to the fluorescence of the Cy5 dye, positive signals from groups of elements with immobilized RBD of the Spike protein of the SARS-CoV-2 coronavirus, Spike proteins of the OS43, HKU1 coronaviruses, proteins were recorded on the biochip nucleoproteins of influenza A and B viruses (Figure 2A). The median of signal values of these groups of elements exceeded the threshold value, i.e. the conditions I SARS-CoV-2 / I ref ≥2.0 are met; I HCoV OC43 / I ref ≥5.0; I HCoV-HKU1 / I ref ≥5.0; I FLUA / I ref ≥2.0; I FLUB / I ref ≥2.0. Thus, in this patient, class G immunoglobulins were detected against RBD protein Spike of SARS-CoV-2 coronavirus, Spike protein of OS43 coronavirus, Spike protein of HKU1 coronavirus, nucleoproteins of influenza A and B.

Для образца сыворотки крови пациента без признаков ОРВИ на биочипе зарегистрированы положительные сигналы от групп элементов с иммобилизованными белками нуклеопротеинов вирусов гриппа А и В, белком Spike коронавируса ОС43, белком Spike коронавируса HKU1, вирусных белков инактивированного вируса парагриппа II (Фигура 2Б). Медиана значений сигналов данных групп элементов превышала пороговое значение, т.е. выполнялись условия IFLUA/Iref≥2,0; IFLUB/Iref≥2,0; IPIV-2/Iref≥5,0; IHCoV OC43/Iref≥5,0; IHCoV-HKU1/Iref≥5,0. Таким образом, у данного пациента были выявлены иммуноглобулины класса G против нуклеопротеина вируса гриппа А, нуклеопротеина вируса гриппа В, вируса парагриппа II типа, белка Spike коронавируса ОС43, белка Spike коронавируса HKU1.For a patient's blood serum sample without signs of SARS, positive signals from groups of elements with immobilized proteins of nucleoproteins of influenza A and B viruses, Spike protein of coronavirus OS43, Spike protein of coronavirus HKU1, viral proteins of inactivated parainfluenza II virus were registered on the biochip (Figure 2B). The median of signal values of these groups of elements exceeded the threshold value, i.e. the conditions I FLUA / I ref ≥2.0 were met; I FLUB / I ref ≥2.0; I PIV-2 / I ref ≥5.0; I HCoV OC43 / I ref ≥5.0; I HCoV-HKU1 / I ref ≥5.0. Thus, in this patient, class G immunoglobulins were detected against the nucleoprotein of the influenza A virus, the nucleoprotein of the influenza B virus, the parainfluenza virus type II, the Spike protein of the OS43 coronavirus, the Spike protein of the HKU1 coronavirus.

Для образца сыворотки крови пациента с подтвержденным диагнозом «коронавирусная инфекция COVID-19» на биочипе зарегистрированы положительные сигналы от групп элементов с иммобилизованными RBD белка Spike SARS-CoV-2, нуклеопротеинами вируса гриппа А и В, белком Spike коронавируса ОС43, белком Spike коронавируса HKU1, вирусными белками инактивированных вирусов парагриппа II и III типов (Фигура 2В). Медиана значений сигналов данных групп элементов превышала пороговое значение, т.е. выполнялось условие ISARS-CoV-2/Iref≥2,0; IFLUA/Iref≥2,0; IFLUB/Iref≥2,0; IHCoV OC43/Iref≥5,0, IHCoV-HKU1/Iref≥5,0;. IPIV-2/Iref≥5,0; IPIV-3/Iref≥5,0. Таким образом, у данного пациента были выявлены иммуноглобулины класса G против RBD белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, нуклеопротеинов вируса гриппа А и В, белка Spike коронавирусов ОС43 и HKU1, вирусов парагриппа II и III типов.For a blood serum sample of a patient with a confirmed diagnosis of coronavirus infection COVID-19, positive signals from groups of elements with immobilized RBD protein Spike SARS-CoV-2, influenza A and B nucleoproteins, Spike protein OS43 coronavirus, Spike protein HKU1 coronavirus were registered on the biochip , viral proteins of inactivated parainfluenza viruses type II and III (Figure 2B). The median of signal values of these groups of elements exceeded the threshold value, i.e. condition I SARS-CoV-2 / I ref ≥2.0 was met; I FLUA / I ref ≥2.0; I FLUB / I ref ≥2.0; I HCoV OC43 / I ref ≥5.0, I HCoV-HKU1 / I ref ≥5.0 ;. I PIV-2 / I ref ≥5.0; I PIV-3 / I ref ≥5.0. Thus, in this patient, class G immunoglobulins against RBD of the Spike protein of the SARS-CoV-2 coronavirus, the nucleoproteins of the influenza A and B virus, the Spike protein of the OS43 and HKU1 coronaviruses, and parainfluenza viruses of types II and III were identified.

Для образца сыворотки крови пациента с аутоиммунным полигландулярным синдромом первого типа на биочипе зарегистрированы положительные сигналы от групп элементов с иммобилизованными белками интерферон-ω, интерферон-α-2а, смесями белков инактивированных вирусов парагриппа II и III типов, белками Spike коронавируса ОС43 и коронавируса HKU1 (Фигура 2Г). Медиана значений сигналов данных групп элементов превышала пороговое значение, т.е. выполнялось условие In/Iref≥5,0 для интерферона-ω, интерферона-α-2а, белка Spike коронавируса HCoV ОС43, белка Spike коронавируса HCoV-HKU1 и вирусных белков инактивированных вирусов парагриппа II и III типов. Таким образом, у данного пациента были выявлены иммуноглобулины класса G - аутоантитела против интерферона-ω, интерферона-α-2а, а также антитела к вирусам парагриппа II и III типов, белкам Spike коронавирусов ОС43 и HKU1 .For a blood serum sample of a patient with autoimmune polyglandular syndrome of the first type, positive signals from groups of elements with immobilized proteins interferon-ω, interferon-α-2a, protein mixtures of inactivated parainfluenza viruses of types II and III, Spike proteins of the OS43 coronavirus and HKU1 coronavirus ( Figure 2D). The median of signal values of these groups of elements exceeded the threshold value, i.e. the condition I n / I ref ≥5.0 was satisfied for interferon-ω, interferon-α-2a, Spike protein of HCoV OS43 coronavirus, Spike protein of HCoV-HKU1 coronavirus and viral proteins of inactivated parainfluenza viruses of types II and III. Thus, this patient was diagnosed with class G immunoglobulins - autoantibodies against interferon-ω, interferon-α-2a, as well as antibodies to parainfluenza viruses of types II and III, Spike proteins of OS43 and HKU1 coronaviruses.

Для всех образцов, флуоресцентные изображения которых представлены на Фигуре 2, зарегистрированы сигналы контрольных элементов биочипа, содержащих anti-human IgG, и human IgG. При проведении анализа на стадии взаимодействия образца сыворотки крови с элементами биочипа, иммобилизованные в контрольных элементах иммобилизованные антивидовые иммуноглобулины против иммуноглобулинов человека классов взаимодействуют с аутоантителами класса G, формируя бинарные комплексы «иммобилизованные антивидовые антитела - антитела соответствующего класса из сыворотки крови». На стадии детекции образовавшихся иммунных комплексов в ячейках биочипа, содержащих anti-human IgG образуются тройные комплексы «иммобилизованные антивидовые антитела - антитела класса G из сыворотки крови-детектирующие антивидовые антитела», одновременно, в ячейках биочипа, содержащих human Ig класса G, образуются двойные комплексы «иммобилизованные антитела класса G человека - детектирующие антивидовые антитела».For all samples, the fluorescence images of which are presented in Figure 2, the signals of the control elements of the biochip containing anti-human IgG and human IgG were recorded. When analyzing at the stage of interaction of a blood serum sample with biochip elements, immobilized anti-species immunoglobulins against human immunoglobulins of classes immobilized in control elements interact with autoantibodies of class G, forming binary complexes "immobilized anti-species antibodies - antibodies of the corresponding class from blood serum." At the stage of detection of the formed immune complexes in the cells of the biochip containing anti-human IgG, triple complexes are formed "immobilized anti-species antibodies - antibodies of class G from the blood serum-detecting anti-species antibodies", at the same time, double complexes are formed in the cells of the biochip containing human Ig of class G "Immobilized antibodies of class G human - detecting anti-species antibodies".

Пример 2. Обнаружение антител класса IgG к SARS-CoV-2 с помощью заявляемого способа и референсного метода на основе хемилюминесценции.Example 2. Detection of IgG antibodies to SARS-CoV-2 using the proposed method and the reference method based on chemiluminescence.

Заявляемым способом по методике, описанной в Примере 1, были проанализированы образцы сывороток крови от 20 пациентов. Все они были охарактеризованы референсным методом с использованием иммунологического хемилюминесцентного анализатора Mindray CL-2000i как положительные по IgG к SARS-CoV-2 (n=10), так и отрицательные по IgG к SARS-CoV-2 (n=10). Все образцы были отрицательны по IgM к SARS-CoV-2. Сравнение результатов, полученных с использованием референсного и заявленного способа, приведено на Фигуре 3. Была продемонстрирована высокая сходимость двух методов, в анализируемой выборке пациентов не было зафиксировано ложно-положительных или ложно-отрицательных результатов. На Фигуре 4 показаны значения сигналов In/Iref от групп элементов с иммобилизованным RBD коронавируса SARS-CoV-2 на длине волны, соответствующей флуоресценции красителя Су5. Для образцов сыворотки крови с выявленными референсным методом IgG к SARS-CoV-2 на биочипе соблюдалось условие ISARS-CoV-2/Iref≥2,0 (Фигура 4А). Таким образом, с использованием заявленного способа для всех положительных образцов были выявлены антитела класса G против домена RBD белка S коронавируса SARS-CoV-2. Для образцов, в которых референсным методом IgG к SARS-CoV-2 выявлены не были, соблюдалось условие ISARS-CoV-2/Iref<2,0 (Фигура 4Б). Таким образом, с использованием заявленного способа для всех отрицательных образцов не было выявлено антител класса G против домена RBD белка S коронавируса SARS-CoV-2.By the inventive method according to the method described in Example 1, blood serum samples from 20 patients were analyzed. All of them were characterized by the reference method using the immunological chemiluminescence analyzer Mindray CL-2000i, both positive for IgG to SARS-CoV-2 (n = 10) and negative for IgG to SARS-CoV-2 (n = 10). All samples were negative for SARS-CoV-2 IgM. Comparison of the results obtained using the reference and the claimed method is shown in Figure 3. High convergence of the two methods was demonstrated; in the analyzed sample of patients, no false-positive or false-negative results were recorded. Figure 4 shows the values of signals I n / I ref from groups of elements with immobilized RBD coronavirus SARS-CoV-2 at a wavelength corresponding to the fluorescence of the Cy5 dye. For blood serum samples with identified by the reference method IgG to SARS-CoV-2 on the biochip, condition I SARS-CoV-2 / I ref ≥2.0 was met (Figure 4A). Thus, using the claimed method for all positive samples, class G antibodies against the RBD domain of protein S of SARS-CoV-2 coronavirus were detected. For samples in which IgG to SARS-CoV-2 were not detected by the reference method, condition I SARS-CoV-2 / I ref <2.0 was met (Figure 4B). Thus, using the claimed method for all negative samples, no class G antibodies were detected against the RBD domain of the protein S of SARS-CoV-2 coronavirus.

Пример 3. Обнаружение антител класса IgG к другим вирусам с помощью заявленного способа.Example 3. Detection of IgG antibodies to other viruses using the claimed method.

Для каждого образца сыворотки крови пациентов, описанных в Примере 2, с помощью разработанного способа были получены данные о наличие антител класса IgG к вирусным белкам, иммобилизованным на биочипе. Результаты анализа образцов на биочипе продемонстрированы на Фигуре 5. В анализируемых образцах не были обнаружены антитела класса IgG против белков Spike коронавирусов SARS-CoV и MERS-CoV (Фигура 5А). Для данной выборки была показана высокая встречаемость (17/20) антител класса IgG против белков Spike коронавирусов HCoV ОС43 и HCoV-HKU1 (Фигура 5Б), при этом сигналы, превышающие пороговые значения были зафиксированы для большинства пациентов одновременно как для иммобилизованного белка Spike коронавируса HCoV ОС43, так и для иммобилизованного белка Spike коронавируса HCoV-HKU1. Антитела класса IgG против нуклеопротеина N вируса гриппа А были выявлены у 9 из 20 пациентов, против нуклеопротеина N вируса гриппа В - у 15 из 20 пациентов (Фигура 5В). Антитела класса IgG против белков вирусов парагриппа были выявлены у 15 из 20 пациентов для иммобилизованной смеси вирусных белков инактивированного вируса парагриппа II типа, и у 11 из 20 пациентов для иммобилизованной смеси вирусных белков инактивированного вируса парагриппа III типа (Фигура 5Г).For each serum sample of the patients described in Example 2, using the developed method, data on the presence of IgG antibodies to viral proteins immobilized on the biochip were obtained. The results of the analysis of the samples on the biochip are shown in Figure 5. In the analyzed samples, IgG antibodies against the Spike proteins of the SARS-CoV and MERS-CoV coronaviruses were not detected (Figure 5A). For this sample, a high incidence (17/20) of IgG antibodies against Spike proteins of HCoV OC43 and HCoV-HKU1 coronaviruses was shown (Figure 5B), while signals exceeding the threshold values were recorded for most patients simultaneously as for the immobilized Spike protein of HCoV coronavirus OC43 and for the immobilized Spike protein of the HCoV-HKU1 coronavirus. IgG antibodies against influenza A nucleoprotein N were detected in 9 out of 20 patients, and against influenza B nucleoprotein N in 15 out of 20 patients (Figure 5B). IgG antibodies against proteins of parainfluenza viruses were detected in 15 out of 20 patients for the immobilized mixture of viral proteins of inactivated parainfluenza virus type II, and in 11 out of 20 patients for the immobilized mixture of viral proteins of inactivated parainfluenza virus type III (Figure 5D).

Figure 00000001
Figure 00000001

Claims (11)

1. Способ выявления антител - иммуноглобулинов класса G в сыворотке крови к возбудителям тяжелых острых респираторных вирусных инфекций, включая SARS-CoV-2, с одновременным прогнозом тяжести протекания новой коронавирусной инфекции COVID-19, на гидрогелевом биочипе, включающий:1. A method for detecting antibodies - class G immunoglobulins in blood serum to pathogens of severe acute respiratory viral infections, including SARS-CoV-2, with a simultaneous prognosis of the severity of a new coronavirus infection COVID-19, on a hydrogel biochip, including: а) обеспечение биочипа, представляющего собой матрицу элементов, в которых иммобилизованы белки, в том числе рецептор-связывающий домен белка Spike коронавируса SARS-CoV-2, белок Spike коронавируса HCoV ОС43, белок Spike коронавируса SARS-CoV, белок Spike коронавируса HCoV-HKU1, белок Spike коронавируса MERS-CoV, нуклеопротеин вируса гриппа А, нуклеопротеин вируса гриппа В, смесь вирусных белков инактивированного вируса парагриппа II типа, смесь вирусных белков инактивированного вируса парагриппа III типа, интерферон омега, интерферон альфа-2-a, при этом каждый из белков - в четырех отдельных элементах, контрольных элементов, содержащих человеческие иммуноглобулины классов G, антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека класса G, и контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков;a) providing a biochip, which is a matrix of elements in which proteins are immobilized, including the receptor-binding domain of the Spike protein of the SARS-CoV-2 coronavirus, the Spike protein of the HCoV OC43 coronavirus, the Spike protein of the SARS-CoV coronavirus, the Spike protein of the HCoV-HKU1 coronavirus , Spike protein of coronavirus MERS-CoV, nucleoprotein of influenza A virus, nucleoprotein of influenza B virus, mixture of viral proteins of inactivated parainfluenza virus type II, mixture of viral proteins of inactivated parainfluenza virus type III, interferon omega, interferon alpha-2-a, each of proteins - in four separate elements, control elements containing human immunoglobulins of classes G, anti-species antibodies against human immunoglobulins of class G, and control elements that do not contain immobilized proteins; б) взаимодействие образца сыворотки крови человека с элементами биочипа с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов белков, иммобилизованных в элементах биочипа, с антителами, находящимися в образце сыворотки крови;b) interaction of a sample of human blood serum with elements of the biochip with the formation of specific binary immune complexes of proteins immobilized in the elements of the biochip with antibodies in the sample of blood serum; в) детекцию образовавшихся иммунных комплексов;c) detection of the formed immune complexes; г) регистрацию и интерпретацию результатов анализа.d) registration and interpretation of the analysis results. 2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что биочип представляет собой подложку с гидрогелевыми элементами, полученными способом химической или фотоиндуцируемой сополимеризации.2. The method according to claim 1, characterized in that the biochip is a substrate with hydrogel elements obtained by chemical or photoinduced copolymerization. 3. Способ по п. 1, в котором стадию детекции иммунных комплексов в элементах биочипа проводят, добавляя флуоресцентно-меченные антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека класса G с образованием тройного комплекса «иммобилизованный белок - антитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело».3. The method according to claim 1, in which the step of detecting immune complexes in the elements of the biochip is carried out by adding fluorescently-labeled anti-species antibodies against human immunoglobulins of class G with the formation of a ternary complex "immobilized protein - antibody - anti-species fluorescently-labeled antibody". 4. Способ по п. 1, в котором на стадии регистрации и интерпретации результатов определяют значения флуоресцентных сигналов элементов биочипа с использованием анализатора флуоресценции и программного обеспечения.4. The method according to claim 1, in which at the stage of registration and interpretation of the results, the values of the fluorescent signals of the elements of the biochip are determined using a fluorescence analyzer and software. 5. Способ по п. 1, в котором на стадии регистрации и интерпретации результатов для каждой группы элементов, содержащих одинаковые белки, результирующее значение сигнала рассчитывают как медиану значений сигналов от четырех соответствующих элементов, а для группы контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков, результирующее значение сигнала рассчитывают как медиану значений от сигналов соответствующих элементов.5. The method according to claim 1, in which at the stage of registration and interpretation of the results for each group of elements containing the same proteins, the resulting signal value is calculated as the median of the signal values from four corresponding elements, and for the group of control elements that do not contain immobilized proteins, the resultant the signal value is calculated as the median of the values from the signals of the corresponding elements. 6. Способ по п. 1, в котором на стадии регистрации и интерпретации результатов наличие антитела против соответствующего вирусного антигена в сыворотке крови определяют в случае, если отношение результирующего сигнала группы элементов с соответствующим иммобилизованным белком к результирующему сигналу группы контрольных элементов превышает пороговое значение.6. The method according to claim 1, in which at the stage of registration and interpretation of the results, the presence of antibodies against the corresponding viral antigen in the blood serum is determined if the ratio of the resulting signal of the group of elements with the corresponding immobilized protein to the resulting signal of the group of control elements exceeds the threshold value. 7. Способ по п. 1, в котором на стадии регистрации и интерпретации результатов, в случае выявления антител к SARS-CoV-2, проводят анализ групп элементов, содержащих интерферон омега, интерферон альфа-2-a, и в случае, если отношение результирующего сигнала группы элементов с соответствующим иммобилизованным белком к результирующему сигналу группы контрольных элементов превышает пороговое значение, делают заключение о наличии прогностических аутоантител класса G против интерферонов I типа, ассоциированных с тяжелым течением коронавирусной инфекции COVID-19.7. The method according to claim 1, in which at the stage of registration and interpretation of the results, in the case of detecting antibodies to SARS-CoV-2, an analysis of groups of elements containing interferon omega, interferon alpha-2-a is carried out, and if the ratio of the resulting signal of the group of elements with the corresponding immobilized protein to the resulting signal of the group of control elements exceeds the threshold value, it is concluded that there are prognostic class G autoantibodies against type I interferons associated with a severe course of coronavirus infection COVID-19.
RU2020142796A 2020-12-24 2020-12-24 Method for detecting antibodies - class g immunoglobulins in blood serum to pathogens of severe acute respiratory viral infections, including sars-cov-2, with simultaneous prognosis of covid-19 severity, based on hydrogel biochip RU2746815C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020142796A RU2746815C1 (en) 2020-12-24 2020-12-24 Method for detecting antibodies - class g immunoglobulins in blood serum to pathogens of severe acute respiratory viral infections, including sars-cov-2, with simultaneous prognosis of covid-19 severity, based on hydrogel biochip

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020142796A RU2746815C1 (en) 2020-12-24 2020-12-24 Method for detecting antibodies - class g immunoglobulins in blood serum to pathogens of severe acute respiratory viral infections, including sars-cov-2, with simultaneous prognosis of covid-19 severity, based on hydrogel biochip

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2746815C1 true RU2746815C1 (en) 2021-04-21

Family

ID=75584794

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020142796A RU2746815C1 (en) 2020-12-24 2020-12-24 Method for detecting antibodies - class g immunoglobulins in blood serum to pathogens of severe acute respiratory viral infections, including sars-cov-2, with simultaneous prognosis of covid-19 severity, based on hydrogel biochip

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2746815C1 (en)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2760438C1 (en) * 2021-06-09 2021-11-25 Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение "Иммунотэкс" METHOD FOR ENZYME IMMUNOASSAY DETERMINATION OF THE LEVEL OF ANTIGEN-RECOGNIZING B-LYMPHOCYTE RECEPTORS REPRESENTED BY MEMBRANE-SPECIFIC RBD PROTEIN SARS-COV-2, IgG ANTIBODIES
RU2764002C1 (en) * 2021-08-19 2022-01-12 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы» (ГБУЗ "НИИ СП ИМ. Н.В.СКЛИФОСОВСКОГО ДЗМ") Method for prediction of outcome of viral pneumonia in covid-19
RU2766302C1 (en) * 2021-08-10 2022-03-14 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук» (Томский НИМЦ) Method for predicting the risk of death within 6 months after suffering a new coronavirus infection covid-19
RU2766347C1 (en) * 2021-07-28 2022-03-15 Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) Method for prediction of outcome of acute disease caused by new coronavirus infection covid-19
RU2818351C1 (en) * 2023-07-04 2024-05-02 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") METHOD FOR DETERMINING COMPLEMENT-ACTIVATING FUNCTION OF SARS-CoV-2 ANTIBODIES FOR PREDICTING SEVERITY OF COVID-19

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150323534A1 (en) * 2006-02-21 2015-11-12 Nexus Dx, Inc. Methods and compositions for analyte detection
CN111089962A (en) * 2020-03-25 2020-05-01 中山生物工程有限公司 Colloidal gold kit for joint detection of novel coronavirus IgM/IgG antibody and preparation method thereof
RU2733379C1 (en) * 2019-12-23 2020-10-01 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа имени А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации Test system for diagnostics of agents of acute respiratory viral infections
CN111766383A (en) * 2020-07-09 2020-10-13 温州医科大学 Method for detecting pathogenic virus and related protein thereof and predicting novel unknown virus
CN111796093A (en) * 2020-07-18 2020-10-20 范春雷 Novel coronavirus, MERS and influenza A/B virus four-in-one rapid detection kit

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150323534A1 (en) * 2006-02-21 2015-11-12 Nexus Dx, Inc. Methods and compositions for analyte detection
RU2733379C1 (en) * 2019-12-23 2020-10-01 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа имени А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации Test system for diagnostics of agents of acute respiratory viral infections
CN111089962A (en) * 2020-03-25 2020-05-01 中山生物工程有限公司 Colloidal gold kit for joint detection of novel coronavirus IgM/IgG antibody and preparation method thereof
CN111766383A (en) * 2020-07-09 2020-10-13 温州医科大学 Method for detecting pathogenic virus and related protein thereof and predicting novel unknown virus
CN111796093A (en) * 2020-07-18 2020-10-20 范春雷 Novel coronavirus, MERS and influenza A/B virus four-in-one rapid detection kit

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BASTARD P. et al, Autoantibodies against type I IFNs in patients with life-threatening COVID-19 // Science 370, 23.10.2020, p.1-12. *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2760438C1 (en) * 2021-06-09 2021-11-25 Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное объединение "Иммунотэкс" METHOD FOR ENZYME IMMUNOASSAY DETERMINATION OF THE LEVEL OF ANTIGEN-RECOGNIZING B-LYMPHOCYTE RECEPTORS REPRESENTED BY MEMBRANE-SPECIFIC RBD PROTEIN SARS-COV-2, IgG ANTIBODIES
RU2766347C1 (en) * 2021-07-28 2022-03-15 Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) Method for prediction of outcome of acute disease caused by new coronavirus infection covid-19
RU2766302C1 (en) * 2021-08-10 2022-03-14 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук» (Томский НИМЦ) Method for predicting the risk of death within 6 months after suffering a new coronavirus infection covid-19
RU2764002C1 (en) * 2021-08-19 2022-01-12 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы» (ГБУЗ "НИИ СП ИМ. Н.В.СКЛИФОСОВСКОГО ДЗМ") Method for prediction of outcome of viral pneumonia in covid-19
RU2818351C1 (en) * 2023-07-04 2024-05-02 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") METHOD FOR DETERMINING COMPLEMENT-ACTIVATING FUNCTION OF SARS-CoV-2 ANTIBODIES FOR PREDICTING SEVERITY OF COVID-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2746815C1 (en) Method for detecting antibodies - class g immunoglobulins in blood serum to pathogens of severe acute respiratory viral infections, including sars-cov-2, with simultaneous prognosis of covid-19 severity, based on hydrogel biochip
US8969009B2 (en) Identification of discriminant proteins through antibody profiling, methods and apparatus for identifying an individual
Lopez et al. Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging
US20090253586A1 (en) Substrates for multiplexed assays and uses thereof
CN112034174A (en) Polypeptide chip and application thereof in virus detection
US20100256005A1 (en) Blood group antibody screening
RU2397178C1 (en) Diagnostic test system in immunochip format and differential serum diagnostics of syphilis
US9410965B2 (en) Identification of discriminant proteins through antibody profiling, methods and apparatus for identifying an individual
WO2022003180A1 (en) Kits and methods for the enrichment and detection of rna viruses of the coronaviridae family
RU181920U1 (en) IMMUNOCHIP FOR TREPONEM-SPECIFIC SEROLOGICAL DIAGNOSTICS OF SYPHILIS
Zattoni et al. Multiplexed flow cytometric approach for detection of anti‐SARS‐CoV‐2 IgG, IgM and IgA using beads covalently coupled to the nucleocapsid protein
ES2674672T3 (en) Interference peptides and microorganism detection procedure
Viitala et al. Surface-activated microtiter-plate microarray for simultaneous CRP quantification and viral antibody detection
WO2021202414A1 (en) Multianalyte test for immune response to sars-cov-2 virus leading to covid-19
Nelson-Mora et al. New detection method of SARS-CoV-2 antibodies toward a point-of-care biosensor
RU2759149C1 (en) Method for carrying out an enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies in a human biological sample specific to the sars-cov2 human coronavirus, a test system
RU2818115C1 (en) Method for determining avidity index of autoantibodies in human blood serum on hydrogel biochips
RU2781976C2 (en) Method for identifying autologous antibodies in blood serum, associated with type i autoimmune polyglandular syndrome, on a hydrogel biochip
CN112724195B (en) Polypeptide, polypeptide product containing polypeptide, kit and application
RU2741382C1 (en) Method for immunoenzymometric analysis of idiotypic and anti-idiotypic antibodies to benzo[a]pyrene in human biological fluids
RU2816512C1 (en) Method for detecting antibodies in blood serum associated with autoimmune endocrine and comorbid pathologies on hydrogel biochip
Jiang et al. Protein arrays based on biotin-streptavidin system for the simultaneous detection of TORCH infections
WO2021137387A1 (en) Immunoassay test strip using capacitive sensor
Constantin et al. Protein microarray technology for antibody detection associated to human pathology
Mishra et al. Biotechnological tools in disease diagnosis in animal