RU2745654C1 - Method of study of gastric and intestinal microbiota during suppression of colonization resistance of gastric mucosa of experimental animals - Google Patents

Method of study of gastric and intestinal microbiota during suppression of colonization resistance of gastric mucosa of experimental animals Download PDF

Info

Publication number
RU2745654C1
RU2745654C1 RU2019145621A RU2019145621A RU2745654C1 RU 2745654 C1 RU2745654 C1 RU 2745654C1 RU 2019145621 A RU2019145621 A RU 2019145621A RU 2019145621 A RU2019145621 A RU 2019145621A RU 2745654 C1 RU2745654 C1 RU 2745654C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
gastric
microbiota
feces
animals
bacteria
Prior art date
Application number
RU2019145621A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Иван Петрович Погорельский
Ирина Александровна Лундовских
Игорь Юрьевич Чичерин
Дарья Николаевна Смирнова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Вятский государственный университет" (ВятГУ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Вятский государственный университет" (ВятГУ) filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Вятский государственный университет" (ВятГУ)
Priority to RU2019145621A priority Critical patent/RU2745654C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2745654C1 publication Critical patent/RU2745654C1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/7036—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin having at least one amino group directly attached to the carbocyclic ring, e.g. streptomycin, gentamycin, amikacin, validamycin, fortimicins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • G—PHYSICS
    • G09—EDUCATION; CRYPTOGRAPHY; DISPLAY; ADVERTISING; SEALS
    • G09B—EDUCATIONAL OR DEMONSTRATION APPLIANCES; APPLIANCES FOR TEACHING, OR COMMUNICATING WITH, THE BLIND, DEAF OR MUTE; MODELS; PLANETARIA; GLOBES; MAPS; DIAGRAMS
    • G09B23/00—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes
    • G09B23/28—Models for scientific, medical, or mathematical purposes, e.g. full-sized devices for demonstration purposes for medicine

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: invention relates to medicine, specifically to experimental medicine, medical microbiology and infectiology, and can be used for studying the gastric and intestinal microbiota during suppression of colonization resistance of gastric mucosa of experimental animals. A selective action is performed on the gastric microbiota of the antibacterial preparation gentamicin sulfate containing 40 mg of the antibiotic in 1 ml and diluted with isotonic sodium chloride solution to a concentration of 24 mg in 1 ml, by oral administration to conventional white mice once a day for 5 days at a dosage of 2.4 mg per one mouse. Oral administration of gentamicin is accompanied by simultaneous daily collection of feces for 8 days to determine the representatives of the gastric and intestinal microbiota extracted from bodies of white mice by inoculation of feces on a solid nutritional medium in Petri dishes incubated under microaerophilic conditions at a temperature of 37ºC for 24 hours. The obtained results of feces inoculation are then processed based on the amount of grown bacterial colonies and a judgment is made on the number and loss of normobiota of the gastrointestinal tract.
EFFECT: method allows to establish the time frame for the development of infection in laboratory animals, from adhesion of Helicobacter pylori bacteria and colonization of gastric mucosa to determination of morphologically and histologically distinguishable manifestations of the pathological process, and to study the duration of Helicobacter pylori presence in the gastric tissues based on quantitative determination of bacteria excreted from the body with intestinal contents, by creating artificial microecological and microbiological bio-incompatibility of the “pathogen versus host” type in this biotope in presence of suppression of gastric microbiota and associated suppression of local immune defense of gastric mucosa.
2 cl, 3 tbl

Description

Изобретение относится к экспериментальной медицине, медицинской микробиологии и инфектологии и может быть использовано для изучения роли колонизационной резистентности слизистой оболочки желудка экспериментальных животных в предупреждении колонизации и приживаемости в организме млекопитающих бактерий Helicobacter pylori, предотвращении развития инфекционного процесса и вызываемых возбудителем патологических изменений в желудке, а также для оценки эффективности новых и разрабатываемых средств эрадикационной терапии хеликобактериоза.The invention relates to experimental medicine, medical microbiology and infectious diseases and can be used to study the role of colonization resistance of the gastric mucosa of experimental animals in the prevention of colonization and survival in the mammalian organism of Helicobacter pylori bacteria, prevention of the development of an infectious process and pathogen-induced pathological changes in the stomach, as well as to assess the effectiveness of new and developed means of eradication therapy for helicobacteriosis.

Хеликобактериоз - инфекционное заболевание с фекально - оральным механизмом передачи, вызываемое бактериями Helicobacter pylori, имеющими выраженную тропность к эпителию слизистой оболочки желудка. В настоящее время Helicobacter pylori рассматривается в качестве патогенного биологического агента, вызывающего хроническое воспаление желудка -хеликобактериоз и способствующего развитию гастрита, язвенной болезни и новообразований желудка (Goodwin C.S., Armstrong J.A., Marshall B.J. Campylobacter pyloris, gastritis, and peptic ulcer // J. Clin. Pathol. - 1986. - Vol. 39. - P.353-365). Хеликобактер приспособился к длительному пребыванию в желудке, в антральной части которого он скапливается в большом количестве. Именно здесь относительно мало клеток, секретирующих соляную кислоту, что способствует выживанию хеликобактера на поверхности эпителия желудка.Helicobacteriosis is an infectious disease with a fecal - oral transmission mechanism caused by the bacteria Helicobacter pylori, which has a pronounced tropism for the epithelium of the gastric mucosa. Currently, Helicobacter pylori is considered as a pathogenic biological agent that causes chronic inflammation of the stomach - helicobacteriosis and contributes to the development of gastritis, peptic ulcer and gastric neoplasms (Goodwin CS, Armstrong JA, Marshall BJ Campylobacter pyloris, gastritis, and peptic ulcer // J. Clin Pathol. 1986. Vol. 39. P. 353-365). Helicobacter has adapted to a long stay in the stomach, in the antrum of which it accumulates in large quantities. It is here that there are relatively few cells secreting hydrochloric acid, which contributes to the survival of Helicobacter on the surface of the gastric epithelium.

Колонизационная резистентность слизистой оболочки желудка является важнейшим барьером на пути многих возбудителей кишечных заболеваний, среди которых бактерии Helicobacter pylori занимают ведущие позиции в патологии человека, инфицируя подавляющее большинство жителей многих стран на всех континентах Земли (Шкитин В.А., Шпирна А.И., Старовойтов Г.Н. Роль Helicobacter pylori в патологии человека // Клин, микробиол. и антимикроб. химиотерапия. 2002; 4(2): 128-145). Полное избавление от возбудителя даже в настоящее время представляет ой довольно сложную медицинскую проблему.Colonization resistance of the gastric mucosa is the most important barrier to many pathogens of intestinal diseases, among which the Helicobacter pylori bacteria occupy a leading position in human pathology, infecting the vast majority of inhabitants of many countries on all continents of the Earth (Shkitin V.A., Shpirna A.I., Starovoitov G.N. The role of Helicobacter pylori in human pathology // Klin, microbiology and antimicrobial chemotherapy. 2002; 4 (2): 128-145). Complete disposal of the pathogen, even at the present time, is a rather complicated medical problem.

В научной литературе интегративную функцию желудочно-кишечного тракта по защите организма от патогенных микроорганизмов и вредных веществ связывают с колонизационной резистентностью, полностью ассоциированной с таким морфо-функциональным образованием, как микробно-тканевой комплекс (Минушкин О.Н., Елизаветина Г.А., Ардатская М.Д. Нарушение баланса микрофлоры и ее коррекция //Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. 2013; 4:4-8). Это сложное эволюционно сложившееся полифункциональное объединение, состоящее из колонизирующей пристеночную зону слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта мукозной микробиоты и подлежащих тканевых структур желудка и кишечника. Неразделимость желудочно-кишечной микробиоты и колонизационной резистентности оформилась в соответствующей формулировке как совокупность механизмов, обеспечивающих способность микробиоты и макроорганизма, кооперативно взаимодействуя, защищать экосистему желудочно-кишечного тракта от воздействия патогенной микрофлоры (Савина В.Е., Погорельский И.П. Колонизационная резистентность кишечника // Всерос. науч. -практ. конф. «Общество, наука, инновации (НПК-2013)». Сборник материалов. Киров: Изд-во Вятского госуниверситета; 2013: 76-78; Звягицева Т.Д., Гриднева С.В. Коррекция нарушений колонизационной резистентности кишечника //health-ua.com/article/15722-korrectciya-narushenij-kolonizacionnoj-rezistentnosti-kishechnika). Иными словами, колонизационная резистентность - это комплекс механизмов, обеспечивающих защиту от доступа патогенов к эпителию желудка и кишечника и последующего их проникновения в организм.In the scientific literature, the integrative function of the gastrointestinal tract to protect the body from pathogenic microorganisms and harmful substances is associated with colonization resistance, fully associated with such morpho-functional formations as the microbial-tissue complex (Minushkin O.N., Elizavetina G.A., Ardatskaya M.D. Imbalance of microflora and its correction // Effective pharmacotherapy. Gastroenterology. 2013; 4: 4-8). This is a complex evolutionary polyfunctional association consisting of the mucosal microbiota colonizing the parietal zone of the gastrointestinal tract mucous microbiota and the underlying tissue structures of the stomach and intestines. The inseparability of the gastrointestinal microbiota and colonization resistance took shape in the appropriate formulation as a set of mechanisms that ensure the ability of the microbiota and the macroorganism, cooperatively interacting, to protect the ecosystem of the gastrointestinal tract from the effects of pathogenic microflora (Savina V.E., Pogorelsky I.P. Colonization resistance of the intestine // All-Russian scientific-practical conference "Society, Science, Innovation (NPK-2013)." Collection of materials. Kirov: Publishing house of Vyatka State University; 2013: 76-78; Zvyagitseva T.D., Gridneva S. B. Correction of violations of colonization resistance of the intestine //health-ua.com/article/15722-korrectciya-narushenij-kolonizacionnoj-rezistentnosti-kishechnika). In other words, colonization resistance is a complex of mechanisms that provide protection against pathogen access to the epithelium of the stomach and intestines and their subsequent penetration into the body.

Под колонизационной резистентностью Б.А. Шендеров (Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т.Том 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. М.: ГРАНТЪ; 1998, 288 с.) понимает совокупность механизмов, придающих стабильность нормальной микрофлоре и обеспечивающих предотвращение заселения организма хозяина патогенными либо условно-патогенными микроорганизмами. По его данным, в понятие колонизационной резистентности входит целый ряд защитных механизмов: прямых - микробно-тканевой комплекс как сложная специфическая приэпителиальная структура, и опосредованных -инактивация иммунной системы, стимуляция системы мононуклеаров, интерфероногенная функция, ингибирование конъюгации желчных кислот и т.д. Важной составляющей перечисленных механизмов является, по мнению Б.А. Шендерова, в первую очередь, анаэробная микрофлора, которая нейтрализует состав условно-патогенных микроорганизмов толстой кишки и является основным источником эндогенной инфекции (Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1998; 7(1):61-65). Естественно, что множественность механизмов, обеспечивающих колонизационную резистентность, предполагает и множественность вариантов, комбинаций ее состояния в конкретных ситуациях. Количественный и качественный состав микрофлоры желудочно-кишечного тракта, а также состояние среды ее обитания, является одним из определяющих условий эффективности колонизационной резистентности (Lammers K.М., Brigidi P., Vitali В., Gionchetti P., Rizello F., Caramelli E., Matteuzzi D., Canepieri M. Immunomodulatori effects of probiotic bacteria DNA: IL-1 and IL-10 response in human peripheral blood mononuclear cells //FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003; 38(2): 165-172; Veckman V., Miettinen M., Matikainen S., Lande P.,Giacomini E., Coccia E. M. Lactobacilli and streptococci induce inflammatory chemokine production in human macrophages that stimulates Th 1 cell chemotaxis //J. Leukoc. Biol. 2003; 74(3): 395-402).Under colonization resistance B.A. Shenderov (Shenderov B.A. Medical microbial ecology and functional nutrition: in 3 volumes, Volume 1: Microflora of humans and animals and its functions. M .: GRANT; 1998, 288 p.) Understands the set of mechanisms that give stability to normal microflora and ensure prevention of colonization of the host organism by pathogenic or opportunistic microorganisms. According to him, the concept of colonization resistance includes a number of protective mechanisms: direct - the microbial-tissue complex as a complex specific epithelial structure, and mediated - inactivation of the immune system, stimulation of the mononuclear system, interferonogenic function, inhibition of conjugation of bile acids, etc. An important component of the listed mechanisms is, according to B.A. Shenderova, first of all, anaerobic microflora, which neutralizes the composition of opportunistic microorganisms of the large intestine and is the main source of endogenous infection (Shenderov B.A. Normal microflora and its role in maintaining human health // Ros.Journal. gastroenterol., Hepatol. , Coloproctol. 1998; 7 (1): 61-65). Naturally, the multiplicity of mechanisms providing colonization resistance also presupposes a multiplicity of options, combinations of its state in specific situations. The quantitative and qualitative composition of the microflora of the gastrointestinal tract, as well as the state of its habitat, is one of the determining conditions for the effectiveness of colonization resistance (Lammers K.M., Brigidi P., Vitali V., Gionchetti P., Rizello F., Caramelli E ., Matteuzzi D., Canepieri M. Immunomodulatori effects of probiotic bacteria DNA: IL-1 and IL-10 response in human peripheral blood mononuclear cells // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003; 38 (2): 165-172; Veckman V., Miettinen M., Matikainen S., Lande P., Giacomini E., Coccia EM Lactobacilli and streptococci induce inflammatory chemokine production in human macrophages that stimulates Th 1 cell chemotaxis // J. Leukoc. Biol. 2003; 74 ( 3): 395-402).

Ввиду того, что довольно часто о состоянии микробиоценоза биотопов желудочно-кишечного тракта судят по численности так называемых микроорганизмов-бенефициаров, к которым относят бифидобактерии, лактобациллы и эшерихии, нами были получены данные о количественном составе микробиоты желудка человека с интактной слизистой оболочкой. Так, численность бифидобактерий в 1 мл желудочного содержимого колеблется от 0 до 4,0×102 КОЕ, лактобацилл - достигает 5,0×103 КОЕ; эшерихии как и протей отсутствуют; численность дрожжей достигает 7,0×103 КОЕ, а количество Sarcina ventriculi может достигать 6,0×103 КОЕ. Для сравнения приводим данные о численности бенефициаров в желудке здоровых конвенциональных белых мышей: бифидобактерии (4,6±0,6)×104 КОЕ × мл-1; лактобациллы (3,9±0,6)×105 КОЕ × мл-1; эшерихии (4,6±0,7)×103 КОЕ × мл-1). Очевидно, что образ жизни грызунов, в частности домовых мышей (вид Mus musculus) обусловил естественную эволюционно сложившуюся микробиоту желудка, соответствующую типу питания, а также более мощный уровень колонизационной резистентности, которые координированно противодействуют адгезии и колонизации слизистой оболочки желудка бактериями Helicobacter pylori еще в начале инфекционного процесса. Таким образом, существующий тип микробиома желудка мышей как атрибут вида, а также колонизационная резистентность слизистой оболочки желудка обеспечивают полную защиту животных от хеликобактера как возбудителя антропонозного инфекционного заболевания в классическом его понимании. Но если убрать с помощью медикаментов (антибактериальных препаратов) эти барьеры, то тогда инфекционный процесс будет инициирован бактериями Helicobacter pylori. Важно при этом подчеркнуть, что развившийся хеликобактерный гастрит сопровождается распрстранением бактерий Helicobacter pylori с желудочным содержимым в двенадцатиперстную кишку и далее в тонкую и толстую кишку. Обнаружение бактерий Helicobacter pylori в фекалиях на вторые сутки после адгезии и колонизации слизистой оболочки желудка является прямым доказательством развития инфекционного процесса и, наоборот, исчезновение бактерий Helicobacter pylori в фекалиях свидетельствует об эрадикации возбудителя.Due to the fact that quite often the state of the microbiocenosis of biotopes of the gastrointestinal tract is judged by the number of so-called beneficiary microorganisms, which include bifidobacteria, lactobacilli and Escherichia, we obtained data on the quantitative composition of the microbiota of the human stomach with intact mucous membrane. So, the number of bifidobacteria in 1 ml of gastric contents ranges from 0 to 4.0 × 10 2 CFU, lactobacilli - reaches 5.0 × 10 3 CFU; Escherichia as well as Proteus are absent; the number of yeasts reaches 7.0 × 10 3 CFU, and the number of Sarcina ventriculi can reach 6.0 × 10 3 CFU. For comparison, we present data on the number of beneficiaries in the stomach of healthy conventional white mice: bifidobacteria (4.6 ± 0.6) × 10 4 CFU × ml -1 ; lactobacilli (3.9 ± 0.6) × 10 5 CFU × ml -1 ; Escherichia (4.6 ± 0.7) × 10 3 CFU × ml -1 ). Obviously, the lifestyle of rodents, in particular house mice (species Mus musculus), determined the natural evolutionary formed microbiota of the stomach, corresponding to the type of nutrition, as well as a more powerful level of colonization resistance, which coordinatedly counteract the adhesion and colonization of the gastric mucosa by Helicobacter pylori bacteria at the beginning infectious process. Thus, the existing type of the gastric microbiome of mice as an attribute of the species, as well as the colonization resistance of the gastric mucosa, provide complete protection of animals from Helicobacter as the causative agent of an anthroponous infectious disease in its classical sense. But if you remove these barriers with the help of medicines (antibacterial drugs), then the infectious process will be initiated by the Helicobacter pylori bacteria. It is important to emphasize that the developed Helicobacter pylori gastritis is accompanied by the spread of Helicobacter pylori bacteria with gastric contents into the duodenum and further into the small and large intestine. The detection of Helicobacter pylori bacteria in feces on the second day after adhesion and colonization of the gastric mucosa is direct evidence of the development of an infectious process, and, conversely, the disappearance of Helicobacter pylori bacteria in feces indicates the eradication of the pathogen.

К сожалению, как в России, так и за рубежом, практические врачи при лечении хеликобактериоза не обращают внимание на состояние желудочной микробиоты пациентов и связанную с ней колонизационную резистентность. Но игнорировать результаты научных исследований недальновидно, поскольку научный прогресс необратим. К этому следует добавить недавно полученные данные об антимикробных пептидах, которые экспрессируются слизистой оболочкой желудка у больных хеликобактероиозом независимо от их клинического состояния пациентов (Cremniter J., Bodet С, Tougeron D., Dray X., Guilhot J., Jegou J.-F., Morel F., Lecron J.-C, Silvain C, Burucoa C. Th-17 response and antimicrobial peptide expression in gastric mucosa of Helicobacter pylori - infected patients independently of their clinical outcomes. 23 (3): MAR 2018. https://doi.org/10.1111/hel.12479). Существуют согласительные документа международного уровня, в которых сформулированы существенные для практического врача положения (Malferthiner P., Megraud F., OMorain С.et al. Management of Helicobacter pylori infection - the Maastricht V/Florence Consensus // Report.Gut. 2017;66(1): 6-30; Пиманов С.И., Макаренко E.B. Оптимизированные эрадикационные протоколы: рекомендации американской коллегии гастроэнтерологов, Маастрихт V/ Флорентийского и Торонтского консенсусов // Медицинский совет. 2017; 5: 10-17). Этими документами предписан выбор эрадикационного лечения с учетом популяционной антибиотикорезистентности возбудителя и индивидуального анамнеза применения антибиотиков, а в случае неэффективности лечения -последовательно переходить от одной линии терапии к последующей и так далее к последней 16 линии (тройной терапии с рифабутином).Unfortunately, both in Russia and abroad, practical doctors in the treatment of Helicobacteriosis do not pay attention to the state of the gastric microbiota of patients and the associated colonization resistance. But to ignore the results of scientific research is shortsighted, since scientific progress is irreversible. To this should be added the recently obtained data on antimicrobial peptides, which are expressed by the gastric mucosa in patients with Helicobacter pyloriosis, regardless of their clinical state of patients (Cremniter J., Bodet C, Tougeron D., Dray X., Guilhot J., Jegou J.-F ., Morel F., Lecron J.-C, Silvain C, Burucoa C. Th-17 response and antimicrobial peptide expression in gastric mucosa of Helicobacter pylori - infected patients independently of their clinical outcomes.23 (3): MAR 2018. : //doi.org/10.1111/hel.12479). There are conciliatory documents of the international level, which formulate provisions that are essential for a practitioner (Malferthiner P., Megraud F., OMorain C. et al. Management of Helicobacter pylori infection - the Maastricht V / Florence Consensus // Report.Gut. 2017; 66 (1): 6-30; Pimanov S.I., Makarenko EB Optimized eradication protocols: recommendations of the American College of Gastroenterologists, Maastricht V / Florence and Toronto Consensus // Medical Council. 2017; 5: 10-17). These documents prescribe the choice of eradication treatment, taking into account the population antibiotic resistance of the pathogen and the individual history of the use of antibiotics, and in case of ineffectiveness of treatment, consistently move from one line of therapy to the next, and so on to the last 16 line (triple therapy with rifabutin).

Такую ситуацию с эрадикационной терапией хеликобактериоза можно с большой долей вероятности связать с отсутствием до недавнего времени способа моделирования данного инфекционного заболевания на животных, поскольку они не болеют данной инфекцией ввиду того, что само заболевание относится к разряду антропонозов. Предварительная апробация тех или иных схем лечения хеликобактериоза на биопробных (модельных) животных позволила бы избежать многих ошибок при ведении больных и повысила бы эффективность эрадикационной терапии.Such a situation with the eradication therapy of Helicobacter pyloriosis can with a high degree of probability be associated with the absence, until recently, of a method for modeling this infectious disease in animals, since they do not suffer from this infection due to the fact that the disease itself belongs to the category of anthroponosis. Preliminary testing of certain treatment regimens for helicobacteriosis in biosimilar (model) animals would allow avoiding many mistakes in the management of patients and would increase the effectiveness of eradication therapy.

Известен способ оценки состояния колонизационной резистентности слизистой оболочки кишечника организма человека на основе определения индекса колонизационной резистентности с учетом бактериологического исследования биологического материала и определения качественного и количественного состава микроорганизмов, присутствующих в исследуемом биологическом материале (Горелов А.В., Плоскирева А.А. Способ оценки состояния колонизационной резистентности микробиоценоза биотопа организм человека (варианты). Патент РФ №2381504 от 10.02.2008, опубл. 10.02.2010, бюл. №4. Номер охранного документа G01N 33/48). Значительная трудоемкость исполнения заявленного объекта изобретения, персонификация проведения бактериологического и других методов изучения микробиоты биотопов организма не позволяют использовать разработанный способ в широких экспериментальных исследованиях с привлечением модельных животных.A known method for assessing the state of colonization resistance of the intestinal mucosa of the human body on the basis of determining the index of colonization resistance, taking into account the bacteriological study of biological material and determining the qualitative and quantitative composition of microorganisms present in the biological material (Gorelov A.V., Ploskireva A.A. the state of colonization resistance of the microbiocenosis of the biotope, the human body (variants). RF Patent No. 2381504 dated 02/10/2008, published on 02/10/2010, bulletin No. 4. Title of the title of protection G01N 33/48). The significant laboriousness of the implementation of the claimed object of the invention, the personification of the bacteriological and other methods of studying the microbiota of the biotopes of the organism do not allow using the developed method in wide experimental studies involving model animals.

Существенным прорывом в изучении патогенза хеликобактериоза является предложенный способ его моделирования на лабораторных животных, а также селективная плотная питательная среда с гемином и антибиотиком рифампицином для выращивания бактерий Helicobacter pylori КМ-11(RifR) (Погорельский И.П., Чичерин И.Ю., Лундовских И.А., Смирнова Д.Н., Богачева Н.В. Способ моделирования хеликобактериоза. Патент РФ №2690943 от 07.06.2019, опубл. 07.06.209. бюл. №16. Номер охранного документа G09B 23/28). Для этого подопытным конвенциональным белым мышам вводят бактерии Helicobacter pylori КМ-11(RifR), маркированные по признаку устойчивости к антибиотику рифампицину, на фоне подавления финальной стадии секреции соляной кислоты под действием ингибиторов протонного насоса в желудке препаратами Париет либо Омепразол, или на фоне иммуносупрессивного эффекта от внутримышечного введения Дексаметазона, отбирают фекалии и определяют в них бактерии Helicobacter pylori КМ-11(RifR) с использованием селективной плотной питательной среды с гемином и рифампицином до начала, в ходе проведения экспериментов, по окончании введения и в последующем в течение 10-14 дней. Способ позволяет судить об интенсивности, длительности и продолжительности бактериовыделения Helicobacter pylori КМ-11(RifR). В то же время следует признать, что реализация данного способа, предполагающего создание в организме лабораторных животных иммуносупрессивного состояния и подавление секреции желудочного сока вследствие блокирования финальной стадии продукции соляной кислоты, как бы искусственно исключает влияние на развитие хеликобактерной инфекции этих двух важных для жизнедеятельности организма физиологических процессов, которые прямо не нацелены на желудочную микробиоту. Такой способ моделирования хеликобактериоза безусловно имеет большое значение, прежде всего, для апробации новых средств эрадикационной терапии, но с его помощью нельзя установить сущность интимных механизмов взаимодействия возбудителя с микробно-тканевым комплексом стенки желудка на ранней стадии инициации инфекционного процесса. Именно поэтому в соответствии с целевой установкой в заявляемом способе основное внимание уделено воздействию на микробиоту желудка, локализующуюся в мукозальном слое слизистой оболочки, не затрагивают иммунную систему и синтез желудочного сока.A significant breakthrough in the study of the pathogenesis of helicobacteriosis is the proposed method for its modeling in laboratory animals, as well as a selective dense nutrient medium with hemin and the antibiotic rifampicin for growing the bacteria Helicobacter pylori KM-11 (Rif R ) (Pogorelsky I.P., Chicherin I.Yu. , Lundovskikh I.A., Smirnova D.N., Bogacheva N.V. Method for modeling Helicobacteriosis. RF Patent No. 2690943 dated 07.06.2019, publ. 07.06.209. Bulletin No. 16. Title of title G09B 23/28) ... To do this, experimental conventional white mice are injected with the bacteria Helicobacter pylori KM-11 (Rif R ), marked for resistance to the antibiotic rifampicin, against the background of suppression of the final stage of secretion of hydrochloric acid under the action of proton pump inhibitors in the stomach with the drugs Pariet or Omeprazole, or against the background of immunosuppressive effect from the intramuscular injection of Dexamethasone, feces are taken and the bacteria Helicobacter pylori KM-11 (Rif R ) are determined in them using a selective dense nutrient medium with hemin and rifampicin before the start, during the experiments, at the end of the administration and thereafter for 10 14 days. The method makes it possible to judge the intensity, duration and duration of bacterial excretion of Helicobacter pylori KM-11 (Rif R ). At the same time, it should be recognized that the implementation of this method, which involves the creation of an immunosuppressive state in the body of laboratory animals and the suppression of gastric acid secretion due to blocking the final stage of hydrochloric acid production, artificially excludes the influence of these two physiological processes on the development of Helicobacter pylori infection. that do not directly target the gastric microbiota. This method of modeling helicobacteriosis is certainly of great importance, first of all, for testing new means of eradication therapy, but with its help it is impossible to establish the essence of the intimate mechanisms of interaction of the pathogen with the microbial-tissue complex of the stomach wall at an early stage of initiation of the infectious process. That is why, in accordance with the target setting, the inventive method focuses on the effect on the gastric microbiota, localized in the mucosal layer of the mucous membrane, does not affect the immune system and the synthesis of gastric juice.

Результаты экспериментальных исследований, посвященных изучению некоторых аспектов эрадикационной терапии при остром экспериментальном хеликобактериозе у лабораторных животных и людей-добровольцев (Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Дармов И.В., Лундовских И.А., Шабалина М.Р., Колеватых Е.П., Козлов П.А., Корнаухов А.С. Оценка эрадикационной эффективности метапребиотика Стимбифид плюс при остром экспериментальном хеликобактериозе у лабораторных животных и людей-добровольцев // Инфекционные болезни. 2018;16(4):62-74) свидетельствуют о возможном участии экзогенных метаболитов лактобацилл в формировании и поддержании колонизационной резистентности слизистой оболочки кишечника, на что указывают также результаты, полученные рядом других исследователей (Ленцнер А.А. Лактофлора животного организма и ее защитная функция. Теоретические и практические проблемы биологии. М.: Агропромиздат; 1986:200 с; Freter R., De Maclas М.Е. Factors affecting the colonization of the gut by lactobacilli and other bacteria. Probiotics: prospects of the use in opportunistic infections. Old Herborn University Seminar. Monograph. Ind. Microbiol., Biochem., Herborn-Dill. Germany; 1995:19-34.; Droy M.T., Drounet Y., Geraud G., Schatz B. Intestinal cytoprotection // Gastroenterol. Clin. Biol.1985; 9(12): 37-44). Действительно, продемонстрированная в экспериментах протективная эффективность надосадочной жидкости нативной культуры лактобацилл L. plantarum 8Р-А3, введенной per os конвециональным белым мышам, инфицированным возбудителями псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза (Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Дармов И В., Маракулин И.В. Экспериментальный псевдотуберкулез: оценка возможности профилактики, лечения и коррекции дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры // Журн. инфектологии. 2012; 4(4): 71-79; Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Бессолицына Е.А., Дармов И В., Шабалина М.Р. Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Бессолицына Е.А., Дармов И В., Шабалина М.Р. Колонизационная резистентность слизистой оболочки кишечника при экспериментальном иерсиниозе // Журн. инфектологии. 2013; 5(1): 75-82; Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И. А., Дармов И.В., Малов А.А. Антибактериальная активность и состав надосадочной жидкости нативной культуры Lactobacillus plantarum 8Р-А3 // Журн. международной медицины. 2013; 1(2): 131-139) со всей очевидностью доказала вероятность блокирования рецепторов эпителиальных клеток слизистой оболочки кишечника, предотвращения адгезии патогенных иерсиний и начального этапа инфекционного процесса (Ленцнер А.А., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э., Тюри М.Э., Брилене Т.А., Брилене В.И., Левков А.А. Лактофлора и колонизационная резистентность // Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987; 32(3): 173-179; Хавкин А.И. Микробиоценоз кишечника и иммунитет // Рос.мед. журн. 2003; 11(3): 122-126). Именно этим обстоятельством можно объяснить факт выживания подопытных животных и отсутствие дисбиотических нарушений в составе микробиоценоза кишечника.The results of experimental studies devoted to the study of some aspects of eradication therapy in acute experimental helicobacteriosis in laboratory animals and human volunteers (Chicherin I.Yu., Pogorelsky I.P., Darmov I.V., Lundovskikh I.A., Shabalina M.R. ., Kolevatykh E.P., Kozlov P.A., Kornaukhov A.S. Evaluation of the eradication efficiency of the metaprebiotic Stimbifid plus in acute experimental helicobacteriosis in laboratory animals and human volunteers // Infectious Diseases. 2018; 16 (4): 62- 74) indicate the possible participation of exogenous metabolites of lactobacilli in the formation and maintenance of colonization resistance of the intestinal mucosa, which is also indicated by the results obtained by a number of other researchers (Lentsner A.A. Lactoflora of an animal organism and its protective function. Theoretical and practical problems of biology. M .: Agropromizdat; 1986: 200 s; Freter R., De Maclas M.E. Factors affecting the colonization of the gut by lactobacilli and other bacteria. Probiotics: prospects of the use in opportunistic infections. Old Herborn University Seminar. Monograph. Ind. Microbiol., Biochem., Herborn-Dill. Germany; 1995: 19-34 .; Droy M.T., Drounet Y., Geraud G., Schatz B. Intestinal cytoprotection // Gastroenterol. Clin. Biol. 1985; 9 (12): 37-44). Indeed, the experimentally demonstrated protective efficacy of the supernatant of the native culture of lactobacilli L. plantarum 8P-A3, administered per os to convectional white mice infected with pathogens of pseudotuberculosis and intestinal yersiniosis (Chicherin I.Yu., Pogorelsky I.P., Lundovskikh I.A. , Darmov I.V., Marakulin I.V. Experimental pseudotuberculosis: an assessment of the possibility of prevention, treatment and correction of dysbiotic disorders of the intestinal microflora // Journal of Infectology. 2012; 4 (4): 71-79; Chicherin I.Yu., Pogorelsky I. P., Lundovskikh I.A., Bessolitsyna E.A., Darmov I.V., Shabalina M.R., Chicherin I.Yu., Pogorelsky I.P., Lundovskikh I.A., Bessolitsyna E.A., Darmov I.V., Shabalina M.R. Colonization resistance of the intestinal mucosa in experimental yersiniosis // Journal of Infectology. 2013; 5 (1): 75-82; Chicherin I.Yu., Pogorelsky I.P., Lundovskikh I. A., Darmov I.V., Malov A.A.Antibacterial activity and composition of the supernatant of the native culture Lactobacillus plantarum 8P-A3 // Zh. international medicine. 2013; 1 (2): 131-139) clearly proved the likelihood of blocking the receptors of epithelial cells of the intestinal mucosa, preventing the adhesion of pathogenic Yersinia and the initial stage of the infectious process (Lentsner A.A., Lentsner H.P., Mikelsaar M.E., Tyuri M.E., Brilene T.A., Brilene V.I., Levkov A.A.Lactoflora and colonization resistance // Antibiotics and medical biotechnology. 1987; 32 (3): 173-179; Khavkin A.I. Intestinal microbiocenosis and immunity // Russian medical journal 2003; 11 (3): 122-126). It is this circumstance that can explain the fact of the survival of experimental animals and the absence of dysbiotic disorders in the composition of the intestinal microbiocenosis.

Таким образом, имеющиеся результаты экспериментальных исследований дают основание полагать, что подавив колонизационную резистентность слизистой оболочки желудка, создав условия для развития в данном биотопе бионесовместимости по типу «патоген против хозяина» (Глушанова Н.А., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro // Журн. микробиол. 2005; 2: 56-61), можно инициировать развитие острого хеликобактериоза, обеспечив на ранней стадии развития инфекционного процесса адгезию и колонизацию слизистой оболочки желудка бактериями Helicobacter pylori.Thus, the available results of experimental studies suggest that by suppressing the colonization resistance of the gastric mucosa, creating conditions for the development of bioincompatibility in this biotope of the pathogen versus host type (Glushanova N.A., Shenderov B.A. lactobacilli of the host in conditions of co-cultivation in vitro // Zhurn.Mikrobiol. 2005; 2: 56-61), it is possible to initiate the development of acute Helicobacteriosis, providing adhesion and colonization of the gastric mucosa by Helicobacter pylori bacteria at an early stage of development of the infectious process.

Важным показателем, характеризующим степень угнетения колонизационной резистентности слизистой оболочки желудка, а в последующем адгезию и размножение хеликобактера и его дальнейшее проникновение в кишечник, является выделение бактерий Helicobacter pylori из желудочного содержимого, мазков-отпечатков и фекалий животных. Такое бактериологическое исследование стало возможным благодаря использованию для перорального введения животным в экспериментах маркированного по признаку устойчивости к антибиотику рифампицину штамма Helicobacter pylori КМ-11(RifR). Признак устойчивости к рифампицину обеспечивает возможность выявления и идентификации хеликобактера в фекалиях животных при их высеве на специальную селективную плотную питательную среду с гемином и рифампицином в концентрации 150 мкг × мл-1, на которой бактерии кишечной микрофлоры и другие бактерии не растут.An important indicator characterizing the degree of inhibition of the colonization resistance of the gastric mucosa, and subsequently the adhesion and reproduction of Helicobacter and its further penetration into the intestine, is the release of Helicobacter pylori bacteria from gastric contents, smears, prints and animal feces. Such a bacteriological study became possible due to the use of the KM-11 (Rif R ) strain of Helicobacter pylori KM-11 (Rif R) marked for resistance to the antibiotic rifampicin for oral administration to animals in experiments. The trait of resistance to rifampicin makes it possible to detect and identify Helicobacter in animal feces when they are sown on a special selective dense nutrient medium with hemin and rifampicin at a concentration of 150 μg × ml -1 , on which bacteria of the intestinal microflora and other bacteria do not grow.

Гистологическое исследование желудка у павших лабораторных животных проводят после фиксации ткани в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживают в изопропаноле и заливают в парафин. Приготовленные на микротоме препараты желудка окрашивают гематоксилином Эрлиха и эозином, просматривают на микроскопе «Микмед -2» (ООО «ЛОМО», Россия) при увеличении х200, х1000, после чего выносят суждение о выраженности патологического процесса.Histological examination of the stomach in fallen laboratory animals is carried out after fixation of the tissue in a 10% solution of neutral formalin, dehydrated in isopropanol and embedded in paraffin. The stomach preparations prepared on a microtome are stained with Ehrlich's hematoxylin and eosin, viewed on a Mikmed-2 microscope (LOMO LLC, Russia) at magnification x200, x1000, after which a judgment is made on the severity of the pathological process.

ПримерExample

Выращивают культуру бактерий Helicobacter pylori КМ-11(RifR) в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С в течение 24 ч, после чего готовят бактериальную суспензию на изотоническом растворе хлорида натрия исходя из расчета 1×105 микробных клеток в объеме 0,2 мл.A culture of bacteria Helicobacter pylori KM-11 (Rif R ) is grown under microaerophilic conditions at 37 ° C for 24 hours, after which a bacterial suspension is prepared on isotonic sodium chloride solution based on 1 × 10 5 microbial cells in a volume of 0.2 ml ...

Берут необходимое количество прошедших акклиматизацию белых мышей массой 18 - 20 г, рассаживают их в индивидуальные кюветы с крышками. Ежедневно отбирают от каждого животного фекалии, взвешивают их, после чего суспендируют в 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия и высевают на селективную плотную питательную среду с рифампицином (150 мкг × мл-1) в чашках Петри, которые инкубируют при температуре 37°С в течение 24-48 ч в микроаэрофильных условиях. С учетом массы фекалий, полученных от каждого животного, делают перерасчет числа бактерий на 1 г фекалий (КОЕ × г-1).Take the required number of acclimatized white mice weighing 18 - 20 g, put them in individual cuvettes with lids. Feces are taken from each animal every day, weighed, then suspended in 1.0 ml of isotonic sodium chloride solution and plated on a selective dense nutrient medium with rifampicin (150 μg × ml -1 ) in Petri dishes, which are incubated at 37 ° C within 24-48 hours in microaerophilic conditions. Taking into account the mass of feces obtained from each animal, recalculate the number of bacteria per 1 g of feces (CFU × g -1 ).

Целью изобретения является разработка способа, позволяющего подавлять колонизационную резистентность слизистой оболочки желудка лабораторных животных.The aim of the invention is to develop a method for suppressing the colonization resistance of the gastric mucosa of laboratory animals.

Технический результат, который может быть получен при использовании данного способа, заключается в том, что у лабораторных животных на фоне угнетения желудочной микробиоты и связанных с этим подавлением локальной иммунной защиты слизистой оболочки желудка, созданием в данном биотопе искусственной микроэкологической и микробиологической бионесовместимости по типу «патоген против хозяина», можно установить временные рамки развития инфекции, начиная от адгезии бактерий Helicobacter pylori и колонизации слизистой оболочки желудка, вплоть до определения морфологически и гистологически различимых проявлений патологического процесса. Другим аспектом решения указанной проблемы является возможность изучения длительности пребывания возбудителя Helicobacter pylori в тканях желудка на основании количественного определения бактерий Helicobacter pylori, выделяемых из организма с кишечным содержимым, как критерия оценки терапевтической эффективности использования эрадикационных протоколов, рекомендованных Маастрихт V/ Флорентийским и Торонтским консенсусов.The technical result that can be obtained using this method is that in laboratory animals, against the background of suppression of the gastric microbiota and the associated suppression of the local immune defense of the gastric mucosa, the creation in this biotope of artificial microecological and microbiological bioincompatibility of the type "pathogen against the host ”, it is possible to establish the time frame for the development of infection, starting from the adhesion of Helicobacter pylori bacteria and colonization of the gastric mucosa, up to the definition of morphologically and histologically distinguishable manifestations of the pathological process. Another aspect of solving this problem is the possibility of studying the duration of stay of the pathogen Helicobacter pylori in the stomach tissues based on the quantitative determination of Helicobacter pylori bacteria excreted from the body with intestinal contents, as a criterion for evaluating the therapeutic effectiveness of using eradication protocols recommended by the Maastricht V / Florence and Toronto Consensus.

Технический результат достигается тем, что заявляемый способ предусматривает селективное воздействие антибактериального препарата на желудочную микробиоту путем перорального введения лабораторным животным однократно в сутки в течение 5 дней в дозе, превышающей его терапевтическую дозу при парентеральном введении в 4 раза. Важным в реализации способа является использование такого антибактериального препарата, который не всасывается в организм в желудочно-кишечном тракте, но оказывает при транзите через желудок локальное воздействие на представителей желудочной микробиоты, снижая их численность и иммунологическую эффективность, способствуя адгезии бактерий Helicobacter pylori, их размножению и развитию тотального хеликобактерного гастрита. Согласно описанию фармакологического действия, приведенному в инструкции по применению (Препарат для медицинского применения Гентамицин. Раствор для внутривенного и внутримышечного введения, 40 мг гентамицина сульфата в 1 мл; регистрационный номер П N016270/01; производитель РУП «Белмедпрепараты», Республика Беларусь), такой характеристикой обладает антибиотик Гентамицин - представитель аминогликозидов (наряду с Канамицином и Стрептомицином). Абсорбция антибиотика при приеме внутрь незначительная - он практически не всасывается при введении в желудочно-кишечный тракт и оказывает местное действие на желудочную микробиоту. В качестве ориентира при выборе вводимой перорально лабораторным животным дозы антибиотика Гентамицина использовали суточную дозу препарата при парентеральном введении, равной 3 мг на 1 кг массы тела больного (всего 240 мг). Соответствующая доза антибиотика для конвенциональных белых мышей в пересчете на единицу поверхности тела составляет 0,6 мг, а для перорального введения с учетом четырехкратного увеличения - 2,4 мг на одно животное.The technical result is achieved in that the claimed method provides for the selective effect of the antibacterial drug on the gastric microbiota by oral administration to laboratory animals once a day for 5 days at a dose that exceeds its therapeutic dose for parenteral administration by 4 times. Important in the implementation of the method is the use of an antibacterial drug that is not absorbed into the body in the gastrointestinal tract, but during transit through the stomach has a local effect on representatives of the gastric microbiota, reducing their number and immunological efficiency, promoting the adhesion of Helicobacter pylori bacteria, their reproduction and the development of total H. pylori gastritis. According to the description of the pharmacological action given in the instructions for use (Preparation for medical use Gentamicin. Solution for intravenous and intramuscular administration, 40 mg of gentamicin sulfate in 1 ml; registration number P N016270 / 01; manufacturer RUE "Belmedpreparaty", Republic of Belarus), such The antibiotic Gentamicin, a representative of aminoglycosides (along with Kanamycin and Streptomycin), has a characteristic. The absorption of the antibiotic when taken orally is insignificant - it is practically not absorbed when introduced into the gastrointestinal tract and has a local effect on the gastric microbiota. As a guideline when choosing the dose of the antibiotic Gentamicin administered orally to laboratory animals, a daily dose of the drug for parenteral administration was used, equal to 3 mg per 1 kg of the patient's body weight (total 240 mg). The corresponding dose of the antibiotic for conventional white mice per unit surface area is 0.6 mg, and for oral administration, taking into account a fourfold increase, 2.4 mg per animal.

В экспериментах по изучению состава желудочной и кишечной микробиоты использовали конвенциональных белых мышей обоего пола массой 18-20 г, прошедших акклиматизацию в виварии. У животных в процессе экспериментов отбирали желудки, гомогенизировали в изотоническом растворе хлорида натрия и высевали на плотную питательную среду для подращивания при температуре 37°С и подсчета выросших колоний; в случае выделения хеликобактера суспензию гомогената высевали на селективную плотную питательную среду с рифампицином. Отбор фекалий у экспериментальных животных для проведения исследований проводили ежедневно в течение всего периода выполнения экспериментов.In experiments to study the composition of the gastric and intestinal microbiota, we used conventional white mice of both sexes weighing 18–20 g, acclimatized in a vivarium. During the experiments, stomachs were taken from the animals, homogenized in isotonic sodium chloride solution and plated on a dense nutrient medium for growing at a temperature of 37 ° C and counting the grown colonies; in the case of isolation of Helicobacter, the homogenate suspension was sown on a selective dense nutrient medium with rifampicin. The collection of feces from experimental animals for research was carried out daily during the entire period of the experiments.

Количество представителей желудочной микробиоты (КОЕ) бифидобактерий, лактобацилл и эшерихий, выделенных из фекалий животных, определяли высевом соответствующих десятикратных разведений изучаемых суспензий на плотные питательные среды рекомендованного состава [Бондаренко В.М., Лиходед В.Г. Методические рекомендации: микробиологическая диагностика дисбактериоза кишечника. М.: ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, 2007; 70] в чашках Петри и подсчетом выросших колоний по истечении времени инкубации.The number of representatives of the gastric microbiota (CFU) of bifidobacteria, lactobacilli and Escherichia isolated from animal feces was determined by sowing the corresponding tenfold dilutions of the studied suspensions on solid nutrient media of the recommended composition [VM Bondarenko, VG Likhoded. Methodical recommendations: microbiological diagnosis of intestinal dysbiosis. M .: GU NIIEM im. N.F. Gamalei RAMS, 2007; 70] in Petri dishes and counting the grown colonies after the incubation time.

Формирование хеликобактериоза у белых мышей осуществляли путем перорального введения конвенциональным белым мышам трех групп суспензий бактерий H.pylori КМ-11(RifR): животным первой группы на фоне перорального введения антибиотика Гентамицина в суточной дозе 2,4 мг (раствор для внутривенного и внутримышечного введения, 40 мг в 1 мл; производитель РУП «Белмедпрепараты», Республика Беларусь) [Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Ердякова А.С., Лундовских И.А., Погорельский И.П. Способ моделирования дисбактериоза кишечника у лабораторных животных. Патент №2477894 от 20.03.2013. Российская Федерация, опубл. 20.03.2013. бюл. №8. Номер охранного документа МПК G09B 23/28]; животным второй группы на фоне перорального введения ингибитора протонной помпы Омепразола в суточной дозе 52 мкг (производитель АО «Акрихин», Россия) [Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Шабалина М.Р., Колеватых Е.П. Изменения в кишечной микробиоте экспериментальных животных под воздейстаием ингибитора протонной помпы Омепразола. Инфекционные болезни. 2018; 16 (3): 60-68]; животным третьей группы на фоне иммунносупрессивного эффекта от внутримышечного введения Дексаметазона в суточной дозе 40 мкг (раствор для инъекций, 4 мг в 1 мл (производитель KRKA, Словения) [Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Горшков А.С., Шабалина М.Р., Смирнова Д.Н., Богачева Н.В. Экспериментальный хеликобактериоз у конвенциональных белых мышей при инфицировании возбудителем Helicobacter pylori. Инфекционные болезни. 2018; 16 (2): 77-85].The formation of helicobacteriosis in white mice was carried out by oral administration to conventional white mice of three groups of suspensions of bacteria H. pylori KM-11 (Rif R ): animals of the first group against the background of oral administration of the antibiotic Gentamicin in a daily dose of 2.4 mg (solution for intravenous and intramuscular administration , 40 mg in 1 ml; manufacturer RUE "Belmedpreparaty", Republic of Belarus) [Darmov I.V., Chicherin I.Yu., Erdyakova A.S., Lundovskikh I.A., Pogorelsky I.P. Method for modeling intestinal dysbiosis in laboratory animals. Patent No. 2477894 dated 03/20/2013. Russian Federation, publ. 03/20/2013. bul. No. 8. IPC number of title of protection G09B 23/28]; animals of the second group on the background of oral administration of the proton pump inhibitor Omeprazole in a daily dose of 52 μg (manufactured by JSC "Akrikhin", Russia) [Chicherin I.Yu., Pogorelsky I.P., Lundovskikh I.A., Shabalina M.R., E.P. Kolevatykh Changes in the intestinal microbiota of experimental animals under the influence of the proton pump inhibitor Omeprazole. Infectious diseases. 2018; 16 (3): 60-68]; animals of the third group against the background of the immunosuppressive effect of intramuscular injection of Dexamethasone in a daily dose of 40 mcg (solution for injection, 4 mg in 1 ml (manufacturer KRKA, Slovenia) [Chicherin I.Yu., Pogorelsky IP, Lundovskikh I.A. , Gorshkov A.S., Shabalina M.R., Smirnova D.N., Bogacheva N.V. Experimental helicobacteriosis in conventional white mice infected with the pathogen Helicobacter pylori. Infectious diseases. 2018; 16 (2): 77-85] ...

Количественный и качественный состав микрофлоры желудочно-кишечного тракта, а также состояние среды ее обитания, является одним из определяющих условий эффективности колонизационной резистентности (Lammers К.М., Brigidi P., Vitali В., Gionchetti P., Rizello F., Caramelli E., Matteuzzi D., Canepieri M. Immunomodulatori effects of probiotic bacteria DNA: IL-1 and IL-10 response in human peripheral blood mononuclear cells. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003; 38(2): 165-172; Veckman V., Miettinen M., Matikainen S., Lande P.,Giacomini E., Coccia E. M. Lactobacilli and streptococci induce inflammatory chemokine production in human macrophages that stimulates Th 1 cell chemotaxis. J. Leukociol. 2003;74(3): 395-402]. Представители нормальной микрофлоры кишечника - бифидобактерии, лактобациллы, эшерихии, пропионовые бактерии, лактококки и др. обладают высокими иммуногенными свойствами, проявляющимися прежде всего в поддержании концентрации секреторного IgA (sIgA) слизистой оболочке, регуляции созревания лимфоидного аппарата кишечника, генерализации иммунного ответа [Gill Н.С.Stimulation of the immune system by lactic culture. Int. Dairy J.1998; 8: 535-544.].The quantitative and qualitative composition of the microflora of the gastrointestinal tract, as well as the state of its habitat, is one of the determining conditions for the effectiveness of colonization resistance (Lammers K.M., Brigidi P., Vitali V., Gionchetti P., Rizello F., Caramelli E ., Matteuzzi D., Canepieri M. Immunomodulatori effects of probiotic bacteria DNA: IL-1 and IL-10 response in human peripheral blood mononuclear cells. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003; 38 (2): 165-172; Veckman V., Miettinen M., Matikainen S., Lande P., Giacomini E., Coccia EM Lactobacilli and streptococci induce inflammatory chemokine production in human macrophages that stimulates Th 1 cell chemotaxis. J. Leukociol. 2003; 74 (3): 395 -402]. Representatives of normal intestinal microflora - bifidobacteria, lactobacilli, escherichia, propionic bacteria, lactococci, etc. have high immunogenic properties, manifested primarily in maintaining the concentration of secretory IgA (sIgA) in the mucous membrane, regulation with maturation of the intestinal lymphoid apparatus, generalization of the immune response [Gill N.S. Stimulation of the immune system by lactic culture. Int. Dairy J. 1998; 8: 535-544.].

Таким образом, сохранив колонизационную резистентность слизистой оболочки желудка, обеспечив в данном биотопе бионесовместимость по типу «хозяин против патогена» [Глушанова Н.А., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro. Журн. микробиол. 2005; 2: 56-61.], можно купировать развитие острого хеликобактериоза на ранней стадии развития инфекционного процесса, предотвратив адгезию и колонизацию слизистой оболочки желудка бактериями Н. pylori.Thus, preserving the colonization resistance of the gastric mucosa, providing in this biotope bio-incompatibility of the "host against pathogen" type [Glushanova N.A., Shenderov B.A. The relationship of probiotic and indigenous lactobacilli of the host in conditions of co-cultivation in vitro. Journal. microbiol. 2005; 2: 56-61.], It is possible to arrest the development of acute helicobacteriosis at an early stage of the development of the infectious process, preventing the adhesion and colonization of the gastric mucosa by H. pylori bacteria.

Синтезируемые бактериями H.pylori КМ-11(RifR) экзометаболиты проявляют довольно высокую антимикробную активность в отношении желудочных бенефициаров (бифидобактерий, лактобацилл, эшерихий), которая прогнозируемо может проявиться как в организме экспериментальных животных, так и людей. Действительно, бактерии хеликобактера, обладая полным набором факторов агрессии, таких как факторы вирулентности и факторы колонизации [Шкитин В.А., Шпирна А.И., Старовойтов Г.Н. Роль Helicobacter pylori в патологии человека. Клин. микробиол. и антимикроб. химиотерапия. 2002;4(2): 128-145], уничтожают нормальную желудочную микробиоту и подавляют колонизационную резистентность как бы «прокладывают» себе путь, обеспечивая адгезию и колонизацию слизистой оболочки желудка [Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Дармов И.В., Лундовских И.А., Шабалина М.Р., Колеватых Е.П., Козлов П.А., Корнаухов А.С. Оценка эрадикационной эффективности метапребиотика Стимбифид плюс при остром экспериментальном хеликобактериозе у лабораторных животных и людей-добровольцев. Инфекционные болезни. 2018; 16(4):62-74].Exometabolites synthesized by the bacteria H. pylori KM-11 (Rif R ) exhibit a fairly high antimicrobial activity against gastric beneficiaries (bifidobacteria, lactobacilli, Escherichia), which can predictably manifest itself both in the body of experimental animals and humans. Indeed, Helicobacter bacteria, possessing a full set of factors of aggression, such as virulence factors and factors of colonization [Shkitin VA, Shpirna AI, Starovoitov GN. The role of Helicobacter pylori in human pathology. Wedge. microbiol. and antimicrobial. chemotherapy. 2002; 4 (2): 128-145], destroy normal gastric microbiota and suppress colonization resistance, as it were, "pave their way", providing adhesion and colonization of the gastric mucosa [Chicherin I.Yu., Pogorelsky I.P., Darmov I. V.V., Lundovskikh I.A., Shabalina M.R., Kolevatykh E.P., Kozlov P.A., Kornaukhov A.S. Evaluation of the eradication efficiency of the metaprebiotic Stimbifid plus in acute experimental helicobacteriosis in laboratory animals and human volunteers. Infectious diseases. 2018; 16 (4): 62-74].

Другие микроорганизмы, поступающие с пищей в желудок и увеличивающие численность микробиоты, не могут конкурировать с бактериями Н. pylori, поскольку для них создаются относительно неблагоприятные условия и где они подвергаются воздействию таких негативных факторов, как повышенная кислотность, протеолитические ферменты, довольно быстрая эвакуация содержимого желудка и других факторов, лимитирующих их рост и размножение. Моделируя с использованием соответствующих медикаментозных средств лимитирующие ситуации, ограничивающие рост и размножение желудочной микробиоты, можно установить факт их влияния как барьера на пути к адгезии и колонизации слизистой оболочки желудка бактериями H.pylori. Такими медикаментозными средствами являются антибиотик Гентамицин, ингибитор протонной помпы Омепразол и глюкокортикоид Дексаметазон [Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Горшков А.С., Шабалина М.Р., Смирнова Д.Н., Богачева Н.В. Экспериментальный хеликобактериоз у конвенциональных белых мышей при инфицировании возбудителем Helicobacter pylori. Инфекционные болезни. 2018; 16 (2): 77-85].Other microorganisms that enter the stomach with food and increase the number of microbiota cannot compete with H. pylori bacteria, since relatively unfavorable conditions are created for them and where they are exposed to such negative factors as high acidity, proteolytic enzymes, rather rapid evacuation of stomach contents and other factors limiting their growth and reproduction. Modeling limiting situations, limiting the growth and reproduction of gastric microbiota, using appropriate medications, it is possible to establish the fact of their influence as a barrier on the way to adhesion and colonization of the gastric mucosa by H. pylori bacteria. Such medications are the antibiotic Gentamicin, the proton pump inhibitor Omeprazole and the glucocorticoid Dexamethasone [Chicherin I.Yu., Pogorelsky I.P., Lundovskikh I.A., Gorshkov A.S., Shabalina M.R., Smirnova D.N. , Bogacheva N.V. Experimental helicobacteriosis in conventional white mice infected with the pathogen Helicobacter pylori. Infectious diseases. 2018; 16 (2): 77-85].

Судя по описанию фармакологического действия, приведенного в инструкции по медицинскому применению [Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Ердякова А.С., Лундовских И.А., Погорельский И.П. Способ моделирования дисбактериоза кишечника у лабораторных животных. Патент №2477894 от 20.03.2013. Российская Федерация, опубл. 20.03.2013. бюл. №8. Номер охранного документа МПК G09B 23/28; Инструкция по применению Гентамицина сульфата (Gentamicin sulfat). Производитель РУП «Белмедпрепараты», Республика Беларусь], антибиотик Гентамицин обладает способностью при пероральном введении угнетать жизнедеятельность микроорганизмов, вызывая микроэкологические нарушения в желудочно-кишечном тракте. Связано это с тем, что абсорбция антибиотика при приеме внутрь незначительная, он практически не всасывается в желудочно-кишечном тракте, оказывая при этом местное антибактериальное действие.Judging by the description of the pharmacological action given in the instructions for medical use [Darmov IV, Chicherin I.Yu., Erdyakova AS, Lundovskikh IA, Pogorelsky I.P. Method for modeling intestinal dysbiosis in laboratory animals. Patent No. 2477894 dated 03/20/2013. Russian Federation, publ. 03/20/2013. bul. No. 8. The number of the title of protection IPC G09B 23/28; Instructions for the use of Gentamicin sulfate. Producer RUE "Belmedpreparaty", Republic of Belarus], the antibiotic Gentamicin has the ability, when administered orally, to inhibit the vital activity of microorganisms, causing microecological disorders in the gastrointestinal tract. This is due to the fact that the absorption of the antibiotic when taken orally is insignificant, it is practically not absorbed in the gastrointestinal tract, while providing a local antibacterial effect.

Ожидаемые результаты изменения состава желудочной микробиоты в ответ на введение в организм подопытных животных: антибиотика Гентамицина - выраженные дисбиотические изменения в составе желудочной и кишечной микробиоты; ингибитора протонной помпы Омепразола -количественное снижение численности бенефициаров в содержимом желудка и кишечника, возрастание численности «заносной» микрофлоры; глюкокортикоида Дексаметазона - снижение/инактивация иммунного статуса слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, адгезия и размножение бактерий H.pylori на фоне обеднения естественной микробиоты.Expected results of changes in the composition of the gastric microbiota in response to the introduction into the body of experimental animals: antibiotic Gentamicin - pronounced dysbiotic changes in the composition of the gastric and intestinal microbiota; proton pump inhibitor Omeprazole - a quantitative decrease in the number of beneficiaries in the contents of the stomach and intestines, an increase in the number of "imported" microflora; glucocorticoid Dexamethasone - decrease / inactivation of the immune status of the mucous membrane of the gastrointestinal tract, adhesion and reproduction of H. pylori bacteria against the background of depletion of the natural microbiota.

Указанные выше лекарственные препараты в соответствующих дозах вводили трем группам конвенциональных белых мышей (по 10 животных в каждой группе): животным первой и второй групп вводили перорально в течение 4 дней, соответственно, антибиотик Гентамицин (2,4 мг) и ингибитор протонной помпы Омепразол (52 мкг), а животным третьей группы -внутримышечно Дексаметазон (40 мкг).The above drugs in appropriate doses were administered to three groups of conventional white mice (10 animals in each group): the animals of the first and second groups were injected orally for 4 days, respectively, the antibiotic Gentamicin (2.4 mg) and the proton pump inhibitor Omeprazole ( 52 μg), and for the animals of the third group - intramuscularly Dexamethasone (40 μg).

На пятые сутки эксперимента животным трех групп однократно перорально вводили суспензию бактерий H.pylori КМ-11(RifR), содержащую 2×107 живых микробных клеток (в таблицах с результатами определений день введения животным суспензии хеликобактера отмечен символом 5*). В течение последующих дней за животными наблюдали, отбирали биоматериал для бактериологического изучения.On the fifth day of the experiment, the animals of the three groups were once orally injected with a suspension of bacteria H. pylori KM-11 (Rif R ), containing 2 × 10 7 living microbial cells (in the tables with the results of determinations, the day of administration of the suspension of Helicobacter to the animals is marked with the symbol 5 *). Over the next days, the animals were observed, and biomaterials were taken for bacteriological study.

Непосредственно в день инфицирования бактериями H.pylori КМ-11(RifR) у животных отбирали фекалии для определения численности бифидобактерий, лактобацилл и эшерихий. Установлено, что у животных первой группы в фекалиях практически отсутствовали указанные выше бактерии, не были выявлены и микроорганизмы заносной микрофлоры; у животных второй группы выявлено снижение в фекалиях численности лактобацилл и эшерихий при полном отсутствии бифидобактерий, но были выявлены кандиды, клебсиеллы и синегнойная палочка; у животных третьей группы в фекалиях присутствовали все три бенефициара кишечной микробиоты, но в сниженном количестве.Immediately on the day of infection with H. pylori KM-11 (Rif R ) bacteria, feces were collected from the animals to determine the number of bifidobacteria, lactobacilli and Escherichia. It was found that in the animals of the first group, the above bacteria were practically absent in the feces, and microorganisms of the introduced microflora were not detected; in the animals of the second group, a decrease in the number of lactobacilli and Escherichia in the feces was revealed in the complete absence of bifidobacteria, but candida, Klebsiella and Pseudomonas aeruginosa were detected; in animals of the third group, all three beneficiaries of the intestinal microbiota were present in feces, but in a reduced amount.

Также в день инфицирования животных трех групп бактериями H.pylori КМ-11(RifR) была определена численность бенефициаров в содержимом желудка: у животных первой группы при пероральном введении гентамицина: бифидобактерии (1,6±0,6)×102 КОЕмл-1, лактобациллы (1,9±0,5)×102 КОЕ⋅мл-1, эшерихии - единичные клетки; у животных второй группы на фоне перорального введения Омепразола бифидобактерии (2,8±0,5)×104 КОЕ⋅мл-1, лактобациллы (2,7±0,5)×105 КОЕ⋅мл-1, эшерихии (1,9±0,5)×103 КОЕ⋅мл-1, заносная микрофлора (1,6±0,7)×104 КОЕ⋅мл-1; у животных третьей группы на фоне иммунносупрессивного эффекта от внутримышечного введения Дексаметазона бифидобактерии (1,1±0,7)×104 КОЕ⋅мл-1, лактобациллы (1,2±0,7)×105 КОЕ-мл-1, эшерихии (1,3±0,6)×103 КОЕ⋅мл-1, заносная микрофлора (3,6±0,6)×104 КОЕ⋅мл-1. Результаты выполненных экспериментов по определению количества бактерий H.pylori КМ-11(RifR) в фекалиях и гомогенатах желудков конвенциональных белых мышей представлены в таблицах 1-3.Also, on the day of infection of animals of three groups with H. pylori KM-11 (Rif R ) bacteria, the number of beneficiaries in the stomach contents was determined: in animals of the first group with oral administration of gentamicin: bifidobacteria (1.6 ± 0.6) × 10 2 CFU ml - 1 , lactobacilli (1.9 ± 0.5) × 10 2 CFU⋅ml -1 , Escherichia - single cells; in animals of the second group against the background of oral administration of Omeprazole, bifidobacteria (2.8 ± 0.5) × 10 4 CFU⋅ml -1 , lactobacilli (2.7 ± 0.5) × 10 5 CFU⋅ml -1 , Escherichia (1 , 9 ± 0.5) × 10 3 CFU⋅ml -1 , alien microflora (1.6 ± 0.7) × 10 4 CFU⋅ml -1 ; in animals of the third group against the background of the immunosuppressive effect from the intramuscular injection of Dexamethasone bifidobacteria (1.1 ± 0.7) × 10 4 CFU⋅ml -1 , lactobacilli (1.2 ± 0.7) × 10 5 CFU-ml -1 , Escherichia (1.3 ± 0.6) × 10 3 CFU⋅ml -1 , alien microflora (3.6 ± 0.6) × 10 4 CFU⋅ml -1 . The results of the experiments performed to determine the number of H. pylori KM-11 (Rif R ) bacteria in the feces and stomach homogenates of conventional white mice are presented in Tables 1-3.

Представленные в таблицах 1-3 результаты однозначно свидетельствуют о том, что каждый из трех взятых в эксперименты лечебных препаратов в той или иной степени содействует экспансии бактерий H.pylori КМ-11(RifR) путем реализации богатого потенциала агрессии возбудителя, сказавшегося, в частности, на депривации (т.е. упрощении, нарушении) микроэкологического биоценоза и на колонизационной резистентности слизистой оболочки желудка подопытных животных. В наиболее манифестной форме это проявилось у животных первой группы, которым перорально вводили суспензию бактерий H.pylori КМ-11(RifR) на фоне перорального введения антибиотика Гентамицина. Данный антибиотик практически не всасывается в желудочно-кишечном тракте и поэтому оказывает местное антибактериальное действие, угнетая жизнедеятельность микроорганизмов. Действительно, у животных первой группы выявлены выраженные дисбиотические изменения в составе желудочной микробиоты: численность бифидобактерий уменьшилась в 287 раз, лактобацилл - в 2052 раза, эшерихии - исчезли практически полностью (в фекалиях бактериологическим методом выявлялись единичные микробные клетки). Создавшийся медикаментозный дисбиоз желудочной микробиоты не препятствовал даже после однократного перорального поступления бактерий H.pylori КМ-11(RifR) в желудок животных их адгезии на эпителиоцитах слизистой оболочки и возможности «продержаться» в таком адгезированном состоянии в течение 10 суток. Согласно опубликованным данным [Шкитин В.А., Шпирна А.И., Старовойтов Г.Н. Роль Helicobacter pylori в патологии человека. Клин. микробиол. и антимикроб. химиотерапия. 2002; 4(2): 128-145; Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Горшков А.С., Шабалина М.Р., Смирнова Д.Н., Богачева Н.В. Экспериментальный хеликобактериоз у конвенциональных белых мышей при инфицировании возбудителем Helicobacter pylori. Инфекционные болезни. 2018; 16 (2): 77-85], на эпителиоцитах адгезируются всего 10-13% бактерий хеликобактера из числа поступивших в желудок, но даже этого количества хватает, чтобы в условиях снижения численности микробиоты и значительной утраты колонизационной резистентности произошло «приживление» возбудителя и его размножение, что было зафиксировано бактериологическим методом при исследовании гомогенатов желудков и фекалий подопытных животных.The results presented in Tables 1-3 clearly indicate that each of the three medicinal preparations taken in the experiments, to one degree or another, promotes the expansion of H. pylori KM-11 (Rif R ) bacteria by realizing the rich potential of aggression of the pathogen, which, in particular, , on deprivation (i.e., simplification, violation) of microecological biocenosis and on the colonization resistance of the gastric mucosa of experimental animals. In the most manifest form, this was manifested in animals of the first group, which were orally administered a suspension of the bacteria H. pylori KM-11 (Rif R ) against the background of oral administration of the antibiotic Gentamicin. This antibiotic is practically not absorbed in the gastrointestinal tract and therefore has a local antibacterial effect, inhibiting the vital activity of microorganisms. Indeed, in animals of the first group, pronounced dysbiotic changes in the composition of the gastric microbiota were revealed: the number of bifidobacteria decreased by 287 times, lactobacilli - by 2052 times, Escherichia - disappeared almost completely (single microbial cells were detected in feces by the bacteriological method). The resulting drug dysbiosis of the gastric microbiota did not prevent, even after a single oral intake of H. pylori KM-11 (Rif R ) bacteria in the stomach of animals, their adhesion to the epithelial cells of the mucous membrane and the ability to "hold out" in such an adhered state for 10 days. According to the published data [V. A. Shkitin, A. Shpirna, G. Starovoitov. The role of Helicobacter pylori in human pathology. Wedge. microbiol. and antimicrobial. chemotherapy. 2002; 4 (2): 128-145; Chicherin I.Yu., Pogorelsky I.P., Lundovskikh I.A., Gorshkov A.S., Shabalina M.R., Smirnova D.N., Bogacheva N.V. Experimental helicobacteriosis in conventional white mice infected with the pathogen Helicobacter pylori. Infectious diseases. 2018; 16 (2): 77-85], only 10-13% of Helicobacter bacteria from the number that entered the stomach adhere to epithelial cells, but even this amount is enough for a decrease in the number of microbiota and a significant loss of colonization resistance to “engraft” the pathogen and its reproduction, which was recorded by the bacteriological method in the study of homogenates of stomachs and feces of experimental animals.

В то же время следует отметить, что прекращение поступления в желудок антибиотика Гентамицина позволило на 8 сутки после однократного перорального введения бактерий H.pylori КМ-11 (RifR) начаться процессу самовосстановления микробиоты и колонизационной резистентности слизистой оболочки желудка. Важно также и то, что очищение желудка и кишечника подопытных животных от бактерий хеликобактера шло параллельно, хотя более ускоренными темпами этот процесс происходил именно в желудке, где после отмены введения антибиотика Гентамицина начала восстанавливаться микробиота и активизироваться колонизационная резистентность, в частности за счет сохранения локального иммунного статуса слизистой оболочки желудка, на который вводимый в желудок антибиотик не влиял. В итоге на 10 сутки после однократного введения в желудок бактерии H.pylori КМ-11(RifR) и отсутствия антибактериального и дисбиотического эффекта антибиотика Гентамицина желудок и кишечник подопытных животных были полностью освобождены от инфекционного патогена.At the same time, it should be noted that the cessation of the intake of the antibiotic Gentamicin into the stomach allowed on the 8th day after a single oral administration of the bacteria H. pylori KM-11 (Rif R ) to begin the process of self-healing of the microbiota and colonization resistance of the gastric mucosa. It is also important that the cleansing of the stomach and intestines of the experimental animals from Helicobacter bacteria proceeded in parallel, although this process took place at a more accelerated rate in the stomach, where, after the cancellation of the administration of the antibiotic Gentamicin, the microbiota began to be restored and colonization resistance was activated, in particular due to the preservation of the local immune the status of the gastric mucosa, which was not affected by the antibiotic administered to the stomach. As a result, on the 10th day after a single injection into the stomach of the bacteria H. pylori KM-11 (Rif R ) and the absence of the antibacterial and dysbiotic effect of the antibiotic Gentamicin, the stomach and intestines of the experimental animals were completely freed from the infectious pathogen.

Механизм действия ингибитора протонной помпы Омепразола в корне отличается от такового антибиотика Гентамицина: нет выраженного непосредственного воздействия (местного антибактериального действия, угнетения жизнедеятельности микроорганизмов) на микроорганизмы желудочной микробиоты. В то же время нельзя сбрасывать со счетов имеющихся данных [Инструкция по медицинскому применению лекарственного препарата Омепразол-Акрихин. Производитель АО «Арихин», Россия], свидетельствующих о выраженных изменениях в составе желудочной микробиоты и появлении заносной микробиоты [Поздеев O.K. Медицинская микробиология /Под ред. В.И. Покровского. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001;768], что сопровождается ухудшением общего состояния животных, неопрятностью внешнего вида, гиподинамией, тремором конечностей. Кроме того, в Инструкции по медицинскому применению ингибитора протонной помпы Омепразола [Инструкция по медицинскому применению лекарственного препарата Омепразол-Акрихин. Производитель АО «Арихин», Россия] прямо указывается на побочные расстройства в организме в процессе его применения, в том числе на развитие кандидоза желудочно-кишечного тракта.The mechanism of action of the proton pump inhibitor Omeprazole is fundamentally different from that of the antibiotic Gentamicin: there is no pronounced direct effect (local antibacterial action, inhibition of the vital activity of microorganisms) on the microorganisms of the gastric microbiota. At the same time, one cannot discount the existing data [Instructions for the medical use of the drug Omeprazole-Akrikhin. Producer of JSC "Arikhin", Russia], indicating pronounced changes in the composition of the gastric microbiota and the emergence of an alien microbiota [Pozdeev O.K. Medical Microbiology / Ed. IN AND. Pokrovsky. M .: GEOTAR-MED, 2001; 768], which is accompanied by a deterioration in the general condition of animals, untidiness of appearance, hypodynamia, tremor of the extremities. In addition, in the Instructions for the medical use of the proton pump inhibitor Omeprazole [Instructions for the medical use of the drug Omeprazole-Akrikhin. Manufacturer JSC "Arikhin", Russia] directly indicates side disorders in the body during its use, including the development of candidiasis of the gastrointestinal tract.

Установлено (см. таблица 3) небольшое, но явное снижение под влиянием ингибитора протонной помпы Омепразола желудочных бенефициаров: бифидобактерий - в 1,6 раза, лактобацилл - в 1,4 раза и эшерихий в 2,4 раза и появление заносной микробиоты, достигающей значения (1,6±0,7)×104 КОЕ×мл-1. Полученные данные свидетельствуют о том, что в данном случае мы имеем дело с разбалансировкой микробиоты желудка. Однако в отличие от классического дисбиоза желудочной микробиоты, при котором отмечается абсолютное уменьшение численности нормобиоты, бактериологическим методом в настоящем эксперименте фиксируется относительное снижение ее численности при уверенном размножении заносной микробиоты. И если на фоне перорального введения животным антибиотика Гентамицина бактерии хеликобактера удерживались в их желудке в течение 10 суток, то при аналогичном способе введения ингибитора протонной помпы Омепразола только 5 суток. Это свидетельствует о довольно высокой скорости самовосстановления общего количества представителей желудочной микробиоты после прекращения перорального введения Омепразола, что соответствует полученным нами ранее результатам [Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Шабалина М.Р., Колеватых Е.П. Изменения в кишечной микробиоте экспериментальных животных под воздейстаием ингибитора протонной помпы Омепразола. Инфекционные болезни. 2018; 16 (3): 60-68]. Акцентируя внимание на самовосстановлении желудочной нормобиоты после прекращения перорального введения животным ингибитора протонной помпы Омепразола и восстановления кислотно-протеолитического барьера желудка, можно с большой долей вероятности считать, что оба эти события стали действительным началом самовосстановления микробиоценоза желудка, чему в значительной мере содействовали сохранившаяся в достаточной степени колонизационная резистентность желудка и эффективная моторно-эвакуационная функция кишечника.It was established (see table 3) a small, but obvious decrease under the influence of the proton pump inhibitor Omeprazole of gastric beneficiaries: bifidobacteria - 1.6 times, lactobacilli - 1.4 times and Escherichia - 2.4 times and the appearance of an alien microbiota, reaching a value (1.6 ± 0.7) × 10 4 CFU × ml -1 . The data obtained indicate that in this case we are dealing with an imbalance in the microbiota of the stomach. However, in contrast to the classical dysbiosis of the gastric microbiota, in which there is an absolute decrease in the number of normobiota, the bacteriological method in this experiment records a relative decrease in its number with a confident reproduction of the invasive microbiota. And if against the background of oral administration of the antibiotic Gentamicin to animals, Helicobacter bacteria were retained in their stomach for 10 days, then with a similar method of administration of the proton pump inhibitor Omeprazole only 5 days. This indicates a fairly high rate of self-healing of the total number of representatives of the gastric microbiota after the termination of oral administration of Omeprazole, which corresponds to our earlier results [Chicherin I.Yu., Pogorelsky I.P., Lundovskikh I.A., Shabalina M.R., Kolevatykh E.P. Changes in the intestinal microbiota of experimental animals under the influence of the proton pump inhibitor Omeprazole. Infectious diseases. 2018; 16 (3): 60-68]. Focusing on the self-healing of the gastric normobiota after the cessation of oral administration of the proton pump inhibitor Omeprazole to animals and the restoration of the acid-proteolytic barrier of the stomach, we can most likely assume that both of these events were the actual beginning of self-healing of the gastric microbiocenosis, which was largely facilitated by the sufficiently preserved colonization resistance of the stomach and effective motor-evacuation function of the intestine.

Figure 00000001
Figure 00000001

Figure 00000002
Figure 00000002

Figure 00000003
Figure 00000003

Claims (2)

1. Способ исследования желудочной и кишечной микробиоты при подавлении колонизационной резистентности слизистой оболочки желудка экспериментальных животных, включающий селективное воздействие на желудочную микробиоту антибактериального препарата гентамицина сульфата, содержащего 40 мг антибиотика в 1 мл и разведенного изотоническим раствором хлорида натрия до концентрации 24 мг в 1 мл, путем его перорального введения конвенциональным белым мышам однократно в сутки в течение 5 дней в дозе 2,4 мг на одну мышь, причем пероральное введение гентамицина сопровождается одновременным в течение 8 суток ежедневным отбором фекалий для определения представителей желудочной и кишечной микробиоты, выводимых из организма белых мышей, путем высева фекалий на плотную питательную среду в чашках Петри, которые инкубируют в микроаэрофильных условиях при температуре 37°С в течение 24 ч, затем обрабатывают полученные результаты высева фекалий, основываясь на количестве выросших колоний бактерий, и выносят суждение о численности и убыли нормобиоты желудочно-кишечного тракта.1. A method for the study of gastric and intestinal microbiota in the suppression of the colonization resistance of the gastric mucosa of experimental animals, including the selective effect on the gastric microbiota of the antibacterial preparation gentamicin sulfate containing 40 mg of antibiotic in 1 ml and diluted with isotonic sodium chloride solution to a concentration of 24 mg in 1 ml, by its oral administration to conventional white mice once a day for 5 days at a dose of 2.4 mg per mouse, and oral administration of gentamicin is accompanied by a simultaneous daily collection of feces for 8 days to determine the representatives of the gastric and intestinal microbiota removed from the body of white mice , by sowing feces on a solid nutrient medium in Petri dishes, which are incubated under microaerophilic conditions at a temperature of 37 ° C for 24 hours, then the obtained results of seeding feces are processed, based on the number of grown bacterial colonies, and removed from determination of the number and decrease in the normobiota of the gastrointestinal tract. 2. Способ подавления колонизационной резистентности по п. 1, отличающийся тем, что начало выполнения дальнейшего цикла исследований на фоне искусственно созданной в желудке белых мышей микроэкологической и микробиологической среды проводят не ранее чем через 3 суток после прекращения перорального введения антибактериального препарата гентамицина, с учетом полученных результатов высева фекалий животных и подсчета выросших на питательной среде колоний бактерий, свидетельствующих об убыли нормобиоты желудочно-кишечного тракта.2. A method for suppressing colonization resistance according to claim 1, characterized in that the beginning of a further cycle of studies against the background of a microecological and microbiological environment artificially created in the stomach of white mice is carried out no earlier than 3 days after the termination of oral administration of the antibacterial preparation gentamicin, taking into account the obtained the results of sowing animal feces and counting bacteria colonies grown on the nutrient medium, indicating a decrease in the normobiota of the gastrointestinal tract.
RU2019145621A 2019-12-30 2019-12-30 Method of study of gastric and intestinal microbiota during suppression of colonization resistance of gastric mucosa of experimental animals RU2745654C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019145621A RU2745654C1 (en) 2019-12-30 2019-12-30 Method of study of gastric and intestinal microbiota during suppression of colonization resistance of gastric mucosa of experimental animals

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019145621A RU2745654C1 (en) 2019-12-30 2019-12-30 Method of study of gastric and intestinal microbiota during suppression of colonization resistance of gastric mucosa of experimental animals

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2745654C1 true RU2745654C1 (en) 2021-03-30

Family

ID=75353308

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019145621A RU2745654C1 (en) 2019-12-30 2019-12-30 Method of study of gastric and intestinal microbiota during suppression of colonization resistance of gastric mucosa of experimental animals

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2745654C1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2773094C1 (en) * 2021-09-18 2022-05-30 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Донской государственный технический университет" (ДГТУ) Method for modeling chicken microbiota in an artificial caecum
CN114621910A (en) * 2022-01-27 2022-06-14 华南理工大学 High-flux bacteria adhesion model based on mouse intestinal tissue and construction method and application thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2175673C1 (en) * 2000-03-07 2001-11-10 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УО РАН Method of determining colonization resistance of human body ecologic niche
RU2381504C1 (en) * 2008-07-29 2010-02-10 Федеральное государственное учреждение науки Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора РФ Method of estimating condition colonisation resistance of human biotope microbiocenosis (versions)
RU2477894C1 (en) * 2011-12-05 2013-03-20 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ВЯТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" (ФГБОУ ВПО "ВятГУ" Method for simulating intestinal dysbacteriosis in laboratory animals

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2175673C1 (en) * 2000-03-07 2001-11-10 Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УО РАН Method of determining colonization resistance of human body ecologic niche
RU2381504C1 (en) * 2008-07-29 2010-02-10 Федеральное государственное учреждение науки Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора РФ Method of estimating condition colonisation resistance of human biotope microbiocenosis (versions)
RU2477894C1 (en) * 2011-12-05 2013-03-20 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "ВЯТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ" (ФГБОУ ВПО "ВятГУ" Method for simulating intestinal dysbacteriosis in laboratory animals

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHAO H. et al. Gut microbiota characteristics in mice with antibiotic-associated diarrhea. BMC Microbiol. 2020, 20(1):313, doi: 10.1186/s12866-020-01999-x. *
АГЕЙЧЕНКО А.В. Состояние микробиоценоза толстого кишечника, липидного состава клеточных мембран и антиоксидантного статуса животных при экспериментальном дисбиозе. Диссер. Курск 2016, стр.1-115. *
АГЕЙЧЕНКО А.В. Состояние микробиоценоза толстого кишечника, липидного состава клеточных мембран и антиоксидантного статуса животных при экспериментальном дисбиозе. Диссер. Курск 2016, стр.1-115. ДОБРЫНЯ Ю.М. Экспериментальная оценка морфофункциональных показателей организма крыс и пребиотического действия при применении биологически активной субстанции на основе Medusomyces gisevii. Диссер. Ставрополь 2019, стр.1-149. СЛАЩОВА Ю.А. Состояние микробиоценоза толстой кишки при экспериментальном дисбиозе и его коррекции. Диссер. Курск 2017, стр.1-125. ГОЛОШОВА Е.В. Изменение колонизационной резистентности кишечника при дисбактериозах, обусловленных антибиотиками широкого спектра действия. Автореф диссер. Ростов-на-Дону 2005, стр.1-24. SHAO H. et al. Gut microbiota characteristics in mice with antibiotic-associated diarrhea. BMC Microbiol. 2020, 20(1):313, doi: 10.1186/s12866-020-01999-x. *
ГОЛОШОВА Е.В. Изменение колонизационной резистентности кишечника при дисбактериозах, обусловленных антибиотиками широкого спектра действия. Автореф диссер. Ростов-на-Дону 2005, стр.1-24. *
ДОБРЫНЯ Ю.М. Экспериментальная оценка морфофункциональных показателей организма крыс и пребиотического действия при применении биологически активной субстанции на основе Medusomyces gisevii. Диссер. Ставрополь 2019, стр.1-149. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2773094C1 (en) * 2021-09-18 2022-05-30 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Донской государственный технический университет" (ДГТУ) Method for modeling chicken microbiota in an artificial caecum
CN114621910A (en) * 2022-01-27 2022-06-14 华南理工大学 High-flux bacteria adhesion model based on mouse intestinal tissue and construction method and application thereof

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6954563B2 (en) Use of pasteurized Akkermansia to treat metabolic disorders
JP6426264B2 (en) Compositions comprising bacterial strains
US8092793B2 (en) Treating inflammatory bowel disease with live bacteria
Zwolinska-Wcislo et al. Effect of Candida colonization on human ulcerative colitis and the healing of inflammatory changes of the colon in the experimental model of colitis ulcerosa
Letkiewicz et al. Eradication of Enterococcus faecalis by phage therapy in chronic bacterial prostatitis—case report
KR20190005846A (en) Methods and compositions for preventing infection by Vibrio species
CN113234640B (en) Bifidobacterium longum MF-269 and application thereof
Javed et al. Oral feeding of probiotic Bifidobacterium infantis: colonic morphological changes in rat model of TNBS-induced colitis
RU2410100C2 (en) Pharmaceutical composition of proton pump inhibitor and prebiotic for treating gastric and duodenal ulcers
CN102091099A (en) Application of bacillus coagulans in preparing medicine for treating inflammatory bowel disease
Giordano et al. Erythema nodosum associated with Staphylococcus xylosus septicemia
RU2460778C1 (en) Method for producing autoprobiotic of enterocuccus faecium being representative of indigenic host intestinal microflora
CN114990014A (en) Lactobacillus plantarum for preventing and treating inflammatory enteritis and application thereof
CN101138573A (en) Application of clostridium butyricum and condensate bacillus in the preparation of medicament for treating inflammatory bowel disease
Smith Equine salmonellosis: a contemporary view
RU2745654C1 (en) Method of study of gastric and intestinal microbiota during suppression of colonization resistance of gastric mucosa of experimental animals
RU2553372C1 (en) Method of prevention post-infectious irritable bowel syndrome
Ghasemi-Niri et al. On the benefit of whey-cultured Lactobacillus casei in murine colitis
US11090357B2 (en) Bioengineered lactobacillus probiotics and the uses thereof
Koh et al. Bacterial translocation, microcirculation injury and sepsis
Stef et al. Virulence characteristics of five new Campylobacter jejuni chicken isolates
JP2021528475A (en) Methods for Preparing Compositions Containing Dead or Inactivated Methanobrevibacter Archaebacteria Cells and Compositions Obtained By It
JP2006180836A (en) Lactic acid bacterium controlling infection with food poisoning bacterium, fermentation product, food and medicine composition containing the same
JP6005041B2 (en) Use of soy fermentation extract for the production of prebiotic compositions
Luo et al. Bacterial translocation of coagulase-negative staphylococci in rats following intestinal ischemia-reperfusion injury