RU2745558C2

RU2745558C2 - Method of producing recombinant capsid protein of hepatitis e virus

Info

Publication number: RU2745558C2
Application number: RU2016151437A
Authority: RU
Inventors: Алексей Михайлович Чумаков; Михаил Иванович Михайлов; Карен Каренович Кюрегян; Ольга Владиславовна Исаева; Айдар Айратович Ишмухаметов
Priority date: 2016-12-27
Filing date: 2016-12-27
Publication date: 2021-03-29
Also published as: RU2016151437A; RU2016151437A3

Abstract

FIELD: biotechnology; genetic engineering.

SUBSTANCE: method of producing recombinant capsid protein of hepatitis E virus (PORF2) and a recombinant vaccine for preventing viral hepatitis E. Capsid protein is obtained by culturing a recombinant Escherichia coli BL21 (DE3)/PORF2 strain containing a synthetic DNA sequence integrated into an expression vector, optimized for expression in bacterial systems and coding amino acid sequence fragment 121 to 671 of position of capsid protein of hepatitis E virus of genotype 3 (PORF2), substitute carrier in amino acid sequence, specific for VGE strains circulating in RF territory (L284P, S324T, Y354H, S357G, I364V, G490N, V492M, S497T, T517S, S527T, F537Y, V571I) under control of hybrid promoter and regulatory sequences of T7 RNA polymerase in self-induction conditions with alpha-lactose. Based on the obtained antigen, a recombinant vaccine for preventing viral hepatitis E is created. Vaccine contains an effective amount of PORF2 protein, an adjuvant and a physiologically acceptable diluent.

EFFECT: method enables to obtain immunogenic hepatitis E virus antigen possessing natural protein properties.

2 cl, 5 ex, 2 dwg

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а именно генной инженерии. Предложен способ получения рекомбинантного капсидного белка вируса гепатита Е. Капсидный белок получают методом автоиндуцируемой экспрессии в клетках E. coli для получения белка, сохраняющего свои антигенные свойства и способность к самосборке в вирусоподобные частицы. Для получения бактериальных штаммов-продуцентов модифицированного капсидного белка ВГЕ использована стратегия создания искусственного гена этого белка, оптимизированного для экспрессии и сворачивания (фолдинга) в клетках E. coli. Способ позволяет получить иммуногенный антиген вируса гепатита Е, обладающий свойствами природного белка.The invention relates to biotechnology, namely genetic engineering. A method for producing a recombinant capsid protein of the hepatitis E virus is proposed. The capsid protein is obtained by the method of autoinduced expression in E. coli cells to obtain a protein that retains its antigenic properties and the ability to self-assemble into virus-like particles. To obtain bacterial strains producing modified HEV capsid protein, a strategy was used to create an artificial gene for this protein, optimized for expression and folding (folding) in E. coli cells. The method allows to obtain an immunogenic antigen of the hepatitis E virus, which has the properties of a natural protein.

Вирус гепатита Е относится к семейству Hepeviridae рода Hepevirus. Частицы вируса представляют собой сферические образования диаметром 27-34 нм, построенные из идентичных структурных элементов, и лишенные наружной оболочки. Вирусные частицы реагируют с антителами сыворотки инфицированных индивидуумов из географически различных регионов, что говорит о повсеместной распространенности HEV. Серологически и молекулярно-генетически HEV отличается от других вирусов гепатита. Последовательность генома HEV впервые была определена в 1991 г. (Tam A.W. et al., 1991 Virology, 185, 120-131). Геном вируса гепатита Е представлен одноцепочечной РНК позитивной полярности. Анализ последовательности генома показал, что его размер 7.2 kb, и он содержит 3 открытые рамки считывания (ORF), каждая из которых кодирует синтез определенного белка или группы белков. ORF1 кодирует неструктурные белки вируса, ответственные за репликацию вируса, ORF2 кодирует структурный белок капсида вируса (ORF2-белок), ORF3 кодирует вспомогательный белок, функция которого еще не определена. С помощью картирования установлено, что линейные антигенные эпитопы локализованы в полипептидах, кодируемых ORF2 и ORF3 (Khydyakov Y.E. et al., Virology 1993, 194, 89-96). Рекомбинантный белок ORF2 способен к самосборке в вирусоподобные частицы (VLP), подобные по антигенным свойствам капсидному белку инфекционного вируса.The hepatitis E virus belongs to the Hepeviridae family of the genus Hepevirus. Virus particles are spherical formations with a diameter of 27-34 nm, built from identical structural elements, and devoid of an outer shell. Viral particles react with antibodies in the serum of infected individuals from geographically different regions, suggesting that HEV is ubiquitous. Serologically and genetically, HEV is different from other hepatitis viruses. The HEV genome was first sequenced in 1991 (Tam A.W. et al., 1991 Virology, 185, 120-131). The genome of the hepatitis E virus is represented by single-stranded RNA of positive polarity. Analysis of the genome sequence showed that its size is 7.2 kb, and it contains 3 open reading frames (ORF), each of which encodes the synthesis of a specific protein or group of proteins. ORF1 encodes non-structural proteins of the virus responsible for viral replication, ORF2 encodes the structural protein of the viral capsid (ORF2 protein), ORF3 encodes an auxiliary protein, the function of which has not yet been determined. By mapping, it was found that linear antigenic epitopes are localized in the polypeptides encoded by ORF2 and ORF3 (Khydyakov Y.E. et al., Virology 1993, 194, 89-96). The recombinant ORF2 protein is capable of self-assembly into virus-like particles (VLP), similar in antigenic properties to the capsid protein of an infectious virus.

Филогенетический анализ, базирующийся на полной длине последовательности генома некоторых изолятов HEV, указывает на существование 4 различных генотипов, каждый из которых доминирует в определенной географической области. Генотип 1 включает штаммы из Азии и Африки, генотип 2 - мексиканский штамм и несколько вариантов из Африки, генотипы 3 и 4 включают HEV штаммы человека и свиньи из индустриальных стран и Азии. Генотипы 1 и 2 обнаружены только у человека, тогда как генотипы 3 и 4 у человека, а также свиней и других животных. Генотип 3 распространен повсеместно, генотип 4 чаще встречается в Китае и Японии. Открытие вирусов, подобных HEV, у свиней (свиной HEV) и кур (птичий HEV) предполагает, что вирус относится к зоонозу. Несмотря на существование различных генотипов, идентифицирован один серотип HEV. Все субтипы вируса имеют основные перекрестно реагирующие эпитопы, позволяющие создать рекомбинантную вакцину, основанную на капсидном белке, эффективную против многих штаммов HEV.Phylogenetic analysis based on the full length of the genome sequence of some HEV isolates indicates the existence of 4 different genotypes, each dominant in a particular geographic area. Genotype 1 includes strains from Asia and Africa, genotype 2 is a Mexican strain and several variants from Africa, genotypes 3 and 4 include HEV human and pig strains from industrialized countries and Asia. Genotypes 1 and 2 are found only in humans, while genotypes 3 and 4 are found in humans, as well as pigs and other animals. Genotype 3 is ubiquitous, while genotype 4 is more common in China and Japan. The discovery of viruses like HEV in pigs (porcine HEV) and chickens (avian HEV) suggests that the virus is zoonotic. Despite the existence of different genotypes, one HEV serotype has been identified. All subtypes of the virus have major cross-reacting epitopes allowing the design of a recombinant capsid protein vaccine effective against many strains of HEV.

При проведении патентно-информационного поиска были выявлены следующие источники патентной информации:During the patent information search, the following sources of patent information were identified:

Международная заявка WO 2001/46696, приоритет 21.12.1999, заявитель ABBOTT LABORATORIES, США. Документ описывает способы и композиции для обнаружения присутствия в образце US-типа или US-подтипа вируса гепатита Е, включая встречающиеся в природе варианты. В частности, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующие геному US-типа или US-подтипа вируса гепатита Е, аминокислотных последовательностей, в том числе эпитопа последовательностей, кодируемого геном таких вирусов, и антител, которые специфически связываются с такими аминокислотными последовательности. Недостатком для данного технического решения является специфичность белковой последовательности, характерная только для США, и небольшая растворимость полученного белка в водной среде.International application WO 2001/46696, priority 21.12.1999, applicant ABBOTT LABORATORIES, USA. The document describes methods and compositions for detecting the presence of a US-type or US-subtype of hepatitis E virus in a sample, including naturally occurring variants. In particular, the present invention relates to nucleic acid sequences corresponding to the genome of the US-type or US-subtype of hepatitis E virus, amino acid sequences, including the epitope of the sequences encoded by the gene of such viruses, and antibodies that specifically bind to such amino acid sequences. The disadvantage of this technical solution is the specificity of the protein sequence, which is characteristic only for the United States, and the low solubility of the obtained protein in an aqueous medium.

В научной и патентной литературе представлены примеры использования для получения рекомбинантных белков HEV бактериальной системы экспрессии на основе E. coli. Так, известно получение рекомбинантного химерного белка trpE-С2, содержащего 439 С-концевых аминокислот ORF2-белка HEV генотипа 1, слитого с N-концевой областью триптофансинтетазы, в бактериальной системе экспрессии в E. coli (Kamili S., Virus Research 2011, 161(1): 93-100). Экспрессируемый в E. coli белок обладает высокой иммунореактивностью и содержит перекрестно реактивные эпитопы, узнаваемые антителами к HEV.In the scientific and patent literature, examples of use for the production of recombinant HEV proteins of the bacterial expression system based on E. coli are presented. Thus, it is known to obtain a recombinant chimeric protein trpE-C2 containing 439 C-terminal amino acids of the ORF2-protein HEV genotype 1 fused with the N-terminal region of tryptophan synthetase in the bacterial expression system in E. coli (Kamili S., Virus Research 2011, 161 (1): 93-100). The protein expressed in E. coli is highly immunoreactive and contains cross-reactive epitopes recognized by antibodies to HEV.

Описано получение иммунореактивного полипептида рЕ2, происходящего из карбокситерминального района белка, кодируемого ORF2 генома китайского штамма D11092. Этот полипептид, благодаря присутствию конформационной антигенной детерминанты, способен из мономеров образовывать активные гомодимеры (US 7,204,989, 17.04.2007). Полипептид рЕ2 экспрессировали в клетках E. coli с использованием вектора pGEX. При клонировании в этом векторе последовательность, кодирующая рЕ2, была соединена в рамке с геном глютатион-S-трансферазы (GST). В результате был получен гибридный ген, кодирующий полипептид, на N-концевой части которого находилась GST, а на С-концевой - рЕ2. Такой составной белок, полученный в результате экспрессии гибридного гена в клетках E. coli, был растворим и мог быть выделен из лизата клеток путем связывания с глютатион-агарозой. Полипептид рЕ2 отделяли от GST при помощи специфической протеазы.Described is the production of an immunoreactive polypeptide pE2 derived from the carboxyterminal region of the protein encoded by ORF2 of the genome of the Chinese strain D11092. This polypeptide, due to the presence of a conformational antigenic determinant, is capable of forming active homodimers from monomers (US 7,204,989, 17.04.2007). The pE2 polypeptide was expressed in E. coli cells using the pGEX vector. When cloned into this vector, the pE2 coding sequence was fused in frame with the glutathione S-transferase (GST) gene. As a result, a hybrid gene was obtained that encodes a polypeptide with GST at the N-terminal end and pE2 at the C-terminal end. Such a fusion protein, resulting from the expression of the fusion gene in E. coli cells, was soluble and could be isolated from the cell lysate by binding to glutathione agarose. The pE2 polypeptide was separated from the GST using a specific protease.

Патент РФ №2501568, приоритет 27.04.2012, правообладатель Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех", Россия. Документ описывает рекомбинантную вакцину для профилактики вирусного гепатита Е у животных. Изобретение относится к биотехнологии, а именно генной инженерии. Предложена рекомбинантная вакцина для профилактики вирусного гепатита Е у животных. Вакцина включает капсидный белок (rtHEV-ORF2), полученный путем культивирования рекомбинантного штамма дрожжей Hansenula polymorpha КБТ-11/pHEV-001, содержащего интегрированную в геном клетки дрожжей последовательность ДНК, кодирующую фрагмент аминокислотной последовательности с 86 по 607 позицию капсидного белка вируса гепатита Е генотипа 3 (rtHEV-ORF2) под контролем промотора гена МОХ. Вакцина содержит эффективное количество rtHEV-ORF2 белка, масляный адъювант и физиологически приемлемый разбавитель.RF patent №2501568, priority 27.04.2012, copyright holder Closed Joint Stock Company Research and Production Company "Kombiotech", Russia. The document describes a recombinant vaccine for the prevention of viral hepatitis E in animals. The invention relates to biotechnology, namely genetic engineering. A recombinant vaccine for the prevention of viral hepatitis E in animals has been proposed. The vaccine includes a capsid protein (rtHEV-ORF2) obtained by culturing a recombinant Hansenula polymorpha yeast strain KBT-11 / pHEV-001 containing a DNA sequence integrated into the genome of a yeast cell encoding a fragment of the amino acid sequence from 86 to 607 position of the capsid protein of the hepatitis E virus genotype 3 (rtHEV-ORF2) under the control of the MOX gene promoter. The vaccine contains an effective amount of the rtHEV-ORF2 protein, an oil adjuvant, and a physiologically acceptable diluent.

Недостатком для данного технического решения является низкая растворимость белка в водных средах и необходимость культивирования клеток дрожжей.The disadvantage of this technical solution is the low solubility of the protein in aqueous media and the need to cultivate yeast cells.

Aye, Т.Т., Uchida, Т., Ma, X.Z., Iida, F., Shikata, Т., Zhuang, Н., & Win, K.М. (1992). Complete nucleotide sequence of a hepatitis E virus isolated from the Xinjiang epidemic (1986-1988) of China. Nucleic Acids Research, Volume 20, N 13, P. 3512.Aye, T.T., Uchida, T., Ma, X.Z., Iida, F., Shikata, T., Zhuang, N., & Win, K.M. (1992). Complete nucleotide sequence of a hepatitis E virus isolated from the Xinjiang epidemic (1986-1988) of China. Nucleic Acids Research, Volume 20, No. 13, P. 3512.

Данная статья описывает полную нуклеотидную последовательность генома вируса гепатита Е, циркулирующего на территории Китая. Геном содержит 7194 пар нуклеотидов. Степень идентичности с известным ранее описанным штаммом составляет от 97,5% до 100%.This article describes the complete nucleotide sequence of the genome of the hepatitis E virus circulating in China. The genome contains 7194 base pairs. The degree of identity with the known previously described strain ranges from 97.5% to 100%.

Fry KE, Tam AW, Smith MM, Kim JP, Luk KC, Young LM, Piatak M, Feldman RA, Yun KY, Purdy MA, et al. Hepatitis E virus (HEV): strain variation in the nonstructural gene region encoding consensus motifs for an RNA-dependent RNA polymerase and an ATP/GTP binding site. Virus Genes. 1992 Apr; 6(2): 173-85. PubMed PMID: 1589964.Fry KE, Tam AW, Smith MM, Kim JP, Luk KC, Young LM, Piatak M, Feldman RA, Yun KY, Purdy MA, et al. Hepatitis E virus (HEV): strain variation in the nonstructural gene region encoding consensus motifs for an RNA-dependent RNA polymerase and an ATP / GTP binding site. Virus Genes. 1992 Apr; 6 (2): 173-85. PubMed PMID: 1589964.

Статья описывает исследование молекулярного клона полной последовательности cDNA вируса гепатита Е путем перевода основных открытых рамок считывания (ORF-1) из этих клонов. Молекулярные клоны, полученные из двух других географически различных изолятов ВГЕ, продемонстрировали неоднородность неструктурных генов в этой области. Схожесть известной аминокислотной последовательности и предмета поиска составляет 95%. Растворимость известного белка в водных средах незначительна.The article describes the study of a molecular clone of the complete cDNA sequence of hepatitis E virus by translating the main open reading frames (ORF-1) from these clones. Molecular clones obtained from two other geographically different isolates of HEV demonstrated heterogeneity of non-structural genes in this region. The similarity between the known amino acid sequence and the subject of the search is 95%. The solubility of the known protein in aqueous media is negligible.

Перспективным направлением развития технологии является конструирование аминокислотной последовательности, обладающей высокой растворимостью в водных средах, и которая может быть использована для формирования вакцины против вируса гепатита Е.A promising direction in the development of technology is the construction of an amino acid sequence with high solubility in aqueous media, and which can be used to form a vaccine against hepatitis E.

Прямая экспрессия эукариотической последовательности ORF2 ВГЕ приводит к образованию нерастворимых агрегатов, что требует денатурации и последующей частичной ренатурации белка в ходе выделения и очистки, а значит неизбежного снижения выхода конечного продукта и возможности неполной ренатурации белка. Для оптимизации гетерологичной экспрессии капсидного белка ОРС2 был использован уникальный подход к реконструкции генов. Этот алгоритм оптимизации принимает во внимание важность редких кодонов и их включения в соответствующие места оптимизированного гена для обеспечения правильного ритма трансляции, а, следовательно, правильного сворачивания образующегося полипептида. Использование подобного подхода приводит к высокому выходу правильно свернутых растворимых белков, экспрессируемых в гетерологичной системе.Direct expression of the eukaryotic sequence ORF2 of HEV leads to the formation of insoluble aggregates, which requires denaturation and subsequent partial renaturation of the protein during isolation and purification, which means an inevitable decrease in the yield of the final product and the possibility of incomplete renaturation of the protein. A unique approach to gene reconstruction was used to optimize the heterologous expression of the ORF2 capsid protein. This optimization algorithm takes into account the importance of rare codons and their inclusion in the appropriate places of the optimized gene to ensure the correct translation rhythm, and, therefore, the correct folding of the resulting polypeptide. Using this approach results in a high yield of correctly folded soluble proteins expressed in a heterologous system.

Задачей изобретения является осуществление способа получения капсидного белка вируса гепатита Е повсеместно распространенных на территории РФ генотипов, обладающего иммуногенными свойствами природного белка.The objective of the invention is to implement a method for producing the capsid protein of the hepatitis E virus of genotypes ubiquitous in the territory of the Russian Federation, having the immunogenic properties of a natural protein.

Последовательность эукариотического гена ORF2, полученная секвенированием распространенного в регионе Российской Федерации штамма ВГЕ: вместо начальных 110 кодонов гена в последовательности была закодирована олигогистидиновая метка для выделения и очистки белка (His-10). Синтетический ген длиной 1719 пар нуклеотидов кодирует белок с молекулярным весом 60.9 кД. Ген собирался из 47 олигонуклеотидов длиной от 38 до 42 нуклеотидов каждый (Invitrogen Inc), после ПЦР клонировался в плазмидный вектор pUC57 по сайту BamHI.The sequence of the eukaryotic ORF2 gene obtained by sequencing the HEV strain widespread in the region of the Russian Federation: instead of the initial 110 codons of the gene, an oligohistidine tag was encoded in the sequence for protein isolation and purification (His-10). The 1719 base pair synthetic gene encodes a protein with a molecular weight of 60.9 kDa. The gene was assembled from 47 oligonucleotides from 38 to 42 nucleotides each (Invitrogen Inc), after PCR was cloned into the pUC57 plasmid vector at the BamHI site.

Пять микрограмм плазмидной ДНК содержащей синтетический ген правильной последовательности затем использовалось для перенесения NdeI-BamHI фрагмента в экспрессионный вектор рЕТ3а под контроль гибридного промотора и регуляторных последовательностей Т7 РНК полимеразы, клонировались в штамме Е. coli DH5a. Полученная экспрессионная плазмида снова анализировалась рестрикционным анализом и трансформировалась в экспрессионный штамм BL21 (DE3). Этот штамм позволяет получить высокий уровень экспрессии гетерологичных белков после индукции РНК полимеразы Т7.Five micrograms of plasmid DNA containing the correct synthetic gene was then used to transfer the NdeI-BamHI fragment into the expression vector pET3a under the control of the hybrid promoter and T7 RNA polymerase regulatory sequences, cloned into E. coli strain DH5a. The resulting expression plasmid was again analyzed by restriction analysis and transformed into the expression strain BL21 (DE3). This strain allows to obtain a high level of expression of heterologous proteins after induction of T7 RNA polymerase.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе получения капсидного белка вируса гепатита Е клонированный фрагмент длиной 1719 bp включает ген ORF2, представляющий вторую рамку считывания генома HEV. Вместо начальных 110 кодонов гена в последовательности была закодирована олигогистидиновая метка для выделения и очистки белка (His-10).The problem is solved due to the fact that in the method for producing the capsid protein of the hepatitis E virus, the cloned fragment of 1719 bp in length includes the ORF2 gene, which is the second reading frame of the HEV genome. Instead of the initial 110 codons of the gene, an oligohistidine tag for protein isolation and purification (His-10) was encoded in the sequence.

Сущность предложенного способа заключается в следующем:The essence of the proposed method is as follows:

Для получения рекомбинантного капсидного белка вируса гепатита Е получена консенсусная последовательность гена, кодирующего данный белок, отражающая характерные для территории Российской федерации штаммы. На основе данной консенсусной последовательности получен синтетический ген: вместо начальных 110 кодонов гена в последовательности была закодирована олигогистидиновая метка для выделения и очистки белка (His-10). Вся остальная последовательность, кодирующая капсидный белок вируса гепатита Е, была систематически оптимизирована для экспрессии в E. coli. Синтетический ген длиной 1719 пар нуклеотидов кодирует белок с молекулярным весом 60.9 кДа. Затем полученный фрагмент перенесен в экспрессионный вектор рЕТ3а под контроль гибридного промотора и регуляторных последовательностей Т7 РНК полимеразы. Сведения о векторе рЕТ3а, на основе которого сконструирована плазмида: размер, генетическая и физическая карта вектора (с указанием литературных ссылок): 4640 bp (чертеж 1).To obtain the recombinant capsid protein of the hepatitis E virus, a consensus sequence of the gene encoding this protein, reflecting the strains characteristic of the territory of the Russian Federation, was obtained. Based on this consensus sequence, a synthetic gene was obtained: instead of the initial 110 codons of the gene, an oligohistidine tag for protein isolation and purification (His-10) was encoded in the sequence. The rest of the sequence encoding the capsid protein of the hepatitis E virus was systematically optimized for expression in E. coli. The 1719 base pair synthetic gene encodes a protein with a molecular weight of 60.9 kDa. Then the obtained fragment was transferred into the expression vector pET3a under the control of the hybrid promoter and regulatory sequences of T7 RNA polymerase. Information about the pET3a vector, on the basis of which the plasmid was constructed: size, genetic and physical map of the vector (with indication of literature references): 4640 bp (drawing 1).

Трансформацией штамма реципиента BL21(DE3) плазмидой pET-ORF2 получен штамм-продуцент PORF2. Штамм-продуцент задепонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Для выделения и очистки рекомбинантного капсидного белка ВГЕ разработаны методики автоиндукции, метод лизиса и первичной очистки растворимого рекомбинантного белка, определены характеристики и параметры выделения белка на аффинной среде для IMAC. Разработаны варианты элюции рекомбинантного белка с аффинной среды и методики вторичной очистки белка гель-фильтрацией.Transformation of the recipient strain BL21 (DE3) with the pET-ORF2 plasmid produced the PORF2 producer strain. The producer strain is deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms. For the isolation and purification of the recombinant HEV capsid protein, autoinduction techniques, lysis and primary purification of soluble recombinant protein were developed, the characteristics and parameters of protein isolation on an affinity medium for IMAC were determined. Variants of elution of a recombinant protein from an affinity medium and a method of secondary protein purification by gel filtration have been developed.

Плазмида выделена из клеток Е. Coli, есть ген устойчивости к ампициллину; наличие элементов, определяющих трансмиссивность плазмид - нет; круг хозяев аннотация выявленных рамок считывания (если вектор имеет происхождение из патогенных микроорганизмов) - отсутствует. Видовая принадлежность донорного организма: Hepatitis Е Virus, Род Hepavirus, семейство Hepaviridae.The plasmid is isolated from E. Coli cells, there is a gene for ampicillin resistance; the presence of elements that determine the transmissibility of plasmids - no; host circle, annotation of the identified reading frames (if the vector is derived from pathogenic microorganisms) is absent. Donor species: Hepatitis E Virus, Genus Hepavirus, family Hepaviridae.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.The invention can be illustrated by the following examples.

В приводимых примерах все генно-инженерные операции производили согласно стандартным методикам и инструкциям компаний производителей ферментов и наборов для манипуляций с ДНК in vitro.In the given examples, all genetic engineering operations were performed according to the standard methods and instructions of the manufacturers of enzymes and kits for in vitro DNA manipulation.

Пример 1. Способ получения штамма.Example 1. A method of obtaining a strain.

Штамм PORF2 получен трансформацией штамма реципиента BL21(DE3) плазмидой pET-ORF2. На плотной питательной среде образует круглые выпуклые колонии средней величины, влажные, с гладкой блестящей поверхностью с ровным краем. Колонии прозрачные с серовато-голубым отливом, легко сливающиеся между собой. В жидких средах (LB) растет в виде интенсивного равномерного помутнения среды, образуя осадок. Штамм продуцирует 1 мг рекомбинантного белка с 1 л культуры. Культура хранится на -70°С (неограниченное время) в 15% глицерине, 7% DMSO. Способ, условия и состав сред для размножения штамма: выращивание в среде LB (1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 0.5% NaCl; рН 7.0) при 37°С, 150-170 об/мин. Генетические особенности штамма: генотип штамма хозяина (мутации, делеции, инверсии, наличие плазмид или профагов, устойчивость (чувствительность) к антибиотикам, фагам и т.д., прочие генетические особенности): F^- ompT gal dcm lon hsdS_B(r_B ^- m_B ^-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]). Описание рекомбинантной плазмиды pET-ORF2: размер, генетическая и физическая карта плазмиды 6297 bp (чертеж 2). Плазмида выделена из клеток Е. Coli, есть ген устойчивости к ампициллину; наличие элементов, определяющих трансмиссивность плазмид - нет; круг хозяев аннотация выявленных рамок считывания (если вектор имеет происхождение из патогенных микроорганизмов) - отсутствует. Видовая принадлежность донорного организма: Hepatitis Е Virus, Род Hepavirus, семейство Hepaviridae.The PORF2 strain was obtained by transforming the recipient strain BL21 (DE3) with the pET-ORF2 plasmid. On a dense nutrient medium, forms round, convex colonies of medium size, moist, with a smooth shiny surface with an even edge. Colonies are transparent with a grayish-blue tint, easily merging with each other. In liquid media (LB) grows in the form of intense uniform turbidity of the medium, forming a precipitate. The strain produces 1 mg of recombinant protein from 1 liter of culture. The culture is stored at -70 ° C (unlimited time) in 15% glycerin, 7% DMSO. Method, conditions and composition of media for strain propagation: cultivation in LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl; pH 7.0) at 37 ° C, 150-170 rpm. Genetic characteristics of the strain: genotype of the host strain (mutations, deletions, inversions, the presence of plasmids or prophages, resistance (sensitivity) to antibiotics, phages, etc., other genetic characteristics): F ^- ompT gal dcm lon hsdS _B (r _B ^- m _B ^- ) λ (DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]). Description of the recombinant plasmid pET-ORF2: size, genetic and physical map of plasmid 6297 bp (drawing 2). The plasmid is isolated from E. Coli cells, there is a gene for ampicillin resistance; the presence of elements that determine the transmissibility of plasmids - no; host circle, annotation of the identified reading frames (if the vector is derived from pathogenic microorganisms) is absent. Donor species: Hepatitis E Virus, Genus Hepavirus, family Hepaviridae.

Пример 2. Метод выращивания и индукции рекомбинантного растворимого капсидного белка ВГЕ на основе методики самоиндукции альфа-лактозой.Example 2. Method of growing and induction of recombinant soluble HEV capsid protein based on the method of self-induction with alpha-lactose.

Для индукции готовят стандартную богатую среду для выращивания E. coli (среда Лурии-Бертани, LB) и следующие стерильные концентрированные растворы: 1) 20-кратный раствор NPS содержащий: 0.5М сульфата аммония (NH₄)₂SO₄, 1М фосфата калия KH₂PO₄, 1М фосфата натрия Na₂HPO₄. 2) 50-кратный раствор 5052, содержащий: 25% глицерина, 2.5% глюкозы, 10% альфа-лактозы. 3) 1000-кратный раствор, содержащий 1М сульфат магния MgSO₄.For induction, a standard rich culture medium for E. coli (Luria-Bertani, LB medium) and the following sterile concentrated solutions are prepared: 1) 20-fold NPS solution containing: 0.5M ammonium sulfate (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 1M potassium phosphate KH ₂ PO ₄ , 1M sodium phosphate Na ₂ HPO ₄ . 2) 50x 5052 solution containing: 25% glycerin, 2.5% glucose, 10% alpha-lactose. 3) 1000-fold solution containing 1M magnesium sulfate MgSO ₄ .

Клетки штамма продуцента PORF2 предварительно рассевают методом исчезающего штриха на чашках Петри со средой LB и 1.8% агара и 75 μg/ml ампициллина. Жидкую среду LB с добавлением 75-100 мкг/мл ампициллина инокулируют единичной бактериальной колонией с чашки (предпочтительный метод) или из замороженного в 50% глицерине стока бактериальной культуры. Данную стартовую культуру выращивают в орбитальной качалке при 37°С и 300 об/мин до достижения поздней логарифмической фазы роста, измеряемой по поглощению в оптической области спектра 600 нм OD600=0.6-0.9. Для самоиндукции в конечном объеме 1 л используют 5 мл стартовой культуры в 50 мл одноразовых полипропиленовых пробирках с приоткрытой крышкой. Искомая плотность культуры достигается в таких условиях примерно за 3-4 часа. К моменту начала культивирования основной культуры готовят 1 л стерильной среды LB с добавлением 75-100 мкг/мл ампициллина и концентрированных растворов 1, 2 и 3 (соответственно, 1/20, 1/50 и 1/1000 объема среды). Среду подогревают в водяной бане до 37°С и разделяют на пять конических колб объемом 2 л, по 200 мл среды в каждой. Стартовую культуру инокулируют в приготовленную среду для самоиндукции из расчета 1/500-1/1000 и выращивается до насыщения (OD600~4) в орбитальной качалке при 37°С и 300 об/мин. Время выращивания в таких условиях составляет более 12 часов, обычно 16-18 часов. Для измерения OD600 после 12 часов культивации требуется разведение проб культуры в 10 раз в свежей среде LB, культивирование считается законченным тогда, когда плотность культуры перестает расти. Из выращенной культуры отбирают 2-3 пробы по 0.5 мл для анализа суммарной бактериальной массы и контроля экспрессии антигена, пробы центрифугируют при 12000 об/мин в настольной центрифуге, среду удаляют аспирацией, осадок бактериальной массы замораживают при -80°С до последующего анализа. Основную культуру объединяют в одной колбе и охлаждают в течение 20 минут при +4°С в мокром льду. Полученные 1000 мл культуры центрифугируют при 3500-4000 g в центрифуге с охлаждением при +4°С в четырех флаконах для центрифугирования объемом 250 мл. Жидкую среду удаляют аспирацией, бактериальную массу замораживают при -80°С до последующего выделения и очистки рекомбинантного белка.Cells of the PORF2 producer strain are pre-plated by the disappearing streak method on Petri dishes with LB medium and 1.8% agar and 75 μg / ml ampicillin. LB liquid medium supplemented with 75-100 μg / ml ampicillin is inoculated with a single bacterial colony from a dish (preferred method) or from a bacterial culture stock frozen in 50% glycerol. This starter culture is grown in an orbital shaker at 37 ° C and 300 rpm until the late logarithmic growth phase is reached, measured by the absorption in the optical spectral region of 600 nm OD600 = 0.6-0.9. For self-induction in a final volume of 1 liter, use 5 ml of the starter culture in 50 ml disposable polypropylene tubes with a slightly open lid. The desired culture density is achieved under such conditions in about 3-4 hours. By the time the main culture begins to cultivate, 1 liter of sterile LB medium is prepared with the addition of 75-100 μg / ml ampicillin and concentrated solutions 1, 2 and 3 (respectively, 1/20, 1/50 and 1/1000 of the volume of the medium). The medium is heated in a water bath to 37 ° C and divided into five conical flasks with a volume of 2 liters, 200 ml of medium each. The starter culture is inoculated into the prepared self-induction medium at a rate of 1 / 500-1 / 1000 and grown to saturation (OD600 ~ 4) in an orbital shaker at 37 ° C and 300 rpm. Growing time under these conditions is more than 12 hours, usually 16-18 hours. To measure OD600 after 12 hours of cultivation, it is required to dilute the culture samples by a factor of 10 in fresh LB medium; cultivation is considered complete when the density of the culture stops growing. From the grown culture, 2-3 samples of 0.5 ml are taken for the analysis of the total bacterial mass and control of the antigen expression, the samples are centrifuged at 12000 rpm in a tabletop centrifuge, the medium is removed by aspiration, the bacterial mass sediment is frozen at -80 ° C until further analysis. The main culture is combined in one flask and cooled for 20 minutes at + 4 ° C in wet ice. The resulting 1000 ml of culture is centrifuged at 3500-4000 g in a centrifuge with cooling at + 4 ° C in four flasks for centrifugation with a volume of 250 ml. The liquid medium is removed by aspiration, the bacterial mass is frozen at -80 ° C until the subsequent isolation and purification of the recombinant protein.

Пример 3. Метод лизиса и первичной очистки растворимого рекомбинантного капсидного белка ВГЕ.Example 3. Method of lysis and primary purification of soluble recombinant HEV capsid protein.

Осадок бактериальной массы после выращивания и автоиндукции в объеме 1 л культуры суспендируют при +4°С в 20 мл лизирующего буфера следующего состава: 50 mM Tris-HCL, рН 7.9, 0.1 mM EDTA, 5% glycerol, 0.1 mM DTT, 0.1М NaCl. В приготовленный лизисный раствор непосредственно перед применением добавляют ингибитор протеаз фенилметилсульфонил фторид (PMSF) до конечной концентрации 1 mM.The sediment of the bacterial mass after cultivation and autoinduction in a volume of 1 L of the culture is suspended at + 4 ° C in 20 ml of lysis buffer of the following composition: 50 mM Tris-HCL, pH 7.9, 0.1 mM EDTA, 5% glycerol, 0.1 mM DTT, 0.1 M NaCl ... The protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) is added to the prepared lysis solution immediately before use to a final concentration of 1 mM.

Бактериальную суспензию разделяют на 4 пробирки для ультразвукового лизирования. Условия ультразвукового лизирования зависят от мощности аппарата и параметров используемой насадки для лизирования. Критичным для сохранности выделяемого белка является возможность поддержания низкой (+4°С) температуры в ходе лизирования, что достигается уменьшением объема лизата. Бактериальную суспензию лизируют ультразвуком при +4°С и 60% мощности при помощи 8-10 пульсов по 30 секунд. После каждого пульса пробу выдерживают 1-2 минуты в мокром льду для охлаждения лизата. Отдельные фракции лизата объединяют в пробирке для центрифугирования. К лизату добавляют 10% стоковый раствор Triton Х-100 до 1% концентрации. Лизат инкубируют во льду при +4°С в течение 20 минут. Из лизата отбирают контрольную пробу объемом 0.2 мл для последующего анализа растворимости белка. Лизат центрифугируют в охлаждаемой центрифуге при 15000 об/мин в течение 30 минут для отделения нерастворимой фракции. Полученная растворимая фракция бактериального лизата готова для выделения растворимого рекомбинантного белка на аффинном носителе.The bacterial suspension is divided into 4 tubes for ultrasonic lysis. The conditions for ultrasonic lysis depend on the power of the apparatus and the parameters of the lysis tip used. The ability to maintain a low (+ 4 ° C) temperature during lysis, which is achieved by reducing the volume of the lysate, is critical for the safety of the secreted protein. The bacterial suspension is lysed by ultrasound at + 4 ° C and 60% power using 8-10 pulses for 30 seconds. After each pulse, the sample is kept for 1-2 minutes in wet ice to cool the lysate. The individual lysate fractions are pooled in a centrifuge tube. A 10% stock solution of Triton X-100 is added to the lysate to a concentration of 1%. The lysate is incubated on ice at + 4 ° C for 20 minutes. A control sample with a volume of 0.2 ml is taken from the lysate for subsequent analysis of protein solubility. The lysate is centrifuged in a refrigerated centrifuge at 15,000 rpm for 30 minutes to separate the insoluble fraction. The obtained soluble fraction of the bacterial lysate is ready for isolation of the soluble recombinant protein on an affinity carrier.

Пример 4. Метод выделения и очистки рекомбинантного капсидного белка ВГЕ методом аффинной хроматографии на иммобилизированных ионах металлов (IMAC).Example 4. Method of isolation and purification of recombinant HEV capsid protein by the method of affinity chromatography on immobilized metal ions (IMAC).

К растворимой фракции клеточного лизата (20 мл лизата из 1 л культуры) после центрифугирования добавляют хлорид имидазола до концентрации 20 мМ, лизат фильтруют через 0.22 μМ фильтр и наносят на колонку с 2 мл носителя Profinity IMAC Ni²⁺ (производства BioRad). Для эффективного связывания лизат пропускают через носитель 3 раза со скоростью 2-5 мл/мин при +4°С. Аффинную колонку промывают 50 объемами (100 мл) фосфатного буфера PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄ с добавлением 0.1 mM DTT, 1 mM PMSF и 20 mM хлорида имидазола) при +4°С. Поглощение OD280 после промывки должно быть на уровне фона (<0.01). После промывки колонку освобождают от буферного раствора. Элюцию рекомбинантного белка проводят при помощи буфера для элюции (250 mM раствора хлорида имидазола в буфере для промывки на основе PBS). Для этого к осушенной колонке добавляют равный объем (2 мл) буфера для элюции. Колонку инкубируют в течение 10 минут при +4°С, после чего добавляют еще 2 мл буфера для элюции и собирают элюат. Колонку носителя Profinity IMAC Ni²⁺ регенерируют в соответствии с протоколом фирмы изготовителя (BioRad). Выделенный на аффинной среде рекомбинантный капсидный белок ВГЕ анализируют электрофорезом в денатурирующем ДСН-ПААГ.After centrifugation, imidazole chloride is added to the soluble fraction of the cell lysate (20 ml of lysate from 1 L of culture) to a concentration of 20 mM, the lysate is filtered through a 0.22 μM filter and applied to a column with 2 ml of Profinity IMAC Ni ²⁺ carrier (manufactured by BioRad). For effective binding, the lysate is passed through the carrier 3 times at a rate of 2-5 ml / min at + 4 ° C. The affinity column is washed with 50 volumes (100 ml) of PBS phosphate buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO ₄ , 1.8 mM KH ₂ PO ₄ supplemented with 0.1 mM DTT, 1 mM PMSF, and 20 mM imidazole chloride) at + 4 ° C. The absorbance of OD280 after washing should be at background (<0.01). After washing, the column is freed from the buffer solution. Elution of the recombinant protein is carried out using elution buffer (250 mM imidazole chloride solution in PBS wash buffer). For this, an equal volume (2 ml) of elution buffer is added to the dried column. The column is incubated for 10 minutes at + 4 ° C, after which another 2 ml of elution buffer is added and the eluate is collected. The Profinity IMAC Ni ²⁺ media column is regenerated according to the manufacturer's protocol (BioRad). The recombinant HEV capsid protein isolated on affinity medium is analyzed by electrophoresis in denaturing SDS-PAGE.

Пример 5. Окончательная очистка полноразмерного белка от низкомолекулярных примесей и выделение вирусоподобных частиц методом гель-фильтрационной хроматографии с использованием носителя Sephacryl S-400 и Sephacryl S-200.Example 5. Final purification of full-length protein from low molecular weight impurities and isolation of virus-like particles by gel filtration chromatography using Sephacryl S-400 and Sephacryl S-200 media.

Оба носителя (Sephacryl S-400 и Sephacryl S-200) дают хорошие результаты для отделения фракций полноразмерного капсидного белка ВГЕ и фракции вирусоподобных частиц от низкомолекулярных компонентов. Для гель-фильтрации используют колонки емкостью 100 мл носителя длиной 50 см и систему для хроматографии среднего давления BioLogic DuoFlow™. Для стимулирования образования вирусоподобных частиц в элюат после аффинной хроматографии на носителе IMAC добавляют хлорид кальция (CaCl₂) до концентрации 5 mM, затем белковый раствор инкубируют в течении 3-6 часов при +4°С. Для выделения вирусоподобных частиц и полноразмерных субъединиц капсидного белка ВГЕ очищенный на аффинном носителе элюат наносят на колонку с носителем Sephacryl S-200 и промываются стандартным фосфатным буфером PBS при +4°С. С помощью коллектора фракций собирают фракции объемом 0,5 мл, которые затем анализируют электрофорезом в денатурирующем ДСН-ПААГ с последующей окраской Кумасси или иммуноблотом со специфическими антителами к ORF2 ВГЕ по стандартной методике для подтверждения чистоты и специфичности очистки.Both carriers (Sephacryl S-400 and Sephacryl S-200) give good results for separating fractions of the full-length HEV capsid protein and the fraction of virus-like particles from low molecular weight components. For gel filtration, 100 ml columns of 50 cm support and a BioLogic DuoFlow ™ medium pressure chromatography system are used. To stimulate the formation of virus-like particles, calcium chloride (CaCl ₂ ) is added to the eluate after affinity chromatography on the IMAC carrier to a concentration of 5 mM, then the protein solution is incubated for 3-6 hours at + 4 ° C. To isolate virus-like particles and full-size subunits of the HEV capsid protein, the eluate purified on an affinity carrier is applied to a column with a Sephacryl S-200 carrier and washed with standard phosphate buffer PBS at + 4 ° C. Using a fraction collector, 0.5 ml fractions are collected, which are then analyzed by electrophoresis in denaturing SDS-PAGE followed by Coomassie staining or immunoblot with specific antibodies to HEV ORF2 according to the standard method to confirm the purity and specificity of the purification.

Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings

Чертеж 1. Сведения о векторе рЕТ3а, на основе которого сконструирована плазмида: размер, генетическая и физическая карта вектора (с указанием литературных ссылок): 4640 bp.Drawing 1. Information about the vector pET3a, on the basis of which the plasmid was constructed: size, genetic and physical map of the vector (with indication of literature references): 4640 bp.

Чертеж 2. Описание рекомбинантной плазмиды pET-ORF2: размер, генетическая и физическая карта плазмиды 6297 bp.Figure 2. Description of the recombinant plasmid pET-ORF2: size, genetic and physical map of the 6297 bp plasmid.

--->--->

Последовательность Sequence

SEQ ID #1: 71): 17 SEQ ID # 1: 71): 17

(Met-10HIS-HEVORF2(121-619 bp) 562 аа:(Met-10HIS-HEVORF2 (121-619 bp) 562 aa:

<PleI<PleI

HinfIHinfI

>BspD6I> BspD6I

NdeINdeI <MlyI<MlyI

| | | |

ggaaatatacatATGCACCATCATCATCACCACCATCATCACCACCTCACGGCAGTATCACCGGCACCGGACACCGCACCGGTTCCGGACGTGGACTCTC < 100 ggaaatatacatATGCACCATCATCATCACCACCATCATCACCACCTCACGGCAGTATCACCGGCACCGGACACCGCACCGGTTCCGGACGTGGACTCTC <100

M H H H H H H H H H H L T A V S P A P D T A P V P D V D S R M H H H H H H H H H H H L T A V S P A P D T A P V P D V D S R

cctttatatgtaTACGTGGTAGTAGTAGTGGTGGTAGTAGTGGTGGAGTGCCGTCATCGTGGCCGTGGCCTGTGGCGTGGCCAAGGCCTGCACCTGAGAG cctttatatgtaTACGTGGTAGTAGTAGTGGTGGTAGTAGTGGTGGAGTGCCGTCATCGTGGCCGTGGCCTGTGGCGTGGCCAAGGCCTGCACCTGAGAG

10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 20 30 40 50 60 70 80 90

>BseMII> BseMII

>BspCNI> BspCNI

>Bpu10I> Bpu10I

>BbvCI> BbvCI <AquIV<AquIV

<EciI<EciI >PspPRI> PspPRI BfaIBfaI <BtgZI<BtgZI ScaIScaI <BcgI<BcgI

| || | | | | | | || | | | | |

GCGGCGCCATACTCCGCCGCCAGTACAACCTCAGCACTTCCCCGTTAACTAGCAGCGTCGCAAGCGGTACCAACTTAGTACTATACGCAGCACCCTTAAA < 200 GCGGCGCCATACTCCGCCGCCAGTACAACCTCAGCACTTCCCCGTTAACTAGCAGCGTCGCAAGCGGTACCAACTTAGTACTATACGCAGCACCCTTAAA <200

G A I L R R Q Y N L S T S P L T S S V A S G T N L V L Y A A P L N G A I L R R Q Y N L S T S P L T S S V A S G T N L V L Y A A P L N

CGCCGCGGTATGAGGCGGCGGTCATGTTGGAGTCGTGAAGGGGCAATTGATCGTGGTAGCGTTGGCCATGGTTGAATCATGATATGCGTCGTGGGAATAG CGCCGCGGTATGAGGCGGCGGTCATGTTGGAGTCGTGAAGGGGCAATTGATCGTGGTAGCGTTGGCCATGGTTGAATCATGATATGCGTCGTGGGAATAG

110 120 130 140 150 160 170 180 190 110 120 130 140 150 160 170 180 190

PflMIPflMI

| |

CCCGCTCCTCCCGCTCCAGGACGGAACCAACACCCATATAATGGCAACCGAAGCAAGCAACTACGCACAGTACCGTGTTGTTCGTGCAACCATACGCTAC < 300 CCCGCTCCTCCCGCTCCAGGACGGAACCAACACCCATATAATGGCAACCGAAGCAAGCAACTACGCACAGTACCGTGTTGTTCGTGCAACCATACGCTAC <300

P L L P L Q D G T N T H I M A T E A S N Y A Q Y R V V R A T I R Y P L L P L Q D G T N T H I M A T E A S N Y A Q Y R V V R A T I R Y

CGGCGAGGAGGGCGAGGTCCTGCCTTGGTTGTGGGTATATTACCGTTGGCTTCGTTCGTTGATGCGTGTCATGGCACAACAAGCACGTTGGTATGCGATG CGGCGAGGAGGGCGAGGTCCTGCCTTGGTTGTGGGTATATTACCGTTGGCTTCGTTCGTTGATGCGTGTCATGGCACAACAAGCACGTTGGTATGCGATG

210 220 230 240 250 260 270 280 290 210 220 230 240 250 260 270 280 290

HaeIIIHaeIII

EaeIEaeI

<GdiII<GdiII

|| ||

CGCCCGCTCGTGCCGAACGCTGTTGGTGGGTACGCAATAAGCATAAGCTTTTGGCCGCAGACTACGACCACCCCGACCAGCGTTGACATGAACAGCATAA < 400 CGCCCGCTCGTGCCGAACGCTGTTGGTGGGTACGCAATAAGCATAAGCTTTTGGCCGCAGACTACGACCACCCCGACCAGCGTTGACATGAACAGCATAA <400

R P L V P N A V G G Y A I S I S F W P Q T T T T P T S V D M N S I T R P L V P N A V G G Y A I S I S F W P Q T T T P T S V D M N S I T

GCGGGCGAGCACGGCTTGCGACAACCACCCATGCGTTATTCGTATTCGAAAACCGGCGTCTGATGCTGGTGGGGCTGGTCGCAACTGTACTTGTCGTATT GCGGGCGAGCACGGCTTGCGACAACCACCCATGCGTTATTCGTATTCGAAAACCGGCGTCTGATGCTGGTGGGGCTGGTCGCAACTGTACTTGTCGTATT

310 320 330 340 350 360 370 380 390 310 320 330 340 350 360 370 380 390

ZraIZraI

AatIIAatII AclIAclI

| | | |

CCAGCACCGACGTCCGCATATTAGTTCAGCCGGGTATAGCAAGCGAGTTAGTGATACCGTCGGAACGTTTACATTACCGTAACCAGGGTTGGCGTTCCGT < 500 CCAGCACCGACGTCCGCATATTAGTTCAGCCGGGTATAGCAAGCGAGTTAGTGATACCGTCGGAACGTTTACATTACCGTAACCAGGGTTGGCGTTCCGT <500

S T D V R I L V Q P G I A S E L V I P S E R L H Y R N Q G W R S V S T D V R I L V Q P G I A S E L V I P S E R L H Y R N Q G W R S V

GGTCGTGGCTGCAGGCGTATAATCAAGTCGGCCCATATCGTTCGCTCAATCACTATGGCAGCCTTGCAAATGTAATGGCATTGGTCCCAACCGCAAGGCA GGTCGTGGCTGCAGGCGTATAATCAAGTCGGCCCATATCGTTCGCTCAATCACTATGGCAGCCTTGCAAATGTAATGGCATTGGTCCCAACCGCAAGGCA

410 420 430 440 450 460 470 480 490 410 420 430 440 450 460 470 480 490

BstZ17IBstZ17I

>AcuI> AcuI MspA1IMspA1I AccIAccI SgrAISgrAI

| | | | | | | |

TGAAACCTCTGGCGTCGCTGAAGAAGAAGCAACCAGCGGTCTCGTCATGCTCTGTATACATGGGAGCCCGGTGAACAGCTACACCAACACGCCGTACACC < 600 TGAAACCTCTGGCGTCGCTGAAGAAGAAGCAACCAGCGGTCTCGTCATGCTCTGTATACATGGGAGCCCGGTGAACAGCTACACCAACACGCCGTACACC <600

E T S G V A E E E A T S G L V M L C I H G S P V N S Y T N T P Y T E T S G V A E E E A T S G L V M L C I H G S P V N S Y T N T P Y T

ACTTTGGAGACCGCAGCGACTTCTTCTTCGTTGGTCGCCAGAGCAGTACGAGACATATGTACCCTCGGGCCACTTGTCGATGTGGTTGTGCGGCATGTGG ACTTTGGAGACCGCAGCGACTTCTTCTTCGTTGGTCGCCAGAGCAGTACGAGACATATGTACCCTCGGGCCACTTGTCGATGTGGTTGTGCGGCATGTGG

510 520 530 540 550 560 570 580 590 510 520 530 540 550 560 570 580 590

SmlISmlI

SciISciI

XhoIXhoI

<TaqII<TaqII PspXIPspXI

| || | ||

GGCGCCCTCGGTCTCCTCGACTTCGCTCTCGAACTCGAGTTTCGTAACCTCACGCCGGGTAACACTAACACTCGTGTTAGCCGTTACACCTCGACGGCTC < 700 GGCGCCCTCGGTCTCCTCGACTTCGCTCTCGAACTCGAGTTTCGTAACCTCACGCCGGGTAACACTAACACTCGTGTTAGCCGTTACACCTCGACGGCTC <700

G A L G L L D F A L E L E F R N L T P G N T N T R V S R Y T S T A R G A L G L L D F A L E L E F R N L T P G N T N T R V S R Y T S T A R

CCGCGGGAGCCAGAGGAGCTGAAGCGAGAGCTTGAGCTCAAAGCATTGGAGTGCGGCCCATTGTGATTGTGAGCACAATCGGCAATGTCGAGCAGCCGAG CCGCGGGAGCCAGAGGAGCTGAAGCGAGAGCTTGAGCTCAAAGCATTGGAGTGCGGCCCATTGTGATTGTGAGCACAATCGGCAATGTCGAGCAGCCGAG

610 620 630 640 650 660 670 680 690 610 620 630 640 650 660 670 680 690

MluIMluI BspHIBspHI

| | | |

GTCACGTGCTACGTCGAGGACCGGACGGTACCGCAGAACTTACCACTACCGCAGCAACGCGTTTCATGAAGGACTTACATTTTACCGGAACCAACGGTGT < 800 GTCACGTGCTACGTCGAGGACCGGACGGTACCGCAGAACTTACCACTACCGCAGCAACGCGTTTCATGAAGGACTTACATTTTACCGGAACCAACGGTGT <800

H R L R R G P D G T A E L T T T A A T R F M K D L H F T G T N G V H R L R R G P D G T A E L T T T A A T R F M K D L H F T G T N G V

CAGTGTTCGATGCAGCTCCTGGCCTGCCATGGCGTCTTGAATGGTGATGGCGTCGTTGCGCAAAGTACTTCCTGAATGTAAAATGGCCTTGGTTGCCACA CAGTGTTCGATGCAGCTCCTGGCCTGCCATGGCGTCTTGAATGGTGATGGCGTCGTTGCGCAAAGTACTTCCTGAATGTAAAATGGCCTTGGGTTGCCACA

710 720 730 740 750 760 770 780 790 710 720 730 740 750 760 770 780 790

>BplI> BplI >SapI> SapI

| | | |

TGGTGAAGTTGGTCGTGGTATCGCTCTCACCTTATTCAACTTAGCAGACACTTTATTAGGTGGATTACCGACGGAGCTTATCTCCTCCGCAGGGGGTCAG < 900 TGGTGAAGTTGGTCGTGGTATCGCTCTCACCTTATTCAACTTAGCAGACACTTTATTAGGTGGATTACCGACGGAGCTTATCTCCTCCGCAGGGGGTCAG <900

G E V G R G I A L T L F N L A D T L L G G L P T E L I S S A G G Q G E V G R G I A L T L F N L A D T L L G G L P T E L I S S A G G Q

ACCACTTCAACCAGCACCATAGCGAGAGTGGAATAAGTTGAATCGTCTGTGAAATAATCCACCTAATGGCTGCCTCGAATAGAGGAGGCGTCCCCCAGTC ACCACTTCAACCAGCACCATAGCGAGAGTGGAATAAGTTGAATCGTCTGTGAAATAATCCACCTAATGGCTGCCTCGAATAGAGGAGGCGTCCCCCAGTC

810 820 830 840 850 860 870 880 890 810 820 830 840 850 860 870 880 890

>EarI> EarI >BsmBI> BsmBI

| | | |

CTCTTCTACTCCCGCCCGGTCGTCTCCGCAAACGGTGAACCGACGGTGAAGTTATACACCTCCGTAGAAAACGCACAGCAGGACAAGGGTATAGCAATCC < 1000 CTCTTCTACTCCCGCCCGGTCGTCTCCGCAAACGGTGAACCGACGGTGAAGTTATACACCTCCGTAGAAAACGCACAGCAGGACAAGGGTATAGCAATCC <1000

L F Y S R P V V S A N G E P T V K L Y T S V E N A Q Q D K G I A I P L F Y S R P V V S A N G E P T V K L Y T S V E N A Q Q D K G I A I P

GAGAAGATGAGGGCGGGCCAGCAGAGGCGTTTGCCACTTGGCTGCCACTTCAATATGTGGAGGCATCTTTTGCGTGTCGTCCTGTTCCCATATCGTTAGG GAGAAGATGAGGGCGGGCCAGCAGAGGCGTTTGCCACTTGGCTGCCACTTCAATATGTGGAGGCATCTTTTGCGTGTCGTCCTGTTCCCATATCGTTAGG

910 920 930 940 950 960 970 980 990 910 920 930 940 950 960 970 980 990

>SdeOSI> SdeOSI

>ApyPI> ApyPI

>RceI> RceI >NmeAIII> NmeAIII <BsmFI<BsmFI

|| | | | || | | |

CCCATGACATCGACTTAGGTGAAAGCCGAGTTGTGATCCAGGACTACGACAACCAACATGAACAAGACCGTCCGACCCCGAGCCCGGCACCGTCCCGCCC < 1100 CCCATGACATCGACTTAGGTGAAAGCCGAGTTGTGATCCAGGACTACGACAACCAACATGAACAAGACCGTCCGACCCCGAGCCCGGCACCGTCCCGCCC <1100

H D I D L G E S R V V I Q D Y D N Q H E Q D R P T P S P A P S R P H D I D L G E S R V V I Q D Y D N Q H E Q D R P T P S P A P S R P

GGGTACTGTAGCTGAATCCACTTTCGGCTCAACACTAGGTCCTGATGCTGTTGGTTGTACTTGTTCTGGCAGGCTGGGGCTCGGGCCGTGGCAGGGCGGG GGGTACTGTAGCTGAATCCACTTTCGGCTCAACACTAGGTCCTGATGCTGTTGGTTGTACTTGTTCTGGCAGGCTGGGGCTCGGGCCGTGGCAGGGCGGG

1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080 1090

PstIPstI

>Bsp24I> Bsp24I SfcISfcI

| | | |

GTTCTCCGTTTTACGTGCAAACGACGTGTTATGGTTATCCCTTACTGCAGCAGAGTACGACCAAACCACCTACGGTAGCAGCACCAACCCGATGTACGTT < 1200 GTTCTCCGTTTTACGTGCAAACGACGTGTTATGGTTATCCCTTACTGCAGCAGAGTACGACCAAACCACCTACGGTAGCAGCACCAACCCGATGTACGTT <1200

F S V L R A N D V L W L S L T A A E Y D Q T T Y G S S T N P M Y V F S V L R A N D V L W L S L T A A E Y D Q T T Y G S S T N P M Y V

CAAGAGGCAAAATGCACGTTTGCTGCACAATACCAATAGGGAATGACGTCGTCTCATGCTGGTTTGGTGGATGCCATCGTCGTGGTTGGGCTACATGCAA CAAGAGGCAAAATGCACGTTTGCTGCACAATACCAATAGGGAATGACGTCGTCTCATGCTGGTTTGGTGGATGCCATCGTCGTGGTTGGGCTACATGCAA

1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190

AGCGACACCGTGACGTTTGTTAACGTAGCTACCGGTGCACAGGCAGTTGCACGCAGCTTAGACTGGAGCAAGGTTACCCTCGACGGTCGCCCGCTCACTA < 1300 AGCGACACCGTGACGTTTGTTAACGTAGCTACCGGTGCACAGGCAGTTGCACGCAGCTTAGACTGGAGCAAGGTTACCCTCGACGGTCGCCCGCTCACTA <1300

S D T V T F V N V A T G A Q A V A R S L D W S K V T L D G R P L T T S D T V T F V N V A T G A Q A V A R S L D W S K V T L D G R P L T T

TCGCTGTGGCACTGCAAACAATTGCATCGATGGCCACGTGTCCCTCAATCGGCGTCGAATCTGACCTCGTTCCAATGGGAGCTGCCAGCGGGCGAGTGAT TCGCTGTGGCACTGCAAACAATTGCATCGATGGCCACGTGTCCCTCAATCGGCGTCGAATCTGACCTCGTTCCAATGGGAGCTGCCAGCGGGCGAGTGAT

1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290

<FokI<FokI

<StsI<StsI

<BtsCI<BtsCI StyIStyI

| | | |

CCATCCAGCAGTACAGCAAGACCTTCTACGTTTTACCCTTACGTGGTAAGTTAAGCTTCTGGGAAGCAGGTACCACCAAGGCAGGTTACCCGTACAACTA < 1400 CCATCCAGCAGTACAGCAAGACCTTCTACGTTTTACCCTTACGTGGTAAGTTAAGCTTCTGGGAAGCAGGTACCACCAAGGCAGGTTACCCGTACAACTA <1400

I Q Q Y S K T F Y V L P L R G K L S F W E A G T T K A G Y P Y N Y I Q Q Y S K T F Y V L P L R G K L S F W E A G T T K A G Y P Y N Y

GGTAGGTCGTCATGTCGTTCTGGAAGAAGCAAAATGGGAATGCACCATTCAATTCGAAGACCCTTCGTCCATGGTGGTTCCGTCCAATGGGCATGTTGAT GGTAGGTCGTCATGTCGTTCTGGAAGAAGCAAAATGGGAATGCACCATTCAATTCGAAGACCCTTCGTCCATGGTGGTTCCGTCCAATGGGCATGTTGAT

1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390

>SfaNI> SfaNI

>BscAI> BscAI BsaBIBsaBI RsrIIRsrII

| | | | | |

CAACACCACCGCATCGGACCAGATCCTAATCGAAAACGCTGCAGGTCACCGTGTTGCAATCAGCACCTACACCACCAGCTTAGGTAGCGGTCCGGTTGCC < 1500 CAACACCACCGCATCGGACCAGATCCTAATCGAAAACGCTGCAGGTCACCGTGTTGCAATCAGCACCTACACCACCAGCTTAGGTAGCGGTCCGGTTGCC <1500

N T T A S D Q I L I E N A A G H R V A I S T Y T T S L G S G P V A N T T A S D Q I L I E N A A G H R V A I S T Y T T S L G S G P V A

GTTGTGGTGGCGTAGCCTGGTCTAGGATTAGCTTTTGCGAGGCCCAGTGGCACAAACATAGTCGTGGATGTGGTGGTTGAATCCATCGCCAGGCCAATCG GTTGTGGTGGCGTAGCCTGGTCTAGGATTAGCTTTTGCGAGGCCCAGTGGCACAAACATAGTCGTGGATGTGGTGGTTGAATCCATCGCCAGGCCAATCG

1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 1480 1490

>BbsI> BbsI

>Bbr7I> Bbr7I PmlIPmlI PshAIPshAI

| | | | | |

GTTAGCGCCGTCGGCGTCCTCGCTCCGCACTCTGCTCTCGCCCTCCTCGAAGACACCGTTGACTACCCGGCACGTGCACATACCTTTGACGACTTCTGTC < 1600 GTTAGCGCCGTCGGCGTCCTCGCTCCGCACTCTGCTCTCGCCCTCCTCGAAGACACCGTTGACTACCCGGCACGTGCACATACCTTTGACGACTTCTGTC <1600

V S A V G V L A P H S A L A L L E D T V D Y P A R A H T F D D F C P V S A V G V L A P H S A L A L L E D T V D Y P A R A H T F D D F C P

TATTCGCGGCAGCCGCAGGAGCGAGGCGTGAGACGAGAGCGGCGGGAGCTTCTGTGGCAACTGATGGGCCGTGCACGTGTATGGAAACTGCTGAAGACAG TATTCGCGGCAGCCGCAGGAGCGAGGCGTGAGACGAGAGCGGCGGGAGCTTCTGTGGCAACTGATGGGCCGTGCACGTGTATGGAAACTGCTGAAGACAG

1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590

<BsmI<BsmI DraIDraI

| | | |

CGGAATGTCGTAACTTAGGTTTACAGGGTTGTGCATTCCAATCCACCATCGCAGAACTCCAGCGTTTAAAGATGAAGGTGGGTAAGACCCGCGAATCCTA < 1700 CGGAATGTCGTAACTTAGGTTTACAGGGTTGTGCATTCCAATCCACCATCGCAGAACTCCAGCGTTTAAAGATGAAGGTGGGTAAGACCCGCGAATCCTA <1700

E C R N L G L Q G C A F Q S T I A E L Q R L K M K V G K T R E S * E C R N L G L Q G C A F Q S T I A E L Q R L K M K V G K T R E S *

GCCTTACAGCACGAAATCCAAATGTCCCAACACGTAAGGTTAGGTGGCAACGTCTTGAGGTCGCAAATTTCTACTTCCACCCATTCTGGGCGCTTATGAT GCCTTACAGCACGAAATCCAAATGTCCCAACACGTAAGGTTAGGTGGCAACGTCTTGAGGTCGCAAATTTCTACTTCCACCCATTCTGGGCGCTTATGAT

1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 1690

BamHIBamHI

| |

ATGAcggatccggctgcaa < 1719 ATGAcggatccggctgcaa <1719

* R I R L Q * R I R L Q

TACTgcctaggccgacgtt TACTgcctaggccgacgtt

1710 1710

<---<---

Claims

1. A method of obtaining a recombinant capsid protein of hepatitis E virus genotype 3 (PORF2), including:

1) creation of a synthetic gene encoding PORF2 carrying substitutions in the amino acid sequence characteristic of HEV strains circulating in the Russian Federation (L284P, S324T, Y354H, S357G, I364V, G490N, V492M, S497T, T517S, S527T, F537Y), the nucleotide sequence of which is optimized for expression in E. coli;

2) cultivation of the producer strain containing the DNA sequence encoding the ORF2 protein under conditions suitable for the expression of the specified protein, isolation and purification of the target protein,

characterized in that the recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) / PORF2 strain is cultivated, containing the DNA sequence integrated into the expression vector, including the recombinant gene encoding the PORF2 polypeptide with the amino acid sequence SEQ ID # 1, under the control of the hybrid promoter and regulatory sequences of T7 RNA polymerase in conditions of self-induction with alpha-lactose, and after isolation and purification, the PORF2 protein is obtained in the form of a VLP consisting of monomers with a monomer molecular weight of 60.9 kDa.

2. Recombinant vaccine for the prevention of viral hepatitis E, containing an effective amount of the capsid protein of the hepatitis E virus, an adjuvant and a physiologically acceptable diluent, characterized in that the vaccine contains the PORF2 protein with the amino acid sequence SEQ ID # 1, obtained by the method according to p. 1.