RU2744198C1 - Set for detecting sars-cov virus by real-time rt-pcr method - Google Patents
Set for detecting sars-cov virus by real-time rt-pcr method Download PDFInfo
- Publication number
- RU2744198C1 RU2744198C1 RU2020118246A RU2020118246A RU2744198C1 RU 2744198 C1 RU2744198 C1 RU 2744198C1 RU 2020118246 A RU2020118246 A RU 2020118246A RU 2020118246 A RU2020118246 A RU 2020118246A RU 2744198 C1 RU2744198 C1 RU 2744198C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cov
- sars
- pcr
- coronavirus
- rna
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к диагностике инфекционных заболеваний, в частности к проблеме выявления генетических маркеров коронавируса вида SARS-CoV-2.The invention relates to biotechnology and medicine, namely to the diagnosis of infectious diseases, in particular to the problem of identifying genetic markers of the SARS-CoV-2 coronavirus.
Заболевание COVID-19, вызываемое коронавирусом вида SARS-CoV-2, как правило сопровождается повышением температуры тела, утомляемостью и сухим кашлем. В отдельных случаях отмечаются заложенность носа, насморк, фарингит или диарея. Обычно эти симптомы носят слабо выраженный характер. В некоторых случаях заболевание протекает бессимптомно. Примерно в 15% случаев возникает тяжелая симптоматика с развитием дыхательной недостаточности. У пожилых людей, а также лиц с имеющимися соматическими заболеваниями, например, артериальной гипертензией, заболеваниями сердца или диабетом, вероятность тяжелого течения заболевания выше. В 3% случаев заболевание заканчивается летальным исходом.The disease COVID-19, caused by the SARS-CoV-2 coronavirus, is usually accompanied by fever, fatigue and a dry cough. In some cases, nasal congestion, runny nose, pharyngitis, or diarrhea are noted. Usually these symptoms are mild. In some cases, the disease is asymptomatic. In about 15% of cases, severe symptoms develop with the development of respiratory failure. Older people and those with pre-existing medical conditions such as hypertension, heart disease, or diabetes are more likely to develop severe illness. In 3% of cases, the disease ends in death.
В виду того, что COVID-19 является высококонтагиозной, а ее распространение вызвало мировую пандемию, ее точная диагностика является актуальной проблемой.In view of the fact that COVID-19 is highly contagious, and its spread caused a global pandemic, its accurate diagnosis is an urgent problem.
Известны несколько наборов для выявления коронавируса вида SARS-CoV-2: РеалБест РНК вида SARS-CoV-2, Вектор-ПЦРрв-2019-nCoV-RG, АмплиТест SARS-CoV-2, SBT-DX-SARS-CoV-2 и другие (https://roszdravnadzor.ru/).There are several known kits for detecting SARS-CoV-2 coronavirus: RealBest RNA SARS-CoV-2, Vector-PCRrv-2019-nCoV-RG, AmpliTest SARS-CoV-2, SBT-DX-SARS-CoV-2 and others (https://roszdravnadzor.ru/).
Целью создания предлагаемого нами набора является расширение арсенала средств, используемых для диагностики COVID-19.The purpose of creating the kit we offer is to expand the arsenal of tools used to diagnose COVID-19.
Технической задачей изобретения являлась разработка высокочувствительного набора, основанного на методе ОТ-ПЦР в режиме реального времени, для идентификации генетического материала коронавируса вида SARS-CoV-2 в биологических образцах и других вируссодержащих пробах (культуральная вируссодержащая жидкость, и т.д).The technical objective of the invention was the development of a highly sensitive kit based on the RT-PCR method in real time, for the identification of the genetic material of the SARS-CoV-2 coronavirus in biological samples and other virus-containing samples (culture virus-containing liquid, etc.).
Поставленная задача решалась путем: конструирования диагностических праймеров и флуоресцентно-меченного зонда на консервативный участок гена РНК-зависимой РНК полимеразы SARS-CoV-2; конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК и М82-фага, несущих специфический участок ДНК- и РНК-матрицы; оптимизации концентраций компонентов реакционной смеси и условий проведения ПНР.The task was solved by: designing diagnostic primers and a fluorescently-labeled probe for the conserved region of the gene for RNA-dependent RNA polymerase SARS-CoV-2; constructing recombinant plasmid DNA and M82 phage carrying a specific region of the DNA and RNA template; optimization of the concentrations of the components of the reaction mixture and the conditions of the commissioning.
Авторами предложен набор, согласно которому выделенную из биологических образцов (кровь и ее производные, мазок из носоглотки, мазок из ротоглотки, мокрота) РНК анализируют в двухстадийной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции для целевых фрагментов РНК генома коронавируса вида SARS-CoV-2 с использованием набора олигонуклеотидных праймеров и соответствующего флуоресцентно меченного зонда, комплементарных участку гена РНК-зависимой РНК полимеразы SARS-CoV-2.The authors proposed a set according to which RNA isolated from biological samples (blood and its derivatives, nasopharyngeal swab, oropharyngeal swab, sputum) is analyzed in a two-step reverse transcription reaction and polymerase chain reaction for target RNA fragments of the SARS-CoV-2 coronavirus genome with using a set of oligonucleotide primers and an appropriate fluorescently labeled probe, complementary to the region of the RNA-dependent RNA polymerase SARS-CoV-2 gene.
Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла Ct, причем результат считают положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имеет характерную «сигмовидную» форму и пересекает пороговую линию.The analysis of the results is carried out using the software of the used device for carrying out PCR with hybridization-fluorescence detection in "real time". The results are interpreted on the basis of the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level, which corresponds to the presence or absence of the threshold cycle Ct value, and the result is considered positive if the fluorescence accumulation curve for the corresponding sample has a characteristic "sigmoid" shape and crosses threshold line.
На начальном этапе были подобрана и синтезирована 1 пара специфических олигонуклеотидных праймеров и зонд для гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов ПЦР. Для этого в базе данных NCBI Mega BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/) был выбран наиболее консервативный участок генома SARS-CoV-2. Были проанализированы все имеющиеся в базе данных последовательности. Также были подобраны праймеры и флуоресцентный зонд для ВКО в качестве внутреннего контроля ПЦР. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда представлены в Таблице 1 и Таблице 2.At the initial stage, 1 pair of specific oligonucleotide primers and a probe for hybridization-fluorescence detection of PCR products were selected and synthesized. For this, the most conserved region of the SARS-CoV-2 genome was selected in the NCBI Mega BLAST database (http: //www.ncbi.nlm.nih. Gov /). All sequences in the database were analyzed. We also selected primers and a fluorescent probe for ICR as an internal PCR control. The sequences of the oligonucleotide primers and fluorescent probe are shown in Table 1 and Table 2.
Подбор и анализ свойств олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда проводился с использованием программного обеспечения Oligonucleotide Properties Calculator и MFold.The selection and analysis of the properties of oligonucleotide primers and a fluorescent probe was carried out using the Oligonucleotide Properties Calculator and MFold software.
Для контроля качества прохождения этапов обратной транскрипции и ПЦР в состав методики были введены рекомбинантные положительные контрольные образцы K+ и ПКО и внутренний контрольный образец (ВКО). Матрицу для создания рекомбинантных положительных контрольных образцов получали синтетическим методом на основе ампликона, включающего в себя диагностическую область-мишень и фланкирующие последовательности нуклеотидов. Ампликон получали методом ПЦР в один шаг.Конечный ПЦР-продукт лигировали в плазмидный вектор pGEM-T («Promega», USA) под контролем промотора Т7 РНК полимеразы и трансформировали им Escherichia coli (штамм XLl-Blue). Рекомбинантные плазмиды из индивидуальных клонов проверяли на правильность ориентации целевой последовательности и отсутствие мутаций в области посадки праймеров и зонда. Проверку осуществляли методом секвенирования по Сэнгеру с помощью прибора для автоматического капиллярного секвенирования ABI PRISM 3500xl («Applied Biosystems», США). Соответствующие заданным критериям рекомбинантные плазмиды использовали для приготовления положительного контрольного образца этапа ПЦР (К+). Для этого определяли концентрацию ДНК в растворе рекомбинантной плазмиды и разводили стерильной водой до рабочей концентрации 1*106 - 1*107 копий/мл. Также данные рекомбинантные плазмиды использовались для получения рекомбинантного РНК-содержащего положительного контрольного образца с защитной белковой оболочкой MS2-фага (ПКО). Для полученного продукта также производили определение концентрации, затем разводили РНК-буфером (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия) до рабочей концентрации 1*106 - 5*107 копий/мл, которую использовали в качестве препарата ПКО. Оценку аналитической чувствительности способа производили на разведениях РНК-содержащего рекомбинантного положительного контрольного образца (ПКО), из которых экстрагировали РНК с помощью набора для выделения нуклеиновых кислот «Рибо-Преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия), а затем с помощью специфических праймеров и флуоресцентных зондов определяли минимальное разведение, детектируемое как положительное в 100% случаев. Определенная таким образом аналитическая чувствительность способа составила 5*103 ГЭ/мл.To control the quality of the passage of the stages of reverse transcription and PCR, recombinant positive control samples K + and PCR and an internal control sample (ICR) were introduced into the method. A matrix for creating recombinant positive control samples was obtained by a synthetic method based on an amplicon, which includes a diagnostic target region and flanking nucleotide sequences. Amplicon was obtained by PCR in one step. The final PCR product was ligated into the plasmid vector pGEM-T (Promega, USA) under the control of the T7 RNA polymerase promoter and transformed into Escherichia coli (strain XLl-Blue). Recombinant plasmids from individual clones were checked for the correct orientation of the target sequence and the absence of mutations in the region of primer and probe landing. The verification was carried out by the Sanger sequencing method using an ABI PRISM 3500xl automatic capillary sequencing device (Applied Biosystems, USA). Recombinant plasmids meeting the specified criteria were used to prepare a positive control sample of the PCR step (K +). For this, the concentration of DNA in the solution of the recombinant plasmid was determined and diluted with sterile water to a working concentration of 1 * 10 6 - 1 * 10 7 copies / ml. Also, these recombinant plasmids were used to obtain a recombinant RNA-containing positive control sample with a protective protein coat of the MS2 phage (PCO). For the obtained product, the concentration was also determined, then it was diluted with RNA buffer (FBSI Central Research Institute of Epidemiology, Russia) to a working concentration of 1 * 10 6 - 5 * 10 7 copies / ml, which was used as a PKO preparation. The analytical sensitivity of the method was assessed on dilutions of an RNA-containing recombinant positive control sample (PCO), from which RNA was extracted using a set for the isolation of nucleic acids "Ribo-Prep" (FBUN Central Research Institute of Epidemiology, Russia), and then using specific primers and fluorescent probes determined the minimum dilution, detected as positive in 100% of cases. The analytical sensitivity of the method determined in this way was 5 * 10 3 GE / ml.
Аналитическую специфичность набора оценивали с помощью панели нуклеиновых кислот 4 респираторных вирусов (таблица 3). В результате исследования перекрестных реакций не зафиксировано.The analytical specificity of the kit was assessed using the 4 respiratory virus nucleic acid panel (Table 3). As a result of the study, cross-reactions were not recorded.
Таким образом, в результате проведенных исследований был разработан и апробирован набор выявления РНК коронавируса вида SARS-CoV-2 в различных видах биологического материала.Thus, as a result of the research carried out, a kit for the detection of RNA of the SARS-CoV-2 coronavirus in various types of biological material was developed and tested.
Технический результат достигается путем определения РНК коронавируса вида SARS-CoV-2, включающим выделение РНК исследуемой пробы, проведение обратной транскрипции и ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, согласно изобретению.The technical result is achieved by determining the RNA of the coronavirus of the SARS-CoV-2 type, including the isolation of the RNA of the test sample, carrying out reverse transcription and PCR taking into account the results in real time, according to the invention.
Диагностика проводится следующим образом: Подготовку проб проводят согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Материалом для исследования могут служить: клинические и биологические образцы. Экстракция производится из 100 мкл полученной суспензии образца с лизирующим буфером на основе 6 моль гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения РНК, и последующим инкубированием 5 минут при температуре (65±1)°C. Выделение РНК осуществляют с помощью наборов «Рибо-преп» и «Рибо-Сорб» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия) в соответствии с инструкциями к наборам. Во все пробирки, включая контроль выделения, на этапе прогревания в лизирующем буфере добавляют 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО).Diagnostics is carried out as follows: Sample preparation is carried out according to MU 1.3.2569-09 "Organization of the work of laboratories using methods of amplification of nucleic acids when working with material containing microorganisms of I-IV pathogenicity groups". Research material can be clinical and biological samples. Extraction is performed from 100 μl of the obtained suspension of the sample with lysis buffer based on 6 mol of guanidine isothiocyanate in the volume specified in the instructions for the kit for RNA isolation, followed by incubation for 5 minutes at a temperature of (65 ± 1) ° C. Isolation of RNA is carried out using the kits "Ribo-prep" and "Ribo-Sorb" (FBSI Central Research Institute of Epidemiology, Russia) in accordance with the instructions for the kits. In all tubes, including the release control, at the stage of warming up in lysis buffer, add 10 μl of an internal control sample (ICR).
После выделения РНК приступают к постановке ОТ-ПЦР. Для упрощения и стандартизации подготовки реактивов в тест-систему входят 8 смесей. Реактив Amp 1RT представляет из себя буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0 (при 25°C), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол, 50% (v/v) глицерин и 0.1% (v/v) NP-40, ингибитор РНКаз, M-MuLV - RH ревертаза и HS-Taq ДНК-полимераза. Реактив Amp 1B представляет из себя буферный раствор, содержащий 100 мМ Трис-HCl, рН 8.3 (при 25°C), 150 мМ KCl, 0,6 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 10 мМ MgCl2, 8 мМ ДТТ, стабилизаторы и усилители ферментов. Реактив Amp 2 содержит олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды к коронавирусу вида SARS-CoV-2 и к ВКО. К+ представляет собой смесь двух типов кДНК: кДНК SARS-Cov-2 и кДНК ВКО, содержащих специфическую последовательность нуклеотидов ДНК, амплифицируемую с участием Реактива Amp 2. К- представляет собой дистиллированную стерильную воду. ПКО представляет собой псевдовирусные частицы на основе MS2 фага, содержащие фрагмент РНК SARS-CoV-2, амплифицируемый с участием Реактива Amp 2. ОКО - дистиллированная стерильная вода. ВКО представляет собой псевдовирусные частицы на основе MS2 фага, содержащие генетическую последовательность артифициальной РНК, амплифицируемую с участием праймеров к ВКО и детектируемую с участием зондов к ВКО в составе Реактива Amp 2. Все реактивы, кроме ПКО и ВКО, хранятся при температуре -20°C. ПКО и ВКО хранятся при температуре +4°C.After RNA isolation, RT-PCR is started. To simplify and standardize the preparation of reagents, the test system includes 8 mixtures. Amp 1RT reagent is a buffer solution containing 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 (at 25 ° C), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM dithiothreitol, 50% (v / v) glycerol, and 0.1% (v / v) NP-40, RNase inhibitor, M-MuLV - RH revertase and HS-Taq DNA polymerase. Reagent Amp 1B is a buffer solution containing 100 mM Tris-HCl, pH 8.3 (at 25 ° C), 150 mM KCl, 0.6 mM each deoxynucleoside triphosphate, 10 mM MgCl2, 8 mM DTT, stabilizers and enzyme enhancers. Reagent Amp 2 contains oligonucleotide primers and fluorescently labeled oligonucleotide probes for the SARS-CoV-2 coronavirus and for VKO. K + is a mixture of two types of cDNA: SARS-Cov-2 cDNA and VKO cDNA, containing a specific DNA nucleotide sequence amplified with the participation of Reagent Amp 2. K- is distilled sterile water. PCO is a pseudoviral particles based on MS2 phage containing a SARS-CoV-2 RNA fragment amplified with the participation of Reagent Amp 2. OKO - distilled sterile water. VKO is pseudoviral particles based on the MS2 phage containing the genetic sequence of artifactual RNA, amplified with primers to VKO and detected with the participation of probes for VKO as part of Reagent Amp 2. All reagents, except VKO and VKO, are stored at -20 ° C ... PKO and VKO are stored at + 4 ° C.
Для постановки реакции ОТ-ПЦР в реальном времени отбирают необходимое количество микропробирок объемом 0,2 мл, соответствующее числу исследуемых проб, а также четыре пробирки для положительных и отрицательных контролей. Далее по числу исследуемых проб смешивают реакционные смеси: 1 мкл реактив Amp1RT, 12,5 мкл реактив Amp1B, 1,5 мкл реактив Amp2. По 15 мкл полученной смеси вносят в подготовленные пробирки, затем добавляют 10 мкл РНК-пробы, экстрагированной из исследуемого материала. Готовят 4 контрольные реакции. Для этого в пробирку для положительного контроля ПЦР вносят 10 мкл К+, в пробирку для положительного контроля обратной транскрипции вносят 10 мкл образца, экстрагированного из ПКО. В пробирку для отрицательного контроля ПЦР вносят 10 мкл К-, в пробирку для отрицательного контроля экстракции вносят 10 мкл пробы, экстрагированной из ОКО. Конечный объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Микропробирки переносят в программируемый амплификатор с функцией амплификации в режиме «реального времени» с наличием 2 каналов детекции флуоресценции (FAM/SybrGreen/Green и JOE/HEX). Режим амплификации представлен в таблице 4.To set up a real-time RT-PCR reaction, take the required number of 0.2 ml microtubes corresponding to the number of samples under study, as well as four tubes for positive and negative controls. Next, according to the number of test samples, mix the reaction mixtures: 1 μl Amp1RT reagent, 12.5 μl Amp1B reagent, 1.5 μl Amp2 reagent. 15 μl of the resulting mixture is added to prepared test tubes, then 10 μl of RNA sample extracted from the test material is added. Prepare 4 control reactions. For this, 10 μl of K + is added to a test tube for a positive control of PCR, and 10 μl of a sample extracted from a PCR is added to a test tube for a positive control of reverse transcription. In the tube for the negative control of PCR add 10 μl of K-, in the tube for the negative control of extraction add 10 μl of the sample extracted from the OKO. The final volume of the reaction mixture is 25 μl. The microtubes are transferred to a programmable amplifier with real-time amplification with 2 fluorescence detection channels (FAM / SybrGreen / Green and JOE / HEX). The amplification mode is shown in Table 4.
Детекцию флуоресцентного сигнала производят при 57°C по каналам Green (FAM) и Yellow (JOE/HEX).The fluorescent signal is detected at 57 ° C through the Green (FAM) and Yellow (JOE / HEX) channels.
Учет и анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора на основании отсутствия или наличия сигнала флуоресценции в исследуемых пробах по детектируемым каналам. Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считают положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имеет характерную «сигмовидную» форму и пересекает пороговую линию. Накопление флуоресцентного сигнала по каналу JOE свидетельствует о наличии в исследуемом материале РНК коронавируса вида SARS-CoV-2. При этом результат считается валидным, если параллельно в пробе по каналу FAM регистрируется накопление флуоресцентного сигнала ВКО, а в образцах К+ и ПКО - по каналу JOE. Сигнал по каналу JOE в образцах К- и ОКО должен отсутствовать.The accounting and analysis of the results is carried out using the software of the device based on the absence or presence of a fluorescence signal in the test samples through the detected channels. The results are interpreted on the basis of the presence (or absence) of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line set at the appropriate level, which corresponds to the presence (or absence) of the Ct value in the corresponding column in the table of results. The result is considered positive if the fluorescence accumulation curve for the corresponding sample has a characteristic "sigmoid" shape and crosses the threshold line. The accumulation of the fluorescent signal through the JOE channel indicates the presence of SARS-CoV-2 coronavirus in the RNA material under study. In this case, the result is considered valid if, in parallel, in the sample through the FAM channel, the accumulation of the IQO fluorescent signal is recorded, and in the samples K + and PKO - through the JOE channel. The signal on the JOE channel in the K- and OKO samples should be absent.
Сущность изобретения поясняется чертежом, где на ФИГ. 1 представлены кривые флуоресценции, отражающие динамику образования продукта реакции при анализе образцов РНК коронавируса вида SARS-CoV-2. Каждая кривая выше пороговой линии отображает положительный результат на выявление в образце РНК коронавируса вида SARS-CoV-2, каждая кривая ниже пороговой линии отображает отрицательные контроли, не содержащие РНК коронавируса вида SARS-CoV-2.The essence of the invention is illustrated by the drawing, where in FIG. 1 shows the fluorescence curves reflecting the dynamics of the formation of the reaction product during the analysis of RNA samples of the SARS-CoV-2 coronavirus. Each curve above the threshold line represents a positive result for detecting SARS-CoV-2 coronavirus in the RNA sample, each curve below the threshold line represents negative controls that do not contain SARS-CoV-2 coronavirus RNA.
Таким образом, заявляемый набор позволяет достоверно выявлять РНК коронавируса вида SARS-CoV-2в клинических пробах.Thus, the claimed kit allows for reliable detection of SARS-CoV-2 coronavirus RNA in clinical trials.
Ниже приведен перечень последовательностей синтетических олигонуклеотидов и флуоресцентно меченого зонда.Below is a sequence listing of synthetic oligonucleotides and a fluorescently labeled probe.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020118246A RU2744198C1 (en) | 2020-05-25 | 2020-05-25 | Set for detecting sars-cov virus by real-time rt-pcr method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020118246A RU2744198C1 (en) | 2020-05-25 | 2020-05-25 | Set for detecting sars-cov virus by real-time rt-pcr method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2744198C1 true RU2744198C1 (en) | 2021-03-03 |
Family
ID=74857712
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020118246A RU2744198C1 (en) | 2020-05-25 | 2020-05-25 | Set for detecting sars-cov virus by real-time rt-pcr method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2744198C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2761025C1 (en) * | 2021-07-26 | 2021-12-02 | Евгений Олегович Рубальский | Set of synthetic oligonucleotides for detecting coronavirus rna |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2460803C2 (en) * | 2010-10-27 | 2012-09-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) | Differential diagnostic technique for respiratory viral infections by real-time multiplex pcr and sequence list for implementation thereof |
| CN111118226A (en) * | 2020-03-25 | 2020-05-08 | 北京微未来科技有限公司 | Novel coronavirus whole genome capture method, primer group and kit |
| CN111139317A (en) * | 2020-03-13 | 2020-05-12 | 欧陆分析技术服务(苏州)有限公司 | Multiplex fluorescent quantitative PCR detection kit and detection method for SARS-COV-2 virus |
| RU2720713C9 (en) * | 2020-03-27 | 2020-05-18 | Евгений Олегович Рубальский | Set of synthetic oligonucleotides for detecting of coronavirus rna |
-
2020
- 2020-05-25 RU RU2020118246A patent/RU2744198C1/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2460803C2 (en) * | 2010-10-27 | 2012-09-10 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) | Differential diagnostic technique for respiratory viral infections by real-time multiplex pcr and sequence list for implementation thereof |
| CN111139317A (en) * | 2020-03-13 | 2020-05-12 | 欧陆分析技术服务(苏州)有限公司 | Multiplex fluorescent quantitative PCR detection kit and detection method for SARS-COV-2 virus |
| CN111118226A (en) * | 2020-03-25 | 2020-05-08 | 北京微未来科技有限公司 | Novel coronavirus whole genome capture method, primer group and kit |
| RU2720713C9 (en) * | 2020-03-27 | 2020-05-18 | Евгений Олегович Рубальский | Set of synthetic oligonucleotides for detecting of coronavirus rna |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2761025C1 (en) * | 2021-07-26 | 2021-12-02 | Евгений Олегович Рубальский | Set of synthetic oligonucleotides for detecting coronavirus rna |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics | |
| CN111286559B (en) | Primer, probe and kit for detecting African swine fever virus | |
| Wu et al. | Development and application of a droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) for detection and investigation of African swine fever virus | |
| US20240026438A1 (en) | Detection of nucleic acids using direct rt-pcr from biological samples | |
| CN112226536A (en) | CRISPR-Cas13 system for detecting novel coronavirus and kit and method thereof | |
| Furuya et al. | Quantitative PCR detection of feline morbillivirus in cat urine samples | |
| US9617606B2 (en) | Oligonucleotide for HIV detection, HIV detection kit, and HIV detection method | |
| JP2006223234A (en) | Method for testing gene | |
| CN112359145A (en) | Multiple primers and kit for rapidly detecting influenza A, influenza B and novel coronavirus | |
| CN110373502B (en) | Complete set of nucleic acid, kit and detection method for detecting Hantaan virus by RPA | |
| RU2744198C1 (en) | Set for detecting sars-cov virus by real-time rt-pcr method | |
| CN110878381A (en) | Primer composition, kit and method for detecting mycoplasma bovis and infectious bovine rhinotracheitis virus | |
| CN111378787A (en) | Novel coronavirus detection method | |
| Callison et al. | Rapid differentiation of avian infectious bronchitis virus isolates by sample to residual ratio quantitation using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction | |
| RU2816270C2 (en) | Method of detecting nipah virus using real-time rt-pcr | |
| CN113817870A (en) | Primer composition for simultaneously detecting seven respiratory tract-related viruses and application thereof | |
| RU2744187C1 (en) | Method for tick-borne encephalitis virus detection by real-time rt-pcr method | |
| CN113046463A (en) | Primer probe combination and application of candida, PCR reaction solution, kit and method | |
| JP6853523B2 (en) | PCR using helicase | |
| RU2795939C2 (en) | Reagent kit for detection of sars-cov-2 virus rna by real-timr polymerase chain reaction | |
| RU2772362C1 (en) | TEST SYSTEM FOR DETECTION OF SARS-CoV-2 OF OMICRON LINE BY SINGLE-STEP POLYMERASE CHAIN REACTION WITH REVERSE TRANSCRIPTION | |
| RU2744665C1 (en) | Method for detecting lujo virus rna by reverse transcription and polymerase chain reaction, taking into account real-time results | |
| RU2765497C1 (en) | SET FOR IDENTIFYING SARS-CoV-2 CORONAVIRUS | |
| RU2778855C1 (en) | Set of oligonucleotide primers and fluorescently labeled probes for the identification of human coronavirus sars-cov-2 rna by isothermal pcr with real-time hybridization-fluorescence detection | |
| Jyothy et al. | REAL-TIME PCR OR QUANTITATIVE PCR (QPCR)–A REVOLUTION IN MODERN SCIENCE |