RU2743851C1

RU2743851C1 - Diagnostic technique for endothelial dysfunction in pregnant women

Info

Publication number: RU2743851C1
Application number: RU2020113194A
Authority: RU
Inventors: Алексей Валентинович Миронов; Мадина Мусаевна Умаханова; Амирхан Михайлович Торчинов; Александр Васильевич Жукоцкий
Priority date: 2020-03-27
Filing date: 2020-03-27
Publication date: 2021-02-26

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: invention refers to medicine and can be used for diagnosing endothelial dysfunction in pregnant women. That is ensured by centrifugation of patient's venous blood, separation of non-platelet plasma and desquamated endotheliocytes. That is combined with desoxamated endotheliocyte morphometry. Average equivalent diameter of desquamated endotheliocytes is determined. Mean equivalent diameter of desquamated endotheliocytes more than 30 mcm is evaluated as an indicator of normal functional state of endothelium. Mean equivalent diameter of desquamated endotheliocytes 30 mcm and less is an indicator of endothelial dysfunction in pregnant women.

EFFECT: invention enables higher accuracy of cytological diagnostics of endothelial dysfunction and provides early diagnosis of vascular disorders in pregnant women.

1 cl, 6 dwg, 6 ex

Description

Изобретение относится к медицине, а именно, к лабораторной диагностике в акушерстве, и может быть использовано для обнаружения эндотелиальной дисфункции у беременных.The invention relates to medicine, namely, to laboratory diagnostics in obstetrics, and can be used to detect endothelial dysfunction in pregnant women.

Течение беременности определяется полноценностью кровотока в системе мать-плацента-плод, нарушение маточно-плацентарных отношений лежит в основе развития акушерской и перинатальной патологии. На современном этапе в исследованиях большое внимание уделяется интиме сосудов: эндотелий представляет собой аппарат, объединяющий основные компоненты гомеостаза в системе микроциркуляции фетоплацентарного комплекса. В научной литературе встречается большое количество работ, подтверждающих роль эндотелиальной дисфункции в развитии патологии беременности (преждевременное прерывание беременности, преэклапсия, фетоплацентарная недостаточность, СЗРП и т.д.) [Сидорова, И.С., Никитина, Н.А. Особенности патогенеза эндотелиоза при преэклампсии // Акушерство и гинекология. - 2015. - №1. - С. 72-78; Зиганшина, М.М. Аутоантитела к антигенам эндотелия при преэклампсии / М.М. Зиганшина, Н.В. Шилова, Н.Р. Хасбиуллина и др. // Акушерство и гинекология, 2016. - №3. - С. 24-31; Моисеева, И.В., Мансур-Хассан, С.Х. Функциональные показатели эндотелия в динамике физиологической беременности у женщин (по данным реактивной пробы плечевой артерии) // Аспирантский вестник Поволжья. - 2015. - №3-4. - С. 78-82; George, Е.М., Granger, J.P. Endothelin: Key mediator of hypertension in preeclampsia // Am J Hypertens. - 2011. - 24(29). P. 964-969; Karthikeyan, V.J., Lip, G.Y. Endothelial damage/dysfunction and hypertension in pregnancy. Front. Biosci. (Elite Ed). - 2011. - №3. - P. 1100-1108 и др.]. Перинатальная медицина сегодня зачастую позволяет диагностировать осложнения беременности только при появлении клинической симптоматики, методы диагностики не всегда совершенны, а первичная профилактика отсутствует. Это диктует необходимость в разработке новых методов ранней диагностики акушерской и перинатальной патологии.The course of pregnancy is determined by the completeness of blood flow in the mother-placenta-fetus system, a violation of the uteroplacental relationship is the basis for the development of obstetric and perinatal pathology. At the present stage in research, much attention is paid to the intima of the vessels: the endothelium is an apparatus that combines the main components of homeostasis in the microcirculation system of the fetoplacental complex. In the scientific literature, there is a large number of works confirming the role of endothelial dysfunction in the development of pregnancy pathology (premature termination of pregnancy, preeclapsia, fetoplacental insufficiency, FGR, etc.) [Sidorova, IS, Nikitina, N.А. Features of the pathogenesis of endotheliosis in preeclampsia // Obstetrics and gynecology. - 2015. - No. 1. - S. 72-78; Ziganshina, M.M. Autoantibodies to endothelial antigens in preeclampsia / M.M. Ziganshina, N.V. Shilova, N.R. Khasbiullina et al. // Obstetrics and gynecology, 2016. - №3. - S. 24-31; Moiseeva, I.V., Mansur-Hassan, S.Kh. Functional indicators of endothelium in the dynamics of physiological pregnancy in women (according to the reactive test of the brachial artery) // Postgraduate Bulletin of the Volga Region. - 2015. - No. 3-4. - S. 78-82; George, E. M., Granger, J.P. Endothelin: Key mediator of hypertension in preeclampsia // Am J Hypertens. - 2011 .-- 24 (29). P. 964-969; Karthikeyan, V.J., Lip, G.Y. Endothelial damage / dysfunction and hypertension in pregnancy. Front. Biosci. (Elite Ed). - 2011. - No. 3. - P. 1100-1108, etc.]. Perinatal medicine today often makes it possible to diagnose complications of pregnancy only when clinical symptoms appear, diagnostic methods are not always perfect, and there is no primary prevention. This dictates the need to develop new methods for early diagnosis of obstetric and perinatal pathology.

Многими авторами изучалась роль маркеров нарушения эндотелия при сердечно-сосудистых заболеваниях, сахарном диабете, нарушениях мозгового кровообращения, метаболическом синдроме, почечной патологии [Асташев, П.Е., Гудымович, В.Г. Маркеры эндотелиальной дисфункции как прогностический признак течения внутрисердечного инфекционного процесса // Вестник Национального медико-хирургического Центра им. Н.И. Пирогова. - 2011. - Т. 6. - №3. - С. 3-8; 115; Сушкина, И.Ф. Сравнительная оценка состояния микрогемодинамики и вазомоторной функции эндотелия у пациентов ИБС и практически здоровых лиц разного возраста / И. Ф.Сушкина, И.О. Халявкина, Я.А.Хананашвили и др. // Вестник ВолгГМУ. - 2014. - Выпуск 2 (50). - С. 63-65; 123; Феоктистова, B.C. Новый подход к оценке дисфункции эндотелия: определение количества циркулирующих эндотелиальных клеток методом проточной цитометрии / В.С. Феоктистова, Т.В. Вавилова, О.В. Сироткина и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2015. - Т.60, №4. - С. 23-27; Fadini, G.P. Reduced endothelial progenitor cells and brachial artery flow-mediated dilation as evidence of endothelial dysfunction in ocular hypertension and primary open-angle glaucoma / G.P. Fadini, C. Pagano, I. Baesso, O. Kotsafti, D. Doro et al. // Acta Ophthalmol. - 2010. - Vol.88. - P. 135-141; Lampka, M., Grabczewska, Z.,

E. Circulating endothelial cells in coronary artery disease. Kardiologia Polska. - 2010. - Vol. 68(10). - P.l100-1105; Jim, B. Hypertension in pregnancy / B.Jim, S.Sharma, T.Kebede et al. // Semin. Perinatol. 2012. - 36(1). - P. 56-9 и др.]. Как правило, состояние сосудистого эндотелия оценивается по количеству циркулирующих десквамированных эндотелиоцитов, уровню метаболитов оксида азота, концентрации С-реактивного белка или фактора фон Виллебранда в плазме крови, уровня альбумина в моче и т.п., либо с помощью выявления нарушений вазомоторной функции эндотелия инструментальными методами исследования. Следует констатировать, что применение классических методов диагностики эндотелиальной дисфункции в акушерстве имеет некоторые недостатки: микроциркуляторное русло во время беременности претерпевает изменения, что необходимо учитывать при интерпретации результатов диагностики сосудодвигательной функции эндотелия, кроме того, введение вазоактивных препаратов функциональных проб не всегда допустимо у беременных, т.к. связано с возможностью негативного влияния на плод. Биохимическая диагностика эндотелиальной дисфункции также имеет ограничения. Состояние эндотелиоцитов теоретически может оцениваться по снижению синтеза оксида азота - прямого показателя функции эндотелия, что, однако, лимитировано нестабильностью и коротким периодом жизни молекулы NO. Остальные же биохимические маркеры дают косвенную оценку функции эндотелия, т.к. сопровождают течение множества других сосудистых заболеваний или коагулопатий, а при беременности изменяют свою концентрацию и в физиологических условиях: Диагностический метод, базирующийся на морфологической характеристике эндотелия, представляется перспективным вектором изучения сосудистых нарушений у беременных. Эндотелиоциты являются лабильными биоструктурами, что позволяет использовать регистрацию их морфологических изменений в качестве информативного критерия нарушений в микрососудистом русле. Десквамированные эндотелиоциты - это эндотелиальные клетки, которые отделяются от стенки сосуда, циркулируют в кровотоке и являются репрезентативным объектом цитологической диагностики системного поражения сосудистой системы. Количество циркулирующих эндотелиоцитов в периферической крови в норме очень мало, т.к. процесс самообновления интимы сосудов проходит медленно, а десквамированные клетки интенсивно разрушаются ретикулоэндотелиальной системой. Продолжительность нахождения десквамированных эндотелиоцитов в крови составляет около 24-42 часа, в течение которых происходит их захват и разрушение макрофагами печени, легких и селезенки [Козловский, В.И. Методы определения числа циркулирующих в крови эндотелиоцитов (методические рекомендации)/ В.И. Козловский, А.П. Солодков, О.Д. Мяделец и др. - Издание Витебского государственного медицинского университета, 2008. - 29 с,]. Тем не менее, отмечается повышение концентрации этих клеток в периферической кровотоке при заболеваниях, сопровождающихся сосудистыми нарушениями (сахарный диабет, сердечно-сосудистые заболевания, нарушение мозгового кровообращения, васкулиты и т.п.). Десквамированные эндотелиальные клетки имеют плоскую форму и обладают выраженной морфологической неоднородностью: толщина клетки составляет 1-2 мкм, диаметр варьирует от 10 до 50 мкм. Доказано, что основным механизмом поражения эндотелиоцитов при эндотелиальной дисфункции является апоптоз [Герилович, Л.А. Эндотелин-1 у пациенток с различными формами бесплодия в программах вспомогательных репродуктивных технологий / Л.А. Герилович, М.И. .Базина, А.Т. Егорова и др. // Медицина и образование в Сибири. - 2013. - №6. - С. 19], морфологическими критериями которого являются уменьшение объема цитоплазмы и ядра с последующей фрагментацией клетки и формированием апоптозных телец.Many authors studied the role of endothelial disruption markers in cardiovascular diseases, diabetes mellitus, cerebrovascular accidents, metabolic syndrome, renal pathology [Astashev, P.E., Gudymovich, V.G. Markers of endothelial dysfunction as a prognostic sign of the course of the intracardiac infectious process // Bulletin of the National Medical and Surgical Center named after V.I. N.I. Pirogov. - 2011. - T. 6. - No. 3. - S. 3-8; 115; Sushkina, I.F. Comparative assessment of the state of microhemodynamics and vasomotor function of the endothelium in patients with coronary artery disease and practically healthy individuals of different ages / I.F.Sushkina, I.O. Khalyavkina, Ya.A. Khananashvili and others // Bulletin of Volgograd State Medical University. - 2014. - Issue 2 (50). - S. 63-65; 123; Feoktistova, BC A new approach to the assessment of endothelial dysfunction: determination of the number of circulating endothelial cells by flow cytometry / V.S. Feoktistova, T.V. Vavilova, O.V. Sirotkina et al. // Clinical laboratory diagnostics. - 2015. - T.60, No. 4. - S. 23-27; Fadini, GP Reduced endothelial progenitor cells and brachial artery flow-mediated dilation as evidence of endothelial dysfunction in ocular hypertension and primary open-angle glaucoma / GP Fadini, C. Pagano, I. Baesso, O. Kotsafti, D. Doro et al. // Acta Ophthalmol. - 2010. - Vol.88. - P. 135-141; Lampka, M., Grabczewska, Z.,

E. Circulating endothelial cells in coronary artery disease. Kardiologia Polska. - 2010. - Vol. 68 (10). - P.l100-1105; Jim, B. Hypertension in pregnancy / B. Jim, S. Sharma, T. Kebede et al. // Semin. Perinatol. 2012 .-- 36 (1). - P. 56-9 and others]. As a rule, the state of the vascular endothelium is assessed by the number of circulating desquamated endothelial cells, the level of nitric oxide metabolites, the concentration of C-reactive protein or von Willebrand factor in blood plasma, the level of albumin in the urine, etc., or by detecting violations of the vasomotor function of the endothelium with instrumental research methods. It should be stated that the use of classical methods for diagnosing endothelial dysfunction in obstetrics has some disadvantages: the microvasculature undergoes changes during pregnancy, which must be taken into account when interpreting the results of diagnosing the vasomotor function of the endothelium, in addition, the introduction of vasoactive drugs of functional tests is not always acceptable in pregnant women, i.e. .to. associated with the possibility of a negative effect on the fetus. Biochemical diagnosis of endothelial dysfunction also has limitations. The state of endothelial cells can theoretically be assessed by a decrease in the synthesis of nitric oxide, a direct indicator of endothelial function, which, however, is limited by the instability and short life span of the NO molecule. The rest of the biochemical markers provide an indirect assessment of endothelial function, since accompany the course of many other vascular diseases or coagulopathies, and during pregnancy change their concentration under physiological conditions: A diagnostic method based on the morphological characteristics of the endothelium seems to be a promising vector for studying vascular disorders in pregnant women. Endotheliocytes are labile biostructures, which makes it possible to use the registration of their morphological changes as an informative criterion for disorders in the microvascular bed. Desquamated endothelial cells are endothelial cells that separate from the vessel wall, circulate in the bloodstream and are a representative object of cytological diagnostics of systemic damage to the vascular system. The number of circulating endothelial cells in the peripheral blood is normally very small, because the process of self-renewal of the vascular intima is slow, and desquamated cells are intensively destroyed by the reticuloendothelial system. The duration of the presence of desquamated endothelial cells in the blood is about 24-42 hours, during which they are captured and destroyed by macrophages of the liver, lungs and spleen [Kozlovsky, V.I. Methods for determining the number of endothelial cells circulating in the blood (guidelines) / V.I. Kozlovsky, A.P. Solodkov, O.D. Myadel and others - Edition of Vitebsk State Medical University, 2008. - 29 p.]. Nevertheless, there is an increase in the concentration of these cells in the peripheral bloodstream in diseases accompanied by vascular disorders (diabetes mellitus, cardiovascular diseases, cerebrovascular accident, vasculitis, etc.). Desquamated endothelial cells have a flat shape and a pronounced morphological heterogeneity: the cell thickness is 1-2 microns, the diameter varies from 10 to 50 microns. It has been proven that the main mechanism of endothelial cell damage in endothelial dysfunction is apoptosis [Gerilovich, L.A. Endothelin-1 in patients with various forms of infertility in programs of assisted reproductive technologies / L.A. Gerilovich, M.I. Bazina, A.T. Egorova et al. // Medicine and education in Siberia. - 2013. - No. 6. - P. 19], the morphological criteria of which are a decrease in the volume of the cytoplasm and nucleus, followed by cell fragmentation and the formation of apoptotic bodies.

В качестве основного метода цитологической диагностики эндотелиальной дисфункции до сих пор используется подсчет ДЭК в периферической крови, разработанный J.Hladovec с соавт. в 1978 г. [Hladovec, J. Circulating endothelial cells in acute myocardial infarction and angina pectoris / J.Hladovec, I.Prerovsky, V.Stanek et al. // Klin. Wochenschr. - 1978. - 56(20). - P. 1033-1036]. Метод основан на визуальной количественной оценке десквамированных клеток с помощью световой микроскопии и представлении результата, как количество ДЭК на единицу объема плазмы. Метод подсчета концентрации десквамированных эндотелиальных клеток (ДЭК) в плазме используется в России в интерпретации Н.Н.Петрищева с соавт. [Петрищев Н.Н., Беркович О.А., Власов Т.Д. и др. Диагностическая ценность определения десквамированных эндотелиальных клеток в крови. // Клиническая и лабораторная диагностика. - 2001, №1. - С. 50-58]. Венозная кровь отбирается в пробирки, стабилизируется 3,8% раствором цитрата натрия, центрифугируется (1000 оборотов/мин в течение 10 мин). Тромбоцитарная масса отделяется путем добавления раствора АДФ; супернатант перемешивается в течение 10 мин и центрифугируется (1000 оборотов/мин в течение 20 мин). Надосадочная жидкость сливается и к преципитату добавляется 0,1 мл 0,9% раствора NaCl. Подсчет количества ДЭК осуществляется в 2 сетках камеры Горяева с пересчетом на 1 л плазмы с учетом изменения концентрации в процессе проведения вышеописанной методики. Метод нашел широкое применение в качестве диагностики тяжести течения заболеваний, сопряженных с поражением сосудистой системы [Загородских, Е.Б., Черкасов, В.А., Щёкотова, А.П. Маркеры эндотелиальной дисфункции и их прогностическое значение при остром панкреатите тяжелого течения // Фундаментальные исследования. - 2013. - №9. - С. 355-361; Козловский, В.И. Методы определения числа циркулирующих в крови эндотелиоцитов (методические рекомендации)/ В.И. Козловский, А.П. Солодков, О.Д. Мяделец и др. - Издание Витебского государственного медицинского университета, 2008. - 29 с.; Савельев, B.C. Перитонит и эндотоксиновая агрессия / B.C. Савельев, В.А. Петухов. - М., 2012. - 326 с. и др.].As the main method of cytological diagnosis of endothelial dysfunction, counting of DEC in peripheral blood, developed by J. Hladovec et al., Is still used. in 1978 [Hladovec, J. Circulating endothelial cells in acute myocardial infarction and angina pectoris / J.Hladovec, I. Prerovsky, V. Stanek et al. // Klin. Wochenschr. 1978. 56 (20). - P. 1033-1036]. The method is based on a visual quantitative assessment of desquamated cells using light microscopy and presentation of the result as the amount of DEC per unit volume of plasma. The method for calculating the concentration of desquamated endothelial cells (DEK) in plasma is used in Russia in the interpretation of N.N. Petrishchev et al. [Petrishchev NN, Berkovich OA, Vlasov T.D. and other Diagnostic value of the determination of desquamated endothelial cells in the blood. // Clinical and laboratory diagnostics. - 2001, No. 1. - S. 50-58]. Venous blood is collected in test tubes, stabilized with a 3.8% sodium citrate solution, and centrifuged (1000 rpm for 10 minutes). The platelet mass is separated by adding an ADP solution; the supernatant is mixed for 10 min and centrifuged (1000 rpm for 20 min). The supernatant liquid is decanted and 0.1 ml of 0.9% NaCl solution is added to the precipitate. The counting of the amount of DEK is carried out in 2 grids of the Goryaev chamber, recalculated per 1 liter of plasma, taking into account the change in concentration in the process of carrying out the above-described technique. The method has found wide application as a diagnosis of the severity of diseases associated with damage to the vascular system [Zagorodskikh, EB, Cherkasov, VA, Shchekotova, A.P. Markers of endothelial dysfunction and their prognostic value in severe acute pancreatitis // Fundamental research. - 2013. - No. 9. - S. 355-361; Kozlovsky, V.I. Methods for determining the number of endothelial cells circulating in the blood (guidelines) / V.I. Kozlovsky, A.P. Solodkov, O.D. Myadel, etc. - Edition of Vitebsk State Medical University, 2008. - 29 p .; Saveliev, B.C. Peritonitis and endotoxin aggression / B.C. Saveliev, V.A. Petukhov. - M., 2012 .-- 326 p. and etc.].

Данный метод является наиболее близким к предлагаемому нами способу диагностики дисфункции эндотелия. Преимуществом классического цитологического метода диагностики эндотелиальной дисфункции являются информативность, малоинвазивность, быстрота выполнения, а также техническая и экономическая доступность. Недостатком способа является представление результата как количество ДЭК на единицу объема плазмы, что снижает информативность теста в связи с вариабельностью содержания форменных элементов крови, различным разведением полученной концентрации ДЭК и, как следствие, несопоставимостью содержания ДЭК у больных и здоровых лиц при различном уровне гематокрита.This method is the closest to our proposed method for diagnosing endothelial dysfunction. The advantages of the classical cytological method for diagnosing endothelial dysfunction are informational content, minimally invasiveness, speed of implementation, as well as technical and economic accessibility. The disadvantage of this method is the presentation of the result as the amount of DEC per unit volume of plasma, which reduces the information content of the test due to the variability of the content of blood corpuscles, different dilutions of the obtained concentration of DEC and, as a consequence, the incomparability of the DEC content in sick and healthy individuals with different hematocrit levels.

Е.Г. Мясоедовой предложен метод, заключающийся в определении ДЭК в одном литре цельной крови с учетом уровня гематокрита (Патент РФ №2338192, G01N 33/49, 10.11.2008), что дает возможность получить результат более универсальный и сопоставимый с концентрацией других клеточных элементов в крови. Недостаток этого способа - использование традиционного метода получения препаратов ДЭК по методике J.Hladovec с соавт.(1978 г.), который включает сложную технику сепарации циркулирующих эндотелиоцитов, выполняемую в ручную, что не исключает возможность погрешности создания стандартной концентрации рабочего раствора исследуемых клеток, и требует либо разработки автоматизации способа, либо учета дополнительных критериев поражения сосудистой системы.E.G. Myasoedova proposed a method for determining DEC in one liter of whole blood, taking into account the hematocrit level (RF Patent No. 2338192, G01N 33/49, 10.11.2008), which makes it possible to obtain a result that is more universal and comparable to the concentration of other cellular elements in the blood. The disadvantage of this method is the use of the traditional method for obtaining DEK preparations according to the method of J. Hladovec et al. (1978), which includes a complex technique of separation of circulating endothelial cells, performed manually, which does not exclude the possibility of an error in creating a standard concentration of the working solution of the cells under study, and requires either the development of automation of the method, or taking into account additional criteria for damage to the vascular system.

Л.Г. Краснова и соавт. усовершенствовали классический метод за счет предварительной компрессии плеча на 40-50 мм рт.ст. за 4 минуты до забора крови (Патент РФ №2234094; G01N 33/49, 08.10.2004), что, согласно трактовке авторов, позволяет выявить скрытую эндотелиальную дисфункцию. Однако следует констатировать, что создание компрессии е области плеча (манжеточная проба) является дополнительным физическим провоцирующим фактором локальной десквамации эндотелия. Кроме того, условие проведения манжеточной пробы и фиксированная экспозиция компрессии до забора крови ограничивает применение данного метода в условиях клинической лаборатории.L.G. Krasnova et al. improved the classical method by pre-compressing the shoulder by 40-50 mm Hg. 4 minutes before blood sampling (RF Patent No. 2234094; G01N 33/49, 08.10.2004), which, according to the interpretation of the authors, makes it possible to reveal latent endothelial dysfunction. However, it should be stated that the creation of compression in the shoulder region (cuff test) is an additional physical provoking factor of local desquamation of the endothelium. In addition, the condition of the cuff test and the fixed exposure of compression before blood sampling limits the use of this method in a clinical laboratory.

А.И. Инжутовой и соавт.(2014) разработан метод микроскопической регистрации десквамированных эндотелиоцитов в пересчете на 100 лимфоцитов с определением коэффициента содержания мембран высвобожденных микрочастиц и суммарного титра антител к фосфолипидам и sPECAM-1 [Пат. РФ №2526154. МПК G01N 33/49]. Использование метода позволяет определить содержание гуморальных маркеров по регистрации десквамированных эндотелиоцитов периферической крови, однако требует использования дорогостоящих реактивов и сопряжена со сложной интерпретацией полученных результатов.A.I. Inzhutova et al. (2014) developed a method for microscopic registration of desquamated endothelial cells in terms of 100 lymphocytes with the determination of the coefficient of the membrane content of released microparticles and the total titer of antibodies to phospholipids and sPECAM-1 [US Pat. RF No. 2526154. IPC G01N 33/49]. The use of the method makes it possible to determine the content of humoral markers by registering desquamated endothelial cells of peripheral blood; however, it requires the use of expensive reagents and is associated with a complex interpretation of the results obtained.

Основным недостатком всех применяемых методов цитологической диагностики эндотелиальной дисфункции является отсутствие четких значений референтных показателей, характеризующих исследуемую патологию, что очевидно, связано с методикой сепарации циркулирующих ДЭК из цельной крови, не исключающей погрешности в создании стандартной концентрации раствора, используемого при подсчете клеток, что в конечном итоге отражается на вариабельности полученных результатов: по способу, предложенному авторами, эндотелиальную дисфункцию диагностируют при значении показателя от 2 до 6×10⁴ в 100 мкл плазмы, что является достаточно большим диапазоном исследуемого критерия. Так, например, по данным B.C. Савельева (2010) количество циркулирующих эндотелиоцитов в плазме крови в норме составляет от 2 до 4 клеток/100 мкл [Савельев, B.C. Перитонит и эндотоксиновая агрессия / B.C. Савельев, В.А. Петухов. - М., 2012. - 326 с.], П.Е. Асташев (2011) оценивает эндотелиальную дисфункцию при значениях количества ДЭК от 6×10⁴ клеток/100 мкл [Асташев, П.Е., Гудымович, В.Г. Маркеры эндотелиальной дисфункции как прогностический признак течения внутрисердечного инфекционного процесса // Вестник Национального медико-хирургического Центра им. Н.И. Пирогова. - 2011. - Т. 6. - №3. - С. 3-8], а в исследовании F.Dignat-George с соавт. (2004), количество циркулирующих эндотелиоцитов у здорового человека составляет менее 3 клеток на 100 мкл крови [Dignat-George, F. Circulating endothelial cells: realities and promises in vascular disorders. / F.Dignat-George, J.Sampol, G.Lip, A.D.Blann et al. // Pathophysiol Haemost Thromb. - 2004. - №33. - Р. 495-499]. В связи с этим, во многих работах учитывается не референтное значение, а сравнительная характеристика параметра с помощью метода «случай-контроль», что адаптирует диагностику в практике с учетом особенностей выполнения метода [Козловский, В.И. Методы определения числа циркулирующих в крови эндотелиоцитов (методические рекомендации) / В.И.Козловский, А.П. Солодков, О.Д. Мяделец и др. - Издание Витебского государственного медицинского университета, 2008. - 29 с.; Савельев, B.C. Перитонит и эндотоксиновая агрессия / B.C. Савельев, В.А. Петухов. - М., 2012. - 326 с. и др.]. Также с целью преодоления вышеуказанного недостатка метода используется определение количества ДЭК в пересчете на концентрацию лейкоцитов [Феоктистова, B.C. Новый подход к оценке дисфункции эндотелия: определение количества циркулирующих эндотелиальных клеток методом проточной цитометрии / В.С.Феоктистова, Т.В. Вавилова, О.В. Сироткина и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2015 - Т.60, №4. - С. 23-27.] или лимфоцитов [Пат. РФ №2526154. МПК G01N 33/49. Способ оценки степени выраженности реактивного ответа организма / А.И. Инжутова, А.Б. Салмина, М.Б. Петрова и др.; Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Красноярский государственный медицинский университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого министерства здравоохранения и социального развития российской федерации. - Заявл 07.09.2012; опубл. 20.08.2014.], что усложняет методику выполнения диагностического теста, а также затрудняет интерпретацию результата. Кроме того, классический метод подсчета циркулирующих ДЭК ограничен морфологической неоднородностью исследуемых клеток. Это отмечается во многим работах, использующих данный метод диагностики эндотелиальной дисфункции. В литературе встречаются термины: апотозные клетки и клетки-предшественники [Woywodt, A. Circulating endothelial cells: life, death, detachment and repair of the endothelial cell layer / A. Woywodt, F.H. Balhmann, K. Groot et al. // Nephrol Dial Transplant. - 2002. - 17. P. 1728-1730.], «зрелые» клетки [Mancuso, P. Validation of a standardized method for enumeratin circulating endothelial cells and progenitors: flow cytometry and molecular and ultrastructural analyses / P.Mancuso, P.Antoniotti, J.Quarna et al. // Clin. Cancer. Res. - 2009. - №5(1). - P. 267-73], «микрочастицы» [Бицадзе, В.О. Тромбофилия как важнейшее звено патогенеза осложнений беременности / В.О. Бицадзе, А.Д .Макацария, Д.Х. Хизроева и др. // Практическая медицина. - 2012. - 5(60). - С. 22-29] и т.п. Геометрические параметры циркулирующих ДЭК рознятся и выбор клеток, учитываемых при подсчете в цитометрической камере, может определяться субъективизмом исследователя, что также является ограничением достоверности диагностического теста.The main disadvantage of all applied methods of cytological diagnostics of endothelial dysfunction is the lack of clear values of reference indicators characterizing the pathology under study, which is obviously associated with the method of separating circulating DECs from whole blood, which does not exclude errors in creating a standard concentration of the solution used for counting cells, which ultimately As a result, it is reflected in the variability of the results obtained: according to the method proposed by the authors, endothelial dysfunction is diagnosed with an indicator value from 2 to 6 × 10 ⁴ in 100 μL of plasma, which is a fairly large range of the criterion under study. So, for example, according to BC Savelyev (2010) the number of circulating endotheliocytes in blood plasma normally ranges from 2 to 4 cells / 100 μl [Savelyev, BC Peritonitis and endotoxin aggression / BC Savelyev, V.A. Petukhov. - M., 2012. - 326 p.], P.E. Astashev (2011) evaluates endothelial dysfunction at values of the number of DECs from 6 × 10 ⁴ cells / 100 μl [Astashev, P.E., Gudymovich, V.G. Markers of endothelial dysfunction as a prognostic sign of the course of the intracardiac infectious process // Bulletin of the National Medical and Surgical Center named after V.I. N.I. Pirogov. - 2011. - T. 6. - No. 3. - S. 3-8], and in the study by F. Dignat-George et al. (2004), the number of circulating endothelial cells in a healthy person is less than 3 cells per 100 μL of blood [Dignat-George, F. Circulating endothelial cells: realities and promises in vascular disorders. / F. Dignat-George, J. Sampol, G. Lip, ADBlann et al. // Pathophysiol Haemost Thromb. - 2004. - No. 33. - P. 495-499]. In this regard, in many works, not the reference value is taken into account, but the comparative characteristic of the parameter using the "case-control" method, which adapts the diagnosis in practice, taking into account the peculiarities of the method [Kozlovsky, V.I. Methods for determining the number of endotheliocytes circulating in the blood (guidelines) / V.I. Kozlovsky, A.P. Solodkov, O.D. Myadel, etc. - Edition of Vitebsk State Medical University, 2008. - 29 p .; Savelyev, BC Peritonitis and endotoxin aggression / BC Savelyev, V.A. Petukhov. - M., 2012 .-- 326 p. and etc.]. Also, in order to overcome the above disadvantage of the method, the determination of the amount of DEC in terms of the concentration of leukocytes is used [Feoktistova, BC A new approach to assessing endothelial dysfunction: determination of the number of circulating endothelial cells by flow cytometry / VS Feoktistova, T.V. Vavilova, O.V. Sirotkina et al. // Clinical laboratory diagnostics. - 2015 - T.60, No. 4. - S. 23-27.] Or lymphocytes [US Pat. RF No. 2526154. IPC G01N 33/49. Method for assessing the severity of the body's reactive response / A. Inzhutova, A.B. Salmina, M.B. Petrova and others; State budgetary educational institution of higher professional education Krasnoyarsk State Medical University named after Professor V.F. Voino-Yasenetsky Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation. - Declared 09/07/2012; publ. 20.08.2014.], Which complicates the method of performing the diagnostic test, and also complicates the interpretation of the result. In addition, the classical method for counting circulating DECs is limited by the morphological heterogeneity of the cells under study. This is noted in many works using this method for diagnosing endothelial dysfunction. In the literature, there are terms: apototic cells and progenitor cells [Woywodt, A. Circulating endothelial cells: life, death, detachment and repair of the endothelial cell layer / A. Woywodt, FH Balhmann, K. Groot et al. // Nephrol Dial Transplant. - 2002. - 17. P. 1728-1730.], "Mature" cells [Mancuso, P. Validation of a standardized method for enumeratin circulating endothelial cells and progenitors: flow cytometry and molecular and ultrastructural analyzes / P. Mancuso, P. Antoniotti, J. Quarna et al. // Clin. Cancer. Res. - 2009. - No. 5 (1). - P. 267-73], "microparticles" [Bitsadze, V.O. Thrombophilia as the most important link in the pathogenesis of pregnancy complications / V.O. Bitsadze, A. D. Makatsaria, D. Kh. Khizroeva et al. // Practical Medicine. - 2012 .-- 5 (60). - S. 22-29], etc. The geometrical parameters of circulating DECs differ, and the choice of cells taken into account when counting in a cytometric chamber can be determined by the subjectivity of the researcher, which is also a limitation of the reliability of the diagnostic test.

В научной литературе использование морфометрического метода в исследовании циркулирующих ДЭК имеет отражение лишь в единичных работах. Простым и доступным методом идентификации и исследования морфологии апоптозных клеток является световая микроскопия. В.И. Козловский и соавт. (2008) исследовали морфологию циркулирующих ДЭК с помощью световой микроскопии. В работе показано увеличение количества клеток с признаками апоптоза у больных с артериальной гипертензией [Козловский, В.И. Методы определения числа циркулирующих в крови эндотелиоцитов (методические рекомендации)/ В.И. Козловский, А.П. Солодков, О.Д. Мяделец и др. - Издание Витебского государственного медицинского университета, 2008. - 29 с.]. Недостаток способа - условие регистрации повреждения ДЭК на основе оценки ядерно-плазменных отношений. Апоптоз - стадийный процесс, и десквамация эндотелиоцитов уже означает инициацию деструктивных изменений в клетке, а значит, идентификация нарушений ядерно-плазменных отношений при световой микроскопии в циркулирующих эндотелиоцитах может определяться субъективизмом исследователя и влиять на конечный результат диагностического метода.In the scientific literature, the use of the morphometric method in the study of circulating DECs is reflected only in a few works. Light microscopy is a simple and accessible method for identifying and studying the morphology of apoptotic cells. IN AND. Kozlovsky et al. (2008) investigated the morphology of circulating DECs using light microscopy. The work shows an increase in the number of cells with signs of apoptosis in patients with arterial hypertension [Kozlovsky, V.I. Methods for determining the number of endothelial cells circulating in the blood (guidelines) / V.I. Kozlovsky, A.P. Solodkov, O.D. Myadel and others - Edition of Vitebsk State Medical University, 2008. - 29 p.]. The disadvantage of this method is the condition for registering damage to the DEC based on the assessment of nuclear-plasma ratios. Apoptosis is a staged process, and desquamation of endothelial cells already means the initiation of destructive changes in the cell, which means that the identification of violations of nuclear-plasma relations during light microscopy in circulating endothelial cells can be determined by the subjectivity of the researcher and affect the final result of the diagnostic method.

Также используется проточная цитометрия циркулирующих эндотелиоцитов для определения количества «зрелых» ДЭК и исключения клеток с измененной геометрией [Феоктистова, B.C. Новый подход к оценке дисфункции эндотелия: определение количества циркулирующих эндотелиальных клеток методом проточной цитометрии/ В.С. Феоктистова, Т.В. Вавилова, О.В. Сироткина и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2015 - Т.60, №4. - С. 23-27; Mancuso, P. Validation of а standardized method for enumeratin circulating endothelial cells and progenitors: flow cytometry and molecular and ultrastructural analyses/ P.Mancuso, P.Antoniotti, J.Quarna et al. // Clin. Cancer. Res.- 2009. - №5(1). - P. 267-73]. Метод проточной цитометрии основан на фиксации сигналов светорассеяния и флюоресценции луча лазера от исследуемого биологического объекта. В работе поврежденные клетки исключали из анализа, так как они дают слабое рассеивание. Увеличение же в крови содержания «зрелых» ДЭК связывали с патологией в ответ на повреждение стенки сосуда. Исключение из исследования поврежденных эндотелиоцитов является, на наш взгляд, недостатком метода, так как не позволяет зафиксировать особенности деструкции ДЭК, что немаловажно для полноценного морфологического исследования изучаемой патологии. Апоптоз во временном промежутке представлен несколькими стадиями, которые сопровождаются изменением геометрии клетки, и игнорирование этих изменений в исследовании не оправдано.Also, flow cytometry of circulating endothelial cells is used to determine the number of "mature" DECs and exclude cells with altered geometry [Feoktistova, B.C. A new approach to assessing endothelial dysfunction: determining the number of circulating endothelial cells by flow cytometry. Feoktistova, T.V. Vavilova, O.V. Sirotkina et al. // Clinical laboratory diagnostics. - 2015 - T.60, No. 4. - S. 23-27; Mancuso, P. Validation of a standardized method for enumeratin circulating endothelial cells and progenitors: flow cytometry and molecular and ultrastructural analyzes / P. Mancuso, P. Antoniotti, J. Quarna et al. // Clin. Cancer. Res. - 2009. - No. 5 (1). - P. 267-73]. The flow cytometry method is based on fixing the signals of light scattering and fluorescence of a laser beam from a biological object under study. In this study, damaged cells were excluded from the analysis, since they show weak scattering. The increase in the content of "mature" DECs in the blood was associated with pathology in response to damage to the vessel wall. The exclusion of damaged endothelial cells from the study is, in our opinion, a disadvantage of the method, since it does not allow fixing the features of the destruction of DEC, which is important for a full-fledged morphological study of the studied pathology. Apoptosis in the time interval is represented by several stages, which are accompanied by changes in cell geometry, and ignoring these changes in the study is not justified.

В зарубежной литературе описывается метод сортировки циркулирующих ДЭК, активированных флюоресценцией, и расчета соотношения между апоптозными клетками эндотелия (CD-146) и клетками-предшественниками (CD-34), как показатель степени поражения эндотелиальной системы [Woywodt, A. Circulating endothelial cells: life, death, detachment and repair of the endothelial cell layer / A. Woywodt, F.H. Balhmann, K. Groot et al. // Nephrol Dial Transplant. - 2002. - №17. - P. 1728-1730]. Информативность исследования достигается требованием наличия дорогостоящего оборудования и подготовленного персонала, что позволяет использовать метод только в специализированных лабораториях.Foreign literature describes a method for sorting circulating DECs, activated by fluorescence, and calculating the ratio between apoptotic endothelial cells (CD-146) and progenitor cells (CD-34), as an indicator of the degree of damage to the endothelial system [Woywodt, A. Circulating endothelial cells: life , death, detachment and repair of the endothelial cell layer / A. Woywodt, FH Balhmann, K. Groot et al. // Nephrol Dial Transplant. - 2002. - No. 17. - P. 1728-1730]. The information content of the study is achieved by the requirement for the availability of expensive equipment and trained personnel, which makes it possible to use the method only in specialized laboratories.

Задачей предлагаемого способа является повышение точности цитологической диагностики эндотелиальной дисфункции у беременных, оптимизация исследования данной патологии с позиции доступности, малоинвазивности и хронометража выполнения, что позволит рассматривать его как скрининговый метод ранней сосудистой патологии у беременных.The objective of the proposed method is to improve the accuracy of the cytological diagnosis of endothelial dysfunction in pregnant women, to optimize the study of this pathology in terms of accessibility, minimally invasiveness and timing of performance, which will allow it to be considered as a screening method for early vascular pathology in pregnant women.

Технический результат предлагаемого способа заключается в определении среднего эквивалентного диаметра циркулирующих ДЭК - морфометрического параметра, являющегося количественной и качественной характеристикой деструктивных изменений эндотелия.The technical result of the proposed method consists in determining the average equivalent diameter of circulating DEC - a morphometric parameter, which is a quantitative and qualitative characteristic of destructive changes in the endothelium.

Предлагается способ диагностики эндотелиальной дисфункции у беременных, дополняющий имеющуюся методику получения ДЭК из периферической крови разработанной J. Hladovec с соавт. в 1978 г., и заключающийся в определении среднего эквивалентного диаметра десквамированных эндотелиоцитов (СДДЭК). Средний эквивалентный диаметр - это расстояние между максимально удаленными точками оптического объекта на плоскости. Цитологические препараты исследуют с помощью светового микроскопа (увеличение 600×) и микрометра для микроскопа с ценой деления 0,01 мм. Изобретение направлено на повышение точности диагностики эндотелиальной дисфункции у беременных.A method for the diagnosis of endothelial dysfunction in pregnant women is proposed, which supplements the existing method for obtaining DEC from peripheral blood developed by J. Hladovec et al. in 1978, and consists in determining the average equivalent diameter of desquamated endothelial cells (CDDEK). The average equivalent diameter is the distance between the most distant points of the optical object on the plane. Cytological preparations are examined using a light microscope (magnification 600 ×) and a micrometer for a microscope with a graduation of 0.01 mm. The invention is aimed at improving the accuracy of diagnosis of endothelial dysfunction in pregnant women.

Алгоритм исследования состоит из следующих функциональных частей:The research algorithm consists of the following functional parts:

1. Пробирку с кровью центрифугируют (1000 оборотов/мин) 10 мин.1. The test tube with blood is centrifuged (1000 rpm) for 10 minutes.

2. В пластиковую пробирку переносят 1 мл полученной плазмы и добавляют 0,1 мл 0,1% раствора АДФ.2. Transfer 1 ml of the obtained plasma into a plastic tube and add 0.1 ml of 0.1% ADP solution.

3. Пробирку встряхивают в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем центрифугируют (2000 оборотов/мин) в течение 10 минут.3. The tube is shaken for 10 minutes at room temperature and then centrifuged (2000 rpm) for 10 minutes.

4. Из полученной надосадочной жидкости переносят 0,2 мл на предметное стекло и проводят микроскопию полученного материала (600×) для выявления циркулирующих ДЭК. Микроскопируют в 10 полях зрения.4. From the resulting supernatant, transfer 0.2 ml onto a glass slide and conduct microscopy of the resulting material (600 ×) to identify circulating DECs. Microscoped in 10 fields of view.

5. Проводят определение эквивалентного диаметра обнаруженных ДЭК в 10 полях зрения с помощью микрометра для микроскопа.5. Determine the equivalent diameter of the detected DECs in 10 fields of view using a micrometer for a microscope.

6. Осуществляют статистический анализ и представляют искомый результат по формуле:6. Carry out a statistical analysis and present the desired result according to the formula:

где СДДЭК - средний эквивалентный диаметр ДЭК; ∑ЭДДЭК _ сумма показателей эквивалентного диаметра исследованных ДЭК; ∑ДЭК -количество исследованных ДЭК.where CDDEK is the average equivalent diameter of the DEK; ∑EDDEK _ the sum of the indicators of the equivalent diameter of the investigated DEK; ∑DEK - the number of investigated DEK.

Количество исследованных клеток ∑ДЭК не должно быть меньше 10, так как объем выборки определяет точность искомого среднего значения. Значение СДДЭК более 30 мкм следует расценивать, как показатель нормального функционального состояния эндотелия, значение СДДЭК 30 мкм и менее является показателем развития эндотелиальной дисфункции у беременных.The number of investigated клетокDEK cells should not be less than 10, since the sample size determines the accuracy of the desired mean value. The CDDEK value of more than 30 μm should be regarded as an indicator of the normal functional state of the endothelium, the SDDEK value of 30 μm or less is an indicator of the development of endothelial dysfunction in pregnant women.

Предлагаемый способ был успешно апробирован в условиях кафедры акушерства и гинеоклогии стоматологического факультета ФГБОУ ВО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России в отделениях гинекологии ГБУЗ ГКБ №13 ДЗ города Москвы на 180 женщинах в I триместре: основную группу составили 90 пациенток, у которых диагностирована неразвивающаяся беременность, в контрольную группу вошли 90 здоровых женщин с физиологическим течением беременности. Неразвивающаяся беременность является необратимым и конечным проявлением нарушений в маточно-плодовых отношениях, и участие в этом процессе эндотелия неоспоримо. Выбор для нашего исследования данной нозологии позволил использовать критические изменения в сосудистой системе при несостоявшемся выкидыше в качестве информативной модели развития эндотелиальной дисфункции у беременных.The proposed method was successfully tested in the conditions of the Department of Obstetrics and Gyneoclogy of the Faculty of Dentistry of the A.I. Evdokimov of the Ministry of Health of the Russian Federation in the gynecology departments of the Moscow City Clinical Hospital No. 13 DZ for 180 women in the first trimester: the main group consisted of 90 patients diagnosed with undeveloped pregnancy, the control group included 90 healthy women with physiological pregnancy. Non-developing pregnancy is an irreversible and final manifestation of disorders in the uterine-fetal relationship, and the participation of the endothelium in this process is undeniable. The choice of this nosology for our study made it possible to use critical changes in the vascular system during miscarriage as an informative model for the development of endothelial dysfunction in pregnant women.

У всех пациенток проведена диагностика эндотелиальной дисфункции. Исследованы традиционные биохимические маркеры поражения эндотелия (высокочувствительный С-реактивный белок сыворотки крови (hsCRP), фактор фон Виллебранда сыворотки крови (vWf), микроальбуминурия (МАУ)), а также осуществлено определение количества ДЭК в периферической крови по методу, разработанному J. Hladovec с соавт. в 1978 г., и проведена морфометричекая диагностика ДЭК по предлагаемому методу: у каждой пациентки выполнена морфометрия 100 оптических объектов циркулирующих ДЭК и определен СДДЭК.All patients underwent diagnostics of endothelial dysfunction. Traditional biochemical markers of endothelial damage (highly sensitive serum C-reactive protein (hsCRP), von Willebrand factor of blood serum (vWf), microalbuminuria (MAU)) were studied, and the amount of DEC in peripheral blood was determined by the method developed by J. Hladovec with et al. in 1978, and the morphometric diagnosis of DEC was carried out according to the proposed method: each patient underwent morphometry of 100 optical objects of circulating DEC and SDDEC was determined.

Ниже приводятся результаты апробации.Below are the results of testing.

Средний возраст беременных основной группы составил 30,9±2,62 лет, в контрольной группе 31,4±2,12 лет. Статистически значимых отличий при исследовании соматической патологии в исследуемых группах обнаружено не было. При цитологическом исследовании циркулирующих ДЭК у беременных в группах получены следующие результаты. Сравнение величин проводилось на основе критерия Манна-Уитни. Среднее количество ДЭК в контрольной группе составило 5,5±2,12×10⁴ клеток/100 мл. В группе с несостоявшимся выкидышем этот показатель был в 2 раза выше и составил 12,6±5,89×10⁴ клеток/100 мл (р<0,0001). При морфометрии ДЭК также получены достоверные отличия в исследуемых группах. Средний эквивалентный диаметр ДЭК в группе с физиологическим течением беременности составил 43,9±3,99 мкм, что в 1,5 раза выше данного показателя в группе с несостоявшимся выкидышем 29,5±9,40 мкм (р<0,0001). Полученные результаты продемонстрировали достоверность отличий СДДЭК в исследуемых группах, что актуализирует морфометрическое исследование циркулирующих ДЭК для определения состояния эндотелия у беременных (фиг. 1-2).The average age of pregnant women in the main group was 30.9 ± 2.62 years, in the control group - 31.4 ± 2.12 years. No statistically significant differences were found in the study of somatic pathology in the study groups. Cytological examination of circulating DECs in pregnant women in groups obtained the following results. The comparison of values was carried out on the basis of the Mann-Whitney test. The average number of DECs in the control group was 5.5 ± 2.12 × 10 ⁴ cells / 100 ml. In the group with missed abortion, this indicator was 2 times higher and amounted to 12.6 ± 5.89 × 10 ⁴ cells / 100 ml (p <0.0001). With the morphometry of DEC, significant differences were also obtained in the studied groups. The average equivalent diameter of DEC in the group with the physiological course of pregnancy was 43.9 ± 3.99 μm, which is 1.5 times higher than this indicator in the group with miscarriage of 29.5 ± 9.40 μm (p <0.0001). The results obtained demonstrated the reliability of differences between SDDEK in the studied groups, which actualizes the morphometric study of circulating DEK to determine the state of the endothelium in pregnant women (Fig. 1-2).

Для подтверждения правильности используемой гипотезы о достоверности выбранного показателя в диагностике дисфункции эндотелия были изучены корреляционные отношения между новым морфометрическим параметром СДДЭК и классическими маркерами поражения эндотелия. Определены вероятностные связи между традиционным цитологическим маркером эндотелиальной дисфункции - количеством ДЭК и разработанным нами параметром среднего эквивалентного диаметра ДЭК. Анализ осуществлялся с помощью метода ранговой корреляции Спирмена и проводился для основной группы, так как разброс значений переменной в ней был существенно выше, чем в контрольной группе. Расчет показал высокий уровень корреляции между исследуемыми показателями. Корреляционный анализ продемонстрировал обратную зависимость количества ДЭК и их среднего диаметра: с количеством ДЭК эквивалентный диаметр ДЭК коррелировал сильно и отрицательно r_s=-0,95, то есть увеличение количества десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови сопровождалось уменьшением их среднего диаметра (фиг. 3-6).To confirm the correctness of the hypothesis used about the reliability of the selected indicator in the diagnosis of endothelial dysfunction, the correlation relations between the new morphometric parameter SDDEK and classical markers of endothelial damage were studied. The probabilistic connections between the traditional cytological marker of endothelial dysfunction - the amount of DEC and the parameter of the mean equivalent diameter of DEC developed by us - have been determined. The analysis was carried out using the Spearman rank correlation method and was carried out for the main group, since the scatter of the variable values in it was significantly higher than in the control group. The calculation showed a high level of correlation between the studied indicators. Correlation analysis showed an inverse relationship between the number of DECs and their average diameter: with the number of DECs, the equivalent DEC diameter correlated strongly and negatively r _s = -0.95, that is, an increase in the number of desquamated endothelial cells in the peripheral blood was accompanied by a decrease in their average diameter (Fig. 3-6 ).

Изучены вероятностные связи между биохимическими маркерами эндотелиальной дисфункции и СДДЭК. Показатель высокочувствительного С-реактвиного белка в сыворотке крови продемонстрировал сильную отрицательную корреляционную связь с СДДЭК и составил r_s=-0,91. Коэффициент корреляции микроальбуминурии и СДДЭК составил r_s=-0,72; коэффициент корреляции фактора фон Виллебранда и СДДЭК r_s=-0,69.The probabilistic relationships between biochemical markers of endothelial dysfunction and SDDEK were studied. The indicator of highly sensitive C-reactin protein in blood serum showed a strong negative correlation with SDDEK and was r _s = -0.91. The correlation coefficient of microalbuminuria and CDDEK was r _s = -0.72; the correlation coefficient of the von Willebrand factor and SDDEK r _s = -0.69.

Перечень и описание рисунков:List and description of figures:

Фиг. 1 - График распределения количества ДЭК в исследуемых группах.FIG. 1 - Diagram of the distribution of the number of DEC in the studied groups.

Фиг. 2 - График распределения среднего эквивалентного диаметра ДЭК в исследуемых группах.FIG. 2 - Diagram of the distribution of the average equivalent diameter of the DEC in the studied groups.

Фиг. 3 - График линейной корреляции среднего эквивалентного диаметра ДЭК (СДДЭК) и количества ДЭК (КДЭК).FIG. 3 - Graph of the linear correlation of the average equivalent diameter of the DEK (CDDEK) and the amount of DEK (KDEK).

Фиг. 4 - График линейной корреляции среднего эквивалентного диаметра ДЭК (СДДЭК) и параметра микроальбуминурии (МАУ).FIG. 4 - Graph of the linear correlation of the mean equivalent diameter of DEC (SDDEC) and the parameter of microalbuminuria (MAU).

Фиг. 5 - График линейной корреляции среднего эквивалентного диаметра ДЭК (СДДЭК) и параметра фактора фон Виллебранда (vWf);FIG. 5 - Graph of the linear correlation of the average equivalent diameter of the DEK (SDDEK) and the parameter of the von Willebrand factor (vWf);

Фиг. 6 - График линейной корреляции среднего эквивалентного диаметра ДЭК (СДДЭК) и параметра высокочувствительного С-реактивного белка (hsCRP).FIG. 6 - Graph of the linear correlation of the mean equivalent diameter of DEC (CDDEC) and the parameter of highly sensitive C-reactive protein (hsCRP).

Ниже приведены клинические примеры использования разработанного метода диагностики эндотелиальной дисфункции у беременных.Below are clinical examples of using the developed method for diagnosing endothelial dysfunction in pregnant women.

Клинический пример №1 (основная группа).Clinical example No. 1 (main group).

Пациентка В., 27 лет, № истории болезни 7804/14. Поступила в гинекологическое отделение 15.03.2014 г. с диагнозом: Беременность 8 недель неразвивающаяся. Беременность 3-ая: в анамнезе 2 родов, без осложнений. Соматический анамнез: детские инфекции, ОРВИ, мочекаменная болезнь. Гинекологический анамнез: не отягощен. Обследована. По УЗИ: Беременность 6-7 недель. Анэмбриония. С-реактивный белок 3,9 мг/мл. Фактор фон Виллебранда 112,4%. Микроальбуминурия 0,015 мкг/мл. Цитологическая диагностика эндотелиальной дисфункции: количество ДЭК 22×10⁴ клеток/100 мл; СДДЭК 20 мкм. Заключение: у пациентки морфометрические признаки эндотелиальной дисфункции.Patient V., 27 years old, case history no. 7804/14. Was admitted to the gynecological department 03/15/2014 with a diagnosis of Pregnancy 8 weeks undeveloped. Pregnancy 3rd: a history of 2 births, without complications. Somatic history: childhood infections, acute respiratory viral infections, urolithiasis. Gynecological history: not burdened. Examined. By ultrasound: Pregnancy 6-7 weeks. Anembryony. C-reactive protein 3.9 mg / ml. The von Willebrand factor is 112.4%. Microalbuminuria 0.015 μg / ml. Cytological diagnostics of endothelial dysfunction: the number of DECs is 22 × 10 ⁴ cells / 100 ml; SDDEK 20 microns. Conclusion: the patient has morphometric signs of endothelial dysfunction.

Клинический пример №2 (основная группа).Clinical example No. 2 (main group).

Пациентка Б., 27 лет, № истории болезни 8536/14. Поступила 22 марта 2014 г с диагнозом: Беременность 8-9 недель. Начавшийся выкидыш. Беременность 1-ая. Соматический анамнез: корь, грипп, ангина, ОРВИ, хронический гастрит. Гинекологический анамнез: эктопия шейки матки; Обследована в стационаре. По УЗИ: Беременность 7-8 недель неразвивающаяся. Ретрохориальная гематома. С-реактивный белок 3,4 мг/мл. Фактор фон Виллебранда 112,6%. Микроальбуминурия 0,0327 мкг/мл. Цитологическая диагностика эндотелиальной дисфункции: количество ДЭК 6×10⁴ клеток/100 мл; СДДЭК 30 мкм. Заключение: у пациентки морфометрические признаки эндотелиальной дисфункции.Patient B., 27 years old, medical history no. 8536/14. Received March 22, 2014 with a diagnosis of Pregnancy 8-9 weeks. The incipient miscarriage. Pregnancy 1st. Somatic history: measles, influenza, tonsillitis, ARVI, chronic gastritis. Gynecological history: ectopia of the cervix; Examined in a hospital. By ultrasound: Pregnancy 7-8 weeks undeveloped. Retrochorial hematoma. C-reactive protein 3.4 mg / ml. The von Willebrand factor is 112.6%. Microalbuminuria 0.0327 μg / ml. Cytological diagnosis of endothelial dysfunction: the number of DEC 6 × 10 ⁴ cells / 100 ml; SDDEK 30 microns. Conclusion: the patient has morphometric signs of endothelial dysfunction.

Клинический пример №3 (основная группа).Clinical example No. 3 (main group).

Пациентка К., 31 год, № истории болезни 13586/14. Поступила в гинекологическое отделение 10 мая 2014 г с диагнозом: Беременность 10 недель неразвивающаяся. Беременность 6-ая, роды - 1, аборты - 4. Соматический анамнез: детские инфекции, ОРВИ. Гинекологический анамнез: хронический сальпингоофорит, хронический эндометрит. Обследована в стационаре. УЗИ малого таза: Беременность 9 недель неразвивающаяся. С-реактивный белок 5,1 мг/мл. Фактор фон Виллебранда 105,9%. Микроальбуминурия 0,03 мкг/мл. Цитологическая диагностика эндотелиальной дисфункции: количество ДЭК 8×10⁴ клеток/100 мл; СДДЭК 18 мкм. Заключение: у пациентки морфометрические признаки эндотелиальной дисфункции.Patient K., 31 years old, case history no. 13586/14. Was admitted to the gynecological department on May 10, 2014 with a diagnosis of Pregnancy 10 weeks undeveloped. Pregnancy 6th, childbirth - 1, abortion - 4. Somatic history: childhood infections, ARVI. Gynecological history: chronic salpingo-oophoritis, chronic endometritis. Examined in a hospital. Ultrasound of the small pelvis: Pregnancy 9 weeks undeveloped. C-reactive protein 5.1 mg / ml. The von Willebrand factor is 105.9%. Microalbuminuria 0.03 μg / ml. Cytological diagnosis of endothelial dysfunction: the number of DEC 8 × 10 ⁴ cells / 100 ml; SDDEK 18 microns. Conclusion: the patient has morphometric signs of endothelial dysfunction.

Клинический пример №4 (контрольная группа).Clinical example No. 4 (control group).

Пациентка Т., 35 лет, №истории болезни 10757/16. Поступила в гинекологическое отделение 28 марта 2016 г. с диагнозом: Беременность 8 недель (для проведения медицинского аборта). Беременность 6-ая: роды - 3, аборты - 3. Соматический анамнез: детские инфекции, ОРВИ. Гинекологический анамнез: эктопия шейки матки. Обследована. УЗИ малого таза: Беременность 8 недель прогрессирующая. С-реактивный белок 1,8 мг/мл. Фактор фон Виллебранда 106,7%. Микроальбуминурия 0,015 мкг/мл. Цитологическая диагностика эндотелиальной дисфункции: количество ДЭК 5×10⁴ клеток/100 мл; СДДЭК 40 мкм. Заключение: у пациентки морфометрические признаки нормального функционального состояния эндотелия.Patient T., 35 years old, case history no. 10757/16. Was admitted to the gynecological department on March 28, 2016 with a diagnosis of Pregnancy 8 weeks (for medical abortion). Pregnancy 6th: childbirth - 3, abortion - 3. Somatic history: childhood infections, ARVI. Gynecological history: ectopia of the cervix. Examined. Pelvic ultrasound: Pregnancy 8 weeks progressive. C-reactive protein 1.8 mg / ml. The von Willebrand factor is 106.7%. Microalbuminuria 0.015 μg / ml. Cytological diagnostics of endothelial dysfunction: the number of DEC 5 × 10 ⁴ cells / 100 ml; SDDEK 40 microns. Conclusion: the patient has morphometric signs of the normal functional state of the endothelium.

Клинический пример №5 (контрольная группа).Clinical example No. 5 (control group).

Пациентка К., 30 лет, № истории болезни 8503/16. Поступила в гинекологическое отделение 10 марта 2016 г. с диагнозом: Беременность 7-8 недель (для проведения медицинского аборта). Беременность 3-ая: роды - 1, выкидыш - 1 (на сроке до 12 недель). Соматический и гинекологический анамнез не отягощен. Обследована. УЗИ малого таза: Беременность 8 недель прогрессирующая. С-реактивный белок 0,2 мг/мл. Фактор фон Виллебранда 98,5%. Микроальбуминурия 0,01 мкг/мл. Цитологическая диагностика эндотелиальной дисфункции: количество ДЭК 8×10⁴ клеток/100 мл; СДДЭК 50 мкм. Заключение: у пациентки морфометрические признаки нормального функционального состояния эндотелия.Patient K., 30 years old, case history no. 8503/16. Was admitted to the gynecological department on March 10, 2016 with a diagnosis of Pregnancy 7-8 weeks (for medical abortion). Pregnancy 3rd: childbirth - 1, miscarriage - 1 (up to 12 weeks). Somatic and gynecological history is not burdened. Examined. Pelvic ultrasound: Pregnancy 8 weeks progressive. C-reactive protein 0.2 mg / ml. The von Willebrand factor is 98.5%. Microalbuminuria 0.01 μg / ml. Cytological diagnosis of endothelial dysfunction: the number of DEC 8 × 10 ⁴ cells / 100 ml; SDDEK 50 microns. Conclusion: the patient has morphometric signs of the normal functional state of the endothelium.

Клинический пример №6 (контрольная группа).Clinical example No. 6 (control group).

Пациентка Г., 36 лет, № истории болезни 13215/16. Поступила в гинекологическое отделение 15 апреля 2016 г. с диагнозом: Беременность 9-10 недель (для проведения медицинского аборта). Беременность 5-ая: роды -2, аборты - 2. Соматический анамнез: хроничекий гастрит. Гинекологический анамнез: эктопия шейки матки (лечение в 2013 г.). Обследована. УЗИ малого таза: Беременность 9 недель прогрессирующая. С-реактивный белок 2,1 мг/мл. Фактор фон Виллебранда 105,7%. Микроальбуминурия 0,015 мкг/мл. Цитологическая диагностика эндотелиальной дисфункции: количество ДЭК 13×10⁴ клеток/100 мл; СДДЭК 40 мкм. Заключение: у пациентки морфометрические признаки нормального функционального состояния эндотелия.Patient G., 36 years old, medical history no. 13215/16. Was admitted to the gynecological department on April 15, 2016 with a diagnosis of Pregnancy 9-10 weeks (for medical abortion). Pregnancy 5th: childbirth -2, abortion - 2. Somatic history: chronic gastritis. Gynecological history: ectopia of the cervix (treatment in 2013). Examined. Pelvic ultrasound: Pregnancy 9 weeks progressive. C-reactive protein 2.1 mg / ml. The von Willebrand factor is 105.7%. Microalbuminuria 0.015 μg / ml. Cytological diagnostics of endothelial dysfunction: the number of DECs is 13 × 10 ⁴ cells / 100 ml; SDDEK 40 microns. Conclusion: the patient has morphometric signs of the normal functional state of the endothelium.

Таким образом, вариабельность результатов параметра количества ДЭК (от 6 до 22×10⁴ клеток/100 мл в основной группе, и от 5 до 13×10⁴клеток/100 мл в контрольной группе) не позволяет получить четкий ответ о функциональном состоянии эндотелия у обследованных больных. Разработанный показатель СДДЭК в представленных примерах четко отражает наличие дисфункции эндотелия у пациенток основной группы (СДДЭК<30 мкм) и нормальное функциональное состояние эндотелия у беременных контрольной группы (СДДЭК>30 мкм). Различие показателей достаточно информативно выявляется уже при единичных исследованиях, что может существенно изменить средний показатель при выборке в целом.Thus, the variability of the results of the parameter of the number of DECs (from 6 to 22 × 10 ⁴ cells / 100 ml in the main group, and from 5 to 13 × 10 ⁴ cells / 100 ml in the control group) does not allow obtaining a clear answer about the functional state of the endothelium in examined patients. The developed SDDEK indicator in the presented examples clearly reflects the presence of endothelial dysfunction in patients of the main group (SDDEK <30 μm) and the normal functional state of the endothelium in pregnant women in the control group (SDDEK> 30 μm). The difference in indicators is quite informatively revealed even in single studies, which can significantly change the average indicator for the sample as a whole.

Исследование традиционных биохимических маркеров поражения эндотелия у пациентов основной группы подтвердило наличие эндотелиальной дисфункции, что также актуализирует диагностическую значимость предложенного метода.The study of traditional biochemical markers of endothelial damage in patients of the main group confirmed the presence of endothelial dysfunction, which also actualizes the diagnostic significance of the proposed method.

Предлагаемым способом достигается повышение точности диагностики эндотелиальной дисфункции. Используемый метод основан на изучении морфогенеза сосудистой системы, а точнее на активности апоптоза эндотелиоцитов, что определяет новый вектор диагностического поиска биомаркеров эндотелиальной дисфункции. Предлагаемый метод диагностики эндотелиальной дисфункции у беременных позволяет на клеточном уровне определять нарушения в сосудистом русле, что следует рассматривать как новый метод ранней пренатальной диагностики, который может рассматриваться в формате скринингового исследования. Разработанная диагностика является доступным, малоинвазивным и быстровыполнимым методом, способствующим своевременному принятию диагностического решения и выбору тактики лечебных мероприятий, определяя дифференцированный подход в прогнозировании, профилактике и лечении сосудистой патологии у беременных.The proposed method improves the accuracy of the diagnosis of endothelial dysfunction. The method used is based on the study of the morphogenesis of the vascular system, or rather on the activity of apoptosis of endothelial cells, which determines a new vector of diagnostic search for biomarkers of endothelial dysfunction. The proposed method for diagnosing endothelial dysfunction in pregnant women makes it possible to determine disorders in the vascular bed at the cellular level, which should be considered as a new method of early prenatal diagnosis, which can be considered in the format of a screening study. The developed diagnostics is an affordable, minimally invasive and fast-performing method that contributes to the timely adoption of a diagnostic decision and the choice of treatment tactics, defining a differentiated approach in predicting, preventing and treating vascular pathology in pregnant women.

Claims

A method for diagnosing endothelial dysfunction in pregnant women, including the collection of venous blood, its centrifugation, separation of platelet-free plasma followed by the isolation of desquamated endothelial cells, characterized in that morphometry of desquamated endothelial cells is additionally carried out with determination of the average equivalent diameter of desquamated endotheliocytes of more than 30 μm should be regarded as an indicator of the normal functional state of the endothelium, the value of the average equivalent diameter of desquamated endothelial cells of 30 μm or less is an indicator of the development of endothelial dysfunction in pregnant women.