RU2740086C1

RU2740086C1 - Polymer material (hydrogel) based on bacterial alginate for placing probiotic bacteria and method for production thereof

Info

Publication number: RU2740086C1
Application number: RU2019141379A
Authority: RU
Inventors: Антон Павлович Бонарцев; Вера Владимировна Воинова; Гарина Александровна Бонарцева
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2021-01-11

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: group of inventions relates to biotechnology. Disclosed are polymer material for arrangement of probiotic bacteria based on bacterial alginate, produced by bacteria of genus Azotobacter, and method of its production. Method includes growth of A. chroococcum and A. vinelandii bacteria biomass in Burke liquid medium, biomass mixing with 50 mM EDTA solution in 0.9 wt. % NaCl, precipitation with 96 % ethyl alcohol and purification. Bacterial alginate solution is further gelated in an aqueous solution of 50 ± 1 mM calcium chloride for 10 ± 1 min.

EFFECT: inventions provide preparing a biologically active material for regenerative medicine in treating gastrointestinal diseases.

5 cl, 4 ex, 1 dwg

Description

Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention relates

Настоящее изобретение относится к области биоразлагаемых, биосовместимых и биологически активных материалов для медицины и экспериментальной биологии, обладающих дополнительным терапевтическим эффектом за счет биологической активности живых пробиотических бактерий, культивируемых in situ в альгинатном гидрогеле, помещенном в область повреждения стенки желудочно-кишечного тракта, для лечения некоторых хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта, таких как язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, неспецифический язвенный колит, ишемический колит, болезнь Крона, а также операционные вмешательства на кишечнике с локальным удалением тканей и их осложнения, а также для создания экспериментальных моделей этих заболеваний с целью разработки новых лекарственных и диагностических средств для их лечения. Заявляемый способ позволяет создать материал для регенеративной медицины нового типа, где активным действующим началом служат пробиотические бактерии, и может использоваться в биотехнологии, тканевой инженерии и регенеративной медицине.The present invention relates to the field of biodegradable, biocompatible and biologically active materials for medicine and experimental biology, which have an additional therapeutic effect due to the biological activity of live probiotic bacteria cultivated in situ in an alginate hydrogel placed in the area of damage to the wall of the gastrointestinal tract, for the treatment of certain chronic diseases of the gastrointestinal tract, such as peptic ulcer of the duodenum, ulcerative colitis, ischemic colitis, Crohn's disease, as well as surgical interventions on the intestine with local tissue removal and their complications, as well as to create experimental models of these diseases in order to develop new medicines and diagnostics for their treatment. The inventive method makes it possible to create a material for regenerative medicine of a new type, where probiotic bacteria serve as an active active principle, and can be used in biotechnology, tissue engineering and regenerative medicine.

Уровень техникиState of the art

Хронические воспалительные заболевания толстого и тонкого кишечника, такие как язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, неспецифический язвенный колит, ишемический колит, болезнь Крона, а также операционные вмешательства на кишечнике с локальным удалением тканей и их осложнения могут стать причиной образования прободных язв и свищей. Такие повреждения стенки кишечника являются очень серьезной патологией и могут привести к развитию перитонита и смерти, поэтому они практически всегда требуют проведения хирургического лечения. В настоящее время при проведении хирургических операций на тонком и толстом кишечнике все чаще используют заплаты кишечника и эндопротезы (плаги, стенты) из биоразлагаемых полимеров, предназначенных для закрытия дефекта тканей стенки кишечника и их регенерации. Однако, недостатками таких медицинских изделий часто являются недостаточная совместимость с окружающими тканями, неспособность к биоразложению с заданными сроками и отсутствие длительного терапевтического воздействия на область дефекта ткани с целью ее регенерации, что связано с использованием полимерных материалов синтетического происхождения, которые обладают плохой биосовместимостью как с тканями стенки кишечника, так и с пробиотическими бактериями, обладающими терапевтическим эффектом при восстановлении тканей. Кроме того, такие изделия часто имеют упрощенное строение, не учитывающее морфологические и физиологические особенности слизистой стенки кишечника, что ухудшает их терапевтическую эффективность, или, напротив, избыточно сложную конструкцию, что значительно усложняет их производство [Бонарцев А.П., Воинова В.В., Бонарцева Г.А. Поли-3-оксибутират и микробиота человека. Прикладная биохимия и микробиология, 2018, 54(6), 561-584].Chronic inflammatory diseases of the large and small intestine, such as duodenal ulcer, ulcerative colitis, ischemic colitis, Crohn's disease, as well as surgical interventions on the intestine with local tissue removal and their complications can cause the formation of perforated ulcers and fistulas. Such damage to the intestinal wall is a very serious pathology and can lead to the development of peritonitis and death, therefore, they almost always require surgical treatment. At present, when carrying out surgical operations on the small and large intestines, intestinal patches and endoprostheses (plugs, stents) made of biodegradable polymers are increasingly used, designed to close the defect in the intestinal wall tissues and regenerate them. However, the disadvantages of such medical devices are often insufficient compatibility with the surrounding tissues, the inability to biodegrade within a given time frame, and the absence of a long-term therapeutic effect on the tissue defect area in order to regenerate it, which is associated with the use of synthetic polymeric materials that have poor biocompatibility as with tissues. intestinal walls, and with probiotic bacteria, which have a therapeutic effect in tissue repair. In addition, such products often have a simplified structure that does not take into account the morphological and physiological characteristics of the intestinal mucosa, which worsens their therapeutic efficacy, or, on the contrary, an excessively complex design, which significantly complicates their production [Bonartsev A.P., Voinova V.V. ., Bonartseva G.A. Poly-3-hydroxybutyrate and human microbiota. Applied Biochemistry and Microbiology, 2018, 54 (6), 561-584].

В настоящее время в медицине, фармацевтике и тканевой инженерии активно используются целый ряд природных биополимеров: альгинат, хитозан, декстран, гиалуроновая кислота, агароза, ксантан, хондроитин сульфат, фибрин, коллаген (желатин), фиброин щелка, поли-L-лизин, полиглутаминовая кислота, поли-3-оксиалканоаты [Бонарцев А.П., Воинова В.В., Бонарцева Г.А. Поли-3-оксибутират и микробиота человека. Прикладная биохимия и микробиология, 2018, 54(6), 561-584]. Так, альгинаты, образующие биосовместимые гидрогели, активно используются в медицине, фармацевтике, косметологии и пищевой промышленности, в биотехнологии, например, для инкапсулирования клеток различных культур млекопитающих (фибробластов, миобластов, остеобластов, МСК, хондроцитов и др.), а также в тканевой инженерии для изготовления матриксов для роста клеток различных типов [Lee K.Y., Mooney D.J. Alginate: properties and biomedical applications. Prog. Polym. Sci., 2012, 37(1), 106-126]. Однако зачастую медицинское использование биополимеров никак не учитывает их роль и функции в природе. Так, если в водорослях альгинаты выполняют преимущественно структурно-механическую функцию, то у бактерий, способных к синтезу этого полисахарида родов Azotobacter и Pseudomonas, их функции более разнообразны, но главная из них - защитная. Клетки этих бактерий синтезируют и секретируют этот экзополихасахарид для формирования внешней слизистой оболочки отдельных клеток и их скоплений - цист или биопленок, которые защищают бактериальные клетки от неблагоприятных внешних факторов. Образование биопленки служит главной причиной патогенеза инфекционных заболеваний, вызываемых Pseudomonas aeruginosa, вызывающими опасное инфекционное поражение эпителия легких. Кроме того, бактериальный альгинат обладает устойчивостью к воздействию альгиназ микробиоты кишечника, в отличие от, например, альгината водорослей. Это связано с тем, что бактериальный альгинат отличается от альгинатов, выделенных из водорослей, более высокой молекулярной массой, большим молярным содержанием в полимере остатков гиалуроновых кислот и уровнем ацетилизования гидроксильных групп маннуроновых остатков в положении 2 и 3. Показано, что эти физико-химические свойства бактериальных альгинатов критически важны для формирования биопленки бактериями Pseudomonas sp. В совокупности эти свойства биополимера позволяют создавать такую слизистую оболочку вокруг бактериальной клетки, которая препятствует: расщеплению биопленки альгиназами, проникновению через нее других бактерий, фагоцитозу инкапсулированных бактерий макрофагами и нейтрофилами, воздействию на них цитотоксических лимфоцитов и антител, снижает воздействие на бактериальные клетки токсинов и антибактериальных лекарственных веществ. Кроме того, альгинатный гидрогель биопленки обеспечивает защиту от высыхания, удержание и аккумуляцию питательных веществ, удержание и связывание катионов, аккумуляцию внеклеточных факторов вирулентности бактерий, утилизации продуктов метаболизма других бактерий, стабильность плазмид и эффективность генетического обмена между бактериями, улучшенную межклеточную связь, создание и поддержание микросреды [Ghafoor А., Hay I.D., Rehm В.Н. Role of exopolysaccharides in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and architecture. Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77(15), 5238-5246]. Более того, последние исследования свидетельствуют о том, что и другие бактерии используют альгинаты, синтезируемые P. aeruginosa для формирования своего собственного биофильма [Scoffield J.A., Duan D., Zhu F., Wu H. A commensal streptococcus hijacks a Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide to promote biofilm formation. PLoS Pathog., 2017, 13(4), el006300]. Показано также, что формирование биопленки патогенными бактериями играет важную роль в процессах заживления и хронического воспаления повреждений эпителия. Отдельные представители микрофлоры эпителия, такие как Staphylococcus epidermidis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis (durans), Escherichia coli, Fusobacterium sp.образуют биопленки, которые представляют собой толстый слизистый барьер, защищающий микроорганизмы от внешних угроз, что ухудшает регенерацию поврежденного эпителия [Percival S.L., McCarty S.M., Lipsky В. Biofilms and Wounds: An Overview of the Evidence. Adv. Wound Care (New Rochelle), 2015, 4(7): 373-381].Currently, a number of natural biopolymers are actively used in medicine, pharmaceuticals and tissue engineering: alginate, chitosan, dextran, hyaluronic acid, agarose, xanthan, chondroitin sulfate, fibrin, collagen (gelatin), lye fibroin, poly-L-lysine, polyglutamic acid, poly-3-hydroxyalkanoates [Bonartsev A. P., Voinova V. V., Bonartseva G. A. Poly-3-hydroxybutyrate and human microbiota. Applied Biochemistry and Microbiology, 2018, 54 (6), 561-584]. Thus, alginates that form biocompatible hydrogels are actively used in medicine, pharmaceuticals, cosmetology and food industry, in biotechnology, for example, for encapsulating cells of various mammalian cultures (fibroblasts, myoblasts, osteoblasts, MSCs, chondrocytes, etc.), as well as in tissue engineering for the manufacture of matrices for the growth of cells of various types [Lee KY, Mooney DJ Alginate: properties and biomedical applications. Prog. Polym. Sci. 2012,37 (1) 106-126]. However, the medical use of biopolymers often does not take into account their role and functions in nature. So, if in algae alginates perform mainly a structural and mechanical function, then in bacteria capable of synthesizing this polysaccharide of the genera Azotobacter and Pseudomonas, their functions are more diverse, but the main one is protective. The cells of these bacteria synthesize and secrete this exopolychasaccharide to form the outer mucous membrane of individual cells and their clusters - cysts or biofilms that protect bacterial cells from adverse external factors. Biofilm formation is the main cause of the pathogenesis of infectious diseases caused by Pseudomonas aeruginosa, which cause a dangerous infection of the lung epithelium. In addition, bacterial alginate is resistant to alginases of the intestinal microbiota, in contrast to, for example, alginate of algae. This is due to the fact that bacterial alginate differs from alginates isolated from algae by its higher molecular weight, higher molar content of hyaluronic acid residues in the polymer, and the level of acetylation of hydroxyl groups of mannuron residues in positions 2 and 3. It has been shown that these physicochemical properties bacterial alginates are critical for biofilm formation by Pseudomonas sp. Taken together, these properties of the biopolymer make it possible to create such a mucous membrane around the bacterial cell, which prevents: the cleavage of the biofilm by alginases, the penetration of other bacteria through it, the phagocytosis of encapsulated bacteria by macrophages and neutrophils, the effect of cytotoxic lymphocytes and antibodies on them, reduces the effect of toxins and antibacterials on bacterial cells medicinal substances. In addition, alginate hydrogel of biofilm provides protection against drying out, retention and accumulation of nutrients, retention and binding of cations, accumulation of extracellular bacterial virulence factors, utilization of metabolic products of other bacteria, stability of plasmids and efficiency of genetic exchange between bacteria, improved intercellular communication, creation and maintenance of microenvironment [Ghafoor A., Hay ID, Rehm V.N. Role of exopolysaccharides in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and architecture. Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77 (15), 5238-5246]. Moreover, recent studies indicate that other bacteria use alginates synthesized by P. aeruginosa to form their own biofilm [Scoffield JA, Duan D., Zhu F., Wu H. A commensal streptococcus hijacks a Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide to promote biofilm formation. PLoS Pathog., 2017, 13 (4), el006300]. It was also shown that the formation of biofilms by pathogenic bacteria plays an important role in the healing and chronic inflammation of epithelial damage. Certain representatives of the epithelial microflora, such as Staphylococcus epidermidis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis (durans), Escherichia coli, Fusobacterium sp. Form biofilms, which are a thick mucous barrier that protects microorganisms from external threats, which Percival SL, McCarty SM, Lipsky B. Biofilms and Wounds: An Overview of the Evidence. Adv. Wound Care (New Rochelle) 2015, 4 (7): 373-381].

В последние годы все больше данных свидетельствует о том, что микробиота человека играет важную роль в процессах регенерации эпителия, в т.ч. слизистой стенки кишечника при ее повреждении, и эта роль далеко не всегда негативная. Показано, что микробиота активирует и поддерживает врожденный иммунитет, важна для нормального функционирования иммунной системы, регулирует воспалительные процессы. Показано, что изменения в составе микробиоты кишечника связаны с возникновением различных патологических состояний, в том числе воспалительных заболеваний кишечника, астмы, сахарного диабета II типа, ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний и психиатрических отклонений [Aron-Wisnewsky J., Clement К. The gut microbiome, diet, and links to cardiometabolic and chronic disorders. Nat. Rev. Nephrol., 2016, 12(3): 169-181]. Более того, бактерии могут не только противодействовать заживлению эпителиальных тканей, в частности слизистой оболочки кишечника, но и способствовать ему [Uchida М., Shimizu К., Kurakazu К. Yogurt containing Lactobacillus gasseri OLL 2716 (LG21 yogurt) accelerated the healing of acetic acid-induced gastric ulcer in rats. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2010, 74(9), 1891-1894; Lam E.K., Yu L., Wong H.P., Wu W.K., Shin V.Y., Tai E.K., So W.H., Woo P.C., Cho C.H. Probiotic Lactobacillus rhamnosus GG enhances gastric ulcer healing in rats. Eur. J. Pharmacol, 2007, 565(1-3), 171-179]. Альгинаты, выделенные из водорослей, использовались для инкапсулирования пробиотических бактерий микробиоты кишечника, в этих исследованиях было показано сохранение жизнеспособности бактерий и положительный эффект инкапсулирования бактерий для терапии заболеваний кишечника при их применении в качестве пробиотиков [D'Orazio G., Di Gennaro P., Boccarusso M., Presti I., Bizzaro G., Giardina S., Michelotti A., Labra M., La Ferla B. Microencapsulation of new probiotic formulations for gastrointestinal delivery: in vitro study to assess viability and biological properties. Appl Microbiol Biotechnol. 2015, 99(22), 9779-9789].In recent years, more and more data indicate that the human microbiota plays an important role in the processes of epithelial regeneration, incl. the intestinal mucosa when it is damaged, and this role is not always negative. It has been shown that microbiota activates and maintains innate immunity, is important for the normal functioning of the immune system, and regulates inflammatory processes. It has been shown that changes in the composition of the intestinal microbiota are associated with the occurrence of various pathological conditions, including inflammatory bowel diseases, asthma, type II diabetes mellitus, obesity, cardiovascular diseases and psychiatric abnormalities [Aron-Wisnewsky J., Clement K. The gut microbiome, diet, and links to cardiometabolic and chronic disorders. Nat. Rev. Nephrol., 2016, 12 (3): 169-181]. Moreover, bacteria can not only resist the healing of epithelial tissues, in particular the intestinal mucosa, but also promote it [Uchida M., Shimizu K., Kurakazu K. Yogurt containing Lactobacillus gasseri OLL 2716 (LG21 yogurt) accelerated the healing of acetic acid -induced gastric ulcer in rats. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2010, 74 (9), 1891-1894; Lam E.K., Yu L., Wong H.P., Wu W.K., Shin V.Y., Tai E.K., So W.H., Woo P.C., Cho C.H. Probiotic Lactobacillus rhamnosus GG enhances gastric ulcer healing in rats. Eur. J. Pharmacol, 2007,565 (1-3), 171-179]. Alginates isolated from algae were used to encapsulate probiotic bacteria of the intestinal microbiota, these studies have shown the preservation of the viability of bacteria and the positive effect of encapsulating bacteria for the treatment of intestinal diseases when used as probiotics [D'Orazio G., Di Gennaro P., Boccarusso M., Presti I., Bizzaro G., Giardina S., Michelotti A., Labra M., La Ferla B. Microencapsulation of new probiotic formulations for gastrointestinal delivery: in vitro study to assess viability and biological properties. Appl Microbiol Biotechnol. 2015, 99 (22), 9779-9789].

Таким образом, учитывая актуальность исследований по разработке материалов медицинского назначения для восстановления дефектов различных тканей и исследований терапевтического потенциала пробиотических бактерий для регенерации тканей особенно актуальными техническими решениями являются те, которые связаны с разработкой средств на основе бактериального альгината, служащих для обеспечения жизнеспособности, роста и терапевтической активности пробиотических бактерий для регенерации тканей стенки кишечника, а также способов, позволяющих создать медицинское изделие для регенеративной медицины нового типа, где активным действующим началом служат пробиотические бактерии, и может использоваться в биотехнологии, тканевой инженерии, регенеративной медицине.Thus, given the relevance of research on the development of medical materials for the restoration of defects in various tissues and research on the therapeutic potential of probiotic bacteria for tissue regeneration, especially relevant technical solutions are those related to the development of agents based on bacterial alginate, which serve to ensure viability, growth and therapeutic activity of probiotic bacteria for the regeneration of tissues of the intestinal wall, as well as methods for creating a medical device for regenerative medicine of a new type, where probiotic bacteria serve as an active active principle, and can be used in biotechnology, tissue engineering, regenerative medicine.

Из уровня техники известна композиция на основе бактериальных экзополисахаридов, а именно геллановой камеди. Данная композиция, преимущественно для перорального введения, может также содержать агент, улучшающий состояние желудочно-кишечного тракта [RU 2563137, 20.09.2015]. Данное изобретение представляет способы и композиции для профилактики или лечения диареи у млекопитающего. К недостаткам данной композиции и способа можно отнести то, что для композиции не показана ее способность улучшать жизнеспособность пробиотических бактерий, а способ не позволяет проводить локальное направленное терапевтическое воздействие на поврежденные ткани стенки пищеварительного тракта.A composition based on bacterial exopolysaccharides, namely gellan gum, is known from the prior art. This composition, mainly for oral administration, may also contain an agent that improves the condition of the gastrointestinal tract [RU 2563137, 20.09.2015]. This invention provides methods and compositions for the prevention or treatment of diarrhea in a mammal. The disadvantages of this composition and method can be attributed to the fact that the composition is not shown its ability to improve the viability of probiotic bacteria, and the method does not allow a local targeted therapeutic effect on damaged tissues of the wall of the digestive tract.

Из уровня техники известен препарат с контролируемым высвобождением и способ его получения, который способен высвобождать в верхней части тонкого кишечника 99% или более слаборастворимого лекарственного средства [US 6274174B1, 2001-08-14]. Изобретателям удалось разработать способ получения слаборастворимого лекарственного средства на агрегатах сферических микрочастиц альгината мультивалентного металла, в котором каждая из вторичных частиц имеет удельную площадь от 1 до 280 м²/г. Недостатком данной композиции является ее неспособность улучшать жизнеспособность пробиотических бактерий, а также способ не позволяет проводить локальное направленное терапевтическое воздействие на поврежденные ткани стенки пищеварительного тракта и не предназначен для инкапсулирования в качестве биоактивного агента пробиотических микроорганизмов.A controlled release preparation and a method for its preparation are known from the prior art, which is capable of releasing 99% or more of a poorly soluble drug in the upper part of the small intestine [US 6274174B1, 2001-08-14]. The inventors have succeeded in developing a method for producing a poorly soluble drug on aggregates of spherical microparticles of multivalent metal alginate, in which each of the secondary particles has a specific area from 1 to 280 m ² / g. The disadvantage of this composition is its inability to improve the viability of probiotic bacteria, and the method does not allow for local targeted therapeutic effects on damaged tissues of the wall of the digestive tract and is not intended for encapsulation as a bioactive agent of probiotic microorganisms.

Из уровня техники известна композиция, состоящая из гидрогеля на основе коллагенового матрикса в сочетании с полоксамером или альгинатом и заключенных в нем вирусных векторов [US 6333194 B1, 2001-12-25]. Данное изобретение направленно на таргетное заживление различных типов тканей или клеток по принципу непосредственной доставки данной композиции к месту повреждения, поэтому такая композиция может относится к области фармакологии. Недостатком такой композиции является то, что некоторые виды вирусов, которые могут доставляться в комбинации, а именно, лентивирусы аденовирусы или вирус герпеса могут вызывать инсерционный мутагенез, по причине случайного встраивания в геном клеток хозяина, также они обладают цитотоксичностью и иммуногенностью, что также нежелательно при терапии живых объектов.From the prior art there is known a composition consisting of a hydrogel based on a collagen matrix in combination with a poloxamer or alginate and enclosed viral vectors [US 6333194 B1, 2001-12-25]. The present invention is directed to the targeted healing of various types of tissues or cells by the principle of direct delivery of this composition to the site of injury, therefore, such a composition can belong to the field of pharmacology. The disadvantage of such a composition is that some types of viruses that can be delivered in combination, namely, lentiviruses, adenoviruses or herpes virus, can cause insertional mutagenesis due to accidental incorporation of host cells into the genome, they also have cytotoxicity and immunogenicity, which is also undesirable when therapy of living objects.

Из уровня техники известно о биополимерном материале в виде микросфер с высокой пористостью на основе поли-3-оксибутирата, полученных методом бактериального биосинтеза, обладающих свойствами биосовместимости и биодеградации, обладающих способностью к контролируемой сорбции и последующему пролонгированному высвобождению положительно заряженного терапевтического белка при введении микросфер в различные ткани, что может быть использовано в регенеративной медицине для длительной терапии повреждений различных тканей. Однако, недостатком данной композиции является ее неспособность улучшать жизнеспособность пробиотических бактерий [RU 2692768, 29.12.2017].It is known from the prior art about a biopolymer material in the form of microspheres with high porosity based on poly-3-hydroxybutyrate, obtained by bacterial biosynthesis, possessing biocompatibility and biodegradation properties, possessing the ability to controlled sorption and subsequent prolonged release of a positively charged therapeutic protein when microspheres are introduced into various tissue, which can be used in regenerative medicine for long-term therapy of damage to various tissues. However, the disadvantage of this composition is its inability to improve the viability of probiotic bacteria [RU 2692768, 29.12.2017].

Из уровня техники известно о биополимерном материале в виде микрокапсул из различных биоматериалов, в том числе полисахаридов, включая альгинат, содержащих пробиотические бактерии, и помещенных в гель. Недостатками этого материала являются жесткие способы инкапсулирования пробиотических бактерий, что снижает их жизнеспособность; использование большого количества различных материалов, что может снижать биосовместимость материала; и быстрый срок разрушения при температуре 37±1°С [RU 2652277, 13.04.2017].It is known from the prior art about biopolymer material in the form of microcapsules from various biomaterials, including polysaccharides, including alginate, containing probiotic bacteria and placed in a gel. The disadvantages of this material are tough methods of encapsulating probiotic bacteria, which reduces their viability; the use of a large number of different materials, which can reduce the biocompatibility of the material; and a fast time of destruction at a temperature of 37 ± 1 ° C [RU 2652277, 13.04.2017].

Этот материал может быть выбран в качестве наиболее близкого аналога по числу общих сходных признаков.This material can be selected as the closest analogue in terms of the number of common similar features.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Технической задачей (изобретения), является получение гидрогеля из бактериального альгината, в который помещены живые пробиотические бактерии, обладающие антагонистической активностью, что обеспечивает их рост in situ в условиях агрессивной среды желудочно-кишечного тракта при различных его заболеваниях и замещение ими патогенной микрофлоры в области повреждения тканей. Это может быть использовано для лечения различных заболеваний желудочно-кишечного тракта благодаря терапевтической функциональности пробиотиков.The technical objective (of the invention) is to obtain a hydrogel from bacterial alginate, in which live probiotic bacteria with antagonistic activity are placed, which ensures their growth in situ in an aggressive environment of the gastrointestinal tract with various diseases and their replacement of pathogenic microflora in the damaged area fabrics. It can be used to treat various diseases of the gastrointestinal tract due to the therapeutic functionality of probiotics.

Техническим результатом для способа является получение полимерного материала (гидрогеля), обеспечивающего не менее 95% выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в материале [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»], а также их защиту и рост.The technical result for the method is to obtain a polymer material (hydrogel), providing at least 95% of the survival rate of bacteria, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the material [GOST R 56139-2014 "Functional food products. Methods for the determination and enumeration of probiotic microorganisms "], as well as their protection and growth.

Полимерный материал гидрогеля, служащего субстратом для обеспечения жизнеспособности и роста пробиотических бактерий и предназначенного также для заполнения пористых полимерных конструкций - бактериальный альгинат получают способом контролируемого микробиологического биосинтеза с использованием штамма-продуцента этого биополимера Azotobacter chroococcum 7Б [RU 2194759, 20.12.2002; Бонарцева Г.А., Акулина Е.А., Мышкина В.Л., Воинова В.В., Махина Т.К., Бонарцев А.П. Биосинтез альгинатов бактериями рода Azotobacter. Прикладная биохимия и микробиология, 2017, 53(1), 61-68] или других бактерий рода Azotobacter. Для поддержания культуры бактерий используют твердую питательную среду Эшби, следующего состава (г/л): K₂HPO₄ - 1,05; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,2; NaCl - 0,2; Na₂MoO₄ - 0,006; СаСОз - 5,0; сахароза - 20, агар - 20. Для биосинтеза альгината штамм-продуцент A. chroococcum 7Б культивируют в жидкой среде Берка следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - от 0,05 до 1,00; K₂HPO₄ - от 0,05 до 1,00; MgSO₄ - 0,4; NaCl - 0,1; FeSO₄ - 0,01; Na₂MoO₄ - 0,06; CaCl₂ - 0,1; цитрат натрия - 0,5; сахароза - от 20 до 40. Сначала готовят посевной материал, для чего штамм-продуцент A. chroococcum 7Б выращивают в жидкой среде Берка указанного состава в качалочных колбах объемом 750 мл (со 100 мл среды) при 250 об./мин (исходный рН среды - 7,2; температура культивирования - 28°С) в течение 24 часов. Затем проводят биосинтез альгината штаммом-продуцентом А. chroococcum 7Б, для чего его культивируют в той же среде после внесения 4% (об.) посевного материала возрастом 24 часа в качалочных колбах на 750 мл (объем культуральной среды - 100 мл) на микробиологической качалке Innova 43 («New Brunswick Scientific)), США) при скорости перемешивания от 200 до 400 об./мин в течение 72 часов. Все процедуры проводят в стерильных условиях.Polymeric material of a hydrogel, which serves as a substrate for ensuring the viability and growth of probiotic bacteria and is also intended for filling porous polymer structures - bacterial alginate is obtained by the method of controlled microbiological biosynthesis using the producer strain of this biopolymer Azotobacter chroococcum 7B [RU 2194759, 20.12.2002; Bonartseva G.A., Akulina E.A., Myshkina V.L., Voinova V.V., Makhina T.K., Bonartsev A.P. Biosynthesis of alginates by bacteria of the genus Azotobacter. Applied Biochemistry and Microbiology, 2017, 53 (1), 61-68] or other bacteria of the genus Azotobacter. To maintain the culture of bacteria, use Ashby's solid nutrient medium of the following composition (g / l): K ₂ HPO ₄ - 1.05; KH ₂ PO ₄ 0.2; MgSO ₄ 0.2; NaCl 0.2; Na ₂ MoO ₄ - 0.006; CaCOz - 5.0; sucrose - 20, agar - 20. For the biosynthesis of alginate, the producer strain A. chroococcum 7B is cultivated in Burk's liquid medium of the following composition (g / l): KH ₂ PO ₄ - from 0.05 to 1.00; K ₂ HPO ₄ - from 0.05 to 1.00; MgSO ₄ 0.4; NaCl - 0.1; FeSO ₄ - 0.01; Na ₂ MoO ₄ - 0.06; CaCl ₂ - 0.1; sodium citrate - 0.5; sucrose - from 20 to 40. First, the inoculum is prepared, for which the producer strain A. chroococcum 7B is grown in Burk's liquid medium of the specified composition in 750 ml shaking flasks (from 100 ml of medium) at 250 rpm (initial pH of the medium - 7.2; cultivation temperature - 28 ° C) for 24 hours. Then biosynthesis of alginate is carried out by the producer strain A. chroococcum 7B, for which it is cultivated in the same medium after adding 4% (vol.) Of inoculum aged 24 hours in shaking flasks of 750 ml (the volume of the culture medium is 100 ml) on a microbiological shaker Innova 43 (New Brunswick Scientific), USA) at a stirring speed of 200 to 400 rpm for 72 hours. All procedures are performed under sterile conditions.

Для выделения альгината биомассу штамма-продуцента смешивают с раствором 50 мМ ЭДТА в 0,9% NaCl (вес.) и тщательно перемешивают, после чего проводят центрифугирование при 15000 g 30 мин. Осадок отделяют и промывают водой. Затем к нему добавляют 3-кратный объем 96% этилового спирта. Осадок снова отделяют и промывают водой. После этого проводят очистку полученного альгината. Для этого альгинат снова осаждают 3-кратным объемом 96% этилового спирта и проводят диализ против 0.5% NaCl в течение 24 h. Осадок снова отделяют и высушивают при помощи лиофильной сушки. Полученный порошок хранят при 4°С не более 3-х месяцев.To isolate alginate, the biomass of the producer strain is mixed with a solution of 50 mM EDTA in 0.9% NaCl (wt.) And thoroughly mixed, after which centrifugation is carried out at 15000 g for 30 minutes. The precipitate is separated and washed with water. Then a 3-fold volume of 96% ethyl alcohol is added to it. The precipitate is again separated and washed with water. After that, the resulting alginate is purified. For this, the alginate is again precipitated with a 3-fold volume of 96% ethanol and dialysis is performed against 0.5% NaCl for 24 h. The precipitate is again separated and dried using a freeze dryer. The resulting powder is stored at 4 ° C for no more than 3 months.

Разработанный способ биосинтеза альгината позволяет получать полимер со следующим сочетанием параметров: молекулярной массой (определяемой методом визкозиметрии) от 10⁵ до 10⁶ г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере от 31 моль% до 48 моль% и уровнем ацетилирования - от 10 моль% до 46 моль% (определяемых методом ИК-спектроскопии). Такие параметры бактериального альгината близки свойствам бактериального альгината, образующего бактериальную биопленку [Boyd A., Chakrabarty A.M. Pseudomonas aeruginosa biofilms: role of the alginate exopolysaccharide. J. Ind. Microbiol., 1995, 15(3), 162-168; Nivens D.E., Ohman D.E., Williams J., Franklin M.J. Role of alginate and its О acetylation in formation of Pseudomonas aeruginosa microcolonies and biofilms. J. Bacteriol., 2001, 183(3), 1047-1057; Tielen P., Strathmann M., Jaeger K.E., Flemming H.C., Wingender J. Alginate acetylation influences initial surface colonization by mucoid Pseudomonas aeruginosa. Microbiological Research, 2005, 160(2), 165-176; Ghafoor A., Hay I.D., Rehm B.H. Role of exopolysaccharides in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and architecture. Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77(15), 5238-5246].The developed method for the biosynthesis of alginate makes it possible to obtain a polymer with the following combination of parameters: molecular weight (determined by viscosimetry) from 10 ⁵ to 10 ⁶ g / mol, molar content of guluronic acid residues in the polymer from 31 mol% to 48 mol%, and acetylation level - from 10 mol% to 46 mol% (determined by IR spectroscopy). Such parameters of bacterial alginate are close to the properties of bacterial alginate, which forms a bacterial biofilm [Boyd A., Chakrabarty AM Pseudomonas aeruginosa biofilms: role of the alginate exopolysaccharide. J. Ind. Microbiol. 1995,15 (3) 162-168; Nivens DE, Ohman DE, Williams J., Franklin MJ Role of alginate and its O acetylation in formation of Pseudomonas aeruginosa microcolonies and biofilms. J. Bacteriol. 2001, 183 (3), 1047-1057; Tielen P., Strathmann M., Jaeger KE, Flemming HC, Wingender J. Alginate acetylation influences initial surface colonization by mucoid Pseudomonas aeruginosa. Microbiological Research 2005,160 (2) 165-176; Ghafoor A., Hay ID, Rehm BH Role of exopolysaccharides in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and architecture. Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77 (15), 5238-5246].

На следующем этапе в альгинате, полученном микробиологическим путем выращивают пробиотические бактерии. Сначала культуры бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium выращивают на полужидкой среде, обеспечивающей рост указанных бактерий. В колбы наливают питательную среду, укупоривают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют. При культивировании бактерий рода Lactobacillus готовую среду не хранят. При культивировании бактерий рода Bifidobacterium готовую среду хранят не более 2-х недель в бытовом холодильнике при температуре 5-8°С. Посев осуществляют, как только температура среды после автоклавирования достигает 40°С. Для этого с помощью пипетки, вносят в полужидкую питательную среду 1,0±0,1 мл суспензии бактериальных клеток и перемешивают [Schillinger U., Holzapfel W.H. Chapter 8. Culture media for lactic acid bacteria, p. 127-140. In: Handbook of Culture Media for Food Microbiology. Edited by Janet E.L. Corry, G.D.W. Curtis, Rosamund M. Baird. V.37, 2003].In the next step, probiotic bacteria are grown in microbiologically obtained alginate. First, cultures of bacteria of the genera Lactobacillus and Bifidobacterium are grown on a semi-liquid medium that ensures the growth of these bacteria. The culture medium is poured into the flasks, sealed with cotton-gauze stoppers and autoclaved. When cultivating bacteria of the genus Lactobacillus, the prepared medium is not stored. When cultivating bacteria of the genus Bifidobacterium, the prepared medium is stored for no more than 2 weeks in a household refrigerator at a temperature of 5-8 ° C. Sowing is carried out as soon as the temperature of the medium after autoclaving reaches 40 ° C. To do this, using a pipette, add 1.0 ± 0.1 ml of bacterial cell suspension to a semi-liquid nutrient medium and mix [Schillinger U., Holzapfel W.H. Chapter 8. Culture media for lactic acid bacteria, p. 127-140. In: Handbook of Culture Media for Food Microbiology. Edited by Janet E.L. Corry, G.D.W. Curtis, Rosamund M. Baird. V.37, 2003].

Параллельно готовят 1±0,1% (вес.) водный раствор альгината натрия с молекулярной массой от 1,0x10⁵ до 1,0x10⁶ г/моль, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 25±5°С и скорости перемешивания 40-80 об/мин.In parallel, a 1 ± 0.1% (wt.) Aqueous solution of sodium alginate with a molecular weight of 1.0x10 ⁵ to 1.0x10 ⁶ g / mol, obtained microbiologically, is prepared in 150 ml of MRS broth on a magnetic stirrer with heating at 25 ± 5 ° С and stirring speed 40-80 rpm.

Для посева культуры бактерий рода Lactobacillus готовят жидкую посевную культуру. Для этого в пробирку с культурой, растущей на скошенном MRS-arape, вносят 3±0,2 мл MRS-бульона. Снимают клетки с поверхности твердой среды путем повторного пипетирования и переносят полученную суспензию в колбу, содержащую 150±10 мл питательной среды на основе бактериального альгината в MRS-бульоне. Колбу с жидкой посевной культурой инкубируют 96±6 часа в аэробных условиях на микробиологической качалке при 37±1°С и скорости перемешивания 120±20 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см).For sowing a culture of bacteria of the genus Lactobacillus, prepare a liquid seed culture. For this, 3 ± 0.2 ml of MRS broth is added to a test tube with a culture growing on a slant MRS-arape. Cells are removed from the surface of the solid medium by repeated pipetting and the resulting suspension is transferred into a flask containing 150 ± 10 ml of a culture medium based on bacterial alginate in MRS broth. A flask with a liquid seed culture is incubated for 96 ± 6 hours under aerobic conditions on a microbiological shaker at 37 ± 1 ° C and a stirring speed of 120 ± 20 rpm (orbital diameter 1.9 cm).

Для посева культуры бактерий рода Bifidobacterium сначала проводят пересев со среды с агар-агаром на среду с альгинатом. Для этого из колбы с 96±6 часовой культурой, растущей в полужидкой среде на агар-агаре, стеклянной серологической пипеткой отбирают 8,0±0,2 мл и вносят в колбу со свежеприготовленной полужидкой средой на основе бактериального альгината в MRS-бульоне. Содержимое колбы перемешивают.Для получения культуры бактерий рода Bifidobacterium в полужидкой среде на дно колбы вносят 4,0±0,2 мл рабочей культуры. Содержимое колбы не перемешивают. После инокуляции колбы укупоривают ватно-марлевыми пробками и для термостатирования помещают в микробиологическую качалку. Инкубируют 96±6 часа при 37±1°С без перемешивания.To inoculate a culture of bacteria of the genus Bifidobacterium, first, subculture is carried out from a medium with agar-agar to a medium with alginate. For this purpose, 8.0 ± 0.2 ml is taken from a flask with a 96 ± 6 hour culture growing in a semi-liquid medium on agar-agar with a glass serological pipette and introduced into a flask with a freshly prepared semi-liquid medium based on bacterial alginate in MRS broth. The contents of the flask are stirred. To obtain a culture of bacteria of the genus Bifidobacterium in a semi-liquid medium, 4.0 ± 0.2 ml of the working culture is added to the bottom of the flask. The contents of the flask are not mixed. After inoculation, the flasks are sealed with cotton-gauze stoppers and placed in a microbiological shaker for thermostating. Incubate for 96 ± 6 hours at 37 ± 1 ° C without stirring.

Из полученного таким образом бактериального капсулярного альгината натрия с выращенной в нем биомассой пробиотических бактерий изготавливают гидрогель в виде пленки. Для этого биомассу бактерий в бактериальном альгинате наносили в стерильных условиях на используемую в качестве подложки стеклянную чашку Петри диаметром 90 мм, заполненную 50±10 мл 50±1 мМ раствором хлорида кальция, с помощью шприца на 20-50 мл с плоской прямоугольной форсункой (насадкой) шириной 2±1 мм, после чего инкубируют 20 мин при температуре 25±3°С. Пленку затем извлекают, промывают в воде и используют по назначению. В результате получают пленку толщиной от 0,5 до 2 мм, содержащую пробиотические бактерии в концентрации более 1×10⁷ КОЕ/г. Причем, такая методика позволяет увеличивать содержание бактерий в гидрогеле по отношению к первоначальному, тогда как в других методиках содержание бактерий в композиции, напротив, значительно уменьшается.From the thus obtained bacterial capsular sodium alginate with the biomass of probiotic bacteria grown in it, a hydrogel is made in the form of a film. For this, the biomass of bacteria in bacterial alginate was applied under sterile conditions onto a glass Petri dish with a diameter of 90 mm used as a substrate, filled with 50 ± 10 ml of a 50 ± 1 mM calcium chloride solution, using a 20-50 ml syringe with a flat rectangular nozzle (nozzle ) 2 ± 1 mm wide, and then incubated for 20 min at 25 ± 3 ° C. The film is then removed, washed in water and used as directed. As a result, a film with a thickness of 0.5 to 2 mm is obtained, containing probiotic bacteria at a concentration of more than 1 × 10 ⁷ CFU / g. Moreover, this technique allows you to increase the content of bacteria in the hydrogel in relation to the original, while in other techniques, the content of bacteria in the composition, on the contrary, significantly decreases.

Эффективность полученного гидрогеля оценивали с помощью модельных тестов: теста устойчивости гидрогеля при температуре 37°С, теста устойчивости в симулированной среде кишечника, тестов ферментативной устойчивости, теста устойчивости в среде чужеродных бактерий, теста миграции бактерий из гидрогеля, теста исследования на цитотоксичность in vitro. В качестве препарата-сравнения использовали инкапсулированную форму бактерий в водорослевом альгинате, изготовленную путем диспергирования соответствующих пробиотических бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium в 2% (об.) растворе водорослевого альгината с последующим получением пленки из альгинатного гидрогеля с инкапсулированными в ней бактериями с помощью раствора хлорида кальция так, что содержание бактерий в полученных пленках было таким же как и в тестируемых конструкциях.The effectiveness of the obtained hydrogel was evaluated using model tests: a hydrogel stability test at 37 ° C, a resistance test in a simulated intestinal environment, enzymatic resistance tests, a resistance test in an alien bacteria environment, a bacteria migration test from a hydrogel, and an in vitro cytotoxicity test. An encapsulated form of bacteria in algal alginate, prepared by dispersing the corresponding probiotic bacteria of the genera Lactobacillus and Bifidobacterium in a 2% (vol.) Solution of algal alginate, was used as a reference drug, followed by obtaining a film from an alginate hydrogel with bacteria encapsulated in it using a calcium chloride solution so that the content of bacteria in the resulting films was the same as in the tested constructs.

Тест устойчивости гидрогеля при температуре 37±1°С: полученные пленки из альгинатного гидрогеля, содержащие бактерии, наносят на стеклянную поверхность чашки Петри и помещают в термостат с поддерживаемой в нем температурой 37±1°С. Выдерживают в течение 10±1 мин, после чего извлекают и наблюдают за изменением формы и агрегатного состояния гидрогеля, фиксируя время полной деформации с момента нанесения на стеклянную поверхность.Hydrogel stability test at 37 ± 1 ° C: the obtained films of alginate hydrogel containing bacteria are applied to the glass surface of a Petri dish and placed in a thermostat maintained at 37 ± 1 ° C. It is kept for 10 ± 1 min, after which it is removed and the change in the shape and state of aggregation of the hydrogel is observed, recording the time of complete deformation from the moment of application to the glass surface.

Тест устойчивости в симулированной среде кишечника: полученные пленки из альгинатного гидрогеля, содержащие бактерии, помещают в стеклянную колбу со 100 мл симулированной среды кишечника следующего состава: 50 мМ KH₂PO₄, 10 мг/мл желчных кислот, рН=7,5; проводят инкубацию в течение 150 мин при 37°С. Полученный гидрогель должен обеспечивать не менее 95% абсолютной их выживаемости, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в среде [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов »].Stability test in simulated intestinal medium: the obtained films of alginate hydrogel containing bacteria are placed in a glass flask with 100 ml of simulated intestinal medium of the following composition: 50 mM KH ₂ PO ₄ , 10 mg / ml bile acids, pH = 7.5; incubation is carried out for 150 min at 37 ° C. The resulting hydrogel should provide at least 95% of their absolute survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the environment [GOST R 56139-2014 “Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "].

Тест ферментативной устойчивости с использованием альгинат лиазы в симулированной среде кишечника: полученные пленки из альгинатного гидрогеля, содержащие бактерии, помещают в стеклянную колбу со 100 мл симулированной среды кишечника, содержащей альгинат лиазу, следующего состава: 50 мМ KH₂PO₄, 10 мг/мл желчных кислот, 1 мг/мл альгинат лиаза (Сигма-Алдрич, ≥10000 ед./г), рН=7,5; проводят инкубацию в течение 150 мин при 37°С. Полученный гидрогель должен обеспечить не менее чем 25% повышение выживаемости бактерий, оцениваемое по стандартной методике определения числа КОЕ в среде [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»].Enzymatic stability test using alginate lyase in a simulated intestinal medium: the obtained films of alginate hydrogel containing bacteria are placed in a glass flask with 100 ml of simulated intestinal medium containing alginate lyase, of the following composition: 50 mM KH ₂ PO ₄ , 10 mg / ml bile acids, 1 mg / ml alginate lyase (Sigma-Aldrich, ≥10000 U / g), pH = 7.5; incubation is carried out for 150 min at 37 ° C. The resulting hydrogel should provide at least 25% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the medium [GOST R 56139-2014 "Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "].

Тест ферментативной устойчивости с использованием лизоцима в симулированной среде кишечника: полученные пленки из альгинатного гидрогеля, содержащие бактерии, помещают в стеклянную колбу со 100 мл симулированной среды кишечника, содержащей лизоцим, следующего состава: 50 мМ KH₂PO₄, 10 мг/мл желчных кислот, 1 мг/мл лизоцима (Сигма-Алдрич, ≥40000 ед./мг), рН=7,5; проводят инкубацию в течение 150 мин при 37°С. Полученный гидрогель должен обеспечивать не менее чем 25% повышение выживаемости бактерий, оцениваемое по стандартной методике определения числа КОЕ в среде [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»].Enzymatic resistance test using lysozyme in simulated intestinal medium: the obtained films of alginate hydrogel containing bacteria are placed in a glass flask with 100 ml of simulated intestinal medium containing lysozyme, of the following composition: 50 mM KH ₂ PO ₄ , 10 mg / ml bile acids , 1 mg / ml lysozyme (Sigma-Aldrich, ≥40,000 U / mg), pH = 7.5; incubation is carried out for 150 min at 37 ° C. The resulting hydrogel should provide at least 25% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the medium [GOST R 56139-2014 "Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "].

Тест ферментативной устойчивости с использованием липазы в симулированной среде кишечника: полученные пленки из альгинатного гидрогеля, содержащие бактерии, помещают в стеклянную колбу со 100 мл симулированной среды кишечника, содержащей липазу, следующего состава: 50 мМ KH₂PO₄, 10 мг/мл желчных кислот, 1 мг/мл липазы (Сигма-Алдрич, ≥40000 ед./мг), рН=7,5; проводят инкубацию в течение 150 мин. при 37°С. Полученный гидрогель должен обеспечивать не менее чем 25% повышение выживаемости бактерий, оцениваемое по стандартной методике определения числа КОЕ в среде [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»].Enzymatic resistance test using lipase in simulated intestinal medium: the obtained films of alginate hydrogel containing bacteria are placed in a glass flask with 100 ml of simulated intestinal medium containing lipase, of the following composition: 50 mM KH ₂ PO ₄ , 10 mg / ml bile acids , 1 mg / ml lipase (Sigma-Aldrich, ≥40,000 U / mg), pH = 7.5; incubation is carried out for 150 minutes. at 37 ° C. The resulting hydrogel should provide at least 25% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the medium [GOST R 56139-2014 "Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "].

Тест устойчивости в среде чужеродных бактерий: полученные пленки из альгинатного гидрогеля, содержащие бактерии, в стерильных условиях помещают в коническую колбу на 250 мл на полужидкой среде, состоящей из 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара в толщу среды, в которую предварительно внесена культура Е. coli BL21 (GE Healthcare, США), содержимое колбы не перемешивают, после инокуляции колбы укупоривают ватно-марлевыми пробками и для термостатирования помещают в микробиологическую качалку, после чего инкубируют 24±4 часа при 37±1°С без перемешивания. Полученный гидрогель должен обеспечивать не менее чем 25% повышение устойчивости культур бактерий родов Lactobacillus или Bifidobacterium к проникновению в гидрогель чужеродных бактерий Е. coli BL21 или наличие в гидрогеле не более 5% чужеродных бактерий Е. coli BL21 от общего количества бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в среде [ГОСТ Р 56139- 2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов »].Stability test in the environment of foreign bacteria: the obtained films of alginate hydrogel containing bacteria are placed under sterile conditions in a 250 ml conical flask on a semi-liquid medium consisting of 200 ml of MRS broth and 0.3% agar-agar in the thickness of the medium, in which was previously introduced with E. coli BL21 culture (GE Healthcare, USA), the contents of the flask are not stirred, after inoculation, the flasks are sealed with cotton-gauze stoppers and placed in a microbiological shaker for incubation, after which they are incubated for 24 ± 4 hours at 37 ± 1 ° C without mixing. The resulting hydrogel should provide at least 25% increase in the resistance of cultures of bacteria of the genera Lactobacillus or Bifidobacterium to the penetration of alien bacteria E. coli BL21 into the hydrogel or the presence in the hydrogel of no more than 5% of foreign bacteria E. coli BL21 of the total number of bacteria, assessed by the standard method determining the number of CFU in the environment [GOST R 56139-2014 "Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "].

Тест миграции бактерий из гидрогеля: полученные пленки из альгинатного гидрогеля, содержащие пробиотические бактерии, в стерильных условиях помещают в коническую колбу на 250 мл на полужидкой среде, состоящей из 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара в толщу среды, содержимое колбы не перемешивают, после инокуляции колбы укупоривают ватно-марлевыми пробками и для термостатирования помещают в микробиологическую качалку, после чего инкубируют 24±4 часа при 37±1°С без перемешивания. Полученный гидрогель должен обеспечивать распространение бактерий родов Lactobacillus или Bifidobacterium в полужидкой среде, в которой помещен гидрогель, на расстояние не менее чем 10 мм от образца гидрогеля, оцениваемое по стандартной методике определения числа КОЕ в среде [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов »].Test for migration of bacteria from the hydrogel: the obtained films from alginate hydrogel containing probiotic bacteria are sterilely placed in a 250 ml conical flask on a semi-liquid medium consisting of 200 ml of MRS broth and 0.3% agar-agar in the thickness of the medium, the contents the flasks are not stirred, after inoculation the flasks are sealed with cotton-gauze stoppers and placed in a microbiological shaker for thermostatting, after which they are incubated for 24 ± 4 hours at 37 ± 1 ° C without stirring. The resulting hydrogel should ensure the spread of bacteria of the genera Lactobacillus or Bifidobacterium in a semi-liquid medium in which the hydrogel is placed, at a distance of at least 10 mm from the hydrogel sample, assessed according to the standard method for determining the number of CFU in the medium [GOST R 56139-2014 “Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "].

Тест исследования на цитотоксичность in vitro проводили согласно ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro». В качестве культуры клеток используют фибробласты мыши линии Balb/3Т3З и испытание методом прямого контакта. Проводят качественную оценку по баллам. Полученный гидрогель не должен быть цитотоксичным (должен иметь балл по шкале цитотоксичности не более «0»).The in vitro cytotoxicity test was performed in accordance with GOST ISO 10993-1-2011 “Medical devices. Assessment of the biological effect of medical devices. Part 5. Testing for cytotoxicity: in vitro methods ”. As a cell culture, mouse fibroblasts of the Balb / 3T3Z line and a direct contact test were used. A qualitative assessment is carried out by points. The resulting hydrogel should not be cytotoxic (it should have a cytotoxicity score of no more than "0").

Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings

Предложенное изобретение характеризуется следующими графическими материалами.The proposed invention is characterized by the following graphic materials.

На Фиг. 1 представлены фрагменты гидрогеля бактериального альгината с растущими в них пробиотическими бактериями Bifidobacterium longum МС-42, при помещении их на стандартную твердую среду через 96 часов культивирования.FIG. 1 shows fragments of a hydrogel of bacterial alginate with the probiotic bacteria Bifidobacterium longum MC-42 growing in them, when placed on a standard solid medium after 96 hours of cultivation.

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

Для биосинтеза бактериального альгината использовали штамм-продуцент Azotobacter chroococcum 7Б [Бонарцева Г.А., Акулина Е.А., Мышкина В.Л., Воинова В.В., Махина Т.К., Бонарцев А.П. Биосинтез альгинатов бактериями рода Azotobacter. Прикладная биохимия и микробиология, 2017, 53(1), 61-68]. Оптическую плотность культуральной среды контролировали нефелометрически при 520 нм. Морфологию бактерий рода Azotobacter контролировали при помощи световой микроскопии с использованием микроскопа Биомед-1 («Биомед», Россия) с цифровой камерой. Для визуализации клеток и альгината использовали окраску фуксином. Эффективность очистки бактериального альгината контролируют при помощи измерения проводимости 1% (вес.) раствора альгината, используя кондуктометр S30 SevenEasyTM (Mettler Toledo, США). Молекулярную массу бактериального альгината определяют методом вискозиметрии; химическое строение и уровень ацетилирования определяют методом ИК-спектроскопии согласно [Бонарцева Г.А., Акулина Е.А., Мышкина В.Л., Воинова В.В., Махина Т.К., Бонарцев А.П. Биосинтез альгинатов бактериями рода Azotobacter. Прикладная биохимия и микробиология, 2017, 53(1), 61-68].For the biosynthesis of bacterial alginate used the producer strain Azotobacter chroococcum 7B [Bonartseva GA, Akulina EA, Myshkina VL, Voinova VV, Makhina TK, Bonartsev A.P. Biosynthesis of alginates by bacteria of the genus Azotobacter. Applied Biochemistry and Microbiology, 2017, 53 (1), 61-68]. The optical density of the culture medium was monitored nephelometrically at 520 nm. The morphology of bacteria of the genus Azotobacter was monitored by light microscopy using a Biomed-1 microscope (Biomed, Russia) with a digital camera. Fuchsin staining was used to visualize cells and alginate. The purification efficiency of bacterial alginate is controlled by measuring the conductivity of a 1% (wt.) Alginate solution using an S30 SevenEasyTM conductometer (Mettler Toledo, USA). The molecular weight of bacterial alginate is determined by viscometry; the chemical structure and the level of acetylation are determined by IR spectroscopy according to [GA Bonartseva, EA Akulina, VL Myshkin, VV Voinova, TK Makhina, AP Bonartsev. Biosynthesis of alginates by bacteria of the genus Azotobacter. Applied Biochemistry and Microbiology, 2017, 53 (1), 61-68].

Все остальные используемые реагенты и штаммы пробиотических бактерий родов родов Lactobacillus и Bifidobacterium являются коммерчески доступными (ООО «Спутник-К»), все процедуры, если не оговорено особо, осуществляют при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°С, а культивирование пробиотических бактерий - при температуре 37±1°С. Микроструктуру биоинженерной конструкции (пористость, размер пор, диаметр полученных микросфер) контролировали с помощью сканирующей электронной микроскопии с использованием электронного микроскопа JSM-6380LA (Jeol, Япония) с предварительным напылением золота на исследуемые образцы в течение 15 мин с помощью установки IB-3 (Giko, Japan) при силе тока 15 мА и программы обработки изображений Image J. Рост культур контролируют методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, USA), морфологическую однородность проверяют при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой). Определение количества бактерий в полученной биоинженерной конструкции проводят по стандартной методике высева бактерий на плотную агаризованную питательную среду с последующим подсчетом выросших колоний; результаты выражают в колониеобразующих единицах (КОЕ) на 1 мл (КОЕ/мл) согласно [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»]. Термины: «биологически активный», «биоинженерный», «пробиотические бактерии», «пробиотики», «культивирование», «биосовместимый», «биоразлагаемый», «терапевтический» употребляются в соответствии с их общепринятыми определениями [Биосовместимые материалы: Учебное пособие / Под. ред. В.И. Севостьянова, М.П. Кирпичникова. Москва. Медицинское информационное агентство, 2011, 540 стр. ; Пробиотики и пребиотики / Всемирная гастроэнтерологическая организация (WGO). Практические рекомендации. 2008. http://www.gastroscan.ru/literature/authors/5634].All other used reagents and strains of probiotic bacteria of the genera Lactobacillus and Bifidobacterium are commercially available (OOO Sputnik-K), all procedures, unless otherwise stated, are carried out at room temperature or ambient temperature, that is, in the range from 18 to 25 ° С, and cultivation of probiotic bacteria - at a temperature of 37 ± 1 ° С. The microstructure of the bioengineering structure (porosity, pore size, diameter of the obtained microspheres) was monitored by scanning electron microscopy using a JSM-6380LA electron microscope (Jeol, Japan) with preliminary gold deposition on the samples under study for 15 min using an IB-3 setup (Giko , Japan) at a current of 15 mA and an image processing program Image J. The growth of cultures is monitored by nephelometry, determining the optical density at a wavelength of 600 nm on a spectrophotometer (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, USA), morphological homogeneity is checked using light microscopy (microscope Biomed-1, "Biomed", RF, with a digital camera). Determination of the number of bacteria in the obtained bioengineering structure is carried out according to the standard method of seeding bacteria on a dense agar nutrient medium, followed by counting the grown colonies; the results are expressed in colony-forming units (CFU) per ml (CFU / ml) according to [GOST R 56139-2014 “Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "]. The terms “biologically active”, “bioengineered”, “probiotic bacteria”, “probiotics”, “cultivation”, “biocompatible”, “biodegradable”, “therapeutic” are used in accordance with their generally accepted definitions [Biocompatible materials: Study guide / Under ... ed. IN AND. Sevostyanova, M.P. Kirpichnikov. Moscow. Medical News Agency, 2011, 540 pp.; Probiotics and Prebiotics / World Gastroenterology Organization (WGO). Practical advice. 2008. http://www.gastroscan.ru/literature/authors/5634].

Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами выполнения, которые не являются единственно возможным, но наглядно демонстрирует возможность достижения требуемого технического результата.The present invention is illustrated by specific examples of execution, which are not the only possible, but clearly demonstrates the possibility of achieving the required technical result.

Пример 1Example 1

Изготовление биоинженерной конструкции проводят в несколько последовательных этапов.The manufacture of a bioengineered structure is carried out in several sequential stages.

На первом этапе способом контролируемого микробиологического биосинтеза также получали бактериальный альгинат. Для поддержания культуры бактерий использовали твердую питательную среду Эшби, следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 1,05; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,2; NaCl - 0,2; Na₂MoO₄ - 0,006; СаСО₃ - 5,0; сахароза - 20, агар - 20. Для биосинтеза альгината штамм-продуцент A. chroococcum 7Б [Патент РФ №2194759, 20.12.2002; Патент РФ №2201453, 27.03.2003; Патент РФ №2307159, 27.09.2007; Bonartsev А.Р., Zharkova I.I., Yakovlev S.G., Myshkina V.L., Mahina Т.К., Voinova V.V., Zernov A.L., Zhuikov V.A., Akoulina E.A., Ivanova E.V., Kuznetsova E.S., Shaitan K.V., Bonartseva G.A. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate) copolymers by Azotobacter chroococcum 7B: a precursor feeding strategy. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2017, 47(2), 173-184] культивировали в жидкой среде Берка следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 0,05; KH₂PO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,4; NaCl - 0,1; FeSO₄ - 0,01; Na₂MoO₄ - 0,06; CaCl₂ - 0,1; цитрат натрия - 0,5; сахароза - 40. Сначала готовили посевной материал, для чего штамм-продуцент A. chroococcum 7Б выращивали в жидкой среде Берка указанного состава в качалочных колбах объемом 750 мл (со 100 мл среды) при 250 об./мин (исходный рН среды - 7,2; температура культивирования - 28°С) в течение 24 часов. Затем проводили биосинтез альгината штаммом-продуцентом A. chroococcum 7Б, для чего его культивировали в той же среде после внесения 4% (об.) посевного материала возрастом 24 часа в качалочных колбах на 750 мл (объем культуральной среды - 100 мл) на микробиологической качалке Innova 43 («New Brunswick Scientific», США) при скорости перемешивания 400 об./мин в течение 72 часов. Все процедуры проводили в стерильных условиях. Для выделения альгината проводили обработку биомассы штамма-продуцента 0,9% NaCl и 50 мМ ЭДТА, после чего проводили центрифугирование при 15000 g 30 мин. Осадок отделяли и промывали водой. Затем к нему добавляли 3-кратный объем 96% этилового спирта. Осадок снова отделяли и промывали водой. После этого проводили очистку полученного альгината. Для этого альгинат снова осаждали 3-кратным объемом 96% этилового спирта и проводили диализ против 0.5% NaCl в течение 24 h. Осадок снова отделяли и высушивали при помощи лиофильной сушки. Полученный порошок хранят при 4°С не более 3-х месяцев. Полученный альгинат обладал следующим сочетанием параметров: молекулярной массой (определяемой методом визкозиметрии) 1×10⁵ г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере - 36% и уровнем ацетилирования - 23% (определяемых методом ИК-спектроскопии).At the first stage, bacterial alginate was also obtained by the method of controlled microbiological biosynthesis. To maintain the culture of bacteria used a solid nutrient medium Ashby, the following composition (g / l): KH ₂ PO ₄ - 1.05; KH ₂ PO ₄ 0.2; MgSO ₄ 0.2; NaCl 0.2; Na ₂ MoO ₄ - 0.006; CaCO ₃ - 5.0; sucrose - 20, agar - 20. For the biosynthesis of alginate, the producer strain A. chroococcum 7B [RF Patent No. 2194759, 20.12.2002; RF patent No. 2201453, 27.03.2003; RF patent No. 2307159, September 27, 2007; Bonartsev A.R., Zharkova II, Yakovlev SG, Myshkina VL, Mahina T.K., Voinova VV, Zernov AL, Zhuikov VA, Akoulina EA, Ivanova EV, Kuznetsova ES, Shaitan KV, Bonartseva GA Biosynthesis of poly (3- hydroxybutyrate) copolymers by Azotobacter chroococcum 7B: a precursor feeding strategy. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2017, 47 (2), 173-184] were cultured in Burk's liquid medium of the following composition (g / l): KH ₂ PO ₄ - 0.05; KH ₂ PO ₄ 0.05; MgSO ₄ 0.4; NaCl - 0.1; FeSO ₄ - 0.01; Na ₂ MoO ₄ - 0.06; CaCl ₂ - 0.1; sodium citrate - 0.5; sucrose - 40. First, the inoculum was prepared, for which the producer strain A. chroococcum 7B was grown in Burk's liquid medium of the specified composition in 750 ml shaking flasks (with 100 ml of medium) at 250 rpm (initial pH of the medium - 7, 2; cultivation temperature - 28 ° C) for 24 hours. Then, biosynthesis of alginate was carried out by the producer strain A. chroococcum 7B, for which it was cultured in the same medium after adding 4% (vol.) Inoculum aged 24 hours in shaking flasks of 750 ml (the volume of the culture medium is 100 ml) on a microbiological shaker Innova 43 (New Brunswick Scientific, USA) at a stirring speed of 400 rpm for 72 hours. All procedures were performed under sterile conditions. To isolate alginate, the biomass of the producer strain was treated with 0.9% NaCl and 50 mM EDTA, after which centrifugation was performed at 15000 g for 30 min. The precipitate was separated and washed with water. Then a 3-fold volume of 96% ethyl alcohol was added thereto. The precipitate was again separated and washed with water. After that, the resulting alginate was purified. For this, the alginate was again precipitated with a 3-fold volume of 96% ethanol and dialysis was performed against 0.5% NaCl for 24 h. The precipitate was again separated and dried by freeze-drying. The resulting powder is stored at 4 ° C for no more than 3 months. The resulting alginate had the following combination of parameters: molecular weight (determined by viscosimetry) 1 × 10 ⁵ g / mol, molar content of guluronic acid residues in the polymer - 36%, and acetylation level - 23% (determined by IR spectroscopy).

На 2-ом этапе выращивали пробиотические бактерии Lactobacillus plantarum 8Р-А3 (ООО «Спутник-К»). На полужидкой среде культуру L. plantarum 8Р-А3 выращивали в конических колбах на 250 мл, содержащих 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара. В колбы наливали питательную среду, укупоривали ватно-марлевыми пробками и автоклавировали. Готовую среду не хранят. Посев осуществляли, как только температура среды после автоклавирования достигала 40°С.At the 2nd stage, the probiotic bacteria Lactobacillus plantarum 8P-A3 (OOO Sputnik-K) were grown. On a semi-liquid medium, the culture of L. plantarum 8P-A3 was grown in 250 ml conical flasks containing 200 ml of MRS broth and 0.3% agar-agar. The culture medium was poured into the flasks, sealed with cotton-gauze stoppers and autoclaved. The finished medium is not stored. The inoculation was carried out as soon as the temperature of the medium after autoclaving reached 40 ° C.

Для посева готовят жидкую посевную культуру. Для этого в пробирку с культурой, растущей на скошенном MRS-arape, вносили 3 мл MRS-бульона. Снимали клетки с поверхности твердой среды путем повторного пипетирования и переносили полученную суспензию в колбу, содержащую 150 мл питательной среды. Колбу с жидкой посевной культурой инкубировали 96 часа в аэробных условиях на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). Рост культуры контролировали методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, торговая марка Microsoft Corporation, USA.), морфологическую однородность проверяли при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой).A liquid seed culture is prepared for sowing. For this, 3 ml of MRS broth was added to a test tube with a culture growing on a slant MRS-arape. The cells were removed from the surface of the solid medium by repeated pipetting and the resulting suspension was transferred into a flask containing 150 ml of culture medium. A flask with a liquid seed culture was incubated for 96 hours under aerobic conditions on a microbiological shaker at 37 ° C and a stirring speed of 120 rpm (orbital diameter 1.9 cm). The growth of the culture was monitored by nephelometry, determining the optical density at a wavelength of 600 nm on a spectrophotometer (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, trademark of Microsoft Corporation, USA.), Morphological homogeneity was checked using light microscopy (microscope Biomed-1, "Biomed" , RF, with a digital camera).

В конической колбе на 250 мл готовили 1% (вес.) раствор альгината, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 60°С и скорости перемешивания 60 об/мин. Для получения биомассы L. plantarum на жидкой среде в аэробных условиях 6 мл жидкой посевной культуры (5×10⁸ КОЕ/г) вносили в коническую колбу, содержащую полученный 1% раствор альгината в 150 мл MRS-бульона, и инкубировали 96 час на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). После окончания инкубации биомассу осаждали центрифугированием 15 мин при 10000g на центрифуге «Beckman J2-21». Супернатант сливали. Все процедуры проводили в стерильных условиях.In a 250 ml conical flask, a 1% (wt.) Solution of microbiologically obtained alginate was prepared in 150 ml of MRS broth on a magnetic stirrer with heating at 60 ° C and a stirring speed of 60 rpm. To obtain L. plantarum biomass on a liquid medium under aerobic conditions, 6 ml of a liquid seed culture (5 × 10 ⁸ CFU / g) was introduced into a conical flask containing the obtained 1% alginate solution in 150 ml of MRS broth, and incubated for 96 hours in a microbiological rocking chair at 37 ° C and stirring speed 120 rpm (orbital diameter 1.9 cm). After the end of the incubation, the biomass was precipitated by centrifugation for 15 min at 10000g on a Beckman J2-21 centrifuge. The supernatant was discarded. All procedures were performed under sterile conditions.

Из полученного таким образом ранее бактериального капсулярного альгината натрия с выращенной в нем биомассой пробиотических бактерий изготавливали пленки. Для этого биомассу бактерий в бактериальном альгинате наносили в стерильных условиях на используемую в качестве подложки стеклянную чашку Петри диаметром 90 мм, заполненную 50 мл 50 мМ раствором хлорида кальция, с помощью шприца на 20-50 мл с плоской прямоугольной форсункой (насадкой) шириной 2 мм, после чего инкубируют 10 мин. Пленку затем извлекают, промывают в воде и используют по назначению. Полученная пленка имела толщину 0,8 мм и содержала пробиотические бактерии в концентрации 2,3×10⁸ КОЕ/г бактерий L. plantarum 8Р-А3. Таким образом, произошло увеличение содержания живых бактерий в гидрогеле против первоначального (1,9×10⁷КОЕ/г) в 12,1 раз по сравнению с падением содержания бактерий в композиции, описанной в патенте-прототипе, в 11 раз с 1×10⁸ КОЕ/г до 8,8×10⁶ КОЕ/г.Films were made from the previously obtained bacterial capsular sodium alginate with the biomass of probiotic bacteria grown in it. For this, the biomass of bacteria in bacterial alginate was applied under sterile conditions onto a glass Petri dish with a diameter of 90 mm, filled with 50 ml of 50 mM calcium chloride solution, using a 20-50 ml syringe with a flat rectangular nozzle (nozzle) 2 mm wide. and then incubated for 10 minutes. The film is then removed, washed in water and used as directed. The resulting film had a thickness of 0.8 mm and contained probiotic bacteria at a concentration of 2.3 × 10 ⁸ CFU / g of L. plantarum 8P-A3 bacteria. Thus, there was an increase in the content of live bacteria in the hydrogel against the initial (1.9 × 10 ⁷ CFU / g) 12.1 times compared to the drop in the content of bacteria in the composition described in the prototype patent, 11 times from 1 × 10 ⁸ CFU / g to 8.8 × 10 ⁶ CFU / g.

Тест устойчивости гидрогеля при температуре 37°С показал отсутствие деформации гидрогеля. В тесте устойчивости в симулированной среде кишечника полученный гидрогель обеспечивал сохранение 2,3×10⁸ КОЕ/г бактерий L. plantarum 8Р-А3, т.е 95% выживаемость бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием альгинат лиазы в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала 28% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием лизоцима в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 34% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте ферментативной устойчивости с использованием липазы в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 43% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте устойчивости в среде чужеродных бактерий полученные биоинженерные конструкции обеспечивали присутствие не более 4% чужеродных бактерий Е. coli BL21. В тесте миграции бактерий из гидрогеля гидрогель обеспечивал распространение бактерий на расстояние 8 мм от образца. Оценка всех тестов проводилась по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»]. Тест исследования на цитотоксичность in vitro полученного гидрогеля показал, что он не является цитотоксичным, а именно, обладает баллом «0» по шкале цитотоксичности [ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro»].The stability test of the hydrogel at 37 ° C showed no deformation of the hydrogel. In the resistance test in a simulated intestinal environment, the obtained hydrogel ensured the preservation of 2.3 × 10 ⁸ CFU / g of L. plantarum 8P-A3 bacteria, i.e. 95% survival of bacteria, assessed by the standard method for determining the number of CFU in comparison with the control bacterial preparation. encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using alginate lyase in a simulated intestinal environment, the resulting construct provided a 28% increase in the survival of bacteria, assessed by the standard method for determining the CFU number in comparison with a control preparation of bacteria encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using lysozyme in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided a 34% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the test of enzymatic resistance using lipase in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided a 43% increase in bacterial survival, as measured by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the resistance test in the environment of foreign bacteria, the obtained bioengineering constructs ensured the presence of no more than 4% of foreign bacteria E. coli BL21. In the test for bacteria migration from the hydrogel, the hydrogel allowed bacteria to spread to a distance of 8 mm from the sample. Evaluation of all tests was carried out according to the standard method for determining the number of CFU in the structure [GOST R 56139-2014 “Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "]. The test for in vitro cytotoxicity of the obtained hydrogel showed that it is not cytotoxic, namely, it has a score of “0” on the cytotoxicity scale [GOST ISO 10993-1-2011 “Medical devices. Assessment of the biological effect of medical devices. Part 5. Testing for cytotoxicity: in vitro methods "].

Пример 2Example 2

На первом этапе способом контролируемого микробиологического биосинтеза также получают бактериальный альгинат. Для поддержания культуры бактерий используют твердую питательную среду Эшби, следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 1,05; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,2; NaCl - 0,2; Na₂MoO₄ - 0,006; СаСО₃ - 5,0; сахароза - 20, агар - 20. Для биосинтеза альгината штамм-продуцент A. chroococcum 7Б культивируют в жидкой среде Берка следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 0,05; KH₂PO₄ - 0,05; MgS O₄ - 0,4; NaCl - 0,1; FeSO₄ - 0,01; Na₂MoO₄ - 0,06; CaCl₂ - 0,1; цитрат натрия - 0,5; сахароза - 20. Сначала готовят посевной материал, для чего штамм-продуцент A. chroococcum 7Б выращивают в жидкой среде Берка указанного состава в качалочных колбах объемом 750 мл (со 100 мл среды) при 250 об./мин (исходный рН среды - 7,2; температура культивирования - 28°С) в течение 24 часов. Затем проводят биосинтез альгината штаммом-продуцентом A. chroococcum 7Б, для чего его культивируют в той же среде после внесения 4% (об.) посевного материала возрастом 24 часа в качалочных колбах на 750 мл (объем культуральной среды - 100 мл) на микробиологической качалке Innova 43 («New Brunswick Scientific)), США) при скорости перемешивания 200 об./мин в течение 72 часов. Все процедуры проводят в стерильных условиях. Для выделения альгината проводят обработку биомассы штамма-продуцента 0,9% NaCl и 50 мМ ЭДТА, после чего проводят центрифугирование при 15000 g 30 мин. Осадок отделяют и промывают водой. Затем к нему добавляют 3-кратный объем 96% этилового спирта. Осадок снова отделяют и промывают водой. После этого проводят очистку полученного альгината. Для этого альгинат снова осаждают 3-кратным объемом 96% этилового спирта и проводят диализ против 0.5% NaCl в течение 24 h. Осадок снова отделяют и высушивают при помощи лиофильной сушки. Полученный порошок хранят при 4°С не более 3-х месяцев. Полученный альгинат обладает следующим сочетанием параметров: молекулярной массой (определяемой методом визкозиметрии) 2,6×10⁵ г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере - 46% и уровнем ацетилирования - 24% (определяемых методом ИК-спектроскопии).At the first stage, bacterial alginate is also obtained by the method of controlled microbiological biosynthesis. To maintain the culture of bacteria, use Ashby's solid nutrient medium of the following composition (g / l): KH ₂ PO ₄ - 1.05; KH ₂ PO ₄ 0.2; MgSO ₄ 0.2; NaCl 0.2; Na ₂ MoO ₄ - 0.006; CaCO ₃ - 5.0; sucrose - 20, agar - 20. For the biosynthesis of alginate, the producer strain A. chroococcum 7B is cultivated in Burk's liquid medium of the following composition (g / l): KH ₂ PO ₄ - 0.05; KH ₂ PO ₄ 0.05; MgS O ₄ - 0.4; NaCl - 0.1; FeSO ₄ - 0.01; Na ₂ MoO ₄ - 0.06; CaCl ₂ - 0.1; sodium citrate - 0.5; sucrose - 20. First, the inoculum is prepared, for which the producer strain A. chroococcum 7B is grown in Burk's liquid medium of the specified composition in 750 ml shaking flasks (from 100 ml of medium) at 250 rpm (initial pH of the medium is 7, 2; cultivation temperature - 28 ° C) for 24 hours. Then biosynthesis of alginate is carried out by the producer strain A. chroococcum 7B, for which it is cultivated in the same medium after adding 4% (vol.) Of inoculum aged 24 hours in shaking flasks of 750 ml (volume of culture medium - 100 ml) on a microbiological shaker Innova 43 (New Brunswick Scientific), USA) at a stirring speed of 200 rpm for 72 hours. All procedures are performed under sterile conditions. To isolate alginate, the biomass of the producer strain is treated with 0.9% NaCl and 50 mM EDTA, after which centrifugation is carried out at 15000 g for 30 minutes. The precipitate is separated and washed with water. Then a 3-fold volume of 96% ethyl alcohol is added to it. The precipitate is again separated and washed with water. After that, the resulting alginate is purified. For this, the alginate is again precipitated with a 3-fold volume of 96% ethanol and dialysis is performed against 0.5% NaCl for 24 h. The precipitate is again separated and dried using a freeze dryer. The resulting powder is stored at 4 ° C for no more than 3 months. The resulting alginate has the following combination of parameters: molecular weight (determined by viscosimetry) 2.6 × 10 ⁵ g / mol, molar content of guluronic acid residues in the polymer - 46% and acetylation level - 24% (determined by IR spectroscopy).

На следующем этапе выращивают пробиотические бактерии Lactobacillus plantarum 8Р-А3 (ООО «Спутник-К»). На полужидкой среде культуру L. plantarum 8Р-А3 выращивают в конических колбах на 250 мл, содержащих 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара. В колбы наливают питательную среду, укупоривают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют. Готовую среду не хранят. Посев осуществляют, как только температура среды после автоклавирования достигает 40°С.At the next stage, the probiotic bacteria Lactobacillus plantarum 8P-A3 (Sputnik-K LLC) are grown. On a semi-liquid medium, the culture of L. plantarum 8P-A3 is grown in 250 ml conical flasks containing 200 ml of MRS broth and 0.3% agar-agar. The culture medium is poured into the flasks, sealed with cotton-gauze stoppers and autoclaved. The finished medium is not stored. Sowing is carried out as soon as the temperature of the medium after autoclaving reaches 40 ° C.

Для посева готовят жидкую посевную культуру. Для этого в пробирку с культурой, растущей на скошенном MRS-arape, вносят 3 мл MRS-бульона. Снимают клетки с поверхности твердой среды путем повторного пипетирования и переносят полученную суспензию в колбу, содержащую 150 мл питательной среды. Колбу с жидкой посевной культурой (5×10⁸ КОЕ/г) инкубируют 96 часа в аэробных условиях на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). Рост культуры контролируют методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, торговая марка Microsoft Corporation, USA.), морфологическую однородность проверяют при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой).A liquid seed culture is prepared for sowing. For this, 3 ml of MRS broth is added to a test tube with a culture growing on a slant MRS-arape. The cells are removed from the surface of the solid medium by repeated pipetting and the resulting suspension is transferred into a flask containing 150 ml of culture medium. A flask with a liquid seed culture (5 × 10 ⁸ CFU / g) is incubated for 96 hours under aerobic conditions on a microbiological shaker at 37 ° C and a stirring speed of 120 rpm (orbital diameter 1.9 cm). The growth of the culture is monitored by nephelometry, by determining the optical density at a wavelength of 600 nm on a spectrophotometer (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, trademark of Microsoft Corporation, USA.), Morphological homogeneity is checked using light microscopy (microscope Biomed-1, "Biomed" , RF, with a digital camera).

В конической колбе на 250 мл готовят 1% (вес.) раствор альгината, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 60°С и скорости перемешивания 60 об/мин. Для получения биомассы L. plantarum на жидкой среде в аэробных условиях 6 мл жидкой посевной культуры вносят в коническую колбу, содержащую полученный 1% раствор альгината в 150 мл MRS-бульона, и инкубируют 96 час на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). После окончания инкубации биомассу осаждают центрифугированием 15 мин при 10000g на центрифуге «Beckman J2-21». Супернатант сливают. Все процедуры проводят в стерильных условиях.In a 250 ml conical flask, a 1% (wt.) Solution of microbiologically obtained alginate is prepared in 150 ml of MRS broth on a magnetic stirrer with heating at 60 ° C and a stirring speed of 60 rpm. To obtain L. plantarum biomass on a liquid medium under aerobic conditions, 6 ml of a liquid seed culture is introduced into a conical flask containing the resulting 1% alginate solution in 150 ml of MRS broth, and incubated for 96 hours on a microbiological shaker at 37 ° C and a stirring speed of 120 rpm (orbit diameter 1.9 cm). After the end of the incubation, the biomass is precipitated by centrifugation for 15 minutes at 10000g on a Beckman J2-21 centrifuge. The supernatant is discarded. All procedures are performed under sterile conditions.

Из полученного таким образом ранее бактериального капсулярного альгината натрия с выращенной в нем биомассой пробиотических бактерий изготавливали пленки. Для этого биомассу бактерий в бактериальном альгинате наносили в стерильных условиях на используемую в качестве подложки стеклянную чашку Петри диаметром 90 мм, заполненную 50 мл 50 мМ раствором хлорида кальция, с помощью шприца на 20-50 мл с плоской прямоугольной форсункой (насадкой) шириной 2 мм, после чего инкубируют 10 мин. Пленку затем извлекают, промывают в воде и используют по назначению. Таким образом, получают альгинатный гидрогель, содержащий 3,7×10⁸ КОЕ/г бактерий L. plantarum 8Р-А3. Таким образом, произошло увеличение содержания живых бактерий в гидрогеле против первоначального (1,9×10⁷ КОЕ/г) в 19,5 раз по сравнению с падением содержания бактерий в композиции, описанной в патенте-прототипе, в 11 раз с 1×10⁸КОЕ/г до 8,8×10⁶ КОЕ/г.Films were made from the previously obtained bacterial capsular sodium alginate with the biomass of probiotic bacteria grown in it. For this, the biomass of bacteria in bacterial alginate was applied under sterile conditions onto a glass Petri dish with a diameter of 90 mm, filled with 50 ml of 50 mM calcium chloride solution, using a 20-50 ml syringe with a flat rectangular nozzle (nozzle) 2 mm wide. and then incubated for 10 minutes. The film is then removed, washed in water and used as directed. Thus, an alginate hydrogel is obtained containing 3.7 × 10 ⁸ CFU / g of L. plantarum 8P-A3 bacteria. Thus, there was an increase in the content of live bacteria in the hydrogel against the initial (1.9 × 10 ⁷ CFU / g) by 19.5 times compared to the drop in the content of bacteria in the composition described in the prototype patent, 11 times from 1 × 10 ⁸ CFU / g to 8.8 × 10 ⁶ CFU / g.

Тест устойчивости гидрогеля при температуре 37°С показал отсутствие деформации гидрогеля. В тесте устойчивости в симулированной среде кишечника полученный гидрогель обеспечивал сохранение 3,6×10⁸ КОЕ/г бактерий L. plantarum 8Р-А3, т.е 97% выживаемость бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием альгинат лиазы в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала 36% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием лизоцима в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 48% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте ферментативной устойчивости с использованием липазы в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 52% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте устойчивости в среде чужеродных бактерий полученные биоинженерные конструкции обеспечивали не более 1% чужеродных бактерий Е. coli BL21 в гидрогеле. В тесте миграции бактерий из гидрогеля гидрогель обеспечивал распространение бактерий на расстояние 3 мм от образца. Оценка всех тестов проводилась по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»]. Тест исследования на цитотоксичность in vitro полученного гидрогеля показал, что он не является цитотоксичным, а именно, обладает баллом «0» по шкале цитотоксичности [ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro»].The stability test of the hydrogel at 37 ° C showed no deformation of the hydrogel. In the resistance test in a simulated intestinal environment, the obtained hydrogel ensured the preservation of 3.6 × 10 ⁸ CFU / g of L. plantarum 8P-A3 bacteria, i.e. 97% bacterial survival, assessed by the standard method for determining the CFU number in comparison with the control bacterial preparation. encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using alginate lyase in a simulated intestinal environment, the resulting construct provided a 36% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the CFU number in comparison with the control preparation of bacteria encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using lysozyme in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided a 48% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the test of enzymatic resistance using lipase in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided a 52% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the test of resistance in the environment of foreign bacteria, the obtained bioengineering constructs provided no more than 1% of foreign bacteria E. coli BL21 in the hydrogel. In the test for bacteria migration from the hydrogel, the hydrogel allowed bacteria to spread to a distance of 3 mm from the sample. Evaluation of all tests was carried out according to the standard method for determining the number of CFU in the structure [GOST R 56139-2014 “Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "]. The test for in vitro cytotoxicity of the obtained hydrogel showed that it is not cytotoxic, namely, it has a score of “0” on the cytotoxicity scale [GOST ISO 10993-1-2011 “Medical devices. Assessment of the biological effect of medical devices. Part 5. Testing for cytotoxicity: in vitro methods "].

Пример 3Example 3

На первом этапе способом контролируемого микробиологического биосинтеза также получают бактериальный альгинат. Для поддержания культуры бактерий используют твердую питательную среду Эшби, следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 1,05; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,2; NaCl - 0,2; Na₂MoO₄ - 0,006; СаСО₃ - 5,0; сахароза - 20, агар -20. Для биосинтеза альгината штамм-продуцент A. chroococcum 7Б культивируют в жидкой среде Берка следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 0,05; KH₂PO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,4; NaCl - 0,1; FeSO₄ - 0,01; Na₂MoO₄ - 0,06; CaCl₂ - 0,1; цитрат натрия - 0,5; сахароза -40. Сначала готовят посевной материал, для чего штамм-продуцент A. chroococcum 7Б выращивают в жидкой среде Берка указанного состава в качалочных колбах объемом 750 мл (со 100 мл среды) при 250 об./мин (исходный рН среды - 7,2; температура культивирования - 28°С) в течение 24 часов. Затем проводят биосинтез альгината штаммом-продуцентом A. chroococcum 7Б, для чего его культивируют в той же среде после внесения 4% (об.) посевного материала возрастом 24 часа в качалочных колбах на 750 мл (объем культуральной среды - 100 мл) на микробиологической качалке Innova 43 («New Brunswick Scientific)), США) при скорости перемешивания 200 об./мин в течение 72 часов. Все процедуры проводят в стерильных условиях. Для выделения альгината проводят обработку биомассы штамма-продуцента 0,9% NaCl и 50 мМ ЭДТА, после чего проводят центрифугирование при 15000 g 30 мин. Осадок отделяют и промывают водой. Затем к нему добавляют 3-кратный объем 96% этилового спирта. Осадок снова отделяют и промывают водой. После этого проводят очистку полученного альгината. Для этого альгинат снова осаждают 3-кратным объемом 96% этилового спирта и проводят диализ против 0.5% NaCl в течение 24 h. Осадок снова отделяют и высушивают при помощи лиофильной сушки. Полученный порошок хранят при 4°С не более 3-х месяцев. Полученный альгинат обладает следующим сочетанием параметров: молекулярной массой (определяемой методом визкозиметрии) 7,6×10⁵ г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере - 31% и уровнем ацетилирования - 48% (определяемых методом ИК-спектроскопии).At the first stage, bacterial alginate is also obtained by the method of controlled microbiological biosynthesis. To maintain the culture of bacteria, use Ashby's solid nutrient medium of the following composition (g / l): KH ₂ PO ₄ - 1.05; KH ₂ PO ₄ 0.2; MgSO ₄ 0.2; NaCl 0.2; Na ₂ MoO ₄ - 0.006; CaCO ₃ - 5.0; sucrose - 20, agar -20. For biosynthesis of alginate, the producer strain A. chroococcum 7B is cultivated in Burke's liquid medium of the following composition (g / l): KH ₂ PO ₄ - 0.05; KH ₂ PO ₄ 0.05; MgSO ₄ 0.4; NaCl - 0.1; FeSO ₄ - 0.01; Na ₂ MoO ₄ - 0.06; CaCl ₂ - 0.1; sodium citrate - 0.5; sucrose -40. First, the inoculum is prepared, for which the producer strain A. chroococcum 7B is grown in Burk's liquid medium of the specified composition in 750 ml shaking flasks (with 100 ml of medium) at 250 rpm (initial pH of the medium - 7.2; cultivation temperature - 28 ° C) within 24 hours. Then biosynthesis of alginate is carried out by the producer strain A. chroococcum 7B, for which it is cultivated in the same medium after adding 4% (vol.) Of inoculum aged 24 hours in shaking flasks of 750 ml (volume of culture medium - 100 ml) on a microbiological shaker Innova 43 (New Brunswick Scientific), USA) at a stirring speed of 200 rpm for 72 hours. All procedures are performed under sterile conditions. To isolate alginate, the biomass of the producer strain is treated with 0.9% NaCl and 50 mM EDTA, after which centrifugation is carried out at 15000 g for 30 minutes. The precipitate is separated and washed with water. Then a 3-fold volume of 96% ethyl alcohol is added to it. The precipitate is again separated and washed with water. After that, the resulting alginate is purified. For this, the alginate is again precipitated with a 3-fold volume of 96% ethanol and dialysis is performed against 0.5% NaCl for 24 h. The precipitate is again separated and dried using a freeze dryer. The resulting powder is stored at 4 ° C for no more than 3 months. The resulting alginate has the following combination of parameters: molecular weight (determined by viscosimetry) 7.6 × 10 ⁵ g / mol, molar content of guluronic acid residues in the polymer - 31% and acetylation level - 48% (determined by IR spectroscopy).

На полужидкой среде культуру Bifidobacterium longum МС-42 (ООО «Спутник-К») выращивают в конических колбах на 250 мл, содержащих 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара. В колбы наливают питательную среду, укупоривают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют. Готовую среду хранят не более 2-х недель в бытовом холодильнике при температуре 5-8°С. Посев осуществляют, как только температура среды после автоклавирования достигает 40°С.On a semi-liquid medium, the culture of Bifidobacterium longum MS-42 (OOO Sputnik-K) is grown in 250 ml conical flasks containing 200 ml of MRS broth and 0.3% agar-agar. The culture medium is poured into the flasks, sealed with cotton-gauze stoppers and autoclaved. The prepared medium is stored for no more than 2 weeks in a household refrigerator at a temperature of 5-8 ° C. Sowing is carried out as soon as the temperature of the medium after autoclaving reaches 40 ° C.

В конической колбе на 250 мл готовят 1% (вес.) раствор альгината с молекулярной массой 4.8×10⁵ г/моль, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 60°С и скорости перемешивания 60 об/мин. Проводят пересев со среды с агар-агаром на среду с альгинатом. Для этого из колбы с 96 часовой культурой, растущей в полужидкой среде на агар-агаре, стеклянной серологической пипеткой отбирают 8 мл и вносят в колбу со свежеприготовленной полужидкой средой на основе бактериального альгината. Содержимое колбы перемешивают. Для получения культуры В. longum МС-42 в полужидкой среде на дно колбы вносят 4 мл рабочей культуры (1×10⁸ КОЕ/г). Содержимое колбы не перемешивают. После инокуляции колбы укупоривают ватно-марлевыми пробками и для термостатирования помещают в микробиологическую качалку. Инкубируют 96 часа при 37°С без перемешивания. Рост культуры контролируют методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, торговая марка Microsoft Corporation, USA.), морфологическую однородность проверяют при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой).In a 250 ml conical flask, prepare a 1% (wt.) Solution of alginate with a molecular weight of 4.8 × 10 ⁵ g / mol, obtained by microbiology, in 150 ml of MRS broth on a magnetic stirrer with heating at 60 ° C and a stirring speed of 60 vol. / min. Subculture is carried out from the agar-agar medium to the alginate medium. For this, 8 ml is taken from a flask with a 96-hour culture growing in a semi-liquid medium on agar-agar with a glass serological pipette and introduced into a flask with a freshly prepared semi-liquid medium based on bacterial alginate. The contents of the flask are mixed. To obtain a culture of B. longum MC-42 in a semi-liquid medium, 4 ml of a working culture (1 × 10 ⁸ CFU / g) is added to the bottom of the flask. The contents of the flask are not mixed. After inoculation, the flasks are sealed with cotton-gauze stoppers and placed in a microbiological shaker for thermostating. Incubated for 96 hours at 37 ° C without stirring. The growth of the culture is monitored by nephelometry, by determining the optical density at a wavelength of 600 nm on a spectrophotometer (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, trademark of Microsoft Corporation, USA.), Morphological homogeneity is checked using light microscopy (microscope Biomed-1, "Biomed" , RF, with a digital camera).

Из полученного таким образом ранее бактериального капсулярного альгината натрия с выращенной в нем биомассой пробиотических бактерий изготавливали пленки. Для этого биомассу бактерий в бактериальном альгинате наносили в стерильных условиях на используемую в качестве подложки стеклянную чашку Петри диаметром 90 мм, заполненную 50 мл 50 мМ раствором хлорида кальция, с помощью шприца на 20-50 мл с плоской прямоугольной форсункой (насадкой) шириной 2 мм, после чего инкубируют 10 мин. Пленку затем извлекают, промывают в воде и используют по назначению. Таким образом, получают альгинатный гидрогель, содержащий 1,9×10⁷ КОЕ/г бактерий В. longum МС-42. Таким образом, произошло увеличение содержания живых бактерий в гидрогеле против первоначального (2,7×10⁶ КОЕ/г) в 7,1 раз по сравнению с падением содержания бактерий в композиции, описанной в патенте-прототипе, в 11 раз с 1×10⁸КОЕ/г до 8,8×10⁶ КОЕ/г.Films were made from the previously obtained bacterial capsular sodium alginate with the biomass of probiotic bacteria grown in it. For this, the biomass of bacteria in bacterial alginate was applied under sterile conditions onto a glass Petri dish with a diameter of 90 mm, filled with 50 ml of 50 mM calcium chloride solution, using a 20-50 ml syringe with a flat rectangular nozzle (nozzle) 2 mm wide. and then incubated for 10 minutes. The film is then removed, washed in water and used as directed. Thus, an alginate hydrogel was obtained containing 1.9 × 10 ⁷ CFU / g of B. longum MC-42 bacteria. Thus, there was an increase in the content of live bacteria in the hydrogel against the initial (2.7 × 10 ⁶ CFU / g) by 7.1 times compared with the drop in the content of bacteria in the composition described in the prototype patent, 11 times from 1 × 10 ⁸ CFU / g to 8.8 × 10 ⁶ CFU / g.

Тест устойчивости гидрогеля при температуре 37°С показал отсутствие деформации гидрогеля. В тесте устойчивости в симулированной среде кишечника полученный гидрогель обеспечивал сохранение 1,8×10⁷ КОЕ/г бактерий В. longum МС-42, т.е 96% выживаемость бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием альгинат лиазы в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала 56% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием лизоцима в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 67% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте ферментативной устойчивости с использованием липазы в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 89% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте устойчивости в среде чужеродных бактерий полученные биоинженерные конструкции обеспечивали отсутствие чужеродных бактерий Е. coli BL21. В тесте миграции бактерий из гидрогеля гидрогель обеспечивал распространение бактерий на расстояние 2 мм от образца. Оценка всех тестов проводилась по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»]. Тест исследования на цитотоксичность in vitro полученного гидрогеля показал, что он не является цитотоксичным, а именно, обладает баллом «0» по шкале цитотоксичности [ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro»].The stability test of the hydrogel at 37 ° C showed no deformation of the hydrogel. In the resistance test in a simulated intestinal environment, the resulting hydrogel ensured the preservation of 1.8 × 10 ⁷ CFU / g of B. longum MC-42 bacteria, i.e. 96% bacterial survival, assessed by the standard method for determining the CFU number in comparison with the control bacterial preparation. encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using alginate lyase in a simulated intestinal environment, the resulting construct provided a 56% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the CFU number in comparison with a control preparation of bacteria encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using lysozyme in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided a 67% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the test of enzymatic resistance using lipase in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided an 89% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the test of resistance in the environment of foreign bacteria, the obtained bioengineering constructs ensured the absence of foreign bacteria E. coli BL21. In the test for bacteria migration from the hydrogel, the hydrogel allowed bacteria to spread to a distance of 2 mm from the sample. Evaluation of all tests was carried out according to the standard method for determining the number of CFU in the structure [GOST R 56139-2014 “Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "]. The test for in vitro cytotoxicity of the obtained hydrogel showed that it is not cytotoxic, namely, it has a score of “0” on the cytotoxicity scale [GOST ISO 10993-1-2011 “Medical devices. Assessment of the biological effect of medical devices. Part 5. Testing for cytotoxicity: in vitro methods "].

Пример 4Example 4

На первом этапе способом контролируемого микробиологического биосинтеза также получают бактериальный альгинат. Для поддержания культуры бактерий используют твердую питательную среду Эшби, следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 1,05; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,2; NaCl - 0,2; Na₂MoO₄ - 0,006; СаСО₃ - 5,0; сахароза - 20, агар - 20. Для биосинтеза альгината штамм-продуцент A. chroococcum 7Б культивируют в жидкой среде Берка следующего состава (г/л): KH₂PO₄ - 1,00; KH₂PO₄ - 1,00; MgSO₄ - 0,4; NaCl - 0,1; FeSO₄ - 0,01; Na₂MoO₄ - 0,06; CaCl₂ - 0,1; цитрат натрия - 0,5; сахароза -30. Сначала готовят посевной материал, для чего штамм-продуцент A. chroococcum 7Б выращивают в жидкой среде Берка указанного состава в качалочных колбах объемом 750 мл (со 100 мл среды) при 250 об./мин (исходный рН среды - 7,2; температура культивирования - 28°С) в течение 24 часов. Затем проводят биосинтез альгината штаммом-продуцентом A. chroococcum 7Б, для чего его культивируют в той же среде после внесения 4% (об.) посевного материала возрастом 24 часа в качалочных колбах на 750 мл (объем культуральной среды - 100 мл) на микробиологической качалке Innova 43 («New Brunswick Scientific)), США) при скорости перемешивания 200 об./мин в течение 72 часов. Все процедуры проводят в стерильных условиях. Для выделения альгината проводят обработку биомассы штамма-продуцента 0,9% NaCl и 50 мМ ЭДТА, после чего проводят центрифугирование при 15000 g 30 мин. Осадок отделяют и промывают водой. Затем к нему добавляют 3-кратный объем 96% этилового спирта. Осадок снова отделяют и промывают водой. После этого проводят очистку полученного альгината. Для этого альгинат снова осаждают 3-кратным объемом 96% этилового спирта и проводят диализ против 0.5% NaCl в течение 24 h. Осадок снова отделяют и высушивают при помощи лиофильной сушки. Полученный порошок хранят при 4°С не более 3-х месяцев. Полученный альгинат обладает следующим сочетанием параметров: молекулярной массой (определяемой методом визкозиметрии) 1,0×10⁶ г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере - 35% и уровнем ацетилирования - 10% (определяемых методом ИК-спектроскопии).At the first stage, bacterial alginate is also obtained by the method of controlled microbiological biosynthesis. To maintain the culture of bacteria, use Ashby's solid nutrient medium of the following composition (g / l): KH ₂ PO ₄ - 1.05; KH ₂ PO ₄ 0.2; MgSO ₄ 0.2; NaCl 0.2; Na ₂ MoO ₄ - 0.006; CaCO ₃ - 5.0; sucrose - 20, agar - 20. For the biosynthesis of alginate, the producer strain A. chroococcum 7B is cultivated in Burk's liquid medium of the following composition (g / l): KH ₂ PO ₄ - 1.00; KH ₂ PO ₄ 1.00; MgSO ₄ 0.4; NaCl - 0.1; FeSO ₄ - 0.01; Na ₂ MoO ₄ - 0.06; CaCl ₂ - 0.1; sodium citrate - 0.5; sucrose -30. First, the inoculum is prepared, for which the producer strain A. chroococcum 7B is grown in Burk's liquid medium of the specified composition in 750 ml shaking flasks (with 100 ml of medium) at 250 rpm (initial pH of the medium - 7.2; cultivation temperature - 28 ° C) within 24 hours. Then biosynthesis of alginate is carried out by the producer strain A. chroococcum 7B, for which it is cultivated in the same medium after adding 4% (vol.) Of inoculum aged 24 hours in shaking flasks of 750 ml (volume of culture medium - 100 ml) on a microbiological shaker Innova 43 (New Brunswick Scientific), USA) at a stirring speed of 200 rpm for 72 hours. All procedures are performed under sterile conditions. To isolate alginate, the biomass of the producer strain is treated with 0.9% NaCl and 50 mM EDTA, after which centrifugation is carried out at 15000 g for 30 minutes. The precipitate is separated and washed with water. Then add a 3-fold volume of 96% ethyl alcohol to it. The precipitate is again separated and washed with water. After that, the resulting alginate is purified. For this, the alginate is again precipitated with a 3-fold volume of 96% ethanol and dialysis is performed against 0.5% NaCl for 24 h. The precipitate is again separated and dried using a freeze dryer. The resulting powder is stored at 4 ° C for no more than 3 months. The resulting alginate has the following combination of parameters: molecular weight (determined by viscosimetry) 1.0 × 10 ⁶ g / mol, molar content of guluronic acid residues in the polymer - 35% and acetylation level - 10% (determined by IR spectroscopy).

На 2-ом этапе выращивают генетически модифицированные пробиотические бактерии Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 (ООО «Спутник-К»), содержащие плазмиду pMCl с геном устойчивости к хлорамфениколу pC194, полученные по стандартной методике [Serror P., Sasaki Т., Ehrlich S.D., Maguin Е. Electrotransformation of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and L. delbrueckii subsp.lactis with Various Plasmids. Appl Environ Microbiol., 2002, 68(1), 46-52]. На полужидкой среде культуру L. delbrueckii subsp.bulgaricus VI104 выращивают в конических колбах на 250 мл, содержащих 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара. В колбы наливают питательную среду, укупоривают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют. Готовую среду не хранят. Посев осуществляют, как только температура среды после автоклавирования достигает 40°С.At the 2nd stage, genetically modified probiotic bacteria Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 (Sputnik-K LLC) are grown, containing the pMCl plasmid with the pC194 chloramphenicol resistance gene obtained by the standard method [Serror P., Sasaki T., Ehrlich SD, Maguin E. Electrotransformation of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and L. delbrueckii subsp.lactis with Various Plasmids. Appl Environ Microbiol. 2002, 68 (1), 46-52]. On a semi-liquid medium, the culture of L. delbrueckii subsp.bulgaricus VI104 is grown in 250 ml conical flasks containing 200 ml of MRS broth and 0.3% agar-agar. The culture medium is poured into the flasks, sealed with cotton-gauze stoppers and autoclaved. The finished medium is not stored. Sowing is carried out as soon as the temperature of the medium after autoclaving reaches 40 ° C.

Для посева готовят жидкую посевную культуру. Для этого в пробирку с культурой, растущей на скошенном MRS-агаре, вносят 3 мл MRS-бульона. Снимают клетки с поверхности твердой среды путем повторного пипетирования и переносят полученную суспензию в колбу, содержащую 150 мл питательной среды. Колбу с жидкой посевной культурой инкубируют 96 часа в аэробных условиях на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). Рост культуры контролируют методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, торговая марка Microsoft Corporation, USA.), морфологическую однородность проверяют при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой).A liquid seed culture is prepared for sowing. For this, 3 ml of MRS broth is added to a test tube with a culture growing on a slant MRS-agar. The cells are removed from the surface of the solid medium by repeated pipetting and the resulting suspension is transferred into a flask containing 150 ml of culture medium. The flask with a liquid seed culture is incubated for 96 hours under aerobic conditions on a microbiological shaker at 37 ° C and a stirring speed of 120 rpm (orbital diameter 1.9 cm). The growth of the culture is monitored by nephelometry, by determining the optical density at a wavelength of 600 nm on a spectrophotometer (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, trademark of Microsoft Corporation, USA.), Morphological homogeneity is checked using light microscopy (microscope Biomed-1, "Biomed" , RF, with a digital camera).

В конической колбе на 250 мл готовят 1% (вес.) раствор альгината, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 60°С и скорости перемешивания 60 об/мин. Для получения биомассы L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 на жидкой среде в аэробных условиях 6 мл жидкой посевной культуры вносят в коническую колбу, содержащую полученный 1% раствор альгината в 150 мл MRS-бульона, и инкубируют 96 час на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). После окончания инкубации биомассу осаждают центрифугированием 15 мин при 10000g на центрифуге «Beckman J2-21». Супернатант сливают. Все процедуры проводят в стерильных условиях.In a 250 ml conical flask, a 1% (wt.) Solution of microbiologically obtained alginate is prepared in 150 ml of MRS broth on a magnetic stirrer with heating at 60 ° C and a stirring speed of 60 rpm. To obtain the biomass of L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 on a liquid medium under aerobic conditions, 6 ml of a liquid seed culture is introduced into a conical flask containing the obtained 1% alginate solution in 150 ml of MRS broth, and incubated for 96 hours on a microbiological shaker at 37 ° C and a stirring speed of 120 rpm (orbital diameter 1.9 cm). After the end of the incubation, the biomass is precipitated by centrifugation for 15 minutes at 10000g on a Beckman J2-21 centrifuge. The supernatant is discarded. All procedures are performed under sterile conditions.

На 3-ем этапе выращивают культуру L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 на полужидкой среде в конических колбах на 250 мл, содержащих 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара. В колбы наливают питательную среду, укупоривают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют.Готовую среду хранят не более 2-х недель в бытовом холодильнике при температуре 5-8°С. Посев осуществляют, как только температура среды после автоклавирования достигает 40°С.At the third stage, a culture of L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 is grown on a semi-liquid medium in 250 ml conical flasks containing 200 ml of MRS broth and 0.3% agar-agar. The culture medium is poured into the flasks, sealed with cotton-gauze stoppers and autoclaved. The prepared medium is stored for no more than 2 weeks in a household refrigerator at a temperature of 5-8 ° C. Sowing is carried out as soon as the temperature of the medium after autoclaving reaches 40 ° C.

В конической колбе на 250 мл готовят 1% (вес.) раствор альгината с молекулярной массой 4.8×10⁵ г/моль, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 60°С и скорости перемешивания 60 об/мин. Проводят пересев со среды с агар-агаром на среду с альгинатом. Для этого из колбы с 96 часовой культурой, растущей в полужидкой среде на агар-агаре, стеклянной серологической пипеткой отбирают 8 мл и вносят в колбу со свежеприготовленной полужидкой средой на основе бактериального альгината. Содержимое колбы перемешивают. Для получения культуры L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 в полужидкой среде на дно колбы вносят 4 мл рабочей культуры (1×10⁸ КОЕ/г). Содержимое колбы не перемешивают. После инокуляции колбы укупоривают ватно-марлевыми пробками и для термостатирования помещают в микробиологическую качалку. Инкубируют 96 часа при 37°С без перемешивания. Рост культуры контролируют методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, торговая марка Microsoft Corporation, USA.), морфологическую однородность проверяют при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой).In a 250 ml conical flask, prepare a 1% (wt.) Solution of alginate with a molecular weight of 4.8 × 10 ⁵ g / mol, obtained by microbiology, in 150 ml of MRS broth on a magnetic stirrer with heating at 60 ° C and a stirring speed of 60 vol. / min. Subculture is carried out from the agar-agar medium to the alginate medium. For this, 8 ml is taken from a flask with a 96-hour culture growing in a semi-liquid medium on agar-agar with a glass serological pipette and introduced into a flask with a freshly prepared semi-liquid medium based on bacterial alginate. The contents of the flask are mixed. To obtain a culture of L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 in a semi-liquid medium, 4 ml of a working culture (1 × 10 ⁸ CFU / g) is added to the bottom of the flask. The contents of the flask are not mixed. After inoculation, the flasks are sealed with cotton-gauze stoppers and placed in a microbiological shaker for thermostating. Incubated for 96 hours at 37 ° C without stirring. The growth of the culture is monitored by nephelometry, by determining the optical density at a wavelength of 600 nm on a spectrophotometer (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, trademark of Microsoft Corporation, USA.), Morphological homogeneity is checked using light microscopy (microscope Biomed-1, "Biomed" , RF, with a digital camera).

Из полученного таким образом ранее бактериального капсулярного альгината натрия с выращенной в нем биомассой пробиотических бактерий изготавливали пленки. Для этого биомассу бактерий в бактериальном альгинате наносили в стерильных условиях на используемую в качестве подложки стеклянную чашку Петри диаметром 90 мм, заполненную 50 мл 50 мМ раствором хлорида кальция, с помощью шприца на 20-50 мл с плоской прямоугольной форсункой (насадкой) шириной 2 мм, после чего инкубируют 10 мин. Пленку затем извлекают, промывают в воде и используют по назначению. Таким образом, получают пленку из альгинатного гидрогеля, содержащую не менее 4,3×10⁷КОЕ/г L. delbrueckii subsp. bulgaricus NCTC 12712. Таким образом, произошло увеличение содержания живых бактерий в гидрогеле против первоначального (2,7×10⁶ КОЕ/г) в 15,9 раз по сравнению с падением содержания бактерий в композиции, описанной в патенте-прототипе, в 11 раз с 1×10⁸ КОЕ/г до 8,8×10⁶ КОЕ/г.Films were made from the previously obtained bacterial capsular sodium alginate with the biomass of probiotic bacteria grown in it. For this, the biomass of bacteria in bacterial alginate was applied under sterile conditions onto a glass Petri dish with a diameter of 90 mm, filled with 50 ml of 50 mM calcium chloride solution, using a 20-50 ml syringe with a flat rectangular nozzle (nozzle) 2 mm wide. and then incubated for 10 minutes. The film is then removed, washed in water and used as directed. Thus, a film is obtained from an alginate hydrogel containing at least 4.3 × 10 ⁷ CFU / g L. delbrueckii subsp. bulgaricus NCTC 12712. Thus, there was an increase in the content of live bacteria in the hydrogel against the initial (2.7 × 10 ⁶ CFU / g) by 15.9 times compared with a drop in the content of bacteria in the composition described in the prototype patent, by 11 times from 1 × 10 ⁸ CFU / g to 8.8 × 10 ⁶ CFU / g.

Тест устойчивости гидрогеля при температуре 37°С показал отсутствие деформации гидрогеля. В тесте устойчивости в симулированной среде кишечника полученный гидрогель обеспечивал сохранение 4,1×10⁷ КОЕ/г бактерий L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712, т.е 96% выживаемость бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием альгинат лиазы в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала 31% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием лизоцима в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 34% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте ферментативной устойчивости с использованием липазы в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 43% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте устойчивости в среде чужеродных бактерий полученные биоинженерные конструкции обеспечивали отсутствие чужеродных бактерий Е. coli BL21. В тесте миграции бактерий из гидрогеля гидрогель обеспечивал распространение бактерий на расстояние 3 мм от образца. Оценка всех тестов проводилась по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»]. Тест исследования на цитотоксичность in vitro полученного гидрогеля показал, что он не является цитотоксичным, а именно, обладает баллом «0» по шкале цитотоксичности [ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro»].The stability test of the hydrogel at 37 ° C showed no deformation of the hydrogel. In the resistance test in a simulated intestinal environment, the obtained hydrogel ensured the retention of 4.1 × 10 ⁷ CFU / g of L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 bacteria, i.e. 96% bacterial survival, assessed by the standard method for determining the CFU number in comparison with the control preparation bacteria encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using alginate lyase in a simulated intestinal environment, the resulting construct provided a 31% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the CFU number in comparison with the control preparation of bacteria encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using lysozyme in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided a 34% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the test of enzymatic resistance using lipase in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided a 43% increase in bacterial survival, as measured by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the test of resistance in the environment of foreign bacteria, the obtained bioengineering constructs ensured the absence of foreign bacteria E. coli BL21. In the test for bacteria migration from the hydrogel, the hydrogel allowed bacteria to spread to a distance of 3 mm from the sample. Evaluation of all tests was carried out according to the standard method for determining the number of CFU in the structure [GOST R 56139-2014 “Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "]. The test for in vitro cytotoxicity of the obtained hydrogel showed that it is not cytotoxic, namely, it has a score of “0” on the cytotoxicity scale [GOST ISO 10993-1-2011 “Medical devices. Assessment of the biological effect of medical devices. Part 5. Testing for cytotoxicity: in vitro methods "].

Таким образом, как показали проведенные эксперименты, бактериальный альгинат обеспечивал большую лучшую выживаемость пробиотических бактерий и большую устойчивость к неблагоприятным факторам (воздействию среды, действию ферментов и чужеродных бактерий) в симулированной среде полости кишечника in vitro.Thus, as shown by the experiments, bacterial alginate provided better and better survival of probiotic bacteria and greater resistance to unfavorable factors (environmental effects, the action of enzymes and foreign bacteria) in the simulated intestinal cavity in vitro.

Claims

1. Polymeric material for placement of probiotic bacteria on the basis of bacterial alginate produced by bacteria of the genus Azotobacter, with a molecular weight from 1 × 10 ⁵ to 1 × 10 ⁶ g / mol, the molar content of guluronic acid residues in the polymer from 25 to 48 mol% and a level acetylation from 10 to 46 mol%.

2. Polymeric material according to claim 1, characterized in that bacteria of the genera Lactobacillus and Bifodobacterium are used as probiotic bacteria.

3. A method of obtaining a polymeric material according to claim 1, characterized in that the growth of biomass from bacteria A. chroococcum and A. vinelandii is carried out in Burk's liquid medium, followed by the isolation of bacterial alginate by mixing the biomass with a solution of 50 mM EDTA in 0.9 weight .% NaCl, the resulting precipitate is separated, washed with water, then precipitated with 96% ethyl alcohol, washed again with water and the polymer is purified, after which an aqueous solution of the obtained alginate is prepared.

4. A method according to claim 3, characterized in that an aqueous solution of a polymeric material according to claim 1 is used to prepare a semi-solid culture medium for growing probiotic bacteria of the genera Lactobacillus and Bifodobacterium, and to encapsulate bacteria in a polymeric material according to claim 1, the solution is gelled.

5. The method according to claim 4, characterized in that the solution of bacterial alginate obtained by the method according to claim 3 is gelled by placing it in an aqueous solution of calcium chloride with a concentration of 50 ± 1 mM for 10 ± 1 min.