RU2740380C1 - Bioengineered structure based on bacterial alginate and probiotic bacteria and method for production thereof - Google Patents
Bioengineered structure based on bacterial alginate and probiotic bacteria and method for production thereof Download PDFInfo
- Publication number
- RU2740380C1 RU2740380C1 RU2019143594A RU2019143594A RU2740380C1 RU 2740380 C1 RU2740380 C1 RU 2740380C1 RU 2019143594 A RU2019143594 A RU 2019143594A RU 2019143594 A RU2019143594 A RU 2019143594A RU 2740380 C1 RU2740380 C1 RU 2740380C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bacteria
- alginate
- microspheres
- mol
- porous
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention relates
Настоящее изобретение относится к области биоразлагаемых, биосовместимых и биологически активных изделий для медицины и экспериментальной биологии, обладающих дополнительным терапевтическим эффектом за счет биологической активности живых пробиотических бактерий, культивируемых in situ в биоинженерной конструкции, помещенной в область повреждения стенки желудочно-кишечного тракта, для лечения некоторых хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта, таких как язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, неспецифический язвенный колит, ишемический колит, болезнь Крона, а также операционные вмешательства на кишечнике с локальным удалением тканей и их осложнения, а также для создания экспериментальных моделей этих заболеваний с целью разработки новых лекарственных и диагностических средств для их лечения. Заявляемый способ позволяет создать медицинское изделие для регенеративной медицины нового типа, где активным действующим началом служат пробиотические бактерии, и может использоваться в биотехнологии, тканевой инженерии, регенеративной медицине, и может использоваться в биотехнологии, тканевой инженерии, регенеративной медицинеThe present invention relates to the field of biodegradable, biocompatible and biologically active products for medicine and experimental biology, which have an additional therapeutic effect due to the biological activity of living probiotic bacteria cultivated in situ in a bioengineered construct placed in the area of damage to the wall of the gastrointestinal tract, for the treatment of certain chronic diseases of the gastrointestinal tract, such as peptic ulcer of the duodenum, ulcerative colitis, ischemic colitis, Crohn's disease, as well as surgical interventions on the intestine with local tissue removal and their complications, as well as to create experimental models of these diseases in order to develop new medicines and diagnostics for their treatment. The inventive method makes it possible to create a medical product for regenerative medicine of a new type, where probiotic bacteria serve as an active active principle, and can be used in biotechnology, tissue engineering, regenerative medicine, and can be used in biotechnology, tissue engineering, regenerative medicine
Уровень техникиState of the art
Хронические воспалительные заболевания толстого и тонкого кишечника, такие как язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, неспецифический язвенный колит, ишемический колит, болезнь Крона, а также операционные вмешательства на кишечнике с локальным удалением тканей и их осложнения могут стать причиной образования прободных язв и свищей. Такие повреждения стенки кишечника являются очень серьезной патологией и могут привести к развитию перитонита и смерти, поэтому они практически всегда требуют проведения хирургического лечения. В настоящее время при проведении хирургических операций на тонком и толстом кишечнике все чаще используют заплаты кишечника и эндопротезы (плати, стенты) из биоразлагаемых полимеров, предназначенных для закрытия дефекта тканей стенки кишечника и их регенерации. Однако, недостатками таких медицинских изделий часто являются недостаточная совместимость с окружающими тканями, неспособность к биоразложению с заданными сроками и отсутствие длительного терапевтического воздействия на область дефекта ткани с целью ее регенерации, что связано с использованием полимерных материалов синтетического происхождения, которые обладают плохой биосовместимостью как с тканями стенки кишечника, так и с пробиотическими бактериями, обладающими терапевтическим эффектом при восстановлении тканей. Кроме того, такие изделия часто имеют упрощенное строение, не учитывающее морфологические и физиологические особенности слизистой стенки кишечника, что ухудшает их терапевтическую эффективность, или, напротив, избыточно сложную конструкцию, что значительно усложняет их производство [Бонарцев А.П., Воинова В.В., Бонарцева Г.А. Поли-3-оксибутират и микробиота человека. Прикладная биохимия и микробиология, 2018, 54(6), 561-584].Chronic inflammatory diseases of the large and small intestine, such as duodenal ulcer, ulcerative colitis, ischemic colitis, Crohn's disease, as well as surgical interventions on the intestine with local tissue removal and their complications can cause the formation of perforated ulcers and fistulas. Such damage to the intestinal wall is a very serious pathology and can lead to the development of peritonitis and death, therefore, they almost always require surgical treatment. Currently, when performing surgical operations on the small and large intestines, intestinal patches and endoprostheses (platy, stents) made of biodegradable polymers are increasingly used to close the defect in the intestinal wall tissues and regenerate them. However, the disadvantages of such medical devices are often insufficient compatibility with the surrounding tissues, the inability to biodegrade within a given time frame, and the absence of a long-term therapeutic effect on the tissue defect area in order to regenerate it, which is associated with the use of synthetic polymeric materials that have poor biocompatibility as with tissues. intestinal walls, and with probiotic bacteria, which have a therapeutic effect in tissue repair. In addition, such products often have a simplified structure that does not take into account the morphological and physiological characteristics of the intestinal mucosa, which worsens their therapeutic efficacy, or, on the contrary, an excessively complex design, which significantly complicates their production [Bonartsev A.P., Voinova V.V. ., Bonartseva G.A. Poly-3-hydroxybutyrate and human microbiota. Applied Biochemistry and Microbiology, 2018, 54 (6), 561-584].
В настоящее время в медицине, фармацевтике и тканевой инженерии активно используются целый ряд природных биополимеров: альгинат, хитозан, декстран, гиалуроновая кислота, агароза, ксантан, хондроитин сульфат, фибрин, коллаген (желатин), фиброин щелка, поли-L-лизин, полиглутаминовая кислота, поли-3-оксиалканоаты [Бонарцев А.П., Воинова В.В., Бонарцева Г.А. Поли-3-оксибутират и микробиота человека. Прикладная биохимия и микробиология, 2018, 54(6), 561-584]. Так, альгинаты, образующие биосовместимые гидрогели, активно используются в медицине, фармацевтике, косметологии и пищевой промышленности, в биотехнологии, например, для инкапсулирования клеток различных культур млекопитающих (фибробластов, миобластов, остеобластов, МСК, хондроцитов и др.), а также в тканевой инженерии для изготовления матриксов для роста клеток различных типов [Lee K.Y., Mooney D.J. Alginate: properties and biomedical applications. Prog. Polym. Sci., 2012, 37(1), 106-126]. Однако зачастую медицинское использование биополимеров никак не учитывает их роль и функции в природе. Так, если в водорослях альгинаты выполняют преимущественно структурно-механическую функцию, то у бактерий, способных к синтезу этого полисахарида родов Azotobacter и Pseudomonas, их функции более разнообразны, но главная из них - защитная. Клетки этих бактерий синтезируют и секретируют этот экзополихасахарид для формирования внешней слизистой оболочки отдельных клеток и их скоплений - цист или биопленок, которые защищают бактериальные клетки от неблагоприятных внешних факторов. Образование биопленки служит главной причиной патогенеза инфекционных заболеваний, вызываемых Pseudomonas aeruginosa, вызывающими опасное инфекционное поражение эпителия легких. Кроме того, бактериальный альгинат обладает устойчивостью к воздействию альгиназ микробиоты кишечника, в отличие от, например, альгината водорослей. Это связано с тем, что бактериальный альгинат отличается от альгинатов, выделенных из водорослей, более высокой молекулярной массой, большим молярным содержанием в полимере остатков гиалуроновых кислот и уровнем ацетилизования гидроксильных групп маннуроновых остатков в положении 2 и 3. Показано, что эти физико-химические свойства бактериальных альгинатов критически важны для формирования биопленки бактериями Pseudomonas sp.В совокупности эти свойства биополимера позволяют создавать такую слизистую оболочку вокруг бактериальной клетки, которая препятствует: расщеплению биопленки альгиназами, проникновению через нее других бактерий, фагоцитозу инкапсулированных бактерий макрофагами и нейтрофилами, воздействию на них цитотоксических лимфоцитов и антител, снижает воздействие на бактериальные клетки токсинов и антибактериальных лекарственных веществ. Кроме того, альгинатный гидрогель биопленки обеспечивает защиту от высыхания, удержание и аккумуляцию питательных веществ, удержание и связывание катионов, аккумуляцию внеклеточных факторов вирулентности бактерий, утилизации продуктов метаболизма других бактерий, стабильность плазмид и эффективность генетического обмена между бактериями, улучшенную межклеточную связь, создание и поддержание микросреды [Ghafoor А., Hay I.D., Rehm В.Н. Role of exopolysaccharides in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and architecture. Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77(15), 5238-5246]. Более того, последние исследования свидетельствуют о том, что и другие бактерии используют альгинаты, синтезируемые P. aeruginosa для формирования своего собственного биофильма [Scoffield J.A., Duan D., Zhu F., Wu H. A commensal streptococcus hijacks a Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide to promote biofilm formation. PLoS Pathog., 2017, 13(4), е1006300]. Показано также, что формирование биопленки патогенными бактериями играет важную роль в процессах заживления и хронического воспаления повреждений эпителия. Отдельные представители микрофлоры эпителия, такие как Staphylococcus epidermidis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis (durans), Escherichia coli, Fusobacterium sp.образуют биопленки, которые представляют собой толстый слизистый барьер, защищающий микроорганизмы от внешних угроз, что ухудшает регенерацию поврежденного эпителия [Percival S.L., McCarty S.M., Lipsky В. Biofilms and Wounds: An Overview of the Evidence. Adv. Wound Care (New Rochelle), 2015, 4(7):373-381].Currently, a number of natural biopolymers are actively used in medicine, pharmaceuticals and tissue engineering: alginate, chitosan, dextran, hyaluronic acid, agarose, xanthan, chondroitin sulfate, fibrin, collagen (gelatin), lye fibroin, poly-L-lysine, polyglutamic acid, poly-3-hydroxyalkanoates [Bonartsev A. P., Voinova V. V., Bonartseva G. A. Poly-3-hydroxybutyrate and human microbiota. Applied Biochemistry and Microbiology, 2018, 54 (6), 561-584]. Thus, alginates that form biocompatible hydrogels are actively used in medicine, pharmaceuticals, cosmetology and food industry, in biotechnology, for example, for encapsulating cells of various mammalian cultures (fibroblasts, myoblasts, osteoblasts, MSCs, chondrocytes, etc.), as well as in tissue engineering for the manufacture of matrices for the growth of cells of various types [Lee KY, Mooney DJ Alginate: properties and biomedical applications. Prog. Polym. Sci. 2012,37 (1) 106-126]. However, the medical use of biopolymers often does not take into account their role and functions in nature. So, if in algae alginates perform mainly a structural and mechanical function, then in bacteria capable of synthesizing this polysaccharide of the genera Azotobacter and Pseudomonas, their functions are more diverse, but the main one is protective. The cells of these bacteria synthesize and secrete this exopolychasaccharide to form the outer mucous membrane of individual cells and their clusters - cysts or biofilms that protect bacterial cells from adverse external factors. Biofilm formation is the main cause of the pathogenesis of infectious diseases caused by Pseudomonas aeruginosa, which cause a dangerous infection of the lung epithelium. In addition, bacterial alginate is resistant to alginases of the intestinal microbiota, in contrast to, for example, alginate of algae. This is due to the fact that bacterial alginate differs from alginates isolated from algae by its higher molecular weight, higher molar content of hyaluronic acid residues in the polymer, and the level of acetylation of hydroxyl groups of mannuron residues in positions 2 and 3. It has been shown that these physicochemical properties bacterial alginates are critically important for the formation of biofilms by the bacteria Pseudomonas sp. Together, these properties of the biopolymer make it possible to create such a mucous membrane around the bacterial cell, which prevents: the cleavage of the biofilm by alginases, the penetration of other bacteria through it, phagocytosis of encapsulated bacteria by macrophages and neutrophils, the effect of cytotoxes on them and antibodies, reduces the effect on bacterial cells of toxins and antibacterial drugs. In addition, alginate hydrogel of biofilm provides protection against drying out, retention and accumulation of nutrients, retention and binding of cations, accumulation of extracellular bacterial virulence factors, utilization of metabolic products of other bacteria, stability of plasmids and efficiency of genetic exchange between bacteria, improved intercellular communication, creation and maintenance of microenvironment [Ghafoor A., Hay ID, Rehm V.N. Role of exopolysaccharides in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and architecture. Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77 (15), 5238-5246]. Moreover, recent studies indicate that other bacteria use alginates synthesized by P. aeruginosa to form their own biofilm [Scoffield JA, Duan D., Zhu F., Wu H. A commensal streptococcus hijacks a Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide to promote biofilm formation. PLoS Pathog., 2017, 13 (4), e1006300]. It was also shown that the formation of biofilms by pathogenic bacteria plays an important role in the healing and chronic inflammation of epithelial damage. Certain representatives of the epithelial microflora, such as Staphylococcus epidermidis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis (durans), Escherichia coli, Fusobacterium sp. Form biofilms, which are a thick mucous barrier that protects microorganisms from external threats, which Percival SL, McCarty SM, Lipsky B. Biofilms and Wounds: An Overview of the Evidence. Adv. Wound Care (New Rochelle) 2015, 4 (7): 373-381].
В последние годы все больше данных свидетельствует о том, что микробиота человека играет важную роль в процессах регенерации эпителия, в т.ч. слизистой стенки кишечника при ее повреждении, и эта роль далеко не всегда негативная. Показано, что микробиота активирует и поддерживает врожденный иммунитет, важна для нормального функционирования иммунной системы, регулирует воспалительные процессы. Показано, что изменения в составе микробиоты кишечника связаны с возникновением различных патологических состояний, в том числе воспалительных заболеваний кишечника, астмы, сахарного диабета I типа, ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний и психиатрических отклонений [Aron-Wisnewsky J., Clement K. The gut microbiome, diet, and links to cardiometabolic and chronic disorders. Nat. Rev. Nephrol., 2016, 12(3): 169-181]. Более того, бактерии могут не только противодействовать заживлению эпителиальных тканей, в частности слизистой оболочки кишечника, но и способствовать ему [Uchida М., Shimizu K., Kurakazu K. Yogurt containing Lactobacillus gasseri OLL 2716 (LG21 yogurt) accelerated the healing of acetic acid-induced gastric ulcer in rats. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2010, 74(9), 1891-1894; Lam E.K., Yu L., Wong H.P., Wu W.K., Shin V.Y., Tai E.K., So W.H., Woo P.C., Cho C.H. Probiotic Lactobacillus rhamnosus GG enhances gastric ulcer healing in rats. Eur. J. Pharmacol., 2007, 565(1-3), 171-179]. Альгинаты, выделенные из водорослей, использовались для инкапсулирования пробиотических бактерий микробиоты кишечника, в этих исследованиях было показано сохранение жизнеспособности бактерий и положительный эффект инкапсулирования бактерий для терапии заболеваний кишечника при их применении в качестве пробиотиков [D'Orazio G., Di Gennaro P., Boccarusso M., Presti I., Bizzaro G., Giardina S., Michelotti A., Labra M., La Ferla B. Microencapsulation of new probiotic formulations for gastrointestinal delivery: in vitro study to assess viability and biological properties. Appl Microbiol Biotechnol. 2015, 99(22), 9779-9789].In recent years, more and more data indicate that the human microbiota plays an important role in the processes of epithelial regeneration, incl. the intestinal mucosa when it is damaged, and this role is not always negative. It has been shown that microbiota activates and maintains innate immunity, is important for the normal functioning of the immune system, and regulates inflammatory processes. It has been shown that changes in the composition of the intestinal microbiota are associated with the occurrence of various pathological conditions, including inflammatory bowel diseases, asthma, type I diabetes mellitus, obesity, cardiovascular diseases and psychiatric abnormalities [Aron-Wisnewsky J., Clement K. The gut microbiome, diet, and links to cardiometabolic and chronic disorders. Nat. Rev. Nephrol., 2016, 12 (3): 169-181]. Moreover, bacteria can not only resist the healing of epithelial tissues, in particular the intestinal mucosa, but also promote it [Uchida M., Shimizu K., Kurakazu K. Yogurt containing Lactobacillus gasseri OLL 2716 (LG21 yogurt) accelerated the healing of acetic acid -induced gastric ulcer in rats. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2010, 74 (9), 1891-1894; Lam E.K., Yu L., Wong H.P., Wu W.K., Shin V.Y., Tai E.K., So W.H., Woo P.C., Cho C.H. Probiotic Lactobacillus rhamnosus GG enhances gastric ulcer healing in rats. Eur. J. Pharmacol., 2007,565 (1-3), 171-179]. Alginates isolated from algae were used to encapsulate probiotic bacteria of the intestinal microbiota, these studies have shown the preservation of the viability of bacteria and the positive effect of encapsulating bacteria for the treatment of intestinal diseases when used as probiotics [D'Orazio G., Di Gennaro P., Boccarusso M., Presti I., Bizzaro G., Giardina S., Michelotti A., Labra M., La Ferla B. Microencapsulation of new probiotic formulations for gastrointestinal delivery: in vitro study to assess viability and biological properties. Appl Microbiol Biotechnol. 2015, 99 (22), 9779-9789].
Таким образом, учитывая актуальность исследований по разработке материалов медицинского назначения для восстановления дефектов различных тканей и исследований терапевтического потенциала пробиотических бактерий для регенерации тканей особенно актуальными техническими решениями являются те, которые связаны с разработкой конструкции на основе бактериальных полимеров, служащей для обеспечения жизнеспособности, роста и терапевтической активности пробиотических бактерий для регенерации тканей стенки кишечника. Такой способ позволяет создать медицинское изделие для регенеративной медицины нового типа, где активным действующим началом служат пробиотические бактерии, и может использоваться в биотехнологии, тканевой инженерии, регенеративной медицине.Thus, given the relevance of research on the development of medical materials for the restoration of defects in various tissues and studies of the therapeutic potential of probiotic bacteria for tissue regeneration, especially relevant technical solutions are those associated with the development of a structure based on bacterial polymers, which serves to ensure viability, growth and therapeutic activity of probiotic bacteria for the regeneration of intestinal wall tissues. This method makes it possible to create a medical device for regenerative medicine of a new type, where probiotic bacteria serve as an active active principle, and can be used in biotechnology, tissue engineering, and regenerative medicine.
Из уровня техники известна композиция на основе бактериальных экзополисахаридов, а именно геллановой камеди. Данная композиция, преимущественно для перорального введения, может также содержать агент, улучшающий состояние желудочно-кишечного тракта [RU2563137, 20.09.2015]. Заявлено, что данное изобретение представляет способы и композиции для профилактики или лечения диареи у млекопитающего. К недостаткам данной композиции и способа можно отнести то, что для композиции не показана ее способность улучшать жизнеспособность пробиотических бактерий, а способ не позволяет проводить локальное направленное терапевтическое воздействие на поврежденные ткани стенки пищеварительного тракта.A composition based on bacterial exopolysaccharides, namely gellan gum, is known from the prior art. This composition, mainly for oral administration, may also contain an agent that improves the condition of the gastrointestinal tract [RU2563137, 20.09.2015]. The invention is claimed to provide methods and compositions for the prevention or treatment of diarrhea in a mammal. The disadvantages of this composition and method can be attributed to the fact that the composition is not shown its ability to improve the viability of probiotic bacteria, and the method does not allow a local targeted therapeutic effect on damaged tissues of the wall of the digestive tract.
Из уровня техники известен способ получения препарата с контролируемым высвобождением, способного высвобождать в верхней части тонкого кишечника 99% или более слаборастворимого лекарственного средства [US6274174B1, 14.08.2001]. Заявлено, что изобретателям удалось установить способ получения слаборастворимого лекарственного средства на агрегатах сферических микрочастиц альгината мультивалентного металла, в котором каждая из вторичных частиц имеет удельную площадь от 1 до 280 м2/г. Недостатком данной композиции является ее неспособность улучшать жизнеспособность пробиотических бактерий, а также способ не позволяет проводить локальное направленное терапевтическое воздействие на поврежденные ткани стенки пищеварительного тракта и не предназначен для инкапсулирования в качестве биоактивного агента пробиотических микроорганизмов.A method for producing a controlled release preparation capable of releasing 99% or more of a poorly soluble drug in the upper part of the small intestine is known from the prior art [US6274174B1, 14.08.2001]. It is claimed that the inventors have succeeded in establishing a method for producing a poorly soluble drug on aggregates of spherical microparticles of multivalent metal alginate, in which each of the secondary particles has a specific area of 1 to 280 m 2 / g. The disadvantage of this composition is its inability to improve the viability of probiotic bacteria, and the method does not allow for local targeted therapeutic effects on damaged tissues of the wall of the digestive tract and is not intended for encapsulation as a bioactive agent of probiotic microorganisms.
Из уровня техники известна композиция, состоящая из гидрогеля на основе коллагенового матрикса в сочетании с полоксамером или альгинатом и заключенных в нем вирусных векторов [US6333194B1, 25.12.2001]. Как заявлено, данное изобретение направленно на таргетное заживление различных типов тканей или клеток по принципу непосредственной доставки данной композиции к месту повреждения, поэтому такая композиция может относится к области фармакологии. Недостатком такой композиции является то, что некоторые виды вирусов, которые могут доставляться в комбинации, а именно, лентивирусы аденовирусы или вирус герпеса могут вызывать инсерционный мутагенез, по причине случайного встраивания в геном клеток хозяина, также они обладают цитотоксичностью и иммуногенностью, что также нежелательно при терапии живых объектов.A composition is known from the prior art, which consists of a hydrogel based on a collagen matrix in combination with a poloxamer or alginate and enclosed viral vectors [US6333194B1, 25.12.2001]. As stated, the present invention is directed to the targeted healing of various types of tissues or cells by the principle of direct delivery of the given composition to the site of injury, therefore, such a composition may belong to the field of pharmacology. The disadvantage of such a composition is that some types of viruses that can be delivered in combination, namely, lentiviruses, adenoviruses or herpes virus, can cause insertional mutagenesis due to accidental incorporation of host cells into the genome, they also have cytotoxicity and immunogenicity, which is also undesirable when therapy of living objects.
Из уровня техники известно о биополимерном материале в виде микросфер с высокой пористостью на основе поли-3-оксибутирата, полученных методом бактериального биосинтеза, обладающих свойствами биосовместимости и биодеградации, обладающих способностью к контролируемой сорбции и последующему пролонгированному высвобождению положительно заряженного терапевтического белка при введении микросфер в различные ткани, что может быть использовано в регенеративной медицине для длительной терапии повреждений различных тканей. Однако, недостатком данной композиции является ее неспособность улучшать жизнеспособность пробиотических бактерий [RU2692768, 29.12.2017].It is known from the prior art about a biopolymer material in the form of microspheres with high porosity based on poly-3-hydroxybutyrate, obtained by bacterial biosynthesis, possessing biocompatibility and biodegradation properties, possessing the ability to controlled sorption and subsequent prolonged release of a positively charged therapeutic protein when microspheres are introduced into various tissue, which can be used in regenerative medicine for long-term therapy of damage to various tissues. However, the disadvantage of this composition is its inability to improve the viability of probiotic bacteria [RU2692768, 29.12.2017].
Из уровня техники известно о полимерной композиции в виде микрокапсул из различных биоматериалов, в том числе полисахаридов, включая альгинат, содержащих пробиотические бактерии, и помещенных в гель. Недостатками этого материала являются жесткие способы инкапсулирования пробиотических бактерий, что снижает их жизнеспособность; использование большого количества различных материалов, что может снижать биосовместимость материала; и быстрый срок разрушения при температуре 37±1°С [RU2652277, 13.04.2017].It is known from the prior art about a polymer composition in the form of microcapsules from various biomaterials, including polysaccharides, including alginate, containing probiotic bacteria and placed in a gel. The disadvantages of this material are tough methods of encapsulating probiotic bacteria, which reduces their viability; the use of a large number of different materials, which can reduce the biocompatibility of the material; and a fast time of destruction at a temperature of 37 ± 1 ° C [RU2652277, 13.04.2017].
Эта композиция может быть выбрана в качестве наиболее близкого аналога по числу общих сходных признаков.This composition can be selected as the closest analogue in terms of the number of common similar features.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Технической задачей (изобретения), является получение биоинженерной конструкции, состоящей из пористого матрикса на основе бактериального поли-3-оксиалканоата, заполненной гидрогелем из бактериального альгината, в который помещены живые пробиотические бактерии, обладающие антагонистической активностью, что обеспечивает их рост in situ в условиях агрессивной среды желудочно-кишечного тракта при различных его заболеваниях и замещение ими патогенной микрофлоры в области повреждения тканей. Это может быть использовано для лечения различных заболеваний желудочно-кишечного тракта благодаря терапевтической функциональности пробиотиков.The technical objective (of the invention) is to obtain a bioengineering structure consisting of a porous matrix based on a bacterial poly-3-hydroxyalkanoate filled with a bacterial alginate hydrogel, in which live probiotic bacteria with antagonistic activity are placed, which ensures their growth in situ under aggressive conditions. the environment of the gastrointestinal tract in its various diseases and their replacement of pathogenic microflora in the area of tissue damage. It can be used to treat various diseases of the gastrointestinal tract due to the therapeutic functionality of probiotics.
Техническим результатом является получение гибридной биоинженерной конструкции на основе пробиотических бактерий и бактериальных полимеров (поли-3-оксиалканоата и альгината), обеспечивающего не менее 95% выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в материале [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»], а также увеличение их защиты (повышение выживаемости бактерий не менее чем на 50%) в неблагоприятной среде при сохранении биосовместимости (отсутствии цитотоксичности) конструкции in vitro.The technical result is to obtain a hybrid bioengineering structure based on probiotic bacteria and bacterial polymers (poly-3-hydroxyalkanoate and alginate), providing at least 95% survival rate of bacteria, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the material [GOST R 56139-2014 "Food Products functional. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "], as well as an increase in their protection (increase in the survival of bacteria by at least 50%) in an unfavorable environment while maintaining the biocompatibility (absence of cytotoxicity) of the construct in vitro.
Технический результат достигается биоинженерной конструкцией для пробиотических бактерий, представляющей собой расположенный на пористой подложке слой из пористых микросфер в гидрогеле, при этом пористая подложка или пористая подложка с микросферами выполнена из поли-3-оксибутирата и/или его сополимера с 3-оксивалератом с молекулярной массой от 1×104 до 2×106 г/моль и характеризуется наличием сквозных пор (или связанных пор), общей пористостью от 75 до 99%, средним диаметром пор от 0,5 до 20 мкм, где поры заполнены гидрогелем, содержащим пробиотические бактерии, при этом гидрогель выполнен из бактериального альгината с молекулярной массой от 105 до 106 г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере от 31 моль % до 48 моль % и уровнем ацетилирования - от 10 моль % до 46 моль %. При этом подложка выполнена толщиной от 10 мкм до 5 см, а диаметр микросфер составляет от 2 до 2000 мкм, микросферы размещены в несколько рядов - от одного до пяти. Также возможен вариант выполнения конструкции в виде трубки, полученной сворачиванием подложки. Бактериальный альгинат является продуктом биосинтеза бактерий рода Azotobacter. В качестве пробиотических бактерий использованы бактерии Lactobacillus и/или Bifidobacterium, или их генетические модификации, в соотношении по числу КОЕ от 1:999 до 999:1. Дополнительно биоинженерная конструкция может содержать, по меньшей мере, одно фармакологически активное вещество, обладающие противовоспалительным действием и стимулирующее регенерацию тканей стенки кишечника, например, симвастатин, куркумин, росвератрол, при этом фармакологически активное вещество находится непосредственно в смеси с поли-3-оксиалканоатом в концентрации от 0,01% до 50% (вес.) лекарственного вещества в полученном полимерном изделии.The technical result is achieved by a bioengineering structure for probiotic bacteria, which is a layer of porous microspheres in a hydrogel located on a porous substrate, while a porous substrate or a porous substrate with microspheres is made of poly-3-hydroxybutyrate and / or its copolymer with 3-hydroxyvalerate with a molecular weight from 1 × 10 4 to 2 × 10 6 g / mol and is characterized by the presence of through pores (or connected pores), a total porosity of 75 to 99%, an average pore diameter of 0.5 to 20 μm, where the pores are filled with a hydrogel containing probiotic bacteria, while the hydrogel is made of bacterial alginate with a molecular weight of 10 5 to 10 6 g / mol, a molar content of guluronic acid residues in the polymer from 31 mol% to 48 mol%, and a level of acetylation from 10 mol% to 46 mol%. In this case, the substrate is made with a thickness of 10 μm to 5 cm, and the diameter of the microspheres is from 2 to 2000 μm, the microspheres are arranged in several rows - from one to five. It is also possible to implement the design in the form of a tube obtained by rolling the substrate. Bacterial alginate is a biosynthetic product of bacteria of the genus Azotobacter. Lactobacillus and / or Bifidobacterium bacteria, or their genetic modifications, were used as probiotic bacteria, in a ratio of CFU from 1: 999 to 999: 1. Additionally, the bioengineering structure may contain at least one pharmacologically active substance having anti-inflammatory action and stimulating the regeneration of intestinal wall tissues, for example, simvastatin, curcumin, rosveratrol, while the pharmacologically active substance is directly mixed with poly-3-hydroxyalkanoate at a concentration from 0.01% to 50% (weight) of a drug substance in the obtained polymer product.
Также технический результат достигается способом получения заявляемой биоинженерной конструкции, заключающийся в том, что включает следующие этапы:Also, the technical result is achieved by the method of obtaining the claimed bioengineering structure, which consists in the fact that it includes the following stages:
- микробиологический биосинтез бактериального альгината с использованием штамма-продуцента рода Azotobacter,- microbiological biosynthesis of bacterial alginate using a producer strain of the genus Azotobacter,
- получение пористой подложки из поли-3-оксибутирата и/или его сополимера с 3-оксивалератом,- obtaining a porous support from poly-3-hydroxybutyrate and / or its copolymer with 3-hydroxyvalerate,
- выращивание пробиотических бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium в бактериальном альгинате,- growing probiotic bacteria of the genera Lactobacillus and Bifidobacterium in bacterial alginate,
- заполнение пористой подложки альгинатом с бактериями,- filling the porous substrate with alginate with bacteria,
- гелирование бактериального альгината in situ путем добавления водного раствора хлорида кальция.- gelation of bacterial alginate in situ by adding an aqueous solution of calcium chloride.
При этом получение пористого изделия из поли-3-оксиалканоата получают одним из следующих методов: лиофилизация, высушивание, выщелачивание, эмульгирование, электроформование, быстрое прототипирование, лазерная резка. Перед заполнением пористого матрикса гидрогелем в бактериальном альгинате, составляющем его основу, выращены живые пробиотические бактерии до содержания не мнее 1×107 КОЕ/мл. Дополнительно на этапе получения пористого матрикса из поли-3-оксиалканоата в него может быть введено по меньшей мере одно фармакологически активное вещество.In this case, obtaining a porous product from poly-3-hydroxyalkanoate is obtained by one of the following methods: lyophilization, drying, leaching, emulsification, electrospinning, rapid prototyping, laser cutting. Before filling the porous matrix with hydrogel, live probiotic bacteria were grown in the bacterial alginate, which forms its basis, to a content not less than 1 × 10 7 CFU / ml. Additionally, at the stage of obtaining a porous matrix of poly-3-hydroxyalkanoate, at least one pharmacologically active substance can be introduced into it.
В качестве полимерного материала для изготовления каркасной пористой подложки биоинженерной конструкции выбраны биоразлагаемые и биосовместимые полимеры: поли-3-оксибутират (ПОБ) и сополимер поли-3-оксибутирата с 3-оксивалератом (ПОБВ) различной молекулярной массы (от 1×103 до 2×106), а в случае сополимера - с различным содержанием мономеров 3-оксивалерата (от 0 до 30%). Разработан эффективный метод контролируемого микробиологического получения биосовместимых и биоразлагаемых полимеров, относящихся к классу поли-3-оксиалканоатов. Разработанный способ биосинтеза ПОБ и его сополимеров позволяет получать полимер с заданным узким распределением молекулярной массы и с заданным мономерным составом. Для этого в ходе биосинтеза штаммы-продуценты биополимера видов Azotobacter chroococcum и Azotobacter vinelandii (например, A. chroococcum 7Б) выращивают на питательной среде, содержащей сахарозу в качестве источника углерода, минеральные соли и дополнительный источник углерода (предшественник мономеров в составе сополимера ПОБ или регулятор молекулярной массы): ацетат натрия, соли карбоновых кислот (пропионовой, валериановой) в определенной концентрации, а также при различной рН среды и при различном уровне аэрации [RU2194759, 20.12.2002; RU2201453, 27.03.2003; RU2307159, 27.09.2007; Bonartsev А.Р., Zharkova I.I., Yakovlev S.G., Myshkina V.L., Mahina Т.К., Voinova V.V., Zemov A.L., Zhuikov V.A., Akoulina E.A., Ivanova E.V., Kuznetsova E.S., Shaitan K.V., Bonartseva G.A. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate) copolymers by Azotobacter chroococcum 7B: a precursor feeding strategy. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2017, 47(2), 173-184]. Использование этих биополимеров для разработки новых лекарственных изделий представляется многообещающим, ввиду их уникальных свойств: высокой биосовместимости как с тканями и органами, так и бактериями микробиоты человека, способности к полному биоразложению с контролируемой скоростью при одновременно относительной устойчивости к агрессивной среде желудочно-кишечного тракта, способности стимулировать регенерацию различных тканей и препятствовать развитию патогенной микрофлоры [Бонарцев А.П., Воинова В.В., Бонарцева Г.А. Поли-3-оксибутират и микробиота человека. Прикладная биохимия и микробиология, 2018, 54(6), 561-584].Biodegradable and biocompatible polymers were selected as a polymer material for the manufacture of a porous framework for a bioengineered structure: poly-3-hydroxybutyrate (PHB) and a copolymer of poly-3-hydroxybutyrate with 3-hydroxyvalerate (PHBV) of various molecular weights (from 1 × 10 3 to 2 × 10 6 ), and in the case of the copolymer - with different contents of 3-hydroxyvalerate monomers (from 0 to 30%). An efficient method has been developed for the controlled microbiological production of biocompatible and biodegradable polymers belonging to the class of poly-3-hydroxyalkanoates. The developed method of biosynthesis of PHB and its copolymers makes it possible to obtain a polymer with a given narrow molecular weight distribution and with a given monomer composition. For this, in the course of biosynthesis, the biopolymer-producing strains of the species Azotobacter chroococcum and Azotobacter vinelandii (for example, A. chroococcum 7B) are grown on a nutrient medium containing sucrose as a carbon source, mineral salts and an additional carbon source (a precursor of monomers in the PHB copolymer or a regulator molecular weight): sodium acetate, salts of carboxylic acids (propionic, valerian) at a certain concentration, as well as at different pH of the medium and at different levels of aeration [RU2194759, 20.12.2002; RU2201453, 27.03.2003; RU2307159, 27.09.2007; Bonartsev A.R., Zharkova II, Yakovlev SG, Myshkina VL, Mahina T.K., Voinova VV, Zemov AL, Zhuikov VA, Akoulina EA, Ivanova EV, Kuznetsova ES, Shaitan KV, Bonartseva GA Biosynthesis of poly (3- hydroxybutyrate) copolymers by Azotobacter chroococcum 7B: a precursor feeding strategy. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2017, 47 (2), 173-184]. The use of these biopolymers for the development of new medicinal products seems promising, due to their unique properties: high biocompatibility with both tissues and organs and bacteria of the human microbiota, the ability to complete biodegradation at a controlled rate while at the same time relative resistance to the aggressive environment of the gastrointestinal tract, the ability stimulate the regeneration of various tissues and prevent the development of pathogenic microflora [Bonartsev A. P., Voinova V. V., Bonartseva G. A. Poly-3-hydroxybutyrate and human microbiota. Applied Biochemistry and Microbiology, 2018, 54 (6), 561-584].
Полимерный материал гидрогеля, служащего субстратом для обеспечения жизнеспособности и роста пробиотических бактерий и предназначенного для заполнения пористой подложки и/или микросфер - бактериальный альгинат получают способом контролируемого микробиологического биосинтеза также с использованием штамм-продуцента этого биополимера Azotobacter chroococcum 7Б [RU2194759, 20.12.2002; Бонарцева Г.А., Акулина Е.А., Мышкина В.Л., Воинова В.В., Махина Т.К., Бонарцев А.П. Биосинтез альгинатов бактериями рода Azotobacter. Прикладная биохимия и микробиология, 2017, 53(1), 61-68]. Для поддержания культуры бактерий используют твердую питательную среду Эшби, следующего состава (г/л): K2HPO4 - 1,05; KH2PO4 - 0,2; MgSO4 - 0,2; NaCl - 0,2; Na2MoO4 - 0,006; СаСО3 - 5,0; сахароза - 20, агар - 20. Для биосинтеза альгината штамм-продуцент A. chroococcum 7Б культивируют в жидкой среде Берка следующего состава (г/л): KH2PO4 - от 0,05 до 1,00; K2HPO4 - от 0,05 до 1,00; MgSO4 - 0,4; NaCl - 0,1; FeSO4 - 0,01; Na2MoO4 - 0,06; CaCl2 - 0,1; цитрат натрия - 0,5; сахароза - от 20 до 40. Сначала готовят посевной материал, для чего штамм-продуцент А. chroococcum 7Б выращивают в жидкой среде Берка указанного состава в качалочных колбах объемом 750 мл (со 100 мл среды) при 250 об./мин (исходный рН среды - 7,2; температура культивирования - 28°С) в течение 24 часов. Затем проводят биосинтез альгината штаммом-продуцентом A. chroococcum 7Б, для чего его культивируют в той же среде после внесения 4% (об.) посевного материала возрастом 24 часа в качалочных колбах на 750 мл (объем культуральной среды - 100 мл) на микробиологической качалке Innova 43 («New Brunswick Scientific», США) при скорости перемешивания от 200 до 400 об./мин в течение 72 часов. Все процедуры проводят в стерильных условиях.Polymeric material of a hydrogel serving as a substrate for ensuring the viability and growth of probiotic bacteria and intended to fill a porous substrate and / or microspheres - bacterial alginate is obtained by the method of controlled microbiological biosynthesis also using the producer strain of this biopolymer Azotobacter chroococcum 7B [RU2.2002759; 20.12 Bonartseva G.A., Akulina E.A., Myshkina V.L., Voinova V.V., Makhina T.K., Bonartsev A.P. Biosynthesis of alginates by bacteria of the genus Azotobacter. Applied Biochemistry and Microbiology, 2017, 53 (1), 61-68]. To maintain the culture of bacteria, use Ashby's solid nutrient medium of the following composition (g / l): K 2 HPO 4 - 1.05; KH 2 PO 4 0.2; MgSO 4 0.2; NaCl 0.2; Na 2 MoO 4 - 0.006; CaCO 3 - 5.0; sucrose - 20, agar - 20. For the biosynthesis of alginate, the producer strain A. chroococcum 7B is cultivated in Burk's liquid medium of the following composition (g / l): KH 2 PO 4 - from 0.05 to 1.00; K 2 HPO 4 - from 0.05 to 1.00; MgSO 4 0.4; NaCl - 0.1; FeSO 4 - 0.01; Na 2 MoO 4 - 0.06; CaCl 2 - 0.1; sodium citrate - 0.5; sucrose - from 20 to 40. First, the inoculum is prepared, for which the producer strain A. chroococcum 7B is grown in Burk's liquid medium of the specified composition in 750 ml shaking flasks (from 100 ml of medium) at 250 rpm (initial pH of the medium - 7.2; cultivation temperature - 28 ° C) for 24 hours. Then biosynthesis of alginate is carried out by the producer strain A. chroococcum 7B, for which it is cultivated in the same medium after adding 4% (vol.) Of inoculum aged 24 hours in shaking flasks of 750 ml (volume of culture medium - 100 ml) on a microbiological shaker Innova 43 (New Brunswick Scientific, USA) at a stirring speed of 200 to 400 rpm for 72 hours. All procedures are performed under sterile conditions.
Для выделения альгината проводят обработку биомассы штамма-продуцента 0,9% NaCl и 50 мМ ЭДТА, после чего проводят центрифугирование при 15000 g 30 мин. Осадок отделяют и промывают водой. Затем к нему добавляют 3-кратный объем 96% этилового спирта. Осадок снова отделяют и промывают водой. После этого проводят очистку полученного альгината. Для этого альгинат снова осаждают 3-кратным объемом 96% этилового спирта и проводят диализ против 0.5% NaCl в течение 24 h. Осадок снова отделяют и высушивают при помощи лиофильной сушки. Полученный порошок хранят при 4°С не более 3-х месяцев.To isolate alginate, the biomass of the producer strain is treated with 0.9% NaCl and 50 mM EDTA, after which centrifugation is carried out at 15000 g for 30 minutes. The precipitate is separated and washed with water. Then a 3-fold volume of 96% ethyl alcohol is added to it. The precipitate is again separated and washed with water. After that, the resulting alginate is purified. For this, the alginate is again precipitated with a 3-fold volume of 96% ethanol and dialysis is performed against 0.5% NaCl for 24 h. The precipitate is again separated and dried using a freeze dryer. The resulting powder is stored at 4 ° C for no more than 3 months.
Разработанный способ биосинтеза альгината позволяет получать полимер со следующим сочетанием параметров: молекулярной массой (определяемой методом визкозиметрии) от 105 до 106 г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере от 31 моль % до 48 моль % и уровнем ацетилирования - от 10 моль % до 46 моль % (определяемых методом ИК-спектроскопии). Такие параметры бактериального альгината близки свойствам бактериального альгината, образующего бактериальную биопленку [Boyd A., Chakrabarty A.M. Pseudomonas aeruginosa biofilms: role of the alginate exopolysaccharide. J. Ind. Microbiol., 1995, 15(3), 162-168; Nivens D.E., Ohman D.E., Williams J., Franklin M.J. Role of alginate and its О acetylation in formation of Pseudomonas aeruginosa microcolonies and biofilms. J. Bacteriol., 2001, 183(3), 1047-1057; Tielen P., Strathmann M., Jaeger K.E., Flemming H.C., Wingender J. Alginate acetylation influences initial surface colonization by mucoid Pseudomonas aeruginosa. Microbiological Research, 2005, 160(2), 165-176; Ghafoor A., Hay I.D., Rehm B.H. Role of exopolysaccharides in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and architecture. Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77(15), 5238-5246].The developed method for the biosynthesis of alginate makes it possible to obtain a polymer with the following combination of parameters: molecular weight (determined by viscosimetry) from 10 5 to 10 6 g / mol, molar content of guluronic acid residues in the polymer from 31 mol% to 48 mol%, and acetylation level - from 10 mol% to 46 mol% (determined by IR spectroscopy). Such parameters of bacterial alginate are close to the properties of bacterial alginate, which forms a bacterial biofilm [Boyd A., Chakrabarty AM Pseudomonas aeruginosa biofilms: role of the alginate exopolysaccharide. J. Ind. Microbiol. 1995,15 (3) 162-168; Nivens DE, Ohman DE, Williams J., Franklin MJ Role of alginate and its O acetylation in formation of Pseudomonas aeruginosa microcolonies and biofilms. J. Bacteriol. 2001, 183 (3), 1047-1057; Tielen P., Strathmann M., Jaeger KE, Flemming HC, Wingender J. Alginate acetylation influences initial surface colonization by mucoid Pseudomonas aeruginosa. Microbiological Research 2005,160 (2) 165-176; Ghafoor A., Hay ID, Rehm BH Role of exopolysaccharides in Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and architecture. Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77 (15), 5238-5246].
После получения бактериального альгината изготавливают различные варианты биоинженерной конструкции в несколько этапов.After obtaining the bacterial alginate, various versions of the bioengineering structure are made in several stages.
На 1-ом этапе изготавливают пористые полимерные микросферы. Для этого готовят раствор ПОБ или ПОБВ в хлороформе или метиленхлориде в концентрации полимера от 50 до 200 мг/мл (масс). Готовят 5±1% (масс.) суспензию карбоната аммония в воде и гомогенизируют ее на роторном гомогенизаторе 5±1 минут при 15000±2000 об/мин до достижения стабильной суспензии, после чего переносят ее полностью в стеклянный стакан с раствором ПОБ или ПОБВ в хлороформе или метиленхлориде. После чего гомогенизируют еще 20±5 минут при 15000±2000 об/мин до получения стабильной эмульсии. Затем готовят в стеклянном стакане 1±0,5% (масс.) раствор поливинилового спирта (ПВС) в дистиллированной воде, с помощью верхнеприводной мешалки с перемешивающим элементом пропеллерного типа перемешивают раствор при скорости от 250 до 1000 об/мин (от чего зависит диаметр и пористость образуемых микросфер) и при этом постоянном перемешивании в него добавляют по каплям полученную сложную коллоидную смесь. Перемешивание проводят до полного испарения хлороформа, ориентировочно более 3±0,5 часов. Затем перемещают стакан на магнитную мешалку с подогревом и перемешивают еще 35±5 мин при температуре 35±5°С для полного разложения порообразователя и выхода газов, что выражается в виде образования пузырьков газа, а также для дополнительной отгонки хлороформа; прекращение выделения газа можно протестировать при помощи влажной стандартной индикаторной бумаги (Химмед, РФ) по отсутствию щелочной реакции, которую дает образующийся аммиак. Затем жидкость, содержащую сформированные полимерные микросферы, центрифугируют на настольной центрифуге при 500±100 об/мин для отделения микросфер от раствора эмульгатора ПВС, супернатант максимально отбирают. Полученные микросферы промывают от эмульгатора и других примесей 3-4 раза дистиллированной водой, качество отмывки проверяют при помощи влажной стандартной индикаторной бумаги (Химмед, РФ) по отсутствию щелочной реакции. Промытые микросферы замораживают в жидком азоте и лиофилизируют с помощью лиофильной сушилки. Полученные микросферы просеивают через лабораторные сита У1-ЕСЛ с тканью из сетки по ГОСТ 6613-86 с размером ячеек 40, 94 мкм, 315 или 900 мкм для дополнительного более точного разделения микросфер по их диаметру.At the 1st stage, porous polymer microspheres are made. For this, a solution of PHB or PHBV is prepared in chloroform or methylene chloride at a polymer concentration of 50 to 200 mg / ml (wt). Prepare a 5 ± 1% (mass.) Suspension of ammonium carbonate in water and homogenize it on a rotary homogenizer for 5 ± 1 minutes at 15000 ± 2000 rpm until a stable suspension is reached, after which it is transferred completely into a glass beaker with a PHB or PHBV solution in chloroform or methylene chloride. Then homogenized for another 20 ± 5 minutes at 15000 ± 2000 rpm until a stable emulsion is obtained. Then a 1 ± 0.5% (mass) solution of polyvinyl alcohol (PVA) in distilled water is prepared in a glass beaker, using an overhead stirrer with a propeller-type stirring element, the solution is stirred at a speed of 250 to 1000 rpm (which determines the diameter and the porosity of the formed microspheres) and with this constant stirring, the resulting complex colloidal mixture is added dropwise to it. Stirring is carried out until the chloroform has completely evaporated, approximately more than 3 ± 0.5 hours. Then move the beaker onto a magnetic stirrer with heating and stir for another 35 ± 5 min at a temperature of 35 ± 5 ° C for complete decomposition of the blowing agent and release of gases, which is expressed in the form of gas bubbles, as well as for additional distillation of chloroform; cessation of gas evolution can be tested using wet standard indicator paper (Khimmed, RF) for the absence of an alkaline reaction, which is produced by the formed ammonia. Then the liquid containing the formed polymer microspheres is centrifuged in a tabletop centrifuge at 500 ± 100 rpm to separate the microspheres from the PVA emulsifier solution, the supernatant is taken as much as possible. The resulting microspheres are washed from the emulsifier and other impurities 3-4 times with distilled water, the quality of washing is checked using wet standard indicator paper (Khimmed, RF) for the absence of an alkaline reaction. The washed microspheres are frozen in liquid nitrogen and lyophilized using a freeze dryer. The resulting microspheres are sieved through U1-ESL laboratory sieves with a mesh fabric in accordance with GOST 6613-86 with a mesh size of 40, 94 μm, 315 or 900 μm for additional more accurate separation of microspheres by their diameter.
Пористые подложки изготавливают с помощью модифицированного метода выщелачивания [Bonartsev А.Р. et al. Adhesion and growth of bone marrow mesenchymal stem cells on 3D scaffolds from poly(3-hydroxybutyrate)-poly(ethylene glycol) copolymer. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering, 2016, 6(1), 42-52]. Эта модификация основана на температурном разложении твердой соли, в то время как стандартный метод подразумевает вымывание соли растворителем. Раствор ПОБВ с молярным содержанием 3-оксивалерата от 6 до 30 моль % и молекулярной массой от 1.5×105 до 1.5×106 г/моль в хлороформе или метиленхлориде в концентрации от 15 до 30 мг/мл смешивали с порошком бикарбоната аммония с линейными размерами частиц соли в диапазоне 90-300 мкм в соотношении от 20:1 до 5:1 по массе и тщательно перемешивали на вортексе 3±1 мин. Смесь помещают в стеклянный сосуд с плоским дном (например, в чашку Петри) диаметром от 40 до 90 мм и оставляют при комнатной температуре до полного испарения органического растворителя от 2 до 3 часов. После этого форму помещают в подогретую дистиллированную воду (70±5°С) до полного прекращения газообразования, промывают дистиллированной водой 4-6 раз для избавления от примесей, качество отмывки проверяют при помощи влажной стандартной индикаторной бумаги (Химмед, РФ) по отсутствию щелочной реакции. Затем высушивают при 37±1°С в течение 24-30 часов до достижения полученной пористой полимерной пленки постоянной массы.Porous substrates are made using a modified leaching method [Bonartsev A.R. et al. Adhesion and growth of bone marrow mesenchymal stem cells on 3D scaffolds from poly (3-hydroxybutyrate) -poly (ethylene glycol) copolymer. Journal of Biomaterials and Tissue Engineering, 2016, 6 (1), 42-52]. This modification is based on thermal decomposition of the solid salt, while the standard method involves washing out the salt with a solvent. A PHBV solution with a molar content of 3-hydroxyvalerate from 6 to 30 mol% and a molecular weight from 1.5 × 10 5 to 1.5 × 10 6 g / mol in chloroform or methylene chloride at a concentration of 15 to 30 mg / ml was mixed with ammonium bicarbonate powder with linear the size of salt particles in the range of 90-300 microns in a ratio from 20: 1 to 5: 1 by weight and thoroughly mixed on a vortex for 3 ± 1 min. The mixture is placed in a flat-bottomed glass vessel (for example, a Petri dish) with a diameter of 40 to 90 mm and left at room temperature until the organic solvent has completely evaporated from 2 to 3 hours. After that, the mold is placed in heated distilled water (70 ± 5 ° C) until gassing has completely ceased, washed with distilled water 4-6 times to get rid of impurities, the quality of washing is checked using wet standard indicator paper (Khimmed, RF) for the absence of an alkaline reaction ... Then it is dried at 37 ± 1 ° C for 24-30 hours until the obtained porous polymer film of constant weight is reached.
В одном из исполнений изобретения в пористую подложку вводят лекарственное вещество (ЛВ), обладающие противовоспалительным действием и стимулирующее регенерацию тканей стенки кишечника, например, таких как симвастатин, куркумин, росвератрол [Bereswill S., Fischer A., Plickert R., Haag L.M., Otto В., Loddenkemper С., Heimesaat M.M. Anti-inflammatory effects of resveratrol, curcumin and simvastatin in acute small intestinal inflammation. PLoS One, 2010, 5(12): e15099]. Для этого готовят раствор ЛВ в хлороформе или метиленхлориде в концентрации от 0,01 до 100 мг/мл и на стадии приготовления раствора ПОБВ в хлороформе добавляют в раствор полимера раствор ЛВ в объеме от 1 мкл до 100 мл для достижения массовой доле ЛВ в полученном полимерном изделии от 0,01% до 50% (вес.). Терапевтические свойства симвастатина для желудочно-кишечного тракта описаны в [Cote-Daigneault J., Mehandru S., Ungaro R., Atreja A., Colombel J.F. Potential Immunomodulatory Effects of Statins in Inflammatory Bowel Disease Inflammatory Bowel Diseases, 2016, 22(3), 724-732].In one embodiment of the invention, a medicinal substance (MD) is introduced into the porous support, which has an anti-inflammatory effect and stimulates the regeneration of tissues of the intestinal wall, for example, such as simvastatin, curcumin, rosveratrol [Bereswill S., Fischer A., Plickert R., Haag LM, Otto B., Loddenkemper S., Heimesaat MM Anti-inflammatory effects of resveratrol, curcumin and simvastatin in acute small intestinal inflammation. PLoS One, 2010, 5 (12): e15099]. For this, a drug solution is prepared in chloroform or methylene chloride at a concentration of 0.01 to 100 mg / ml, and at the stage of preparing a PHBV solution in chloroform, a drug solution is added to the polymer solution in a volume of 1 μl to 100 ml to achieve the drug mass fraction in the resulting polymer product from 0.01% to 50% (wt.). The therapeutic properties of simvastatin for the gastrointestinal tract are described in [Cote-Daigneault J., Mehandru S., Ungaro R., Atreja A., Colombel JF Potential Immunomodulatory Effects of Statins in Inflammatory Bowel Disease Inflammatory Bowel Diseases, 2016, 22 (3) , 724-732].
Из полученной пористой пленки вырезают полоски длиной от 1 до 400 мм и шириной от 1 до 400 мм. Полученные полоски обмакивают в хлороформе или метиленлориде путем полного погружения в растворитель 3-4 раза, затем на поверхность пленки, не дожидаясь высыхания, сплошным слоем насыпают полученные ранее микросферы различного диаметра от 10 и до 1000 мкм, равномерно распределяя их шпателем и оставляют сушиться в течение 24-30 часов. В одном из исполнений изобретения полученную полоску с нанесенными на нее микросферами сворачивают с небольшим захлестом (от 5 до 10% от длины) в трубку диаметром от 0,2 мм до 120 мм и длиной от 1 до 400 мм. Края пленки склеивают с помощью раствора 2-3% ПОБ в хлороформе, который с помощью пипетки наносят на край пленки с внешней стороны, после чего сворачивают пленку таким образом, чтобы к нему можно было приложить другой ее край с внутренней стороны, склеив эти края и изготовив таким образом трубку. Готовые изделия промывают дистиллированной водой 4-6 раз для избавления от примесей, качество отмывки проверяют при помощи влажной стандартной индикаторной бумаги (Химмед, РФ) по отсутствию щелочной реакции. Затем высушивают при 37±1°С в течение 24-30 часов до достижения полученной пористой полимерной пленки постоянной массы. Готовые изделия можно нарезать на фрагменты необходимого размера.Strips from 1 to 400 mm long and 1 to 400 mm wide are cut from the obtained porous film. The resulting strips are dipped in chloroform or methylene chloride by full immersion in a solvent 3-4 times, then on the surface of the film, without waiting for drying, the previously obtained microspheres of various diameters from 10 to 1000 microns are poured in a continuous layer, evenly distributing them with a spatula and left to dry for 24-30 hours. In one embodiment of the invention, the resulting strip with microspheres deposited on it is rolled up with a slight overlap (from 5 to 10% of the length) into a tube with a diameter of 0.2 mm to 120 mm and a length of 1 to 400 mm. The edges of the film are glued using a solution of 2-3% PHB in chloroform, which is applied with a pipette to the edge of the film from the outside, after which the film is folded so that its other edge can be applied to it from the inside, gluing these edges and thus making a tube. The finished products are washed with distilled water 4-6 times to get rid of impurities, the quality of washing is checked using wet standard indicator paper (Khimmed, RF) for the absence of an alkaline reaction. Then it is dried at 37 ± 1 ° C for 24-30 hours until the obtained porous polymer film of constant weight is reached. Finished products can be cut into pieces of the required size.
Таким образом, биоинженерную конструкцию изготовляют из двух видов бактериальных полимеров - поли-3-оксиалканоата и альгината, получаемых биотехнологическим путем, так, чтобы изделие из одного полимера выполняла каркасную «жесткостную» роль, а второй полимер был бы наполнителем и носителем, в который можно было бы загрузить пробиотические бактерии или какие-то другие клетки или вещества при необходимости.Thus, a bioengineering structure is made of two types of bacterial polymers - poly-3-hydroxyalkanoate and alginate, obtained biotechnologically, so that a product made of one polymer plays a skeletal "rigid" role, and the second polymer would be a filler and a carrier in which would load probiotic bacteria or some other cells or substances as needed.
Поверхность и внутренняя структура микросфер представляет собой сложную систему разветвленных сквозных пор с линейными размерами более 4 мкм, что больше среднего размера бактерий. Создание слоя из таких пористых микросфер может решить задачу не только получения некого каркаса, который можно заполнить альгинатным гидрогелем, содержащим пробиотические бактерии, но позволяет значительно увеличить площадь поверхности и шероховатости конструкции, что является очень важной характеристикой изделий для регенерации различных тканей и способствует проникновению в такую конструкцию питательных веществ и биоактивных молекул, адгезии клеток к изделию, ее срастанию с окружающими живыми тканями, постепенной биодеградации изделия с замещением ее регенерирующей тканью.The surface and internal structure of microspheres is a complex system of branched through pores with a linear size of more than 4 microns, which is larger than the average size of bacteria. The creation of a layer of such porous microspheres can solve the problem of not only obtaining a certain framework that can be filled with an alginate hydrogel containing probiotic bacteria, but also allows to significantly increase the surface area and roughness of the structure, which is a very important characteristic of products for the regeneration of various tissues and facilitates penetration into such the design of nutrients and bioactive molecules, adhesion of cells to the product, its fusion with the surrounding living tissues, gradual biodegradation of the product with its replacement with regenerating tissue.
На следующем этапе в альгинате, полученном микробиологическим путем выращивают пробиотические бактерии. Сначала культуры бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium выращивают на полужидкой среде, обеспечивающей рост указанных бактерий. В колбы наливают питательную среду, укупоривают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют. При культивировании бактерий рода Lactobacillus готовую среду не хранят. При культивировании бактерий рода Bifidobacterium готовую среду хранят не более 2-х недель в бытовом холодильнике при температуре 5-8°С. Посев осуществляют, как только температура среды после автоклавирования достигает 40°С. Для этого с помощью пипетки, вносят в полужидкую питательную среду 1,0±0,1 мл суспензии бактериальных клеток и перемешивают [Schillinger U., Holzapfel W.H. Chapter 8. Culture media for lactic acid bacteria, p. 127-140. In: Handbook of Culture Media for Food Microbiology. Edited by Janet E.L. Corry, G.D.W. Curtis, Rosamund M. Baird. V. 37, 2003].In the next step, probiotic bacteria are grown in microbiologically obtained alginate. First, cultures of bacteria of the genera Lactobacillus and Bifidobacterium are grown on a semi-liquid medium that ensures the growth of these bacteria. The culture medium is poured into the flasks, sealed with cotton-gauze stoppers and autoclaved. When cultivating bacteria of the genus Lactobacillus, the prepared medium is not stored. When cultivating bacteria of the genus Bifidobacterium, the prepared medium is stored for no more than 2 weeks in a household refrigerator at a temperature of 5-8 ° C. Sowing is carried out as soon as the temperature of the medium after autoclaving reaches 40 ° C. To do this, using a pipette, add 1.0 ± 0.1 ml of bacterial cell suspension to a semi-liquid nutrient medium and mix [Schillinger U., Holzapfel W.H. Chapter 8. Culture media for lactic acid bacteria, p. 127-140. In: Handbook of Culture Media for Food Microbiology. Edited by Janet E.L. Corry, G.D.W. Curtis, Rosamund M. Baird. V. 37, 2003].
Параллельно готовят 1±0,1% (вес.) водный раствор альгината натрия с молекулярной массой от 1.0×105 до 2×106 г/моль, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 25±5°С и скорости перемешивания 40-80 об/мин.In parallel, a 1 ± 0.1% (wt.) Aqueous solution of sodium alginate with a molecular weight of 1.0 × 10 5 to 2 × 10 6 g / mol, obtained microbiologically, is prepared in 150 ml of MRS-broth on a magnetic stirrer with heating at 25 ± 5 ° С and stirring speed 40-80 rpm.
Для посева культуры бактерий рода Lactobacillus готовят жидкую посевную культуру. Для этого в пробирку с культурой, растущей на скошенном MRS-агаре, вносят 3±0,2 мл MRS-бульона. Снимают клетки с поверхности твердой среды путем повторного пипетирования и переносят полученную суспензию в колбу, содержащую 150±10 мл питательной среды на основе бактериального альгината в MRS-бульоне. Колбу с жидкой посевной культурой инкубируют 96±6 часа в аэробных условиях на микробиологической качалке при 37±1°С и скорости перемешивания 120±20 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см).For sowing a culture of bacteria of the genus Lactobacillus, prepare a liquid seed culture. For this, 3 ± 0.2 ml of MRS broth is added to a test tube with a culture growing on a slant MRS-agar. Cells are removed from the surface of the solid medium by repeated pipetting and the resulting suspension is transferred into a flask containing 150 ± 10 ml of a culture medium based on bacterial alginate in MRS broth. A flask with a liquid seed culture is incubated for 96 ± 6 hours under aerobic conditions on a microbiological shaker at 37 ± 1 ° C and a stirring speed of 120 ± 20 rpm (orbital diameter 1.9 cm).
Для посева культуры бактерий рода Bifidobacterium сначала проводят пересев со среды с агар-агаром на среду с альгинатом. Для этого из колбы с 96±6 часовой культурой, растущей в полужидкой среде на агар-агаре, стеклянной серологической пипеткой отбирают 8,0±0,2 мл и вносят в колбу со свежеприготовленной полужидкой средой на основе бактериального альгината в MRS-бульоне. Содержимое колбы перемешивают. Для получения культуры бактерий рода Bifidobacterium в полужидкой среде на дно колбы вносят 4,0±0,2 мл рабочей культуры. Содержимое колбы не перемешивают. После инокуляции колбы укупоривают ватно-марлевыми пробками и для термостатирования помещают в микробиологическую качалку. Инкубируют 96±6 часа при 37±1°С без перемешивания.To inoculate a culture of bacteria of the genus Bifidobacterium, first, subculture is carried out from a medium with agar-agar to a medium with alginate. For this purpose, 8.0 ± 0.2 ml is taken from a flask with a 96 ± 6 hour culture growing in a semi-liquid medium on agar-agar with a glass serological pipette and introduced into a flask with a freshly prepared semi-liquid medium based on bacterial alginate in MRS broth. The contents of the flask are mixed. To obtain a culture of bacteria of the genus Bifidobacterium in a semi-liquid medium, 4.0 ± 0.2 ml of a working culture is added to the bottom of the flask. The contents of the flask are not mixed. After inoculation, the flasks are sealed with cotton-gauze stoppers and placed in a microbiological shaker for thermostating. Incubate for 96 ± 6 hours at 37 ± 1 ° C without stirring.
В одном из исполнений заявляемого способа используют также генетически модифицированные штаммы бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium. Данные штаммы можно получать из природных штаммов пробиотических бактерий посредством общепринятых способов генетической трансформации с использованием электрокорпорации, описанные, например, для бактерий из рода Lactobacillus [Serror P., Sasaki Т., Ehrlich S.D., Maguin E. Electrotransformation of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and L. delbrueckii subsp. lactis with Various Plasmids. Appl Environ Microbiol., 2002, 68(1), 46-52] и для бактерий из рода Bifidobacterium [Argnani A., Leer R.J., van Luijk N., Pouwels P.H. A convenient and reproducible method to genetically transform bacteria of the genus Bifidobacterium. Microbiology, 1996, 142, 109-114].In one embodiment of the proposed method, genetically modified strains of bacteria of the genera Lactobacillus and Bifidobacterium are also used. These strains can be obtained from natural strains of probiotic bacteria by conventional methods of genetic transformation using electrocorporation, described, for example, for bacteria from the genus Lactobacillus [Serror P., Sasaki T., Ehrlich SD, Maguin E. Electrotransformation of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and L. delbrueckii subsp. lactis with Various Plasmids. Appl Environ Microbiol., 2002, 68 (1), 46-52] and for bacteria from the genus Bifidobacterium [Argnani A., Leer R.J., van Luijk N., Pouwels P.H. A convenient and reproducible method to genetically transform bacteria of the genus Bifidobacterium. Microbiology 1996, 142, 109-114].
Наконец, на последнем этапе осуществляют «пропитку» полученных конструкций раствором полученного ранее бактериального капсулярного альгината натрия с биомассой пробиотических бактерий или изготовление из альгината с бактериями сфер в наиболее простом варианте. Для этой процедуры используют 1±0,1% (вес.) водный раствор альгината натрия, содержащий не менее 107 КОЕ/г выращенных в нем бактерии родов Lactobacillus и Bifidobacterium. Конструкцию помещают в этот раствор, а емкость с ним в эксикатор, где создают отрицательное давление (0,7-0,8 атм.) в течение 10 мин для вымещения воздуха из пор микросфер и подложки и замещения его раствором альгината и бактериями, содержащимися в нем, при температуре 25±3°С. Внешне процесс заполнения пор микросфер при этих условиях выглядит как образование множества микропузырьков воздуха вокруг микросфер, при этом раствор альгината заполняет поры микросфер и подложки. Затем проводят гелирование альгината, для чего конструкцию, пропитанную раствором альгината натрия помещают в стеклянный стакан со 100 мл 50±1 мМ водного раствора хлорида кальция на 10±1 мин.Finally, at the last stage, the resulting structures are “impregnated” with a solution of the previously obtained bacterial capsular sodium alginate with the biomass of probiotic bacteria or the production of spheres from alginate with bacteria in the simplest version. For this procedure, use a 1 ± 0.1 wt% aqueous solution of sodium alginate containing at least 10 7 CFU / g of bacteria of the genera Lactobacillus and Bifidobacterium grown in it. The structure is placed in this solution, and the container with it in a desiccator, where a negative pressure (0.7-0.8 atm.) Is created for 10 minutes to displace air from the pores of the microspheres and the substrate and replace it with an alginate solution and bacteria contained in it, at a temperature of 25 ± 3 ° C. Externally, the process of filling the pores of microspheres under these conditions looks like the formation of many microspheres of air around the microspheres, while the alginate solution fills the pores of the microspheres and the substrate. Then, the alginate is gelled, for which the structure impregnated with a sodium alginate solution is placed in a glass beaker with 100 ml of 50 ± 1 mM aqueous solution of calcium chloride for 10 ± 1 min.
В наиболее простом исполнении заявляемого способа из полученного ранее бактериального капсулярного альгината натрия с выращенной в нем биомассой пробиотических бактерий изготавливают гранулы. Для этого автоматической пипеткой в стеклянный стакан с 50±1 мМ водного раствора хлорида кальция по каплям (10-30 мкл) вносят раствор альгината, содержащего бактерии, полученного ранее описанным способом. В результате образуются гранулы альгината диаметром от 0,2 до 1 мм.In the simplest embodiment of the proposed method, granules are made from the previously obtained bacterial capsular sodium alginate with the biomass of probiotic bacteria grown therein. For this, an automatic pipette into a glass beaker with a 50 ± 1 mM aqueous solution of calcium chloride is added dropwise (10-30 μl) a solution of alginate containing bacteria, obtained by the previously described method. As a result, alginate granules with a diameter of 0.2 to 1 mm are formed.
В одном из исполнений заявляемого способа помимо бактерий в альгинат вводят биологически активные вещества, обладающие противовоспалительным действием и стимулирующее регенерацию тканей стенки кишечника, например, такого как интерлейкин 10. Для этого готовят раствор биоактивного вещества в воде в концентрации от 0,01 мкг/л до 100 мг/мл и на стадии завершения выращивания бактерий в бактериальном альгинате добавляют в раствор полимера, содержащего бактерии, раствор ЛВ в объеме от 1 мкл до 100 мл для достижения массовой доле ЛВ в полученном полимерном изделии от 0,00001% до 50% (вес). Терапевтические свойства различных биологически активных веществ, в т.ч. интерлейкина 10 для желудочно-кишечного тракта описаны в [Takedatsu Н., Mitsuyama K., Torimura Т. Nanomedicine and drug delivery strategies for treatment of inflammatory bowel disease. World J. Gastroenterol., 2015, 21(40), 11343-11352, doi: 10.3748/wjg.v21.i40.11343].In one of the embodiments of the proposed method, in addition to bacteria, biologically active substances are introduced into the alginate that have anti-inflammatory effects and stimulate the regeneration of tissues of the intestinal wall, for example, such as interleukin 10. For this, a solution of the bioactive substance in water is prepared at a concentration of 0.01 μg / l to 100 mg / ml, and at the stage of completion of the cultivation of bacteria in bacterial alginate, a drug solution in a volume of 1 μl to 100 ml is added to a solution of a polymer containing bacteria in a volume of 1 μl to 100 ml to achieve the mass fraction of drug in the obtained polymer product from 0.00001% to 50% (weight ). The therapeutic properties of various biologically active substances, incl. interleukin 10 for the gastrointestinal tract is described in [Takedatsu H., Mitsuyama K., Torimura T. Nanomedicine and drug delivery strategies for treatment of inflammatory bowel disease. World J. Gastroenterol. 2015, 21 (40), 11343-11352, doi: 10.3748 / wjg.v21.i40.11343].
Эффективность полученных биоинженерных конструкций оценивали с помощью модельных тестов: теста устойчивости при температуре 37°С, теста устойчивости в симулированной среде кишечника, тестов ферментативной устойчивости, теста устойчивости в среде чужеродных бактерий, теста миграции бактерий из гидрогеля, теста исследования на цитотоксичность in vitro. В качестве препарата-сравнения использовали инкапсулированную форму бактерий в водорослевом альгинате, изготовленную путем диспергирования соответствующих пробиотических бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium в 2% (об.) растворе водорослевого альгината с последующим получением гранул альгинатного гидрогеля с инкапсулированными в них бактериями с помощью раствора хлорида кальция так, что содержание бактерий в полученных гранулах было таким же как и в тестируемых конструкциях.The effectiveness of the obtained bioengineering constructs was assessed using model tests: resistance test at 37 ° C, resistance test in a simulated intestine environment, enzymatic resistance tests, resistance test in an alien bacteria environment, bacteria migration test from hydrogel, and in vitro cytotoxicity test. An encapsulated form of bacteria in algal alginate, made by dispersing the corresponding probiotic bacteria of the genera Lactobacillus and Bifidobacterium in a 2% (vol.) Solution of algal alginate, was used as a reference drug, followed by obtaining granules of alginate hydrogel with encapsulated bacteria in them using a calcium chloride solution that the content of bacteria in the obtained granules was the same as in the tested constructs.
Тест устойчивости конструкции при температуре 37±1°С: полученные конструкции, содержащие бактерии, помещают на стеклянную поверхность чашки Петри и помещают в термостат с поддерживаемой в нем температурой 37±1°С. Выдерживают в течение 10±1 мин, после чего извлекают и наблюдают за изменением формы и агрегатного состояния гидрогеля, фиксируя время полной деформации с момента помещения на стеклянную поверхность.Structural stability test at 37 ± 1 ° C: the resulting structures containing bacteria are placed on a glass surface of a Petri dish and placed in a thermostat maintained at 37 ± 1 ° C. It is kept for 10 ± 1 min, after which it is removed and the change in the shape and state of aggregation of the hydrogel is observed, recording the time of complete deformation from the moment it is placed on a glass surface.
Тест устойчивости в симулированной среде кишечника: полученные биоинженерные конструкции в различных формах (гранулы, микросферы, подложка со слоем микросфер в виде пластины или трубки) помещают в стеклянную колбу со 100 мл симулированной среды кишечника следующего состава: 50 мМ KH2PO4, 10 мг/мл желчных кислот, рН=7,5; проводят инкубацию в течение 150 мин. при 37°С. Полученные биоинженерные конструкции должны обеспечивать не менее чем 50% повышение выживаемости бактерий или не менее 95% абсолютной их выживаемости, оцениваемого по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»].Stability test in simulated intestine environment: the obtained bioengineering constructs in various forms (granules, microspheres, a support with a layer of microspheres in the form of a plate or tube) are placed in a glass flask with 100 ml of simulated intestinal environment of the following composition: 50 mM KH 2 PO 4 , 10 mg / ml of bile acids, pH = 7.5; incubation is carried out for 150 minutes. at 37 ° C. The resulting bioengineering structures should provide at least 50% increase in the survival rate of bacteria or at least 95% of their absolute survival rate, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the structure [GOST R 56139-2014 “Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "].
Тест ферментативной устойчивости с использованием альгинат лиазы в симулированной среде кишечника: полученные биоинженерные конструкции в различных формах (гранулы, микросферы, подложка со слоем микросфер в виде пластины или трубки) помещают в стеклянную колбу со 100 мл симулированной среды кишечника, содержащей альгинат лиазу, следующего состава: 50 мМ KH2PO4, 10 мг/мл желчных кислот, 1 мг/мл альгинат лиаза (Сигма-Алдрич, ≥10000 ед./г), рН=7,5; проводят инкубацию в течение 150 мин. при 37°С. Полученные биоинженерные конструкции ого уполномоченно не менее чем 50% повышение выживаемости бактерий, оцениваемого по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов »].Enzymatic resistance test using alginate lyase in a simulated intestinal environment: the resulting bioengineered constructs in various forms (granules, microspheres, a support with a layer of microspheres in the form of a plate or tube) are placed in a glass flask with 100 ml of simulated intestinal medium containing alginate lyase, of the following composition : 50 mM KH 2 PO 4 , 10 mg / ml bile acids, 1 mg / ml alginate lyase (Sigma-Aldrich, ≥10000 U / g), pH = 7.5; incubation is carried out for 150 minutes. at 37 ° C. The obtained bioengineering structures are authorized to increase the survival rate of bacteria by at least 50%, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the structure [GOST R 56139-2014 “Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "].
Тест ферментативной устойчивости с использованием лизоцима в симулированной среде кишечника: полученные биоинженерные конструкции в различных формах (гранулы, микросферы, подложка со слоем микросфер в виде пластины или трубки) помещают в стеклянную колбу со 100 мл симулированной среды кишечника, содержащей лизоцим, следующего состава: 50 мМ KH2PO4, 10 мг/мл желчных кислот, 1 мг/мл лизоцима (Сигма-Алдрич, ≥40000 ед./мг), рН=7,5; проводят инкубацию в течение 150 мин. при 37°С. Полученные биоинженерные конструкции обеспечивают не менее чем 50% повышение выживаемости бактерий, оцениваемого по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»].Test of enzymatic resistance using lysozyme in a simulated intestinal environment: the obtained bioengineered constructs in various forms (granules, microspheres, a support with a layer of microspheres in the form of a plate or tube) are placed in a glass flask with 100 ml of simulated intestinal medium containing lysozyme, of the following composition: 50 mM KH 2 PO 4 , 10 mg / ml bile acids, 1 mg / ml lysozyme (Sigma-Aldrich, ≥40,000 units / mg), pH = 7.5; incubation is carried out for 150 minutes. at 37 ° C. The obtained bioengineering structures provide at least 50% increase in the survival rate of bacteria, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the structure [GOST R 56139-2014 “Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "].
Тест устойчивости в среде чужеродных бактерий: полученные биоинженерные конструкции в различных формах (гранулы, микросферы, подложка со слоем микросфер в виде пластины или трубки) в стерильных условиях помещают в коническую колбу на 250 мл на полужидкой среде, состоящей из 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара в толщу среды, в которую предварительно внесена культура Е. coli BL21 (GE Healthcare, США), содержимое колбы не перемешивают, после инокуляции колбы укупоривают ватно-марлевыми пробками и для термостатирования помещают в микробиологическую качалку, после чего инкубируют 24±4 часа при 37±1°С без перемешивания. Полученные биоинженерные конструкции обеспечивают не менее чем 50% повышение устойчивости культур бактерий родов Lactobacillus или Bifidobacterium к проникновению в конструкцию чужеродных бактерий Е. coli BL21 или наличие в конструкции не более 5% чужеродных бактерий Е. coli BL21 от общего количества бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов »].Test of resistance in the environment of foreign bacteria: the obtained bioengineering constructs in various forms (granules, microspheres, a substrate with a layer of microspheres in the form of a plate or a tube) under sterile conditions are placed in a 250 ml conical flask on a semi-liquid medium consisting of 200 ml of MRS broth and 0.3% agar-agar in the thickness of the medium, into which the E. coli BL21 culture (GE Healthcare, USA) was previously introduced, the contents of the flask are not stirred, after inoculation the flasks are sealed with cotton-gauze plugs and placed in a microbiological shaker for thermostating, after which incubated for 24 ± 4 hours at 37 ± 1 ° C without stirring. The obtained bioengineering constructs provide at least 50% increase in the resistance of cultures of bacteria of the genera Lactobacillus or Bifidobacterium to the penetration of alien bacteria E. coli BL21 into the structure or the presence in the structure of no more than 5% of foreign bacteria E. coli BL21 of the total number of bacteria, assessed by the standard method determination of the number of CFU in the design [GOST R 56139-2014 "Food functional products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "].
Тест миграции бактерий из биоинженерной конструкции: полученные биоинженерные конструкции, содержащие пробиотические бактерии, в стерильных условиях помещают в коническую колбу на 250 мл на полужидкой среде, состоящей из 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара в толщу среды, содержимое колбы не перемешивают, после инокуляции колбы укупоривают ватно-марлевыми пробками и для термостатирования помещают в микробиологическую качалку, после чего инкубируют 24±4 часа при 37±1°С без перемешивания. Полученная биоинженерная конструкция должна обеспечивать распространение бактерий родов Lactobacillus или Bifidobacterium в полужидкой среде, в которую помещена конструкция, на расстояние не менее чем 10 мм от образца гидрогеля, оцениваемое по стандартной методике определения числа КОЕ в среде [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»].Bacteria migration test from a bioengineered construct: the resulting bioengineered constructs containing probiotic bacteria are sterilely placed in a 250 ml conical flask on a semi-liquid medium consisting of 200 ml MRS broth and 0.3% agar-agar into the medium, the contents of the flask do not mix, after inoculation, the flasks are sealed with cotton-gauze plugs and for thermostating placed in a microbiological shaker, after which they are incubated for 24 ± 4 hours at 37 ± 1 ° C without stirring. The resulting bioengineering structure should ensure the spread of bacteria of the genera Lactobacillus or Bifidobacterium in a semi-liquid medium, in which the structure is placed, at a distance of at least 10 mm from the hydrogel sample, assessed according to the standard method for determining the number of CFU in the medium [GOST R 56139-2014 "Functional food products ... Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "].
Тест исследования на цитотоксичность in vitro проводили согласно ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro». В качестве культуры клеток используют фибробласты мыши линии Balb/3Т3 и испытание методом прямого контакта. Проводят качественную оценку по баллам. Полученная биоинженерная конструкция не должна быть цитотоксичной (должна иметь балл по шкале цитотоксичности не более «0»).The in vitro cytotoxicity test was performed in accordance with GOST ISO 10993-1-2011 “Medical devices. Assessment of the biological effect of medical devices. Part 5. Testing for cytotoxicity: in vitro methods ”. As a cell culture, Balb / 3T3 mouse fibroblasts and direct contact assay were used. A qualitative assessment is carried out by points. The resulting bioengineering construct should not be cytotoxic (it should have a cytotoxicity score of no more than "0").
Изготовление сложносоставной полимерной конструкции, состоящей из пористого каркаса, заполненного гидрогелем, который содержит пробиотические бактерии, обеспечивает биологическую активность, жизнеспособность и рост пробиотических бактерий, выполняющих роль активного терапевтического агента. Такое строение биоинженерной конструкции значительно увеличивает площадь поверхности и внутреннего объема изделия как для обеспечения контакта пробиотических бактерий с поврежденными тканями стенки кишечника, та и для их защиты от патогенной микрофлоры при лечении некоторых хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта, таких как язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки, неспецифический язвенный колит, ишемический колит, болезнь Крона, а также операционные вмешательства на кишечнике с локальным удалением тканей и их осложнения.Manufacturing of a complex polymer structure, consisting of a porous framework filled with a hydrogel that contains probiotic bacteria, provides biological activity, viability and growth of probiotic bacteria acting as an active therapeutic agent. Such a structure of the bioengineering structure significantly increases the surface area and internal volume of the product both to ensure contact of probiotic bacteria with damaged tissues of the intestinal wall, and to protect them from pathogenic microflora in the treatment of certain chronic diseases of the gastrointestinal tract, such as duodenal ulcer, nonspecific ulcerative colitis, ischemic colitis, Crohn's disease, as well as bowel surgery with local tissue removal and their complications.
Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings
Предложенное изобретение характеризуется следующими графическими материалами.The proposed invention is characterized by the following graphic materials.
На фиг. 1 представлена схема разработанной биоинженерной конструкции. Конструкция состоит из пористой полимерной подложки (3), на поверхности которой иммобилизированы пористые микросферы (1), которые заполнены альгинатным гидрогелем (2), содержащим пробиотические бактерии (4).FIG. 1 shows a diagram of the developed bioengineering structure. The structure consists of a porous polymer substrate (3), on the surface of which porous microspheres (1) are immobilized, which are filled with an alginate hydrogel (2) containing probiotic bacteria (4).
На фиг. 2 представлена морфология поверхности биоинженерной конструкции, широкопольная световая микроскопия, ×400.FIG. 2 shows the surface morphology of a bioengineered structure, wide-field light microscopy, × 400.
Осуществление изобретенияImplementation of the invention
Используемые для получения полимерной пористой подложки и микросфер биоразлагаемые и биосовместимые полимеры: ПОБ и ПОБВ получены методом контролируемого биосинтеза с использованием высокоэффективного штамма-продуцента Azotobacter chroococcum 7Б [RU2194759, 20.12.2002; RU2201453, 27.03.2003; RU2307159, 27.09.2007; Bonartsev А.Р., Zharkova I.I., Yakovlev S.G., Myshkina V.L., Mahina Т.K., Voinova V.V., Zernov A.L., Zhuikov V.A., Akoulina E.A., Ivanova E.V., Kuznetsova E.S., Shaitan K.V., Bonartseva G.A. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate) copolymers by Azotobacter chroococcum 7B: a precursor feeding strategy. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2017, 47(2), 173-184]. Для биосинтеза бактериального альгината также использовали штамм-продуцент Azotobacter chroococcum 7Б [Бонарцева Г.А., Акулина Е.А., Мышкина В.Л., Воинова В.В., Махина Т.К., Бонарцев А.П. Биосинтез альгинатов бактериями рода Azotobacter. Прикладная биохимия и микробиология, 2017, 53(1), 61-68]. Оптическую плотность культуральной среды контролировали нефелометрически при 520 нм. Морфологию бактерий рода Azotobacter контролировали при помощи световой микроскопии с использованием микроскопа Биомед-1 («Биомед», Россия) с цифровой камерой. Для визуализации клеток и альгината использовали окраску фуксином. Эффективность очистки бактериального альгината контролируют при помощи измерения проводимости 1% (вес/об.) раствора альгината, используя кондуктометр S30 SevenEasyTM (Mettler Toledo, США). Молекулярную массу бактериального альгината определяют методом вискозиметрии; химическое строение и уровень ацетилирования определяют методом ИК-спектроскопии согласно [Бонарцева Г.А., Акулина Е.А., Мышкина В.Л., Воинова В.В., Махина Т.К., Бонарцев А.П. Биосинтез альгинатов бактериями рода Azotobacter. Прикладная биохимия и микробиология, 2017, 53(1), 61-68].Biodegradable and biocompatible polymers used to obtain a polymeric porous substrate and microspheres: PHB and PHBV were obtained by the method of controlled biosynthesis using the highly efficient producer strain Azotobacter chroococcum 7B [RU2194759, 20.12.2002; RU2201453, 27.03.2003; RU2307159, 27.09.2007; Bonartsev A.R., Zharkova I.I., Yakovlev S.G., Myshkina V.L., Mahina T.K., Voinova V.V., Zernov A.L., Zhuikov V.A., Akoulina E.A., Ivanova E.V., Kuznetsova E.S., Shaitan K.V., Bonartseva G.A. Biosynthesis of poly (3-hydroxybutyrate) copolymers by Azotobacter chroococcum 7B: a precursor feeding strategy. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2017, 47 (2), 173-184]. For the biosynthesis of bacterial alginate also used the producer strain Azotobacter chroococcum 7B [Bonartseva GA, Akulina EA, Myshkina VL, Voinova VV, Makhina TK, Bonartsev A.P. Biosynthesis of alginates by bacteria of the genus Azotobacter. Applied Biochemistry and Microbiology, 2017, 53 (1), 61-68]. The optical density of the culture medium was monitored nephelometrically at 520 nm. The morphology of bacteria of the genus Azotobacter was monitored by light microscopy using a Biomed-1 microscope (Biomed, Russia) with a digital camera. Fuchsin staining was used to visualize cells and alginate. The purification efficiency of bacterial alginate was monitored by measuring the conductivity of a 1% (w / v) alginate solution using an S30 SevenEasyTM conductometer (Mettler Toledo, USA). The molecular weight of bacterial alginate is determined by viscometry; the chemical structure and the level of acetylation are determined by IR spectroscopy according to [GA Bonartseva, EA Akulina, VL Myshkin, VV Voinova, TK Makhina, AP Bonartsev. Biosynthesis of alginates by bacteria of the genus Azotobacter. Applied Biochemistry and Microbiology, 2017, 53 (1), 61-68].
Все остальные используемые реагенты и штаммы пробиотических бактерий родов родов Lactobacillus и Bifidobacterium являются коммерчески доступными (ООО «Спутник-К»), все процедуры, если не оговорено особо, осуществляют при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°С, а культивирование пробиотических бактерий - при температуре 37±1°С. Микроструктуру биоинженерной конструкции (общая пористость, размер пор, диаметр полученных микросфер) контролировали с помощью сканирующей электронной микроскопии с использованием электронного микроскопа JSM-6380LA (Jeol, Япония) с предварительным напылением золота на исследуемые образцы в течение 15 мин с помощью установки IB-3 (Giko, Japan) при силе тока 15 мА и программы обработки изображений Image J. Общую пористость рассчитывали как отношение общего объема связных пор конструкции к ее общему объему. Рост культур контролируют методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, USA), морфологическую однородность проверяют при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой). Определение количества бактерий в полученной биоинженерной конструкции проводят по стандартной методике высева бактерий на плотную агаризованную питательную среду с последующим подсчетом выросших колоний; результаты выражают в колониеобразующих единицах (КОЕ) на 1 мл (КОЕ/мл) согласно [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»]. Термины: «биологически активный», «биоинженерный», «пробиотические бактерии», «пробиотики», «культивирование», «биосовместимый», «биоразлагаемый», «терапевтический» употребляются в соответствии с их общепринятыми определениями [Биосовместимые материалы: Учебное пособие / Под. ред. В.И. Севостьянова, М.П. Кирпичникова. Москва. Медицинское информационное агентство, 2011, 540 стр.; Пробиотики и пребиотики / Всемирная гастроэнтерологическая организация (WGO). Практические рекомендации. 2008. http://www.gastroscan.ru/literature/authors/5634].All other used reagents and strains of probiotic bacteria of the genera Lactobacillus and Bifidobacterium are commercially available (OOO Sputnik-K), all procedures, unless otherwise stated, are carried out at room temperature or ambient temperature, that is, in the range from 18 to 25 ° С, and cultivation of probiotic bacteria - at a temperature of 37 ± 1 ° С. The microstructure of the bioengineered structure (total porosity, pore size, diameter of the obtained microspheres) was monitored by scanning electron microscopy using a JSM-6380LA electron microscope (Jeol, Japan) with preliminary gold deposition on the samples under study for 15 min using an IB-3 ( Giko, Japan) at a current of 15 mA and Image J image processing software. The total porosity was calculated as the ratio of the total volume of connected pores of the structure to its total volume. The growth of cultures is controlled by nephelometry, determining the optical density at a wavelength of 600 nm on a spectrophotometer (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, USA), morphological homogeneity is checked using light microscopy (microscope Biomed-1, "Biomed", RF, with a digital camera ). Determination of the number of bacteria in the obtained bioengineering structure is carried out according to the standard method of seeding bacteria on a dense agar nutrient medium, followed by counting the grown colonies; the results are expressed in colony-forming units (CFU) per ml (CFU / ml) according to [GOST R 56139-2014 “Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "]. The terms “biologically active”, “bioengineered”, “probiotic bacteria”, “probiotics”, “cultivation”, “biocompatible”, “biodegradable”, “therapeutic” are used in accordance with their generally accepted definitions [Biocompatible materials: Study guide / Under ... ed. IN AND. Sevostyanova, M.P. Kirpichnikov. Moscow. Medical News Agency, 2011, 540 pp .; Probiotics and Prebiotics / World Gastroenterology Organization (WGO). Practical advice. 2008. http://www.gastroscan.ru/literature/authors/5634].
Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами выполнения, которые не являются единственно возможным, но наглядно демонстрирует возможность достижения требуемого технического результата.The present invention is illustrated by specific examples of execution, which are not the only possible, but clearly demonstrates the possibility of achieving the required technical result.
Пример 1.Example 1.
Изготовление биоинженерной конструкции проводят в несколько последовательных этапов.The manufacture of a bioengineered structure is carried out in several sequential stages.
На первом этапе способом контролируемого микробиологического биосинтеза также получали бактериальный альгинат. Для поддержания культуры бактерий использовали твердую питательную среду Эшби, следующего состава (г/л): K2HPO4 - 1,05; KH2PO4 - 0,2; MgSO4 - 0,2; NaCl - 0,2; Na2MoO4 - 0,006; СаСО3 - 5,0; сахароза - 20, агар - 20. Для биосинтеза альгината штамм-продуцент A. chroococcum 7Б [Патент РФ №2194759, 20.12.2002; Патент РФ №2201453, 27.03.2003; Патент РФ №2307159, 27.09.2007; Bonartsev А.Р., Zharkova I.I., Yakovlev S.G., Myshkina V.L., Mahina Т.K., Voinova V.V., Zernov A.L., Zhuikov V.A., Akoulina E.A., Ivanova E.V., Kuznetsova E.S., Shaitan K.V., Bonartseva G.A. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate) copolymers by Azotobacter chroococcum 7B: a precursor feeding strategy. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2017, 47(2), 173-184] культивировали в жидкой среде Берка следующего состава (г/л): KH2PO4 - 0,05; K2HPO4 - 0,05; MgSO4 - 0,4; NaCl - 0,1; FeSO4 - 0,01; Na2MoO4 - 0,06; CaCl2 - 0,1; цитрат натрия - 0,5; сахароза - 40. Сначала готовили посевной материал, для чего штамм-продуцент A. chroococcum 7Б выращивали в жидкой среде Берка указанного состава в качалочных колбах объемом 750 мл (со 100 мл среды) при 250 об./мин (исходный рН среды - 7,2; температура культивирования - 28°С) в течение 24 часов. Затем проводили биосинтез альгината штаммом-продуцентом A. chroococcum 7Б, для чего его культивировали в той же среде после внесения 4% (об.) посевного материала возрастом 24 часа в качалочных колбах на 750 мл (объем культуральной среды - 100 мл) на микробиологической качалке Innova 43 («New Brunswick Scientific», США) при скорости перемешивания 400 об./мин в течение 72 часов. Все процедуры проводили в стерильных условиях. Для выделения альгината проводили обработку биомассы штамма-продуцента 0,9% NaCl и 50 мМ ЭДТА, после чего проводили центрифугирование при 15000 g 30 мин. Осадок отделяли и промывали водой. Затем к нему добавляли 3-кратный объем 96% этилового спирта. Осадок снова отделяли и промывали водой. После этого проводили очистку полученного альгината. Для этого альгинат снова осаждали 3-кратным объемом 96% этилового спирта и проводили диализ против 0.5% NaCl в течение 24 h. Осадок снова отделяли и высушивали при помощи лиофильной сушки. Полученный порошок хранят при 4°С не более 3-х месяцев. Полученный альгинат обладал следующим сочетанием параметров: молекулярной массой (определяемой методом визкозиметрии) 1×105 г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере - 36% и уровнем ацетилирования - 23% (определяемых методом ИК-спектроскопии).At the first stage, bacterial alginate was also obtained by the method of controlled microbiological biosynthesis. To maintain the culture of bacteria used a solid nutrient medium Ashby, the following composition (g / l): K 2 HPO 4 - 1.05; KH 2 PO 4 0.2; MgSO 4 0.2; NaCl 0.2; Na 2 MoO 4 - 0.006; CaCO 3 - 5.0; sucrose - 20, agar - 20. For the biosynthesis of alginate, the producer strain A. chroococcum 7B [RF Patent No. 2194759, 20.12.2002; RF patent No. 2201453, 27.03.2003; RF patent No. 2307159, September 27, 2007; Bonartsev A.R., Zharkova II, Yakovlev SG, Myshkina VL, Mahina T.K., Voinova VV, Zernov AL, Zhuikov VA, Akoulina EA, Ivanova EV, Kuznetsova ES, Shaitan KV, Bonartseva GA Biosynthesis of poly (3- hydroxybutyrate) copolymers by Azotobacter chroococcum 7B: a precursor feeding strategy. Preparative Biochemistry and Biotechnology, 2017, 47 (2), 173-184] were cultured in Burk's liquid medium of the following composition (g / l): KH 2 PO 4 - 0.05; K 2 HPO 4 - 0.05; MgSO 4 0.4; NaCl - 0.1; FeSO 4 - 0.01; Na 2 MoO 4 - 0.06; CaCl 2 - 0.1; sodium citrate - 0.5; sucrose - 40. First, the inoculum was prepared, for which the producer strain A. chroococcum 7B was grown in Burk's liquid medium of the specified composition in 750 ml shaking flasks (with 100 ml of medium) at 250 rpm (initial pH of the medium - 7, 2; cultivation temperature - 28 ° C) for 24 hours. Then, biosynthesis of alginate was carried out by the producer strain A. chroococcum 7B, for which it was cultured in the same medium after adding 4% (vol.) Inoculum aged 24 hours in shaking flasks of 750 ml (the volume of the culture medium is 100 ml) on a microbiological shaker Innova 43 (New Brunswick Scientific, USA) at a stirring speed of 400 rpm for 72 hours. All procedures were performed under sterile conditions. To isolate alginate, the biomass of the producer strain was treated with 0.9% NaCl and 50 mM EDTA, after which centrifugation was performed at 15000 g for 30 min. The precipitate was separated and washed with water. Then a 3-fold volume of 96% ethyl alcohol was added thereto. The precipitate was again separated and washed with water. After that, the resulting alginate was purified. For this, the alginate was again precipitated with a 3-fold volume of 96% ethanol and dialysis was performed against 0.5% NaCl for 24 h. The precipitate was again separated and dried by freeze-drying. The resulting powder is stored at 4 ° C for no more than 3 months. The resulting alginate had the following combination of parameters: molecular weight (determined by viscosimetry) 1 × 10 5 g / mol, molar content of guluronic acid residues in the polymer - 36%, and acetylation level - 23% (determined by IR spectroscopy).
На 2-ом этапе выращивали пробиотические бактерии Lactobacillus plantarum 8Р-А3 (ООО «Спутник-К»). На полужидкой среде культуру L. plantarum 8Р-А3 выращивали в конических колбах на 250 мл, содержащих 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара. В колбы наливали питательную среду, укупоривали ватно-марлевыми пробками и автоклавировали. Готовую среду не хранят. Посев осуществляли, как только температура среды после автоклавирования достигала 40°С.At the 2nd stage, the probiotic bacteria Lactobacillus plantarum 8P-A3 (OOO Sputnik-K) were grown. On a semi-liquid medium, the culture of L. plantarum 8P-A3 was grown in 250 ml conical flasks containing 200 ml of MRS broth and 0.3% agar-agar. The culture medium was poured into the flasks, sealed with cotton-gauze stoppers and autoclaved. The finished medium is not stored. The inoculation was carried out as soon as the temperature of the medium after autoclaving reached 40 ° C.
Для посева готовят жидкую посевную культуру. Для этого в пробирку с культурой, растущей на скошенном MRS-arape, вносили 3 мл MRS-бульона. Снимали клетки с поверхности твердой среды путем повторного пипетирования и переносили полученную суспензию в колбу, содержащую 150 мл питательной среды. Колбу с жидкой посевной культурой инкубировали 96 часа в аэробных условиях на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). Рост культуры контролировали методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, торговая марка Microsoft Corporation, USA.), морфологическую однородность проверяли при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой).A liquid seed culture is prepared for sowing. For this, 3 ml of MRS broth was added to a test tube with a culture growing on a slant MRS-arape. The cells were removed from the surface of the solid medium by repeated pipetting and the resulting suspension was transferred into a flask containing 150 ml of culture medium. A flask with a liquid seed culture was incubated for 96 hours under aerobic conditions on a microbiological shaker at 37 ° C and a stirring speed of 120 rpm (orbital diameter 1.9 cm). The growth of the culture was monitored by nephelometry, determining the optical density at a wavelength of 600 nm on a spectrophotometer (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, trademark of Microsoft Corporation, USA.), Morphological homogeneity was checked using light microscopy (microscope Biomed-1, "Biomed" , RF, with a digital camera).
В конической колбе на 250 мл готовили 1% (вес.) раствор альгината, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 60°С и скорости перемешивания 60 об/мин. Для получения биомассы L. plantarum на жидкой среде в аэробных условиях 6 мл жидкой посевной культуры (5×108 КОЕ/г) вносили в коническую колбу, содержащую полученный 1% раствор альгината в 150 мл MRS-бульона, и инкубировали 96 час на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). После окончания инкубации биомассу осаждали центрифугированием 15 мин при 10000g на центрифуге «Beckman J2-21». Супернатант сливали. Все процедуры проводили в стерильных условиях.In a 250 ml conical flask, a 1% (wt.) Solution of microbiologically obtained alginate was prepared in 150 ml of MRS broth on a magnetic stirrer with heating at 60 ° C and a stirring speed of 60 rpm. To obtain L. plantarum biomass on a liquid medium under aerobic conditions, 6 ml of a liquid seed culture (5 × 10 8 CFU / g) was introduced into a conical flask containing the obtained 1% alginate solution in 150 ml of MRS broth, and incubated for 96 hours in a microbiological rocking chair at 37 ° C and stirring speed 120 rpm (orbital diameter 1.9 cm). After the end of the incubation, the biomass was precipitated by centrifugation for 15 min at 10000g on a Beckman J2-21 centrifuge. The supernatant was discarded. All procedures were performed under sterile conditions.
Из полученного таким образом ранее бактериального капсулярного альгината натрия с выращенной в нем биомассой пробиотических бактерий изготавливали гранулы. Для этого автоматической пипеткой на 100 мкл в стеклянный стакан со 100 мл 50 мМ раствора хлорида кальция по каплям (10-30 мкл) вносили раствор альгината, содержащего бактерии.Granules were prepared from the previously obtained bacterial capsular sodium alginate with the biomass of probiotic bacteria grown in it. For this, a solution of alginate containing bacteria was added dropwise (10-30 μl) into a glass beaker with 100 ml of 50 mM calcium chloride solution with an automatic pipette of 100 μl.
Полученные гранулы имели диаметр от 0,2 до 1 мм и содержали пробиотические бактерии в концентрации 2,1×108 КОЕ/г бактерий L. plantarum 8Р-А3. Таким образом, произошло увеличение содержания живых бактерий в гранулах против первоначального (1,9×107 КОЕ/г) в 11,1 раза по сравнению с падением содержания бактерий в композиции, описанной в патенте-прототипе, в 11 раз с 1×108 КОЕ/г до 8,8×106 КОЕ/г.The resulting granules had a diameter of 0.2 to 1 mm and contained probiotic bacteria at a concentration of 2.1 × 10 8 CFU / g of L. plantarum 8P-A3 bacteria. Thus, there was an increase in the content of living bacteria in the granules against the initial (1.9 × 10 7 CFU / g) 11.1 times compared to the drop in the content of bacteria in the composition described in the prototype patent, 11 times from 1 × 10 8 CFU / g to 8.8 × 10 6 CFU / g.
Тест устойчивости конструкции при температуре 37°С показал отсутствие ее деформации. В тесте устойчивости в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала сохранение 2,1×108 КОЕ/г бактерий L. plantarum 8Р-А3, т.е 98% выживаемость бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием альгинат лиазы в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала 51% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием лизоцима в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 59% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте ферментативной устойчивости с использованием липазы в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 61% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте устойчивости в среде чужеродных бактерий полученные биоинженерные конструкции обеспечивали присутствие не более 3% чужеродных бактерий Е. coli BL21. В тесте миграции бактерий из гидрогеля гидрогель обеспечивал распространение бактерий на расстояние 8 мм от образца. Оценка всех тестов проводилась по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»]. Тест исследования на цитотоксичность in vitro полученной конструкции показал, что он не является цитотоксичным, а именно, обладает баллом «0» по шкале цитотоксичности [ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro»].The stability test of the structure at a temperature of 37 ° C showed no deformation. In the resistance test in a simulated intestinal environment, the resulting construct ensured the retention of 2.1 × 10 8 CFU / g of L. plantarum 8P-A3 bacteria, i.e. 98% bacterial survival, assessed by the standard method for determining the CFU number in comparison with the control bacterial preparation. encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using alginate lyase in a simulated intestinal environment, the resulting construct provided a 51% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the CFU number in comparison with the control preparation of bacteria encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using lysozyme in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided a 59% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the test of enzymatic resistance using lipase in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided a 61% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the test of resistance in the environment of foreign bacteria, the obtained bioengineering constructs ensured the presence of no more than 3% of foreign bacteria E. coli BL21. In the test for bacteria migration from the hydrogel, the hydrogel allowed bacteria to spread to a distance of 8 mm from the sample. Evaluation of all tests was carried out according to the standard method for determining the number of CFU in the structure [GOST R 56139-2014 “Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "]. An in vitro cytotoxicity test of the resulting construct showed that it is not cytotoxic, namely, it has a score of “0” on the cytotoxicity scale [GOST ISO 10993-1-2011 “Medical devices. Assessment of the biological effect of medical devices. Part 5. Testing for cytotoxicity: in vitro methods "].
Пример 2.Example 2.
Изготовление биоинженерной конструкции проводят в несколько последовательных этапов.The manufacture of a bioengineered structure is carried out in several sequential stages.
На первом этапе способом контролируемого микробиологического биосинтеза также получают бактериальный альгинат. Для поддержания культуры бактерий используют твердую питательную среду Эшби, следующего состава (г/л): K2HPO4 - 1,05; KH2PO4 - 0,2; MgSO4 - 0,2; NaCl - 0,2; Na2MoO4 - 0,006; СаСО3 - 5,0; сахароза - 20, агар - 20. Для биосинтеза альгината штамм-продуцент A. chroococcum 7Б культивируют в жидкой среде Берка следующего состава (г/л): KH2PO4 - 0,05; K2HPO4 - 0,05; MgSO4 - 0,4; NaCl - 0,1; FeSO4 - 0,01; Na2Mo04 - 0,06; CaCl2 - 0,1; цитрат натрия - 0,5; сахароза - 20. Сначала готовят посевной материал, для чего штамм-продуцент A. chroococcum 7Б выращивают в жидкой среде Берка указанного состава в качалочных колбах объемом 750 мл (со 100 мл среды) при 250 об./мин (исходный рН среды - 7,2; температура культивирования - 28°С) в течение 24 часов. Затем проводят биосинтез альгината штаммом-продуцентом A. chroococcum 7Б, для чего его культивируют в той же среде после внесения 4% (об.) посевного материала возрастом 24 часа в качалочных колбах на 750 мл (объем культуральной среды - 100 мл) на микробиологической качалке Innova 43 («New Brunswick Scientific», США) при скорости перемешивания 200 об./мин в течение 72 часов. Все процедуры проводят в стерильных условиях. Для выделения альгината проводят обработку биомассы штамма-продуцента 0,9% NaCl и 50 мМ ЭДТА, после чего проводят центрифугирование при 15000 g 30 мин. Осадок отделяют и промывают водой. Затем к нему добавляют 3-кратный объем 96% этилового спирта. Осадок снова отделяют и промывают водой. После этого проводят очистку полученного альгината. Для этого альгинат снова осаждают 3-кратным объемом 96% этилового спирта и проводят диализ против 0.5% NaCl в течение 24 h. Осадок снова отделяют и высушивают при помощи лиофильной сушки. Полученный порошок хранят при 4°С не более 3-х месяцев.At the first stage, bacterial alginate is also obtained by the method of controlled microbiological biosynthesis. To maintain the culture of bacteria, use Ashby's solid nutrient medium of the following composition (g / l): K 2 HPO 4 - 1.05; KH 2 PO 4 0.2; MgSO 4 0.2; NaCl 0.2; Na 2 MoO 4 - 0.006; CaCO 3 - 5.0; sucrose - 20, agar - 20. For the biosynthesis of alginate, the producer strain A. chroococcum 7B is cultivated in Burk's liquid medium of the following composition (g / l): KH 2 PO 4 - 0.05; K 2 HPO 4 - 0.05; MgSO 4 0.4; NaCl - 0.1; FeSO 4 - 0.01; Na 2 Mo0 4 - 0.06; CaCl 2 - 0.1; sodium citrate - 0.5; sucrose - 20. First, the inoculum is prepared, for which the producer strain A. chroococcum 7B is grown in Burk's liquid medium of the specified composition in 750 ml shaking flasks (from 100 ml of medium) at 250 rpm (initial pH of the medium is 7, 2; cultivation temperature - 28 ° C) for 24 hours. Then biosynthesis of alginate is carried out by the producer strain A. chroococcum 7B, for which it is cultivated in the same medium after adding 4% (vol.) Of inoculum aged 24 hours in shaking flasks of 750 ml (volume of culture medium - 100 ml) on a microbiological shaker Innova 43 (New Brunswick Scientific, USA) at a stirring speed of 200 rpm for 72 hours. All procedures are performed under sterile conditions. To isolate alginate, the biomass of the producer strain is treated with 0.9% NaCl and 50 mM EDTA, after which centrifugation is carried out at 15000 g for 30 minutes. The precipitate is separated and washed with water. Then a 3-fold volume of 96% ethyl alcohol is added to it. The precipitate is again separated and washed with water. After that, the resulting alginate is purified. For this, the alginate is again precipitated with a 3-fold volume of 96% ethanol and dialysis is performed against 0.5% NaCl for 24 h. The precipitate is again separated and dried using a freeze dryer. The resulting powder is stored at 4 ° C for no more than 3 months.
Полученный альгинат обладает следующим сочетанием параметров: молекулярной массой (определяемой методом визкозиметрии) 2,6×105 г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере - 46% и уровнем ацетилирования - 24% (определяемых методом ИК-спектроскопии).The resulting alginate has the following combination of parameters: molecular weight (determined by viscosimetry) 2.6 × 10 5 g / mol, molar content of guluronic acid residues in the polymer - 46% and acetylation level - 24% (determined by IR spectroscopy).
На 2-м этапе готовят рабочие растворы бактериальных полимеров. Готовят раствор поли-3-оксибутирата (ПОБ) с молекулярной массой 3.2×105 г/моль, полученного бактериальным биосинтезом, в общей концентрации 112,5 мг/мл (вес./об.) в объеме 8 мл в стеклянном стакане на 50 мл, для чего готовят навеску в 90 мг. Готовят раствор поли-3-оксибутират-со-3-оксивалета (ПОБВ) с молярным содержанием 3-оксивалерата 17,6% и с молекулярной массой 1.15×106 г/моль, полученного бактериальным биосинтезом, в концентрации 24 мг/мл в хлороформе в общей концентрации 112,5 мг/мл (вес./об.) в объеме 8 мл в стеклянном стакане на 50 мл, для чего готовят навеску в 90 мг.At the second stage, working solutions of bacterial polymers are prepared. Prepare a solution of poly-3-hydroxybutyrate (PHB) with a molecular weight of 3.2 × 10 5 g / mol, obtained by bacterial biosynthesis, at a total concentration of 112.5 mg / ml (w / v) in a volume of 8 ml in a glass beaker of 50 ml, for which a sample of 90 mg is prepared. Prepare a solution of poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalet (PHBV) with a molar content of 3-hydroxyvalerate of 17.6% and a molecular weight of 1.15 × 10 6 g / mol, obtained by bacterial biosynthesis, at a concentration of 24 mg / ml in chloroform in a total concentration of 112.5 mg / ml (w / v) in a volume of 8 ml in a 50 ml glass beaker, for which a 90 mg portion is prepared.
На 3-м этапе изготавливают пористые подложки биоинженерной конструкции модифицированным методом выщелачивания. Раствор ПОБВ 17,6% 1150 кДа в хлороформе в концентрации 24 мг/мл смешивают с порошком бикарбоната аммония (с размером частиц соли в диапазоне 90-300 мкм в соотношении 10:1 по массе и тщательно перемешивают шпателем. Смесь помещают в стеклянную чашку Петри диаметром 5 см и оставляют при комнатной температуре до полного испарения органического растворителя в течение 3-х часов. После этого форму помещают в горячую дистиллированную воду (60°С) до полного прекращения газообразования, промывают дистиллированной водой 5 раз и высушивают при 37°С в течение суток.At the third stage, porous substrates of a bioengineered structure are made by a modified leaching method. A solution of PHBV 17.6% 1150 kDa in chloroform at a concentration of 24 mg / ml is mixed with ammonium bicarbonate powder (with a salt particle size in the range of 90-300 microns in a ratio of 10: 1 by weight and thoroughly mixed with a spatula. The mixture is placed in a glass Petri dish with a diameter of 5 cm and left at room temperature until the organic solvent has completely evaporated for 3 hours.Then the mold is placed in hot distilled water (60 ° C) until gassing completely ceases, washed with distilled water 5 times and dried at 37 ° C for during the day.
На 4-м этапе получают пористые микросферы со средним диаметром 160 мкм при помощи метода «водная фаза/масляная фаза/водная фаза» (W/O/W), с последующим вымыванием порообразователя. В качестве пороборазователя также используют водный раствор карбоната аммония. 21 мл хлороформенного раствора ПОБ 350 кДа в концентрации 40 мг/мл гомогенизировуют с 6,6 мл 5%-го (вес/об.) водного раствора карбоната аммония. Полученный коллоид по каплям добавляют в 210 мл 1%-го (вес./об.) раствора поливинилового спирта при постоянном перемешивании на верхнеприводной мешалке при скорости 750 об/мин. После полного испарения хлороформа частицы отделяют от эмульгатора (ПВС) путем осаждения и промывки дистиллированной водой. Для полного выхода порообразователя, микросферы инкубируют в горячей дистиллированной воде (70°С). Получают микросферы со средним диаметром 160±30 мкм, обладающие сквозной пористостью с пренебрежительно малой долей закрытых пор, общую пористость 94% и средним размером пор 1,8±0,5 мкм Из полученной пористой пленки вырезают кусочки длиной 2,5 см и шириной 2 см. Полученный кусок сворачивают в трубку. Края пленки склеивают с помощью раствора ПОБ в хлороформе и наносят на поверхность трубки слой микросфер, для чего на поверхность пленки, не дожидаясь ее высыхания, плотным слоем насыпают микросферы и оставляют сушиться в течение 24 час. Готовые двуслойные подложки со слоем пористых микросфер нарезают на кусочки необходимых размеров и трижды промывают стерильным буферным раствором 4-5 раз не менее 2 часов.At the 4th stage, porous microspheres with an average diameter of 160 μm are obtained using the "water phase / oil phase / water phase" (W / O / W) method, followed by washing out the blowing agent. An aqueous solution of ammonium carbonate is also used as a blowing agent. 21 ml of a chloroform solution of PHB 350 kDa at a concentration of 40 mg / ml is homogenized with 6.6 ml of a 5% (w / v) aqueous solution of ammonium carbonate. The resulting colloid is added dropwise to 210 ml of a 1% (w / v) solution of polyvinyl alcohol with constant stirring on an overhead stirrer at a speed of 750 rpm. After complete evaporation of chloroform, the particles are separated from the emulsifier (PVA) by precipitation and washing with distilled water. For a complete exit of the blowing agent, the microspheres are incubated in hot distilled water (70 ° C). Microspheres with an average diameter of 160 ± 30 μm are obtained, having a through porosity with a negligible fraction of closed pores, a total porosity of 94% and an average pore size of 1.8 ± 0.5 μm. Pieces of 2.5 cm in length and 2 in width are cut from the obtained porous film. see The resulting piece is rolled into a tube. The edges of the film are glued with a PHB solution in chloroform and a layer of microspheres is applied to the surface of the tube, for which microspheres are poured onto the surface of the film, without waiting for it to dry, and left to dry for 24 hours. Ready two-layer substrates with a layer of porous microspheres are cut into pieces of the required size and washed three times with sterile buffer solution 4-5 times for at least 2 hours.
На следующем этапе выращивают пробиотические бактерии Lactobacillus plantarum 8Р-А3 (ООО «Спутник-К»). На полужидкой среде культуру L. plantarum 8Р-А3 выращивают в конических колбах на 250 мл, содержащих 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара. В колбы наливают питательную среду, укупоривают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют. Готовую среду не хранят. Посев осуществляют, как только температура среды после автоклавирования достигает 40°С.At the next stage, the probiotic bacteria Lactobacillus plantarum 8P-A3 (Sputnik-K LLC) are grown. On a semi-liquid medium, the culture of L. plantarum 8P-A3 is grown in 250 ml conical flasks containing 200 ml of MRS broth and 0.3% agar-agar. The culture medium is poured into the flasks, sealed with cotton-gauze stoppers and autoclaved. The finished medium is not stored. Sowing is carried out as soon as the temperature of the medium after autoclaving reaches 40 ° C.
Для посева готовят жидкую посевную культуру. Для этого в пробирку с культурой, растущей на скошенном MRS-агаре, вносят 3 мл MRS-бульона. Снимают клетки с поверхности твердой среды путем повторного пипетирования и переносят полученную суспензию в колбу, содержащую 150 мл питательной среды. Колбу с жидкой посевной культурой (5×108 КОЕ/г) инкубируют 96 часа в аэробных условиях на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). Рост культуры контролируют методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, торговая марка Microsoft Corporation, USA.), морфологическую однородность проверяют при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой).A liquid seed culture is prepared for sowing. For this, 3 ml of MRS broth is added to a test tube with a culture growing on a slant MRS-agar. The cells are removed from the surface of the solid medium by repeated pipetting and the resulting suspension is transferred into a flask containing 150 ml of culture medium. A flask with a liquid seed culture (5 × 10 8 CFU / g) is incubated for 96 hours under aerobic conditions on a microbiological shaker at 37 ° C and a stirring speed of 120 rpm (orbital diameter 1.9 cm). The growth of the culture is monitored by nephelometry, by determining the optical density at a wavelength of 600 nm on a spectrophotometer (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, trademark of Microsoft Corporation, USA.), Morphological homogeneity is checked using light microscopy (microscope Biomed-1, "Biomed" , RF, with a digital camera).
В конической колбе на 250 мл готовят 1% (вес.) раствор альгината, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 60°С и скорости перемешивания 60 об/мин. Для получения биомассы L. plantarum на жидкой среде в аэробных условиях 6 мл жидкой посевной культуры вносят в коническую колбу, содержащую полученный 1% раствор альгината в 150 мл MRS-бульона, и инкубируют 96 час на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). После окончания инкубации биомассу осаждают центрифугированием 15 мин при 10000g на центрифуге «Beckman J2-21». Супернатант сливают. Все процедуры проводят в стерильных условиях.In a 250 ml conical flask, a 1% (wt.) Solution of microbiologically obtained alginate is prepared in 150 ml of MRS broth on a magnetic stirrer with heating at 60 ° C and a stirring speed of 60 rpm. To obtain L. plantarum biomass on a liquid medium under aerobic conditions, 6 ml of a liquid seed culture is introduced into a conical flask containing the resulting 1% alginate solution in 150 ml of MRS broth, and incubated for 96 hours on a microbiological shaker at 37 ° C and a stirring speed of 120 rpm (orbit diameter 1.9 cm). After the end of the incubation, the biomass is precipitated by centrifugation for 15 minutes at 10000g on a Beckman J2-21 centrifuge. The supernatant is discarded. All procedures are performed under sterile conditions.
На следующем этапе в биомассу L. plantarum в бактериальном альгинате вводят интерлейкин 10 (ИЛ-10). Для этого готовят раствор ИЛ-10 в воде в концентрации 1 мг/мл и на стадии завершения выращивания бактерий в бактериальном альгинате добавляют в 99 мл раствора полимера, содержащего бактерии, раствор ИЛ-10 в объеме 1 мл для достижения массовой доли ИЛ-10 в полученном полимерном изделии 0,0001% (вес.).At the next stage, interleukin 10 (IL-10) is introduced into the biomass of L. plantarum in bacterial alginate. To do this, prepare a solution of IL-10 in water at a concentration of 1 mg / ml and, at the stage of completion of the cultivation of bacteria in bacterial alginate, add a solution of IL-10 in a volume of 1 ml to 99 ml of a polymer solution containing bacteria to achieve the mass fraction of IL-10 in the resulting polymer product 0.0001% (wt.).
На последнем этапе полученную пористую конструкцию на основе ПОБ/ПОБВ заполняют раствором полученного ранее бактериального капсулярного альгината натрия, содержащего пробиотические бактерии. Для этой процедуры конструкцию на основе ПОБ/ПОБВ помещают в 100 мл жидкой биомассы бактерий L. plantarum 8Р-А3 и ИЛ-10 в культуральной среде MRS, содержащей 1% альгината натрия, а емкость с ней в эксикатор, где создают отрицательное давление для вымещения воздуха из пор микросфер и подложки и замещения их раствором среды. Внешне процесс заполнения пор микросфер при этих условиях выглядит как образование множества микропузырьков воздуха вокруг микросфер. Затем проводят гелирование альгината, для чего конструкцию, пропитанную раствором альгината натрия помещают в стеклянный стакан со 100 мл 50 мМ раствора хлорида кальция на 10 мин.At the last stage, the obtained porous structure based on PHB / PHBV is filled with a solution of the previously obtained bacterial capsular sodium alginate containing probiotic bacteria. For this procedure, the PHB / PHBV-based construct is placed in 100 ml of liquid biomass of L. plantarum 8P-A3 and IL-10 bacteria in MRS culture medium containing 1% sodium alginate, and a container with it into a desiccator, where negative pressure is created to displace air from the pores of the microspheres and the substrate and replacing them with a solution of the medium. Outwardly, the process of filling the pores of the microspheres under these conditions looks like the formation of many microbubbles of air around the microspheres. Then the alginate is gelled, for which the structure impregnated with sodium alginate solution is placed in a glass beaker with 100 ml of 50 mM calcium chloride solution for 10 minutes.
Таким образом, получают биоинженерную композитную полимерную конструкцию в форме трубки длиной 25 мм и диаметром 6 мм, содержащую 1,2×108 КОЕ/г бактерий L. plantarum 8Р-А3. Таким образом, произошло увеличение содержания живых бактерий в конструкции против первоначального (1,9×107 КОЕ/г) в 6,3 раз по сравнению с падением содержания бактерий в композиции, описанной в патенте-прототипе, в 11 раз с 1×108 КОЕ/г до 8,8×106 КОЕ/г.Thus, a bioengineered composite polymer structure is obtained in the form of a tube 25 mm long and 6 mm in diameter, containing 1.2 × 10 8 CFU / g of L. plantarum 8P-A3 bacteria. Thus, there was an increase in the content of living bacteria in the structure against the initial (1.9 × 10 7 CFU / g) by 6.3 times as compared to the drop in the content of bacteria in the composition described in the prototype patent, 11 times from 1 × 10 8 CFU / g to 8.8 × 10 6 CFU / g.
Тест устойчивости конструкции при температуре 37°С показал отсутствие ее деформации. В тесте устойчивости в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала сохранение 1,2×108 КОЕ/г бактерий L. plantarum 8Р-А3, т.е 99% выживаемость бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием альгинат лиазы в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала 54% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием лизоцима в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 67% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте ферментативной устойчивости с использованием липазы в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 79% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте устойчивости в среде чужеродных бактерий полученные биоинженерные конструкции обеспечивали не более 1% чужеродных бактерий Е. coli BL21 в гидрогеле. В тесте миграции бактерий из гидрогеля гидрогель обеспечивал распространение бактерий на расстояние 3 мм от образца. Оценка всех тестов проводилась по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»]. Тест исследования на цитотоксичность in vitro полученной конструкции показал, что он не является цитотоксичным, а именно, обладает баллом «0» по шкале цитотоксичности [ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro»].The stability test of the structure at a temperature of 37 ° C showed no deformation. In the resistance test in a simulated intestinal environment, the resulting construct ensured the preservation of 1.2 × 10 8 CFU / g of L. plantarum 8P-A3 bacteria, i.e., 99% bacterial survival, assessed by the standard method for determining the CFU number in comparison with the control bacterial preparation. encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using alginate lyase in a simulated intestinal environment, the resulting construct provided a 54% increase in the survival of bacteria, assessed by the standard method for determining the number of CFUs in comparison with a control preparation of bacteria encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using lysozyme in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided a 67% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the test of enzymatic resistance using lipase in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided a 79% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the test of resistance in the environment of foreign bacteria, the obtained bioengineering constructs provided no more than 1% of foreign bacteria E. coli BL21 in the hydrogel. In the test for bacteria migration from the hydrogel, the hydrogel allowed bacteria to spread to a distance of 3 mm from the sample. Evaluation of all tests was carried out according to the standard method for determining the number of CFU in the structure [GOST R 56139-2014 “Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "]. An in vitro cytotoxicity test of the resulting construct showed that it is not cytotoxic, namely, it has a score of “0” on the cytotoxicity scale [GOST ISO 10993-1-2011 “Medical devices. Assessment of the biological effect of medical devices. Part 5. Testing for cytotoxicity: in vitro methods "].
Пример 3.Example 3.
Изготовление биоинженерной конструкции проводят в несколько последовательных этапов.The manufacture of a bioengineered structure is carried out in several sequential stages.
На первом этапе способом контролируемого микробиологического биосинтеза также получают бактериальный альгинат. Для поддержания культуры бактерий используют твердую питательную среду Эшби, следующего состава (г/л): K2HPO4 - 1,05; KH2PO4 - 0,2; MgSO4 - 0,2; NaCl - 0,2; Na2MoO4 - 0,006; СаСО3 - 5,0; сахароза - 20, агар - 20. Для биосинтеза альгината штамм-продуцент A. chroococcum 7Б культивируют в жидкой среде Берка следующего состава (г/л): KH2PO4 - 0,05; K2HPO4 - 0,05; MgSO4 - 0,4; NaCl - 0,1; FeSO4 - 0,01; Na2MoO4 - 0,06; СаС12 - 0,1; цитрат натрия - 0,5; сахароза - 40. Сначала готовят посевной материал, для чего штамм-продуцент A. chroococcum 7Б выращивают в жидкой среде Берка указанного состава в качалочных колбах объемом 750 мл (со 100 мл среды) при 250 об./мин (исходный рН среды - 7,2; температура культивирования - 28°С) в течение 24 часов. Затем проводят биосинтез альгината штаммом-продуцентом A. chroococcum 7Б, для чего его культивируют в той же среде после внесения 4% (об.) посевного материала возрастом 24 часа в качалочных колбах на 750 мл (объем культуральной среды - 100 мл) на микробиологической качалке Innova 43 («New Brunswick Scientific)), США) при скорости перемешивания 200 об./мин в течение 72 часов. Все процедуры проводят в стерильных условиях. Для выделения альгината проводят обработку биомассы штамма-продуцента 0,9% NaCl и 50 мМ ЭДТА, после чего проводят центрифугирование при 15000 g 30 мин. Осадок отделяют и промывают водой. Затем к нему добавляют 3-кратный объем 96% этилового спирта. Осадок снова отделяют и промывают водой. После этого проводят очистку полученного альгината. Для этого альгинат снова осаждают 3-кратным объемом 96% этилового спирта и проводят диализ против 0.5% NaCl в течение 24 h. Осадок снова отделяют и высушивают при помощи лиофильной сушки. Полученный порошок хранят при 4°С не более 3-х месяцев. Полученный альгинат обладает следующим сочетанием параметров: молекулярной массой (определяемой методом визкозиметрии) 7,6×105 г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере - 31% и уровнем ацетилирования - 48% (определяемых методом ИК-спектроскопии).At the first stage, bacterial alginate is also obtained by the method of controlled microbiological biosynthesis. To maintain the culture of bacteria, use Ashby's solid nutrient medium of the following composition (g / l): K 2 HPO 4 - 1.05; KH 2 PO 4 0.2; MgSO 4 0.2; NaCl 0.2; Na 2 MoO 4 - 0.006; CaCO 3 - 5.0; sucrose - 20, agar - 20. For the biosynthesis of alginate, the producer strain A. chroococcum 7B is cultivated in Burk's liquid medium of the following composition (g / l): KH 2 PO 4 - 0.05; K 2 HPO 4 - 0.05; MgSO 4 0.4; NaCl - 0.1; FeSO 4 - 0.01; Na 2 MoO 4 - 0.06; CaCl 2 - 0.1; sodium citrate - 0.5; sucrose - 40. First, the inoculum is prepared, for which the producer strain A. chroococcum 7B is grown in Burk's liquid medium of the specified composition in 750 ml shaking flasks (from 100 ml of medium) at 250 rpm (initial pH of the medium is 7, 2; cultivation temperature - 28 ° C) for 24 hours. Then biosynthesis of alginate is carried out by the producer strain A. chroococcum 7B, for which it is cultivated in the same medium after adding 4% (vol.) Of inoculum aged 24 hours in shaking flasks of 750 ml (volume of culture medium - 100 ml) on a microbiological shaker Innova 43 (New Brunswick Scientific), USA) at a stirring speed of 200 rpm for 72 hours. All procedures are performed under sterile conditions. To isolate alginate, the biomass of the producer strain is treated with 0.9% NaCl and 50 mM EDTA, after which centrifugation is carried out at 15000 g for 30 minutes. The precipitate is separated and washed with water. Then a 3-fold volume of 96% ethyl alcohol is added to it. The precipitate is again separated and washed with water. After that, the resulting alginate is purified. For this, the alginate is again precipitated with a 3-fold volume of 96% ethanol and dialysis is performed against 0.5% NaCl for 24 h. The precipitate is again separated and dried using a freeze dryer. The resulting powder is stored at 4 ° C for no more than 3 months. The resulting alginate has the following combination of parameters: molecular weight (determined by viscosimetry) 7.6 × 10 5 g / mol, molar content of guluronic acid residues in the polymer - 31% and acetylation level - 48% (determined by IR spectroscopy).
На 2-ом этапе готовят рабочие растворы бактериальных полимеров. Готовят раствор поли-3-оксибутирата (ПОБ) с молекулярной массой 5.3×105 г/моль, полученного бактериальным биосинтезом, в общей концентрации 112,5 мг/мл (вес./об.) в объеме 8 мл в стеклянном стакане на 50 мл, для чего готовят навеску в 90 мг. Готовят раствор ПОБВ с молярным содержанием 3-оксивалерата 9,0% и с молекулярной массой 8.5×105 г/моль, полученного бактериальным биосинтезом, в концентрации 24 мг/мл в хлороформе в общей концентрации 112,5 мг/мл (вес./об.) в объеме 8 мл в стеклянном стакане на 50 мл, для чего готовят навеску в 90 мг. Готовят раствор симвастатина в 1 мл хлороформа в концентрации 9 мг/мл, для чего готовят навеску в 9 мг.At the second stage, working solutions of bacterial polymers are prepared. Prepare a solution of poly-3-hydroxybutyrate (PHB) with a molecular weight of 5.3 × 10 5 g / mol, obtained by bacterial biosynthesis, at a total concentration of 112.5 mg / ml (w / v) in a volume of 8 ml in a glass beaker of 50 ml, for which a sample of 90 mg is prepared. Prepare a PHBV solution with a molar content of 3-hydroxyvalerate of 9.0% and a molecular weight of 8.5 × 10 5 g / mol, obtained by bacterial biosynthesis, at a concentration of 24 mg / ml in chloroform at a total concentration of 112.5 mg / ml (w / vol.) in a volume of 8 ml in a glass beaker of 50 ml, for which a sample of 90 mg is prepared. Prepare a solution of simvastatin in 1 ml of chloroform at a concentration of 9 mg / ml, for which a 9 mg sample is prepared.
На 3-ем этапе изготавливают пористые подложки биоинженерной конструкции модифицированным методом выщелачивания и загружают их лекарственным веществом, симвастатином. Смешивают растворы ПОБВ и симвастатина в хлороформе, для чего к 8 мл раствора ПОБВ в хлороформе в концентрации 24 мг/мл добавляют 0,1 мл раствора симвастатина в хлороформе в концентрации 9 мг/мл. Полученный совместный раствор ПОБВ и симвастатина в хлороформе смешивают с порошком бикарбоната аммония (с размером частиц соли в диапазоне 90-300 мкм в соотношении 10:1 по массе) и тщательно перемешивают шпателем. Смесь помещают в стеклянную чашку Петри диаметром 5 см и оставляют при комнатной температуре до полного испарения органического растворителя в течение 3-х часов. После этого форму помещают в горячую дистиллированную воду (60°С) до полного прекращения газообразования, промывают дистиллированной водой 5 раз и высушивают при 37°С в течение суток.At the third stage, porous substrates of a bioengineered structure are made by a modified leaching method and loaded with a medicinal substance, simvastatin. The solutions of PHBV and simvastatin in chloroform are mixed, for which purpose 0.1 ml of a solution of simvastatin in chloroform at a concentration of 9 mg / ml is added to 8 ml of a solution of PHBV in chloroform at a concentration of 24 mg / ml. The resulting joint solution of PHBV and simvastatin in chloroform is mixed with ammonium bicarbonate powder (with a salt particle size in the range of 90-300 microns in a ratio of 10: 1 by weight) and thoroughly mixed with a spatula. The mixture is placed in a glass Petri dish 5 cm in diameter and left at room temperature until the organic solvent has completely evaporated within 3 hours. After that, the mold is placed in hot distilled water (60 ° C) until gassing completely stops, washed with distilled water 5 times and dried at 37 ° C for a day.
На 4-ом этапе получают пористые микросферы со средним диаметром 120 мкм при помощи метода «водная фаза/масляная фаза/водная фаза» (W/O/W), с последующим вымыванием порообразователя. В качестве пороборазователя также используют водный раствор карбоната аммония. 21 мл хлороформенного раствора ПОБ в концентрации 40 мг/мл гомогенизируют с 6,6 мл 5%-го (вес./об.) водного раствора карбоната аммония. Полученный коллоид по каплям добавляют в 210 мл 1%-го (вес/об.) раствора поливинилового спирта при постоянном перемешивании на верхнеприводной мешалке при скорости 750 об/мин. После полного испарения хлороформа частицы отделяют от эмульгатора (ПВС) путем осаждения и промывки дистиллированной водой. Для полного выхода порообразователя, микросферы инкубируют в горячей дистиллированной воде (70°С). Получают микросферы со средним диаметром 120±25 мкм, обладающие сквозной пористостью с пренебрежительно малой долей закрытых пор, общую пористость 92% и средним размером пор 1,5±0,4 мкм.At the 4th stage, porous microspheres with an average diameter of 120 µm are obtained using the "water phase / oil phase / water phase" (W / O / W) method, followed by washing out the blowing agent. An aqueous solution of ammonium carbonate is also used as a blowing agent. 21 ml of a chloroform solution of PHB at a concentration of 40 mg / ml is homogenized with 6.6 ml of a 5% (w / v) aqueous solution of ammonium carbonate. The resulting colloid is added dropwise to 210 ml of a 1% (w / v) solution of polyvinyl alcohol with constant stirring on an overhead stirrer at a speed of 750 rpm. After complete evaporation of chloroform, the particles are separated from the emulsifier (PVA) by precipitation and washing with distilled water. For a complete exit of the blowing agent, the microspheres are incubated in hot distilled water (70 ° C). Microspheres with an average diameter of 120 ± 25 μm are obtained, having a through porosity with a negligible fraction of closed pores, a total porosity of 92% and an average pore size of 1.5 ± 0.4 μm.
Из полученной пористой пленки вырезают полоски длиной 15 мм и шириной 5 мм и наносят на ее поверхность слой микросфер. Для этого на поверхность пленки, не дожидаясь ее высыхания, плотным слоем насыпают микросферы и оставляют сушиться в течение 24 час.Strips 15 mm long and 5 mm wide are cut from the obtained porous film and a layer of microspheres is applied to its surface. To do this, microspheres are poured onto the surface of the film, without waiting for it to dry, in a dense layer and left to dry for 24 hours.
На полужидкой среде культуру Bifidobacterium longum МС-42 (ООО «Спутник-К») выращивают в конических колбах на 250 мл, содержащих 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара. В колбы наливают питательную среду, укупоривают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют. Готовую среду хранят не более 2-х недель в бытовом холодильнике при температуре 5-8°С. Посев осуществляют, как только температура среды после автоклавирования достигает 40°С.On a semi-liquid medium, the culture of Bifidobacterium longum MS-42 (OOO Sputnik-K) is grown in 250 ml conical flasks containing 200 ml of MRS broth and 0.3% agar-agar. The culture medium is poured into the flasks, sealed with cotton-gauze stoppers and autoclaved. The prepared medium is stored for no more than 2 weeks in a household refrigerator at a temperature of 5-8 ° C. Sowing is carried out as soon as the temperature of the medium after autoclaving reaches 40 ° C.
В конической колбе на 250 мл готовят 1% (вес.) раствор альгината с молекулярной массой 4.8×105 г/моль, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 60°С и скорости перемешивания 60 об/мин. Проводят пересев со среды с агар-агаром на среду с альгинатом. Для этого из колбы с 96 часовой культурой, растущей в полужидкой среде на агар-агаре, стеклянной серологической пипеткой отбирают 8 мл и вносят в колбу со свежеприготовленной полужидкой средой на основе бактериального альгината. Содержимое колбы перемешивают. Для получения культуры В. longum МС-42 в полужидкой среде на дно колбы вносят 4 мл рабочей культуры (1×108 КОЕ/г). Содержимое колбы не перемешивают. После инокуляции колбы укупоривают ватно-марлевыми пробками и для термостатирования помещают в микробиологическую качалку. Инкубируют 96 часа при 37°С без перемешивания. Рост культуры контролируют методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, торговая марка Microsoft Corporation, USA.), морфологическую однородность проверяют при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой).In a 250 ml conical flask, prepare a 1% (wt.) Solution of alginate with a molecular weight of 4.8 × 10 5 g / mol, obtained by microbiology, in 150 ml of MRS broth on a magnetic stirrer with heating at 60 ° C and a stirring speed of 60 vol. / min. Subculture is carried out from the agar-agar medium to the alginate medium. For this, 8 ml is taken from a flask with a 96-hour culture growing in a semi-liquid medium on agar-agar with a glass serological pipette and introduced into a flask with a freshly prepared semi-liquid medium based on bacterial alginate. The contents of the flask are mixed. To obtain a culture of B. longum MC-42 in a semi-liquid medium, 4 ml of a working culture (1 × 10 8 CFU / g) is added to the bottom of the flask. The contents of the flask are not mixed. After inoculation, the flasks are sealed with cotton-gauze stoppers and placed in a microbiological shaker for thermostating. Incubated for 96 hours at 37 ° C without stirring. The growth of the culture is monitored by nephelometry, by determining the optical density at a wavelength of 600 nm on a spectrophotometer (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, trademark of Microsoft Corporation, USA.), Morphological homogeneity is checked using light microscopy (microscope Biomed-1, "Biomed" , RF, with a digital camera).
На последнем этапе полученную пористую конструкцию на основе ПОБ/ПОБВ заполняют раствором полученного ранее бактериального капсулярного альгината натрия, содержащего пробиотические бактерии. Для этой процедуры конструкцию на основе ПОБ/ПОБВ помещают в жидкую биомассу бактерий В. longum МС-42 в культуральной среде MRS, содержащей 1% альгината натрия, а емкость с ней в эксикатор, где создают отрицательное давление для вымещения воздуха из пор микросфер и подложки и замещения их раствором среды. Затем проводят гелирование альгината, для чего конструкцию, пропитанную раствором альгината натрия помещают в стеклянный стакан со 100 мл 50 мМ раствора хлорида кальция на 10 мин.At the last stage, the obtained porous structure based on PHB / PHBV is filled with a solution of the previously obtained bacterial capsular sodium alginate containing probiotic bacteria. For this procedure, a PHB / PHBV-based construct is placed in a liquid biomass of B. longum MC-42 bacteria in an MRS culture medium containing 1% sodium alginate, and a container with it in a desiccator, where negative pressure is created to displace air from the pores of the microspheres and the substrate. and replacing them with a solution of the medium. Then the alginate is gelled, for which the structure impregnated with sodium alginate solution is placed in a glass beaker with 100 ml of 50 mM calcium chloride solution for 10 minutes.
Таким образом, получают биоинженерную композитную полимерную конструкцию в форме пластины длиной 15 мм и шириной 6 мм, содержащую 1,3×107 КОЕ/г бактерий В. longum МС-42. Таким образом, произошло увеличение содержания живых бактерий в конструкции против первоначального (2,7×106 КОЕ/г) в 4,8 раз по сравнению с падением содержания бактерий в композиции, описанной в патенте-прототипе, в 11 раз с 1×108 КОЕ/г до 8,8×106 КОЕ/г.Thus, a bioengineered composite polymer structure is obtained in the form of a plate 15 mm long and 6 mm wide, containing 1.3 × 10 7 CFU / g of B. longum MC-42 bacteria. Thus, there was an increase in the content of live bacteria in the structure against the initial (2.7 × 10 6 CFU / g) by 4.8 times compared to the drop in the content of bacteria in the composition described in the prototype patent, 11 times from 1 × 10 8 CFU / g to 8.8 × 10 6 CFU / g.
Тест устойчивости конструкции при температуре 37°С показал отсутствие ее деформации. В тесте устойчивости в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала сохранение 1,3×107 КОЕ/г бактерий В. longum МС-42, т.е 96% выживаемость бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием альгинат лиазы в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала 87% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием лизоцима в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 93% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте ферментативной устойчивости с использованием липазы в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 117% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте устойчивости в среде чужеродных бактерий полученные биоинженерные конструкции обеспечивали отсутствие чужеродных бактерий Е. coli BL21. В тесте миграции бактерий из гидрогеля гидрогель обеспечивал распространение бактерий на расстояние 2 мм от образца. Оценка всех тестов проводилась по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»]. Тест исследования на цитотоксичность in vitro полученной конструкции показал, что он не является цитотоксичным, а именно, обладает баллом «0» по шкале цитотоксичности [ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro»].The stability test of the structure at a temperature of 37 ° C showed no deformation. In the resistance test in a simulated intestinal environment, the resulting structure ensured the preservation of 1.3 × 10 7 CFU / g of B. longum MC-42 bacteria, i.e. 96% bacterial survival, assessed by the standard method for determining the CFU number in comparison with the control bacterial preparation. encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using alginate lyase in a simulated intestinal environment, the resulting construct provided an 87% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the CFU number in comparison with the control preparation of bacteria encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using lysozyme in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided a 93% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the test of enzymatic resistance using lipase in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided a 117% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the test of resistance in the environment of foreign bacteria, the obtained bioengineering constructs ensured the absence of foreign bacteria E. coli BL21. In the test for bacteria migration from the hydrogel, the hydrogel allowed bacteria to spread to a distance of 2 mm from the sample. Evaluation of all tests was carried out according to the standard method for determining the number of CFU in the structure [GOST R 56139-2014 “Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "]. An in vitro cytotoxicity test of the resulting construct showed that it is not cytotoxic, namely, it has a score of “0” on the cytotoxicity scale [GOST ISO 10993-1-2011 “Medical devices. Assessment of the biological effect of medical devices. Part 5. Testing for cytotoxicity: in vitro methods "].
Пример 4.Example 4.
Изготовление биоинженерной конструкции проводят в несколько последовательных этапов.The manufacture of a bioengineered structure is carried out in several sequential stages.
На первом этапе способом контролируемого микробиологического биосинтеза также получают бактериальный альгинат.Для поддержания культуры бактерий используют твердую питательную среду Эшби, следующего состава (г/л): K2HPO4 - 1,05; KH2PO4 - 0,2; MgSO4 - 0,2; NaCl - 0,2; Na2MoO4 - 0,006; СаСО3 - 5,0; сахароза - 20, агар - 20. Для биосинтеза альгината штамм-продуцент A. chroococcum 7Б культивируют в жидкой среде Берка следующего состава (г/л): KH2PO4 - 1,00; K2HPO4 - 1,00; MgSO4 - 0,4; NaCl - 0,1; FeSO4 - 0,01; Na2MoO4 - 0,06; CaCl2 - 0,1; цитрат натрия - 0,5; сахароза - 30. Сначала готовят посевной материал, для чего штамм-продуцент A. chroococcum 7Б выращивают в жидкой среде Берка указанного состава в качалочных колбах объемом 750 мл (со 100 мл среды) при 250 об./мин (исходный рН среды - 7,2; температура культивирования - 28°С) в течение 24 часов. Затем проводят биосинтез альгината штаммом-продуцентом A. chroococcum 7Б, для чего его культивируют в той же среде после внесения 4% (об.) посевного материала возрастом 24 часа в качалочных колбах на 750 мл (объем культуральной среды - 100 мл) на микробиологической качалке Innova 43 («New Brunswick Scientific)), США) при скорости перемешивания 200 об./мин в течение 72 часов. Все процедуры проводят в стерильных условиях. Для выделения альгината проводят обработку биомассы штамма-продуцента 0,9% NaCl и 50 мМ ЭДТА, после чего проводят центрифугирование при 15000 g 30 мин. Осадок отделяют и промывают водой. Затем к нему добавляют 3-кратный объем 96% этилового спирта. Осадок снова отделяют и промывают водой. После этого проводят очистку полученного альгината. Для этого альгинат снова осаждают 3-кратным объемом 96% этилового спирта и проводят диализ против 0.5% NaCl в течение 24 h. Осадок снова отделяют и высушивают при помощи лиофильной сушки. Полученный порошок хранят при 4°С не более 3-х месяцев. Полученный альгинат обладает следующим сочетанием параметров: молекулярной массой (определяемой методом визкозиметрии) 1,0×106 г/моль, молярным содержанием остатков гулуроновой кислоты в полимере - 35% и уровнем ацетилирования - 10% (определяемых методом ИК-спектроскопии).At the first stage, bacterial alginate is also obtained by the method of controlled microbiological biosynthesis. To maintain the culture of bacteria, a solid Ashby nutrient medium is used with the following composition (g / l): K 2 HPO 4 - 1.05; KH 2 PO 4 0.2; MgSO 4 0.2; NaCl 0.2; Na 2 MoO 4 - 0.006; CaCO 3 - 5.0; sucrose - 20, agar - 20. For the biosynthesis of alginate, the producer strain A. chroococcum 7B is cultivated in Burk's liquid medium of the following composition (g / l): KH 2 PO 4 - 1.00; K 2 HPO 4 1.00; MgSO 4 0.4; NaCl - 0.1; FeSO 4 - 0.01; Na 2 MoO 4 - 0.06; CaCl 2 - 0.1; sodium citrate - 0.5; sucrose - 30. First, the inoculum is prepared, for which the producer strain A. chroococcum 7B is grown in Burk's liquid medium of the specified composition in 750 ml shaking flasks (from 100 ml of medium) at 250 rpm (initial pH of the medium is 7, 2; cultivation temperature - 28 ° C) for 24 hours. Then biosynthesis of alginate is carried out by the producer strain A. chroococcum 7B, for which it is cultivated in the same medium after adding 4% (vol.) Of inoculum aged 24 hours in shaking flasks of 750 ml (volume of culture medium - 100 ml) on a microbiological shaker Innova 43 (New Brunswick Scientific), USA) at a stirring speed of 200 rpm for 72 hours. All procedures are performed under sterile conditions. To isolate alginate, the biomass of the producer strain is treated with 0.9% NaCl and 50 mM EDTA, after which centrifugation is carried out at 15000 g for 30 minutes. The precipitate is separated and washed with water. Then a 3-fold volume of 96% ethyl alcohol is added to it. The precipitate is again separated and washed with water. After that, the resulting alginate is purified. For this, the alginate is again precipitated with a 3-fold volume of 96% ethanol and dialysis is performed against 0.5% NaCl for 24 h. The precipitate is again separated and dried using a freeze dryer. The resulting powder is stored at 4 ° C for no more than 3 months. The resulting alginate has the following combination of parameters: molecular weight (determined by viscosimetry) 1.0 × 10 6 g / mol, molar content of guluronic acid residues in the polymer - 35% and acetylation level - 10% (determined by IR spectroscopy).
На 2-ом этапе готовят раствор ПОБ с молекулярной массой 7.6×105 г/моль, полученного бактериальным биосинтезом, в общей концентрации 112,5 мг/мл в объеме 8 мл в стеклянном стакане на 50 мл, для чего готовят навеску в 90 мг.At the second stage, a PHB solution with a molecular weight of 7.6 × 10 5 g / mol obtained by bacterial biosynthesis is prepared at a total concentration of 112.5 mg / ml in a volume of 8 ml in a 50 ml glass beaker, for which a sample of 90 mg is prepared ...
На 3-ем этапе получают пористые микросферы со средним диаметром 560 мкм при помощи метода «водная фаза/масляная фаза/водная фаза» (W/0/W), с последующим вымыванием порообразователя. В качестве пороборазователя используют водный раствор карбоната аммония. 21 мл хлороформенного раствора ПОБ 350 кДа в концентрации 40 мг/мл гомогенизируют с 6,6 мл 5%-го (вес./об.) водного раствора карбоната аммония. Полученный коллоид по каплям добавляют в 210 мл 1%-го (масс.) раствора поливинилового спирта при постоянном перемешивании на верхнеприводной мешалке при скорости 750 об/мин. После полного испарения хлороформа частицы отделяют от эмульгатора (ПВС) путем осаждения и промывки дистиллированной водой. Для полного выхода порообразователя, микросферы инкубируют в горячей дистиллированной воде (70°С). Получают микросферы со средним диаметром 560±60 мкм, обладающие сквозной пористостью с пренебрежительно малой долей закрытых пор, общую пористость 96% и средним размером пор 3,4±0,9 мкмAt the third stage, porous microspheres with an average diameter of 560 μm are obtained using the "water phase / oil phase / water phase" (W / 0 / W) method, followed by washing out the pore former. An aqueous solution of ammonium carbonate is used as a pore-forming agent. 21 ml of a chloroform solution of PHB 350 kDa at a concentration of 40 mg / ml is homogenized with 6.6 ml of a 5% (w / v) aqueous solution of ammonium carbonate. The obtained colloid is added dropwise to 210 ml of a 1% (wt.) Solution of polyvinyl alcohol with constant stirring on an overhead stirrer at a speed of 750 rpm. After complete evaporation of chloroform, the particles are separated from the emulsifier (PVA) by precipitation and washing with distilled water. For a complete exit of the blowing agent, the microspheres are incubated in hot distilled water (70 ° C). Microspheres with an average diameter of 560 ± 60 μm are obtained, having through porosity with a negligible fraction of closed pores, a total porosity of 96% and an average pore size of 3.4 ± 0.9 μm
На 4-ом этапе выращивают генетически модифицированные пробиотические бактерии Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 (ООО «Спутник-К»), содержащие плазмиду pMC1 с геном устойчивости к хлорамфениколу рС194, полученные по стандартной методике [Serror P., Sasaki Т., Ehrlich S.D., Maguin Е. Electrotransformation of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and L. delbrueckii subsp. lactis with Various Plasmids. Appl Environ Microbiol., 2002, 68(1), 46-52]. На полужидкой среде культуру L. delbrueckii subsp. bulgaricus VI104 выращивают в конических колбах на 250 мл, содержащих 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара. В колбы наливают питательную среду, укупоривают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют. Готовую среду не хранят. Посев осуществляют, как только температура среды после автоклавирования достигает 40°С.At the 4th stage, genetically modified probiotic bacteria Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 (Sputnik-K LLC) are grown, containing the pMC1 plasmid with the pC194 chloramphenicol resistance gene, obtained by the standard method [Serror P., Sasaki T., Ehrlich SD, Maguin E. Electrotransformation of Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus and L. delbrueckii subsp. lactis with Various Plasmids. Appl Environ Microbiol. 2002, 68 (1), 46-52]. On a semi-liquid medium, the culture of L. delbrueckii subsp. bulgaricus VI104 are grown in 250 ml conical flasks containing 200 ml of MRS broth and 0.3% agar-agar. The culture medium is poured into the flasks, sealed with cotton-gauze stoppers and autoclaved. The finished medium is not stored. Sowing is carried out as soon as the temperature of the medium after autoclaving reaches 40 ° C.
Для посева готовят жидкую посевную культуру. Для этого в пробирку с культурой, растущей на скошенном MRS-агаре, вносят 3 мл MRS-бульона. Снимают клетки с поверхности твердой среды путем повторного пипетирования и переносят полученную суспензию в колбу, содержащую 150 мл питательной среды. Колбу с жидкой посевной культурой инкубируют 96 часа в аэробных условиях на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). Рост культуры контролируют методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, торговая марка Microsoft Corporation, USA.), морфологическую однородность проверяют при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой).A liquid seed culture is prepared for sowing. For this, 3 ml of MRS broth is added to a test tube with a culture growing on a slant MRS-agar. The cells are removed from the surface of the solid medium by repeated pipetting and the resulting suspension is transferred into a flask containing 150 ml of culture medium. The flask with a liquid seed culture is incubated for 96 hours under aerobic conditions on a microbiological shaker at 37 ° C and a stirring speed of 120 rpm (orbital diameter 1.9 cm). The growth of the culture is monitored by nephelometry, by determining the optical density at a wavelength of 600 nm on a spectrophotometer (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, trademark of Microsoft Corporation, USA.), Morphological homogeneity is checked using light microscopy (microscope Biomed-1, "Biomed" , RF, with a digital camera).
В конической колбе на 250 мл готовят 1% (вес.) раствор альгината, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 60°С и скорости перемешивания 60 об/мин. Для получения биомассы L. delbrueckii subsp. bulgaricus NCTC 12712 на жидкой среде в аэробных условиях 6 мл жидкой посевной культуры (1×108 КОЕ/г) вносят в коническую колбу, содержащую полученный 1% раствор альгината в 150 мл MRS-бульона, и инкубируют 96 час на микробиологической качалке при 37°С и скорости перемешивания 120 об/мин (диаметр орбиты 1,9 см). После окончания инкубации биомассу осаждают центрифугированием 15 мин при 10000g на центрифуге «Весктап J2-21». Супернатант сливают. Все процедуры проводят в стерильных условиях.In a 250 ml conical flask, a 1% (wt.) Solution of microbiologically obtained alginate is prepared in 150 ml of MRS broth on a magnetic stirrer with heating at 60 ° C and a stirring speed of 60 rpm. To obtain biomass L. delbrueckii subsp. bulgaricus NCTC 12712 on a liquid medium under aerobic conditions 6 ml of a liquid seed culture (1 × 10 8 CFU / g) are introduced into a conical flask containing the resulting 1% alginate solution in 150 ml of MRS broth, and incubated for 96 hours on a microbiological shaker at 37 ° C and a stirring speed of 120 rpm (orbital diameter 1.9 cm). After the end of the incubation, the biomass is precipitated by centrifugation for 15 minutes at 10000g in a "Vesktap J2-21" centrifuge. The supernatant is discarded. All procedures are performed under sterile conditions.
На 5-ом этапе выращивают культуру Bifidobacterium longum МС-42 на полужидкой среде в конических колбах на 250 мл, содержащих 200 мл MRS-бульона и 0,3% агар-агара. В колбы наливают питательную среду, укупоривают ватно-марлевыми пробками и автоклавируют. Готовую среду хранят не более 2-х недель в бытовом холодильнике при температуре 5-8°С. Посев осуществляют, как только температура среды после автоклавирования достигает 40°С.At the 5th stage, a culture of Bifidobacterium longum MC-42 is grown on a semi-liquid medium in 250 ml conical flasks containing 200 ml of MRS broth and 0.3% agar-agar. The culture medium is poured into the flasks, sealed with cotton-gauze stoppers and autoclaved. The prepared medium is stored for no more than 2 weeks in a household refrigerator at a temperature of 5-8 ° C. Sowing is carried out as soon as the temperature of the medium after autoclaving reaches 40 ° C.
В конической колбе на 250 мл готовят 1% (вес.) раствор альгината с молекулярной массой 4.8×105 г/моль, полученного микробиологическим путем, в 150 мл MRS-бульона на магнитной мешалке с подогревом при 60°С и скорости перемешивания 60 об/мин. Проводят пересев со среды с агар-агаром на среду с альгинатом. Для этого из колбы с 96 часовой культурой, растущей в полужидкой среде на агар-агаре, стеклянной серологической пипеткой отбирают 8 мл и вносят в колбу со свежеприготовленной полужидкой средой на основе бактериального альгината. Содержимое колбы перемешивают. Для получения культуры В. longum МС-42 в полужидкой среде на дно колбы вносят 4 мл рабочей культуры (1×108 КОЕ/г). Содержимое колбы не перемешивают. После инокуляции колбы укупоривают ватно-марлевыми пробками и для термостатирования помещают в микробиологическую качалку. Инкубируют 96 часа при 37°С без перемешивания. Рост культуры контролируют методом нефелометрии, определяя оптическую плотность при длине волны 600 нм на спектрофотометре (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, торговая марка Microsoft Corporation, USA.), морфологическую однородность проверяют при помощи световой микроскопии (микроскоп Биомед-1, «Биомед», РФ, с цифровой камерой).In a 250 ml conical flask, prepare a 1% (wt.) Solution of alginate with a molecular weight of 4.8 × 10 5 g / mol, obtained by microbiology, in 150 ml of MRS broth on a magnetic stirrer with heating at 60 ° C and a stirring speed of 60 vol. / min. Subculture is carried out from the agar-agar medium to the alginate medium. For this, 8 ml is taken from a flask with a 96-hour culture growing in a semi-liquid medium on agar-agar with a glass serological pipette and introduced into a flask with a freshly prepared semi-liquid medium based on bacterial alginate. The contents of the flask are mixed. To obtain a culture of B. longum MC-42 in a semi-liquid medium, 4 ml of a working culture (1 × 10 8 CFU / g) is added to the bottom of the flask. The contents of the flask are not mixed. After inoculation, the flasks are sealed with cotton-gauze stoppers and placed in a microbiological shaker for thermostating. Incubated for 96 hours at 37 ° C without stirring. The growth of the culture is monitored by nephelometry, by determining the optical density at a wavelength of 600 nm on a spectrophotometer (Ultrospec 1100 pro, Amersham Biosciences Limited, trademark of Microsoft Corporation, USA.), Morphological homogeneity is checked using light microscopy (microscope Biomed-1, "Biomed" , RF, with a digital camera).
На последнем этапе полученные пористые конструкции в форме микросфер на основе ПОБ/ПОБВ заполняют раствором полученного ранее бактериального капсулярного альгината натрия, содержащего пробиотические бактерии. Сначала готовят смесь бактерий в бактериальном альгинате. Для этого 50 мл биомассы выращенных ранее бактерий В. longum МС-42 в культуральной среде MRS, содержащей 1% альгината натрия, смешивают с 50 мл биомассы выращенных ранее генетически модифицированных бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NCTC 12712 в культуральной среде MRS, содержащей 1% альгината натрия, в стеклянной колбе на 150 мл и тщательно перемешивают. Пористые микросферы на основе ПОБ/ПОБВ помещают в смесь биомассы бактерий в культуральной среде MRS, содержащей 1% альгината натрия, а емкость с ней в эксикатор, где создают отрицательное давление для вымещения воздуха из пор микросфер и замещения их раствором среды. Затем проводят гелирование альгината, для чего конструкцию, пропитанную раствором альгината натрия помещают в стеклянный стакан со 100 мл 50 мМ раствора хлорида кальция на 10 мин.At the last stage, the obtained porous structures in the form of microspheres based on PHB / PHBV are filled with a solution of the previously obtained bacterial capsular sodium alginate containing probiotic bacteria. First, a mixture of bacteria in bacterial alginate is prepared. For this, 50 ml of the biomass of the previously grown bacteria B. longum MC-42 in the MRS culture medium containing 1% sodium alginate is mixed with 50 ml of the biomass of the previously grown genetically modified bacteria Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NCTC 12712 in MRS culture medium containing 1% sodium alginate in a 150 ml glass flask and mix thoroughly. Porous microspheres based on PHB / PHBV are placed in a mixture of bacterial biomass in a MRS culture medium containing 1% sodium alginate, and a container with it in a desiccator, where negative pressure is created to displace air from the pores of the microspheres and replace them with a solution of the medium. Then the alginate is gelled, for which the structure impregnated with sodium alginate solution is placed in a glass beaker with 100 ml of 50 mM calcium chloride solution for 10 minutes.
Таким образом, получают биоинженерную композитную полимерную конструкцию в форме трубки длиной 25 мм и диаметром 6 мм, содержащую 1,2×107 КОЕ/г бактерий L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 и 1,0×107 КОЕ/г бактерий В. longum МС-42. Таким образом, произошло увеличение содержания живых бактерий в конструкции против первоначального (2,7×106 КОЕ/г) не менее чем в 3,7 раза по сравнению с падением содержания бактерий в композиции, описанной в патенте-прототипе, в 11 раз с 1×108 КОЕ/г до 8,8×106 КОЕ/г.Thus, a bioengineered composite polymer structure is obtained in the form of a tube 25 mm long and 6 mm in diameter, containing 1.2 × 10 7 CFU / g of bacteria L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 and 1.0 × 10 7 CFU / g of bacteria B longum MC-42. Thus, there was an increase in the content of live bacteria in the structure against the initial (2.7 × 10 6 CFU / g) by at least 3.7 times compared with the drop in the content of bacteria in the composition described in the prototype patent, 11 times with 1 × 10 8 CFU / g to 8.8 × 10 6 CFU / g.
Тест устойчивости конструкции при температуре 37°С показал отсутствие ее деформации. В тесте устойчивости в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала обеспечивал сохранение 1,2×107 КОЕ/г бактерий L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 и 1,0×107 КОЕ/г бактерий В. longum МС-42., 98% выживаемость бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием альгинат лиазы в симулированной среде кишечника полученная конструкция обеспечивала 61% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в сравнении с контрольным препаратом бактерий, инкапсулированных в альгинатный гидрогель на основе водорослевого альгината. В тесте ферментативной устойчивости с использованием лизоцима в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 65% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте ферментативной устойчивости с использованием липазы в симулированной среде кишечника полученные конструкции обеспечивали 77% повышение выживаемости бактерий, оцениваемых по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции. В тесте устойчивости в среде чужеродных бактерий полученные биоинженерные конструкции обеспечивали отсутствие чужеродных бактерий Е. coli BL21. В тесте миграции бактерий из гидрогеля гидрогель обеспечивал распространение бактерий на расстояние 3 мм от образца. Оценка всех тестов проводилась по стандартной методике определения числа КОЕ в конструкции [ГОСТ Р 56139-2014 «Продукты пищевые функциональные. Методы определения и подсчета пробиотических микроорганизмов»]. Тест исследования на цитотоксичность in vitro полученной конструкции показал, что он не является цитотоксичным, а именно, обладает баллом «0» по шкале цитотоксичности [ГОСТ ISO 10993-1-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro»].The stability test of the structure at a temperature of 37 ° C showed no deformation. In a resistance test in a simulated intestinal environment, the resulting construct ensured the preservation of 1.2 × 10 7 CFU / g bacteria L. delbrueckii subsp.bulgaricus NCTC 12712 and 1.0 × 10 7 CFU / g bacteria B. longum MC-42., 98 % bacterial survival, assessed by the standard method for determining the CFU number in comparison with the control preparation of bacteria encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using alginate lyase in a simulated intestinal environment, the resulting construct provided a 61% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the CFU number in comparison with a control preparation of bacteria encapsulated in an alginate hydrogel based on algal alginate. In the test of enzymatic resistance using lysozyme in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided a 65% increase in bacterial survival, as measured by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the test of enzymatic resistance using lipase in a simulated intestinal environment, the resulting constructs provided a 77% increase in bacterial survival, assessed by the standard method for determining the number of CFU in the construct. In the test of resistance in the environment of foreign bacteria, the obtained bioengineering constructs ensured the absence of foreign bacteria E. coli BL21. In the test for bacteria migration from the hydrogel, the hydrogel allowed bacteria to spread to a distance of 3 mm from the sample. Evaluation of all tests was carried out according to the standard method for determining the number of CFU in the structure [GOST R 56139-2014 “Functional food products. Methods for the determination and counting of probiotic microorganisms "]. An in vitro cytotoxicity test of the resulting construct showed that it is not cytotoxic, namely, it has a score of “0” on the cytotoxicity scale [GOST ISO 10993-1-2011 “Medical devices. Assessment of the biological effect of medical devices. Part 5. Testing for cytotoxicity: in vitro methods "].
Claims (25)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019143594A RU2740380C1 (en) | 2019-12-24 | 2019-12-24 | Bioengineered structure based on bacterial alginate and probiotic bacteria and method for production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2019143594A RU2740380C1 (en) | 2019-12-24 | 2019-12-24 | Bioengineered structure based on bacterial alginate and probiotic bacteria and method for production thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2740380C1 true RU2740380C1 (en) | 2021-01-13 |
Family
ID=74183949
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2019143594A RU2740380C1 (en) | 2019-12-24 | 2019-12-24 | Bioengineered structure based on bacterial alginate and probiotic bacteria and method for production thereof |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2740380C1 (en) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2530577C2 (en) * | 2012-11-23 | 2014-10-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Pharmaceutical composition of polymer microparticles with modified release kinetics of poorly soluble drug substances |
RU2563137C2 (en) * | 2004-09-16 | 2015-09-20 | Хилл'С Пет Ньютришн, Инк. | Method and composition for prevention and treatment of diarrhoea |
RU2593327C2 (en) * | 2011-01-21 | 2016-08-10 | Весейл Фарма Са | Microencapsulated probiotic substance and preparation method thereof |
RU2606041C2 (en) * | 2015-10-16 | 2017-01-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский радиологический центр" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИРЦ" Минздрава России) | Method of producing composite 3d frame for replacement of bone-cartilage defects |
RU2652277C1 (en) * | 2017-04-13 | 2018-04-25 | Артем Михайлович Гурьев | Microcapsules, containing living microorganisms, and their application |
RU2692768C1 (en) * | 2017-12-29 | 2019-06-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Porous bio-polymer microspheres for controlled release of positively charged proteins and method for producing microspheres |
-
2019
- 2019-12-24 RU RU2019143594A patent/RU2740380C1/en active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2563137C2 (en) * | 2004-09-16 | 2015-09-20 | Хилл'С Пет Ньютришн, Инк. | Method and composition for prevention and treatment of diarrhoea |
RU2593327C2 (en) * | 2011-01-21 | 2016-08-10 | Весейл Фарма Са | Microencapsulated probiotic substance and preparation method thereof |
RU2530577C2 (en) * | 2012-11-23 | 2014-10-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Pharmaceutical composition of polymer microparticles with modified release kinetics of poorly soluble drug substances |
RU2606041C2 (en) * | 2015-10-16 | 2017-01-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский радиологический центр" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИРЦ" Минздрава России) | Method of producing composite 3d frame for replacement of bone-cartilage defects |
RU2652277C1 (en) * | 2017-04-13 | 2018-04-25 | Артем Михайлович Гурьев | Microcapsules, containing living microorganisms, and their application |
RU2692768C1 (en) * | 2017-12-29 | 2019-06-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Porous bio-polymer microspheres for controlled release of positively charged proteins and method for producing microspheres |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
D Orazio G. et al. Microencapsulation of new probiotic formulations for gastrointestinal delivery: in vitro study to assess viability and biological properties. Applied Microbiology Biotechnology. 2015, 99(22), p.9779-9789. * |
Иванов С.Ю. и др. Разработка и доклинические исследования изолирующей мембраны на основе сополимера поли-3-оксибутирата-со-3-оксивалерата для направленной костной регенерации. Биомедицинская химия. 2015, т.61, вып. 6, с. 717-723. * |
Муравьев А.А. и др. Разработка и доклинические исследования ортотопических костных имплантатов на основе гибридной конструкции из поли-3-оксибутирата и альгината натрия. Современные технологии в медицине. 2016, 8(4), с. 42-50. * |
Муравьев А.А. и др. Разработка и доклинические исследования ортотопических костных имплантатов на основе гибридной конструкции из поли-3-оксибутирата и альгината натрия. Современные технологии в медицине. 2016, 8(4), с. 42-50. Иванов С.Ю. и др. Разработка и доклинические исследования изолирующей мембраны на основе сополимера поли-3-оксибутирата-со-3-оксивалерата для направленной костной регенерации. Биомедицинская химия. 2015, т.61, вып. 6, с. 717-723. D Orazio G. et al. Microencapsulation of new probiotic formulations for gastrointestinal delivery: in vitro study to assess viability and biological properties. Applied Microbiology Biotechnology. 2015, 99(22), p.9779-9789. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Dhamecha et al. | Applications of alginate microspheres in therapeutics delivery and cell culture: Past, present and future | |
Muzzarelli et al. | Physical properties imparted by genipin to chitosan for tissue regeneration with human stem cells: A review | |
JP6820340B2 (en) | Coating method of lactic acid bacteria with enhanced intestinal survival rate | |
US8512693B2 (en) | Self-assembling membranes and related methods thereof | |
Naumenko et al. | Halloysite nanoclay/biopolymers composite materials in tissue engineering | |
Zhu et al. | Biomaterial-based encapsulated probiotics for biomedical applications: Current status and future perspectives | |
Bonartsev et al. | Poly (3-hydroxybutyrate) and poly (3-hydroxybutyrate)-based biopolymer systems | |
Nahar et al. | Alginate and its versatile application in drug delivery | |
Buriuli et al. | Polyelectrolyte complexes (PECs) for biomedical applications | |
JPH08508933A (en) | Use of an acyl exchange reaction between an esterified polysaccharide and a polyamine to form a film on at least the surface of a gelled particle in an aqueous medium, the particle thus produced, a process for their preparation and a composition containing said particle. | |
Zhang et al. | An ionically crosslinked hydrogel containing vancomycin coating on a porous scaffold for drug delivery and cell culture | |
JP2020516311A (en) | Hydrogels for cell culture and biomedical applications | |
Li et al. | Effects of concentration variation on the physical properties of alginate-based substrates and cell behavior in culture | |
Munarin et al. | Structural properties of polysaccharide-based microcapsules for soft tissue regeneration | |
Khoshnood et al. | The potential impact of polyethylenimine on biological behavior of 3D-printed alginate scaffolds | |
Petzold et al. | Alginate as a versatile polymer matrix with biomedical and food applications | |
Lencina et al. | Recent studies on alginates based blends, composites, and nanocomposites | |
Carvalho et al. | Recent advances in the production of biomedical systems based on polyhydroxyalkanoates and exopolysaccharides | |
CN108042793B (en) | Preparation method of GDNF (GDNF) -embedded multi-core-single-shell microsphere sustained-release system | |
Jalilpour et al. | A simple route for preparation of pH-sensitive hydrogels by using egg white proteins in alginate scaffold for the encapsulation of probiotics | |
Dou et al. | Probiotic-loaded calcium alginate/fucoidan hydrogels for promoting oral ulcer healing | |
Diep et al. | Electrospinning Living Bacteria: A Review of Applications from Agriculture to Health Care | |
Morelli et al. | Polymers from renewable resources | |
RU2740380C1 (en) | Bioengineered structure based on bacterial alginate and probiotic bacteria and method for production thereof | |
Iurciuc et al. | Gellan. Pharmaceutical, medical and cosmetic applications |