RU2739565C1

RU2739565C1 - Способ получения ферментативно устойчивых коллагеновых материалов

Info

Publication number: RU2739565C1
Application number: RU2019143945A
Authority: RU
Inventors: Анна Владимировна Шишкина; Илья Александрович ДЕМЬЯНЕНКО; Нина Владимировна Калмыкова; Анатолий Петрович Суслов; Владимир Георгиевич Нестеренко; Сергей Владимирович Нестеренко; Алексей Владимирович Нестеренко
Original assignee: Ниармедик Интернэшнл Лимитед
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2020-12-25

Abstract

Группа изобретений относится к области фармацевтики, медицины и биоорганической химии. Раскрыт способ получения сшитого карбодиимидом устойчивого к ферментативной деградации коллагеназами коллагенового материала, включающий стадию дезамидирования боковых групп остатков аспарагина и глутамина в составе альфа-цепей коллагена путем обработки исходного коллагенсодержащего сырья водным раствором гидроокиси лития, калия или натрия, в концентрации от 0,3 м до концентрации насыщенного раствора при температуре от 0 до 45°С в течение 8-168 часов, стадию отмывки полученного на предыдущей стадии дезамидированного коллагенового материала от водного раствора гидроокиси щелочного металла; и последующую стадию сшивания дезамидированного коллагенового материала карбодиимидом в водной, водно-органической или органической среде. Также раскрыт продукт для имплантации в ткани организма, полученный вышеуказанным способом. Группа изобретений обеспечивает получение сшитых коллагеновых материалов, устойчивых к ферментативной деградации коллагеназами. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 10 ил., 2 табл., 1 пр.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к области фармацевтики, медицины и биоорганической химии, а именно к способу получения сшитых карбодиимидами высокоустойчивых к ферментативной деградации биосовместимых коллагеновых материалов.

Предпосылки изобретения

Коллаген является преобладающим в количественном отношении белком внеклеточного матрикса в организме млекопитающих. Его массовая доля среди всех белков составляет около 30%, а в органах с превалированием волокнистого соединительнотканного компонента, таких как кожа, может достигать 75% (Gelse K., Poschl E., Aigner T. Collagens - structure, function, and biosynthesis. Adv. Drug Deliv Rev. 2003, v. 55, № 12, pp. 1531-1546). Возможность получения в больших количествах различными методами, высокая биосовместимость, способность к биоразложению, а также низкая иммуногенность обуславливают широкое применение данного белка в качестве биоматериала в выделенном виде или же в составе очищенных от клеточных компонентов коллагенсодержащих внеклеточных матриксов тканей животных и человека.

В настоящее время материалы на основе коллагена применяют во многих областях хирургии и регенеративной биомедицины. В то же время такое свойство коллагена как биодеградация значительно ограничивает возможность его использования в случаях, когда требуется пролонгированное нахождение медицинских изделий и препаратов в тканях in vivo. Для увеличения устойчивости коллагеновых материалов к рассасыванию в организме осуществляют химическую модификацию белка путем внесения дополнительных ковалентных сшивок между его молекулами, что повышает резистентность к расщеплению протеолитическими ферментами. Сшивание коллагена можно проводить как физическими методами, среди которых наиболее распространены дегидротермическая обработка и облучение ультрафиолетовым излучением, так и ферментативно, например, обработкой трансглутаминазой (Chattopadhyay S., Raines R.T. Review collagen-based biomaterials for wound healing. Biopolymers. 2014, v. 101, № 8, pp. 821-833). Однако данные методы не обеспечивают образования достаточного числа сшивок для существенного увеличения ферментативной устойчивости материала. В связи с этим наибольшее распространение получили методы стабилизации коллагена различными химическими агентами. Химическое сшивание белка может осуществляться путем обработки бифункциональными или мультифункциональными сшивающими агентами альдегидной, эпоксидной или изоцианатной природы. При этом реакционноспособные группы агента образуют ковалентные связи с аминогруппами белка, формируя мостики между полипептидными цепями, а агент включается в состав готового сшитого материала. Чаще всего для сшивания коллагеновых материалов применяют растворы глутарового альдегида в различных концентрациях, что связано с его доступностью, низкой стоимостью и хорошей растворимостью в воде. Одним из наиболее известных медицинских изделий, изготавливаемых на основе коллагена, сшитого глутаровым альдегидом, является инъекционный имплант Zyplast, производящийся с 1983 года по технологии патента US 4582640 и применяющийся для контурной пластики лица. Существенным недостатком использования бифункциональных или мультифункциональных сшивающих агентов является вероятность появления цитотоксических свойств у обработанных ими коллагеновых материалов. Это может быть обусловлено высвобождением молекул агента в процессе деградации материала в организме, а также наличием свободных реакционноспособных групп.

Применение сшивающих агентов, так называемой, нулевой длины позволяет избежать неблагоприятных последствий, вызванных наличием непрореагировавших реакционноспособных групп реагента в составе материала. Механизм действия данных агентов основан на активации карбоксильных групп остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот с последующей их реакцией с аминогруппами остатков лизина и гидроксилизина на другой полипептидной цепи. При этом молекулы сшивающего агента не остаются в составе готового материала (Lee J.M., Edwards H.H.L., Pereira C.A., Samii S.I.). Crosslinking of tissue-derived biomaterials in 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC). J. Mater. Sci. Mater. Med. 1996, v. 7, № 9, pp. 531-541). В области изготовления материалов медицинского назначения к таким агентам относятся карбодиимиды или ацилазиды. Однако использование ацилазидов менее распространено в силу длительности реакции сшивки и необходимости проведения ее в органическом растворителе. Таким образом, применение карбодиимидов для сшивания коллагена является более предпочтительным. Среди данной группы веществ для стабилизации коллагеновых материалов чаще всего используют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид во многих случаях в комбинации с N-гидроксисукцинимидом (Olde Damink L.H., Dijkstra P.J., van Luyn M.J., van Wachem P.B., Nieuwenhuis P., Feijen J. Cross-linking of dermal sheep collagen using a water-soluble carbodiimide. Biomaterials. 1996, v. 17, № 8, pp. 765-773). Химическое сшивание коллагеновых материалов позволяет увеличить срок биодеградации за счет придания им частичной устойчивости к специфическим протеазам - коллагеназам. Однако существуют области медицины, в которых необходима практически полная устойчивость применяемых материалов к коллагенолитическим ферментам. Подобные материалы востребованы в кардиологии в области разработки и изготовления биологических протезов клапанов сердца; в косметологии при изготовлении семиперманентных (биодеградируемых с длительным сроком рассасывания) инъекционных имплантатов для аугментации мягких тканей; в полостной хирургии и челюстно-лицевой хирургии для производства барьерных мембран и каркасов для направленной тканевой регенерации.

Недостаточная ферментативная устойчивость химически сшитых с помощью агентов нулевой длины коллагеновых материалов вызвана тем, что число сформированных в молекулах белка ковалентных сшивок, не позволяет полностью блокировать его связывание с коллагеназами. Это обусловлено главным образом ограниченным количеством реакционноспособных групп, расположенных друг от друга на достаточно близком расстоянии, позволяющем им образовать ковалентную связь. Таким образом, существует потребность в разработке новых более эффективных подходов к сшиванию коллагена, которые бы обеспечивали как можно более высокую степень его устойчивости к расщеплению коллагеназами. Ранее в патенте WO 2010021738 A2 задача получения сшитых коллагеновых материалов с повышенной устойчивостью к ферментативной деградации коллагеназой была решена путем последовательной обработки белка парой сшивающих агентов различной природы, включающих альдегиды, эпоксиды и карбодиимиды. При этом данные сшивающие агенты могут применяться в разнообразных последовательных комбинациях. Однако недостатком данного подхода является обязательное использование бифункциональных сшивающих агентов во всех вариантах его воплощения, что может приводить к появлению цитотоксической активности у сшитого материала. В литературе описан другой подход к решению данной задачи, основанный на увеличении эффективности сшивания коллагена химическим агентом нулевой длины 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом за счет проведения реакции в присутствии диаминов путресцина и гександиамина или же в присутствии аминокислот в виде рацематов или определенных оптических изомеров (Ma L., Gao C., Mao Z., Zhou J., Shen J. Enhanced biological stability of collagen porous scaffolds by using amino acids as novel cross-linking bridges. Biomaterials. 2004, v. 25, № 15, pp. 2997-3004). Данные вещества выступают в качестве линкеров между реакционноспособными группами в цепях тропоколлагена, удаленными на расстояние, не позволяющее им образовать ковалентную связь только лишь в присутствии карбодиимида. Проведение подобных реакций имеет технические трудности, связанные с необходимостью тщательного предварительного подбора концентраций веществ, образующих линкеры, в зависимости от соотношения амино- и карбоксигрупп в исходном коллагенсодержащем сырье, поскольку значительное превышение доли одной из них в реакционной системе приводит к блокированию функциональных групп на коллагеновых молекулах и, как следствие, к снижению эффективности сшивки. Кроме того, применение полученных таким способом материалов несет потенциальные риски, связанные с возможным высвобождением при биодеградации D-аминокислот или же диаминов, для которых в литературе описаны нейротоксические (Kiriyama Y, Nochi H. D-Amino Acids in the Nervous and Endocrine Systems. Scientifica. 2016, 2016:6494621) и общетоксические (Robert A. Smiley. "Hexamethylenediamine" in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2005; Til H.P., Falke H.E., Prinsen M.K., Willems M.I. Acute and subacute toxicity of tyramine, spermidine, spermine, putrescine and cadaverine in rats. Food. Chem. Toxicol. 1997, v. 35, № 3-4, pp. 337-348) эффекты.

В настоящее время сохраняется необходимость разработки новых доступных способов получения сшитых агентами нулевой длины высокоустойчивых к ферментативной деградации коллагеновых материалов.

Краткое изложение сущности изобретения

Поставленная задача решена в результате разработки способа получения сшитых карбодиимидами высокоустойчивых к ферментативной деградации коллагеновых материалов, где предложенный способ включает:

- стадию дезамидирования боковых групп остатков аспарагина и глутамина в составе альфа-цепей коллагена путем обработки исходного коллагенсодержащего сырья водным раствором гидроокиси щелочного металла,

- стадию отмывки полученного на предыдущей стадии дезамидированного коллагенового материала от водного раствора гидроокиси щелочного металла; и

- последующую стадию сшивания дезамидированного коллагенового материала карбодиимидом в водной, водно-органической или органической среде;

- стадию отделения полученного сшитого карбодиимидом коллагенового материала от промежуточных продуктов реакции сшивания и непрореагировавшего карбодиимида путем обработки материала водным раствором основания и последующей его промывки.

В конкретном варианте воплощения предложенного способа промывку сшитого карбодиимидом коллагенового материала проводят буферным раствором и затем водой.

В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа в качестве исходного коллагенсодержащего сырья используют выделенный из тканей позвоночных животных, включая человека, или же полученный рекомбинантным путем фибриллярный коллаген I, II, III, V, XI, XXIV и XXVI типов.

В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа в качестве исходного коллагенсодержащего сырья используют очищенный от клеточных компонентов внеклеточный матрикс соединительных тканей позвоночных животных, включая человека.

В других конкретных вариантах воплощения предложенного способа в качестве водного раствора гидроокиси щелочного металла применяют водный раствор гидроокиси лития, водный раствор гидроокиси натрия или водный раствор гидроокиси калия.

В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа концентрация водного раствора гидроокиси щелочного металла составляет от 0,3М до концентрации насыщенного раствора.

В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа обработку исходного коллагенсодержащего сырья водным раствором гидроокиси щелочного металла осуществляют при температуре от 0 до 45°С, предпочтительно, в диапазоне 4-32°С в течение 8-168 часов, предпочтительно, 17-43 часов, более предпочтительно 24-36 часов.

В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа водный раствор гидроокиси щелочного металла может дополнительно содержать электролиты.

В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа отмывку дезамидированного коллагенового материала от водного раствора гидроокиси щелочного металла проводят водой, водным раствором солей сильных минеральных кислот, водным раствором слабых минеральных кислот, водным раствором слабых органических кислот, буферным раствором либо их различными комбинациями.

В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа в качестве карбодиимида используют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, N, N’-диизопропилкарбодииимид, 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимид, 1,3-дициклогексилкарбодиимид, а также их солевые формы.

В другом конкретном варианте воплощения предложенного способа сшивание дезамидированного коллагенового материала карбодиимидом проводят в присутствии N-гидроксисукцинимида.

Еще одним объектом настоящего изобретения является биомедицинский продукт, предназначенный для имплантации в ткани организма, содержащий высокоустойчивый к ферментативной деградации коллагеновый материал, полученный описанным выше способом.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 схематично изображен химический принцип получения сшитых коллагеновых материалов, изложенный в настоящем изобретении. На первом этапе проводят обработку исходного белка (1) раствором гидроокиси щелочного металла, что приводит к превращению остатков глутамина и аспарагина в остатки глутаминовой и аспарагиновой кислот. На втором этапе осуществляют химическую сшивку полученного дезамидированного белка (3) при помощи карбодиимида. Сочетание данных этапов обработки позволяет получить белок с увеличенным количеством ковалентных сшивок (4) по сравнению с белком, сшитым карбодиимидом без предварительной обработки раствором гидроокиси щелочного металла (2). Повышенное число внутри- и межмолекулярных сшивок в свою очередь обуславливает высокую ферментативную устойчивость белка.

На Фиг. 2 показано содержание амидного азота в исходном коллагенсодержащем сырье (КСС) и дезамидированном коллагеновом материале (ДАКМ). Звездочкой отмечено значение статистически достоверно (p < 0,05) отличающееся от значения группы КСС.

На Фиг. 3 показаны репрезентативные ИК-спектры исходного коллагенсодержащего сырья (а), дезамидированного коллагенового материала (б), а также их наложение (в).

На Фиг. 4 показано количество микромоль аминогрупп на 1 г коллагенсодержащего сырья (КСС), сшитого КСС, дезамидированного коллагенового материала (ДАКМ) и сшитого ДАКМ (а), а также степень сшивки сшитых КСС и ДАКМ, выраженная в % (б). Звездочкой отмечены значения статистически достоверно (p < 0,05) отличающиеся от значений группы сшитого КСС.

На Фиг. 5 показаны массовые доли образцов коллагенсодержащего сырья (КСС), сшитого КСС, дезамидированного коллагенового материала (ДАКМ), сшитого ДАКМ, а также радиационно стерилизованного сшитого ДАКМ (Ст. сшитый ДАКМ), сохранившиеся после ферментативной обработки трипсином (а) и коллагеназой (б). Звездочкой отмечены значения статистически достоверно (p < 0,05) отличающиеся от значений группы сшитого КСС.

На Фиг. 6 приведены показатели жизнеспособности клеток линии MDCK при 48-и часовом культивировании в различных разведениях экстракта сшитого дезамидированного коллагенового материала, а также в отрицательном контрольном экстракте (ОК).

На Фиг. 7 показаны репрезентативные макрофотоснимки иссеченных лоскутов кожи мышей с инъекционными имплантатами через 4 недели после введения.

На Фиг. 8 представлены репрезентативные микрофотографии поперечных гистологических срезов инъекционных имплантатов через 4 недели после введения. Окрашивание гематоксилином и эозином.

На Фиг. 9 представлены репрезентативные микрофотографии краевых участков инъекционных имплантатов с фиброзной капсулой через 4 недели после введения на поперечных гистологических срезах. Окрашивание гематоксилином и эозином.

На Фиг. 10 приведены показатели средней толщины фиброзной капсулы вокруг инъекционных имплантатов через 4 недели после введения. Значения групп, отмеченные звездочкой, достоверно (p < 0,05) отличаются от значения группы животных, которым вводили имплантат Radiesse.

Подробное описание изобретения

В качестве исходного сырья для изготовления сшитых карбодиимидами высокоустойчивых к ферментативной деградации коллагеновых материалов, предназначенных для биомедицинского применения, могут быть использованы белки группы фибриллярных коллагенов, а именно типов I, II, III, V, XI, XXIV, XXVI, выделенные из соединительных тканей животных по различным методикам, описанным в литературе. Также могут быть использованы рекомбинантные коллагены указанных типов, полученные в различных системах in vitro. Однако применение рекомбинантных белков является менее предпочтительным, что связано с наличием в них низкого числа природных внутри- и межмолекулярных сшивок и, соответственно, с пониженной устойчивостью к необратимой денатурации при высоких значениях pH. В качестве исходного материала может выступать также белок в составе конструкции желаемой формы, например в виде пористых каркасов, предназначенных для заселения клетками, или же плоских мембран для направленной тканевой регенерации.

Другим видом исходного коллагенсодержащего сырья, которое может быть использовано применительно к способу, описанному в настоящем изобретении, являются очищенные различными методами от клеточных компонентов (бесклеточные или децеллюляризированные) внеклеточные матриксы соединительных тканей животных. Наилучшим образом для получения сшитых коллагеновых материалов подходят бесклеточные матриксы с количественным преобладанием в их структуре волокон коллагена, такие как внеклеточные матриксы плотных волокнистых соединительных тканей (например, сухожилия или сетчатого слоя дермы кожи) или волокнистой хрящевой ткани (например, межпозвоночного диска). При этом волокнистые белки матриксов тканей взрослых животных более устойчивы к денатурации в растворах с высокими значениями pH, нежели белки тканей молодых животных или эмбриональных тканей, что обусловлено наличием большего числа природных межмолекулярных сшивок. В связи с этим они могут быть подвержены обработке раствором с более высокой концентрацией щелочи, что будет способствовать ускорению и повышению эффективности дезамидирования коллагена. В свою очередь для обработки матриксов волокнистых соединительных и хрящевых тканей молодых животных, а также соединительных тканей со значительной долей аморфного компонента (например, матрикса стромы органов), следует использовать меньшие концентрации щелочи, во избежание их деструкции.

Поскольку обработка растворами с высокими значениями pH является одним из известных методов удаления из ткани клеточных компонентов (Gilpin A., Yang Y. Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications. Biomed Res Int. 2017, v. 2017: 9831534), обработка коллагенсодержащего сырья водным раствором гидроокиси щелочного металла для химической модификации боковых групп остатков аминокислот полипептидных цепей коллагена может одновременно применяться и как дополнительный этап очистки внеклеточного матрикса от клеток в случае, если используемый внеклеточный матрикс не был предварительно децеллюляризирован до желаемой степени.

В качестве раствора гидроокиси щелочного металла для обработки коллагенсодержащего сырья применяют водный раствор гидроокиси лития, натрия или калия в концентрации от 0,3М до концентрации насыщенного раствора. Концентрацию гидроокиси щелочного металла выбирают в зависимости от устойчивости коллагена в составе коллагенсодержащего сырья к денатурации в щелочных условиях. Так при низкой устойчивости коллагена предпочтительно использовать концентрацию, не превышающую 1,5М. Обработку раствором гидроокиси щелочного металла следует проводить при температуре, не приводящей к нарушению структурной целостности обрабатываемого белка при высоких значениях рН, в диапазоне 0-45°С, предпочтительно, в диапазоне 4-32°С. При этом для обработки коллагена с низкой устойчивостью к щелочной денатурации желательно использовать диапазон 4-15°С, тогда как наибольшая эффективность дезамидирования боковых групп коллагена у устойчивого к щелочи белка наблюдается в интервале температур 10-30°С. Для проведения дезамидирования коллагенсодержащее сырье помещают в емкость, заполненную предварительно приготовленным раствором гидроокиси щелочного металла таким образом, чтобы данный раствор полностью его покрыл. Желательно, чтобы объем раствора превышал объем коллагенсодержащего сырья не менее чем в два раза. Материал емкости, в которой производится обработка, должен быть устойчив к щелочам. Емкость может помещаться в термостат или холодильник для поддержания необходимого температурного режима инкубации. Время инкубации в растворе гидроокиси щелочного металла должно составлять 8-168 часов, предпочтительно, 17-43 часов, более предпочтительно 24-36 часов. При этом количество образуемых дополнительных карбоксильных групп на молекулах коллагена позволяет значительно увеличить степень сшивки материала при последующей обработке карбодиимидом. Длительность обработки определяется устойчивостью исходного материала к воздействию щелочи, и не должна приводить к деструкции коллагенсодержащего сырья. Обработка коллагенсодержащего сырья растворами с высоким значением pH вызывает ионизацию карбоксильных групп, что приводит к набуханию материала и возможной потере его структурной целостности. Для предотвращения данного неблагоприятного явления в водный раствор гидроокиси щелочного металла, могут быть дополнительно внесены электролиты для повышения ионной силы раствора. В качестве таких добавок используют соли сильных неорганических кислот, наиболее предпочтительно соли серной кислоты. В результате инкубации в растворе гидроокиси щелочного металла происходит дезамидирование остатков глутамина и аспарагина в коллагене, содержащемся в обрабатываемом сырье, с превращением их в остатки глутаминовой и аспарагиновой кислот соответственно. Таким образом, увеличивается число карбоксильных групп в материале, способных на этапе проведения сшивки вступить в реакцию с карбодиимидом (Рис. 1).

После проведения обработки жидкость сливают из емкости и проводят отмывку материала путем инкубации в отмывочных растворах с периодической их заменой. В качестве последних могут быть использованы водопроводная или дистиллированная вода, а также водные растворы слабых минеральных и органических кислот (например, уксусной или угольной), водные растворы сильных электролитов (например, солей минеральных кислот), а также буферные растворы. При этом применение водных растворов сильных электролитов целесообразно в случае значительного набухания материала в растворе гидроокиси щелочного металла, а использование водных растворов слабых кислот и буферных растворов - при необходимости ускорения достижения pH смыва целевых значений. Возможно проведение отмывки путем последовательного использования различных растворов. Так, наиболее целесообразно сначала проводить отмывку водой или водными растворами электролитов, затем инкубировать в водных растворах кислоты или буфера, а на заключительном этапе проводить промывку водой. Наиболее предпочтительно использовать соотношение объема отмывочного раствора к объему коллагенового материала не менее 10:1. Эффективность отмывки повышается при перемешивании содержимого емкости, которое можно проводить вручную или же при помощи приборов-шейкеров различной конструкции. Достижение целевых значений pH смыва можно контролировать методом ионометрии при помощи pH-метра или же используя индикаторы. По завершении процесса отмывки полученный материал может быть охарактеризован различными биохимическими методами, описанными в научной литературе. Так, например, сохранность структурной организации коллагена в составе материала, может быть оценена методом инфракрасной (ИК) спектроскопии (Sylvester M.F., Yannas I.V,. Salzman E.W., Forbes M.J. Collagen banded fibril structure and the collagen-platelet reaction. Thromb Res. 1989, v. 55, № 1, pp. 135-148). Эффективность дезамидирования коллагена в растворе гидроокиси щелочного металла может быть оценена по содержанию амидного азота в полученном материале (Eastoe J.E., Long J.E., Willian L.D. The amide nitrogen content of gelatins. Biochem. J. 1961, v. 78, pp. 51-56). Полученный дезамидированный коллагеновый материал с увеличенным числом карбоксильных групп подвергают сшиванию раствором карбодиимида с целью значительного повышения его ферментативной устойчивости. Для проведения сшивки можно использовать как невысушенный влажный дезамидированный коллагеновый материал, так и лиофильно высушенный, или высушенный на воздухе, или высушенный при термостатировании, или высушенный при пониженном давлении с нагревом не выше температуры денатурации белка.

В качестве карбодиимида для сшивки используют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, N, N’-диизопропилкарбодиимид, 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимид, 1,3-дициклогексилкарбодиимид, а также их солевые формы (например, гидрохлориды). Однако наилучшим образом для реализации методики, описанной в настоящем изобретении, при производстве материала медицинского назначения подходит 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, что обуславливается его коммерческой доступностью, растворимостью в воде и простотой удаления его и продуктов его превращения из реакционной среды. Реакцию сшивания дезамидированного коллагена проводят в водных, водно-органических или органических средах, основываясь на свойствах выбранного карбодиимида. Также можно использовать буферные растворы для поддержания заданных условий реакции (значения рН и ионной силы). Так, например в случае 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида наиболее предпочтительно в качестве реакционной среды использовать фосфатный буфер. Если материал имеет склонность к излишнему набуханию в водных средах, допустимо добавление в данный буфер органического растворителя, например, этилового или изопропилового спирта. Количество вносимого в реакционную смесь сшивающего агента следует подбирать, учитывая число реакционноспособных групп в материале. Также для дополнительного увеличения реакционноспособности активируемых карбоксильных групп карбодиимид может быть использован в комбинации с N-гидроксисукцинимидом. Однако высокая устойчивость сшитого дезамидированного коллагенового материала к ферментативной деградации коллагеназами достигается и без применения данного вещества.

Прошедший обработку раствором гидроокиси щелочного металла коллагеновый материал помещают в емкость достаточного объема и заливают раствором сшивающего агента. Желательно, чтобы объем раствора карбодиимида превышал объем дезамидированного коллагенового материала не менее чем в пять раз. Раствор должен полностью покрывать материал. Концентрацию сшивающего агента, а также время обработки, следует выбирать в зависимости от типа и структуры материала, используемого для сшивки. Так, как правило, более толстые и плотные материалы (например, пласты очищенного внеклеточного матрикса плотных волокнистых соединительных тканей) требуют большей концентрации карбодиимида и более продолжительного времени инкубации для достижения желаемой ферментативной устойчивости, нежели тонкие, рыхлые, пористые или измельченные (например, тонкие мембраны и губки из выделенного коллагена или пласты очищенного матрикса эмбриональных тканей, а также измельченное на мельнице до мелкодисперсного порошка коллагенсодержащее сырье различного происхождения). Использование перемешивания при обработке может ускорить процесс сшивки. Поскольку при обработке раствором гидроокиси щелочного металла разрушается часть природных ковалентных сшивок между молекулами коллагена в составе коллагенсодержащего сырья, происходит значительное понижение температуры его денатурации во влажном состоянии. В связи с этим температуру обработки раствором сшивающего агента выбирают исходя из гидротермоустойчивости дезамидированного материала. Материалы с низкой гидротермоустойчивостью наиболее целесообразно инкубировать при охлаждении до 4-10°С. Параметры гидротермоустойчивости дезамидированного материала перед проведением сшивки могут быть установлены описанными в научной литературе физико-химическими методами, например методом дифференциальной сканирующей калориметрии.

По окончании сшивки материала необходимо провести гидролиз промежуточных продуктов взаимодействия карбоксильных групп с молекулами карбодиимида, преимущественно О-ацилизомочевин, а также непрореагировавшего карбодиимида, если последний остался в смеси. Для этого из емкости удаляют раствор сшивающего агента и добавляют к сшитому материалу водный раствор основания, наиболее предпочтительно использовать водные растворы гидрофосфатов, карбонатов, гидрокарбонатов. Выдерживают материал в течение не менее чем 0,5 часа. Далее проводят отмывку материала от низкомолекулярных продуктов реакций сшивания и гидролиза. Для этого раствор основания удаляют и не менее двух раз промывают буферным раствором с близким к нейтральному значением рН, например, фосфатным буфером pH 7,0-7,4 в течение такого же времени. После этого не менее трех раз проводят финальную промывку водой от низкомолекулярных продуктов реакций сшивания и гидролиза, а также компонентов используемых растворов до достижения pH смыва нейтральных значений.

Полученный сшитый коллагеновый материал может быть охарактеризован различными биохимическими и физическими методами, описанными в научной литературе. Так, например, степень сшивки материала может быть проанализирована путем химического определения числа свободных аминогрупп методом цветной реакции с тринитробензосульфокислотой (Bubnis W.A., Ofner C.M. The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 1992, v. 207, № 1, pp. 129-133). Ферментативная устойчивость материала к перевариванию коллагеназами может быть оценена посредством инкубации фрагментов материала в растворе коллагеназы, выделенной из Clostridium histolyticum.

Полученный сшитый коллагеновый материал может быть заморожен или высушен различными способами для осуществления длительного хранения, а также подвергнут различным видам стерилизации, если это не будет оказывать существенного влияния на его характеристики.

Из полученного сшитого коллагенового материала могут быть изготовлены по различным опубликованным в научной литературе или запатентованным методикам устойчивые к биорезорбции имплантируемые в ткани организма изделия медицинского назначения.

Описанные выше стадии получения сшитого коллагенового материала могут быть легко масштабированы и валидированы для применения на производстве продукции фармацевтического назначения. При этом для промышленного изготовления данных материалов может быть использовано надлежащим образом сертифицированное фармацевтическое оборудование, включающее емкостные реакторы, оснащенные перемешивающими устройствами и системой поддержания температуры. Материалы используемого оборудования должны быть устойчивы к воздействию щелочей.

Область применения

Сшитые карбодиимидами высокоустойчивые к ферментативной деградации коллагеновые материалы, полученные способом, описанным в настоящем изобретении можно применять в области:

(1) изготовления мембран или каркасов (скаффолдов) для направленной тканевой регенерации, предназначенных для применения в стоматологии, челюстно-лицевой, полостной и реконструктивной хирургии;

(2) изготовления имплантатов-носителей для трансплантации клеток, предназначенных для применения в области регенеративной биомедицины;

(3) изготовления инъекционных имплантатов для аугментации мягких тканей, предназначенных для применения в косметологии, урологии, отоларингологии, реконструктивной хирургии;

(4) изготовления гемостатических губок и раневых покрытий, предназначенных для применения в травматологии и дерматологии.

Пример

В качестве исходного коллагенсодержащего сырья (КСС) использовали очищенный от клеточных компонентов методом детергентной обработки внеклеточный матрикс сетчатого слоя дермы Быка домашнего (Bos taurus taurus). Для его получения проводили забор кожи из чепрачной области у свежезабитых животных возрастом 16-18 месяцев. Полученную ткань обрабатывали по стандартной методике водным раствором, содержащим сульфида натрия и гидроокись кальция для удаления волосяных луковиц. Затем для удаления клеточных компонентов ткань отмывали 0,1% раствором детергента Tween-80 в течение 12 часов. Двоильной машиной удаляли слой дермы, содержащий волосяные луковицы вместе с эпидермисом, а также подлежащие под дермой фасцию или гиподерму. Ткань разрезали на фрагменты удобного для дальнейшей работы размера. Полученный волокнистый бесклеточный матрикс плотной неоформленной соединительной ткани дермы отмывали проточной водой для удаления реактивов. Контроль эффективности удаления клеточных компонентов из ткани проводили путем морфологического анализа гистологических срезов полученного матрикса, а также путем биохимического определения в нем двухцепочечной ДНК. Гистологическое исследование не выявило в материале наличия клеточных компонентов, содержание дцДНК при этом составило всего 3,85 нг/мг, что свидетельствует об успешной децеллюляризации.

Для получения дезамидированного коллагенового материала (ДАКМ) из исходного сырья фрагменты матрикса дермы массой 3000 г помещали в пластиковую бочку, добавляли 7000 мл водного раствора, содержащего гидроокись калия в концентрации 2,0М и калиевую соль серной кислоты в концентрации 0,6М и выдерживали при комнатной температуре в течение 45 часов. Затем жидкость заменяли на раствор калиевой соли серной кислоты в концентрации 0,6М объемом 8000 мл, перемешивали сутки, при этом четыре раза заменяли раствор на свежий. После этого фрагменты материала двукратно промывали фосфатным буфером рН 6,5 по 7000 мл, а затем многократно отмывали водой.

Для увеличения площади поверхности полученный ДАКМ пропускали через электрический роторно-ножевой измельчитель (Bosh, Германия), а затем высушивали в потоке воздуха в асептических условиях.

Для оценки степени дезамидирования коллагена проводили определение содержания амидного азота в материале. Для этого 1 г лиофильно высушенного материала растворяли в 20 мл 2N раствора HCl и кипятили с обратным холодильником в течение 1,0-1,5 ч. Затем объем доводили дистиллированной водой до 50 мл в мерной колбе. Аликвоту 5 мл переносили в круглодонную колбу и добавляли 20 мл раствора, содержащего тетраборат натрия (0,05М) и гидроокись натрия (0,15М). Полученный раствор дистиллировали и собирали 15 мл дистиллята, который затем титровали 0,01M раствором HCl с индикатором метиловым оранжевым. Определяли содержание амидного азота из расчета, что 1 мл ушедшей на титрование 0,01М хлористоводородной кислоты, соответствует 0,1401 мг азота. Для каждого образца проводили три испытания.

Для анализа изменения количества свободных карбоксильных групп при дезамидировании материала применяли метод потенциометрического титрования. Образцы исходного КСС и ДАКМ массой около 130 мг выдерживали 24 ч в 1М растворе уксусной кислоты, после чего замораживали и лиофилизировали. Затем образцы выдерживали в 0,5М растворе трифторуксусной кислоты и вновь лиофилизировали и выдерживали в эксикаторе до достижения постоянной массы. К каждому образцу добавляли по 13 мл деионизированной воды, и после полного пропитывания образцов в вакууме проводили потенциометрическое титрование 0,1М раствором NaOH. Измеряли объем щелочи, ушедший на титрование карбоксильных групп в образцах исходного КСС и ДАКМ. Рассчитывали число карбоксильных групп, приходящееся на одну молекулу коллагена, по следующей формуле:

n(COOH)=V*M*Mw/(1000*m), где

V - объем титранта в мл, М - молярность титранта, Mw - молекулярная масса коллагена, принимаемая за 280000 г/моль, m - масса навески образца.

Для оценки степени денатурации коллагена в материале анализировали сохранность структуры тройной спирали молекул тропоколлагена методом ИК-спектроскопии. Для проведения анализа использовали лиофильно высушенный материал, измельченный на универсальной режущей мельнице. Спектры поглощения регистрировали на ИК-Фурье спектрометре Spectrum 65 (Perkin Elmer) методом НПВО с разрешением 4 см^-1 в интервале от 650 до 4000 см^-1. Определяли соотношение значений интенсивности пиков при длинах волн 1235/1450 см^-1 для оценки целостности структуры тройной спирали коллагена. Полоса поглощения при 1235 см^-1 отвечает плоскостным колебаниям связи C-N (амид III) и валентным колебаниям связи N-H, которые характерны для тройной спирали коллагена, и являются чувствительными к изменениям в структуре белка. Полоса поглощения при 1450 см^-1 обусловлена колебаниями пироллидинового кольца пролина и гидроксипролина и не чувствительна к изменениям вторичной структуры. Соотношение интенсивности данных полос поглощения у нативного коллагена близко к 1, а у денатурированного коллагена значение этого показателя близко к 0,6 (Sylvester M.F., Yannas I.V,. Salzman E.W., Forbes M.J. Collagen banded fibril structure and the collagen-platelet reaction. Thromb Res. 1989, v. 55, № 1, pp. 135-148).

Проведенный биохимический анализ показал, что обработка очищенного внеклеточного матрикса дермы кожи раствором гидроокиси щелочного металла приводит к практически четырехкратному снижению содержания амидного азота в получаемом коллагеновом материале (Рис. 2), что сопровождается статистически значимым увеличением числа титруемых карбоксильных групп в расчете на молекулу коллагена (с 249±4 до 374±6). Полученные данные свидетельствуют о прохождении процесса дезамидирования групп боковых цепей остатков аспарагина и глутамина с превращением их в остатки апарагиновой и глутаминовой кислот соответственно. Таким образом, полученный ДАКМ характеризуется повышенным содержанием карбоксильных групп, способных вступать в реакцию образования амидной связи с аминогруппами остатков лизина.

Для контроля сохранности пространственной структуры коллагена после проведенной обработки раствором с высоким значением pH методом ИК-спектроскопии проанализировали как исходное КСС, так и ДАКМ, и сравнили их спектры поглощения (Рис. 3). Было показано, что спектры всех образцов содержат характерные для белков полосы. Так во всех спектрах присутствует широкая полоса в диапазоне 3000-3500 см^-1, отвечающая за валентные колебания аминогруппы и амидных групп, а также ОН-групп. Также выявлены полосы при 1630 см^-1 и 1530 см^-1, характерные для деформационных колебаний связи С=О в амидных группах (амид I) и связи N-H (амид II) в белках, соответственно. Соотношение интенсивности полос поглощения при длинах волн 1235/1450 см^-1 составляло 1,03±0,01 для КСС и 1,01±0,01 для ДАКМ, что свидетельствовало о сохранности структуры тройной спирали коллагена. Таким образом, условия обработки исходного КСС позволяют гидролизовать боковые амидные группы, не приводя к необратимой денатурации белка.

На следующем этапе ДАКМ подвергали химической сшивке с помощью карбодиимида. Для этого материал массой 100 г помещали в пластиковую емкость с крышкой, заполненную 1000 мл свежеприготовленного 1,3М раствора 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида в фосфатно-солевом буфере. Концентрацию сшивающего агента подбирали исходя из количества реакционноспособных карбоксильных групп в материале, определенного методом потенциометрического титрования, таким образом, чтобы количество вещества карбодиимида соответствовало мольэквиваленту карбоксильных групп. Материал выдерживали в растворе в течение 22 часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере. По завершении реакции удаляли раствор карбодиимида, добавляли к материалу 0,05М водный раствор гидрофосфата натрия (1500 мл) и перемешивали на орбитальном шейкере в течение 45 минут. Затем дважды промывали фосфатым буфером (рН 7,2), после чего пять раз промывали водой.

Сшитый ДАКМ высушивали в потоке воздуха в асептических условиях. Далее материал биохимически характеризовали. Для оценки влияния стадии дезамидирования на эффективность сшивки предварительно изготавливали образец сравнения - сшитое карбодиимидом по идентичной методике исходное КСС (бесклеточный матрикс дермы), не прошедшее дезамидирование. Дополнительно для оценки устойчивости сшитого материала к радиационной стерилизации образец материала подвергали радиационной стерилизации дозой 15,6 кГр.

Эффективность сшивки материалов оценивали напрямую путем определения числа свободных аминогрупп методом цветной реакции с тринитробензосульфокислотой (TNBS). Для этого к образцам массой 2-4 мг добавляли 0,5 мл 4% (w/v) раствора NaHCO₃ и 0,5 мл свежеприготовленного 0,05% (w/v) раствора TNBS (Sigma) и инкубировали 2 часа при 40°С. После этого добавляли 1,5 мл 6M раствора HCl и гидролизовали образцы 90 мин при 60°С. Контрольные образцы готовили так же, как и экспериментальные, за исключением того, что HCl добавляли до внесения TNBS. После гидролиза разбавляли реакционную смесь 2,5 мл дистиллированной воды, охлаждали до комнатной температуры и регистрировали интенсивность поглощения полученных растворов при 345 нм на спектрофотометре СФ 2000 (ОКБ Спектр, Россия). В кювету сравнения помещали контрольные образцы. Значение поглощения образцов соотносили с калибровочной кривой, полученной для глицина в водном растворе NaHCO₃ (0,1 мг/мл) и вычисляли количество микромоль аминогрупп, приходящееся на 1 г исследуемого материала. Степень сшивки образцов рассчитывали по следующей формуле:

, где

А_с.о. - интенсивность поглощения образца сшитого материала при 345 нм, М_с.о. - масса образца сшитого материала, А_и.о. - интенсивность поглощения образца исходного материала при 345 нм, М_и.о. - масса образца исходного материала.

Для оценки гидротермоустойчивости материала проводили определение температуры его денатурации с использованием дифференциального сканирующего калориметра теплового потока DSC 214 Polyma (NETZSCH, Германия) в атмосфере воздуха. Навеска образца составляла 5-12 мг в зависимости от плотности препарата. Материал извлекали из раствора, промокали фильтровальной бумагой, после чего отделяли необходимое количество с помощью скальпеля и взвешивали. Навески образцов помещали в алюминиевые тигли диаметром 6 мм (NETZSCH-Geratebau GmbH, Германия). Нагрев образцов осуществляли в температурном диапазоне +20-+160°С при скорости сканирования 5°/мин с последующим охлаждением до +20°C со скоростью 10°/мин. Термограммы ДСК всех образцов были пронормированы на навеску (1,0±0,1) мг. Обработку данных осуществляли при помощи управляющей программы Proteus.

Для оценки резистентности материалов к деградации протеазами проводили исследование их устойчивости к перевариванию в модельных условиях in vitro двумя типами ферментов: 1) коллагеназой - специфичной к гидролизу трехспиральной молекулы тропоколлагена с нативной структурой; 2) трипсином - обладающим способностью к гидролизу только лишь денатурированного коллагена (Weadock K.S., Miller E.J., Keuffel E.L., Dunn M.G. Effect of physical crosslinking methods on collagen-fiber durability in proteolytic solutions. J Biomed Mater Res. 1996, v. 32, № 2, pp. 221-226). Для проведения анализа из лиофильно высушенных материалов вырезали по 6 фрагментов массой около 10 мг. Определяли точную массу фрагментов, а также микроцентрифужных пробирок при помощи аналитических весов Discovey DV114C (OHAUS, США). Помещали каждый фрагмент в отдельную пробирку. В половину пробирок вносили по 1мл раствора коллагеназы из Clostridium hystolyticum (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 1 мг/мл (активность фермента не менее 2,0 FALGPA-единиц), приготовленного на 0,01М фосфатно-солевом буфере (pH 7,2-7,4), содержащем 0,005% азида натрия. Во вторую половину пробирок - по 1 мл раствора трипсина из поджелудочной железы быка (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 0,5 мг/мл (активность фермента не менее 5000 BAEE-единиц), приготовленного на 0,01М фосфатно-солевом буфере (pH 7,2-7,4), содержащем 0,005% азида натрия. Образцы термостатировали 72 часа при +37°С, затем центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 мин и осторожно удаляли надосадочную жидкость при помощи вакуумного отсасывателя. После этого в каждую пробирку добавляли по 1 мл дистиллированной воды, встряхивали на лабораторном вортексе и центрифугировали на микроцентрифуге 15 мин при 5000 об/мин. Удаляли надосадочную жидкость вакуумным отсасывателем. Повторяли данную процедуру отмывки образцов еще два раза и по завершении лиофильно высушивали материал в пробирках. Определяли точную массу пробирок с образцами на аналитических весах. Рассчитывали в % массовую долю образца, не подвергшуюся деградации в растворе фермента (М_нд), как показатель его ферментативной устойчивости по формуле:

, где

М - масса пробирки с лиофильно высушенным недеградировавшим в растворе фермента материалом,

М_обр- исходная масса фрагмента лиофильно высушенного материала,

М_пр- масса пустой пробирки.

При оценке эффективности сшивки методом определения свободных аминогрупп исходного КСС, сшитого КСС, ДАКМ и сшитого ДАКМ, было показано, что количество свободных аминогрупп одинаково в исходном КСС и в ДАКМ, и составляет в среднем около 80 мкмоль на 1 г материала, и снижается при сшивке обоих материалов (Рис. 4а). Однако рассчитанная величина степени сшивки ДАКМ практически двукратно статистически значимо превышает этот показатель у КСС (Рис. 4б). Это свидетельствует об увеличении эффективности процесса формирования сшивок (амидных связей), в случае предварительного дезамидирования коллагенового материала.

В результате исследования гидротермоустойчивости методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) были изучены теплофизические свойства образцов коллагеновых материалов при нагревании, и установлено наличие тепловых эффектов, соответствующих процессам денатурации белка. В таблице 1 приведены сводные результаты теплофизического анализа всех образцов, указаны средние значения для трех испытаний.

Таблица 1. Денатурация (1й эндотермический пик) образцов коллагеновых материалов, изученная методом ДСК.

Образец	Начальная температура, °С		Температура максимума, °С		Конечная температура, °С		Энтальпия, Дж/г
	(Δ± 2°С)	Среднее значение	(Δ± 2°С)	Среднее значение	(Δ±2°С)	Среднее значение	(Δ± 2Дж/ г)	Среднее значение
Исходное КСС	58	57	62	70	95	97	30	33
	57		75		97		31
	56		73		100		37
Сшитое КСС	63	62	72	72	86	86	12	13
	60		67		79		11
	64		77		94		17
ДАКМ	33	33	46	42	52	48	15	10
	33		42		49		10
	32		38		43		4
Сшитый ДАКМ	61	61	72	72	82	80	8	9
	61		72		78		9
	61		73		80		11
Стерилизованный сшитый ДАКМ	59	57	72	69	77	73	15	10
	56		-		70		5
	64		66		71		-

Для исходного КСС начало процесса денатурации наблюдалось при средней температуре 57°С, окончание - при 98°С. В свою очередь сшивка КСС не приводила к значительному изменению показателей термостабильности: средняя температура начала процесса денатурации составляла 62°С, а максимум увеличивался лишь на 2°С (Табл. 1).

У ДАКМ средняя температура начала процесса денатурации составляла 33°С, а максимум фиксировался при 42°С, что свидетельствует о значительном снижении термической стабильности ДАКМ по сравнению с исходным КСС. Очевидно, это объясняется разрушением части природных межцепочечных и межмолекулярных ковалентных связей коллагена в результате воздействия раствора с высоким значением рН. Однако термические характеристики сшитого ДАКМ оказались сравнимы с характеристиками сшитого КСС - так начальная температура денатурации составила 61°С, а средняя температура максимума совпадала.

Метод, основанный на изучении устойчивости материала к воздействию протеолитических ферментов, позволяет оценить его резистентность к биорезорбции при имплантации in vivo (McPherson J.M., Ledger P.W., Sawamura S., Conti A., Wade S., Reihanian H., Wallace D.G. The preparation and physicochemical characterization of an injectable form of reconstituted, glutaraldehyde cross-linked, bovine corium collagen. J. Biomed. Mater. Res. 1986, v. 20, № 1, pp. 79-92), а также косвенно отражает эффективность химической сшивки. Была протестирована способность исходных и сшитых КСС и ДАКМ противостоять действию неспецифического фермента - трипсина (Рис. 5а) - и специфического фермента - коллагеназы (Рис. 5б). Анализ показал, что исходное КСС лишь в небольшой степени (около 20%) подвержено ферментативной деградации трипсином. В то же время после обработки КСС сшивающим агентом устойчивость к гидролизу данным ферментом близка к максимальной. В свою очередь ДАКМ практически полностью не устойчив к перевариванию трипсином, что согласуется с данными ДСК, свидетельствующими о начале процесса денатурации белка при температуре проведения данного анализа (37°С) (Табл. 1). Сшивка ДАКМ полностью нивелирует потерю резистентности материала к трипсину, увеличивая значения данного показателя. Было выявлено, что как КСС, так и ДАКМ почти полностью резорбируются коллагеназой. Сшивание КСС не оказывает какого-либо влияния на данный показатель. Однако сшивание ДАКМ обеспечивает радикальное увеличение устойчивости к перевариванию коллагенолитическим ферментом, приближающейся к 100%.

Данные проведенного химического исследования свидетельствуют о том, что дезамидирование боковых групп остатков аспарагина и глутамина в коллагене, предшествующее обработке раствором карбодиимида, позволяет получить в результате сшивания коллагеновый материал с увеличенным количеством внутри- и межмолекулярных ковалентных сшивок, что приводит к появлению выраженной устойчивости к деградации ферментом со специфической коллагенолитической активностью.

Анализ сшитого ДАКМ, подвергнутого радиационной стерилизации, не выявил статистически значимых изменений теплофизических свойств (Рис. 4), а также ферментативной устойчивости (Рис. 5) по сравнению с нестерилизованным материалом, что свидетельствует о возможности применении данного метода его обеззараживания.

Далее для оценки биосовместимости полученного сшитого ДАКМ, а также возможности его применения в качестве структурной основы инъекционного имплантата для аугментации мягких тканей проводили исследование цитотоксичности в экспериментальной модели in vitro, а также сравнительное исследование местного действия после имплантации в модели in vivo.

Образцы материала для проведения биологических исследований предварительно измельчали на режущей мельнице (Fritsch, Германия). Полученный материал в виде мелкодисперсного порошка со средним размером частиц не более 80 мкм упаковывали в пластиковые контейнеры и подвергали радиационной стерилизации дозой 15,6 кГр.

Исследование цитотоксичности проводили при помощи MTS-теста. Для этого клетки линии MDCK высевали в 96-луночные планшеты по 18000 клеток на лунку и культивировали 24 часа при 37°С и 5% CO₂ в среде Игла MEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, а также L-глутамин (300 мкг/мл) и нормоцин (100 мкг/мл). Затем среду заменяли на экстракт материала, полученный путем инкубации в культуральной среде при 37°С в течение 24-х часов, или же на одно из его 6 последовательных двукратных разведений. В качестве отрицательного контроля использовали среду, инкубированную при тех же условиях в отсутствии материала. По истечении 48 часов к клеткам добавляли реагент MTS (Promega) и измеряли оптическую плотность при 492-620 нм на спектрофотометре Sunrise (Tecan). Рассчитывали показатели жизнеспособности клеток, культивированных в присутствии экстракта или отрицательного контроля в % от показателей контрольных клеток, культивируемых в интактной культуральной среде.

Для исследования в модели подкожной имплантации in vivo из полученного стерилизованного измельченного материала готовили 15% суспензионную форму для инъекционного введения по технологии патента RU 2627844. Порошок суспендировали в 0,9% растворе NaCl для инфузий в гомогенизаторе-диспергаторе циркуляционного типа magic LAB (IKA, Германия) путем трехкратного последовательного чередования двух операционных циклов: перемешивания якорной мешалкой (20 об/мин в течение 10 минут) и диспергирования (3000 об/мин при зазоре между ротором и статором 1мм в течение 10 минут). Массовая доля материала в полученной форме (15%) была подобрана в предварительных экспериментах, как обеспечивающая сочетание оптимальных реологических и когезионных свойств получаемых инъекционных имплантатов. Суспензию асептически расфасовывали в стеклянные шприцы объемом 1 мл, оснащенные луер-замком и хранили при температуре от +8°С до +25°С.

Сравнительное исследование местного действия инъекционных имплантатов проводили в модели подкожной имплантации у мышей. Для этого мышам линии Balb/C (n=24) массой 32,5±0,6 г самцам в две точки в межлопаточной области спины через иглу 27G субдермально вводили по 250 мкл 15% суспензии измельченного сшитого ДАКМ (n=6), а также коммерчески доступных имплантатов для аугментации мягких тканей Juvederm Ultra 3 на основе сшитой гиалуроновой кислоты (Allegran, Франция) (n=6) и Radiesse на основе микросфер гидроксиапатита кальция (Merz North America, США) (n=6). Мышам контрольной группы (n=6) проводили аналогичные инъекции 0,9% раствора NaCl для инфузий. Животных выводили из эксперимента путем передозировки наркоза через 4 недели после имплантации образцов. При помощи хирургических ножниц и пинцета иссекали кожные лоскуты из области введения имплантатов. Непосредственно после иссечения производили макрофотосъемку полученных тканей для последующего качественного макроскопического анализа. Затем лоскуты помещали в расправленном состоянии в 10% формалин на фосфатном буфере, подвергали стандартной гистологической обработке и заливали в парафин. При помощи микротома получали срезы толщиной 3 мкм, которые монтировали на предметные стекла и окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Проводили качественное гистологическое исследование полученных препаратов. При этом анализировали состояние имплантатов и окружающих их тканей. Для оценки местного раздражающего действия при имплантации исследуемых образцов проводили анализ гистологических препаратов согласно полуколичественной системе оценки, описанной в приложении E ГОСТ Р ИСО 10993-6-2011. Также дополнительно проводили количественное морфометрическое исследование толщины фиброзной капсулы вокруг имплантатов. Для этого на микроскопе Eclipse Ni-U (Nikon, Япония), используя объектив Plan Fluor 40Х/0,75 (Nikon, Япония), при помощи цифровой камеры DS-Fi1 (Nikon, Япония) получали микрофотографии 8-и произвольно выбранных участков фиброзной капсулы, окружающей имплантаты. На полученных микрофотоснимках, используя программу imageJ, измеряли толщину капсулы на ее поперечных срезах. Для каждого животного рассчитывали среднее значение данного морфометрического показателя по результатам 8-и измерений.

Результаты эксперимента in vitro выявили отсутствие достоверных изменений жизнеспособности клеток при их 48-и часовом культивировании как в разведенном, так и в исходном экстракте сшитого ДАКМ (Рис. 6). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии цитотоксической активности у исследуемого биоматериала.

Макроскопическое исследование введенных под кожу образцов в модели in vivo показало, что имплантаты всех типов покрыты соединительнотканной капсулой, патологические изменения в окружающих тканях не выявляются. В капсулах присутствуют единичные микрососуды, врастающие в имплантаты, наибольшее число которых наблюдается в образцах на основе гидроксиапатита кальция (Рис. 7). Имплантаты на основе сшитого ДАКМ, эластичные при надавливании, имеют целостную структуру и гладкую ровную поверхность, что свидетельствует об их хороших когезионных свойствах. По сравнению с коммерчески реализуемыми дермальными филлерами в экспериментальных имплантатах не наблюдается многократного набухания, как в образцах на основе гиалуроновой кислоты, а также потери структурной целостности имплантата, как в образцах на основе гидроксиапатита кальция (Рис. 7).

Гистологический анализ выявил, что экспериментальные имплантаты, а также имплантаты на основе гиалуроновой кислоты инфильтрированы лейкоцитами преимущественно лишь в поверхностных областях. Среди лейкоцитов преобладают моноциты/макрофаги. От тонкой соединительнотканной капсулы в некоторых местах в толщу имплантатов врастает рыхлая волокнистая соединительная ткань, содержащая фибробласты и сосуды микроциркуляторного русла. В поверхностных областях образцов встречаются единичные гигантские клетки инородных тел (ГКИТ) (Рис. 8, 9). В окружающих тканях кожи патологические изменения практически отсутствуют за исключением небольших очагов моноцитарно/макрофагальной инфильтрации. В свою очередь имплантаты на основе микросфер гидроксиапатита кальция характеризуются наличием выраженного лейкоцитарного инфильтрата, преимущественно смешанного, с сопоставимым соотношением макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов. Лейкоциты инфильтрируют практически всю толщу исследованных образцов за исключением небольших участков в их центральных зонах. Большинство макрофагов имеют ярко базофильную цитоплазму, по-видимому, в следствие фагоцитирования гелеобразующей основы имплантата, состоящей из карбоксиметилцеллюлозы и глицерина. В некоторых поверхностных участках макрофаги образуют плотно лежащие в несколько слоев пласты. В толщу имплантатов между микросферами прорастает значительное количество фиброзной ткани, содержащей клетки лейкоцитарного инфильтрата и сосуды (Рис. 8, 9). Вокруг микросфер материала присутствует большое число ГКИТ. В окружающих тканях кожи выявляется большое число макрофагов с базофильной цитоплазмой.

Результаты полуколичественного исследования местного воздействия образцов, проведенного по системе оценки ГОСТ Р ИСО 10993-6-2011, находятся в полном соответствии с данными качественного морфологического анализа (Табл. 2). Так, интегральный показатель местного действия 15% суспензии сшитого ДАКМ практически соответствует таковому у имплантатов из гиалуроновой кислоты и характеризует оба типа филлеров как оказывающие умеренное местнораздражающее действие. В то же время, значение данного показателя в группе животных, которым инъецировали филлер на основе гидроксиапатита кальция, значительно выше, и свидетельствует о наличии тяжелого местнораздражающего эффекта. Также о более выраженной биосовместимости экспериментальных имплантатов наряду с имплантатами на основе гиалуроновой кислоты свидетельствуют данные количественного морфометрического анализа толщины фиброзной капсулы. Так было выявлено трехкратное статистически достоверное увеличение медианного значения этого параметра у образцов на основе гидроксиапатита кальция по сравнению с образцами других типов (Рис. 10).

По результатам биологических исследований, проведенных как in vitro, так и in vivo, можно заключить, что полученный из очищенного внеклеточного матрикса дермы кожи сшитый карбодиимидом дезамидированный коллагеновый материал не имеет цитотоксических свойств, а также обладает высокой биосовместимостью, сопоставимой с таковой у коммерчески реализуемых дермальных имплантатов, и может быть применен для изготовления филлеров, предназначенных для аугментации мягких тканей.

Claims

1. Способ получения сшитого карбодиимидом устойчивого к ферментативной деградации коллагеназами коллагенового материала, включающий обработку исходного коллагенсодержащего сырья карбодиимидом, отличающийся тем, что способ включает:

- стадию дезамидирования боковых групп остатков аспарагина и глутамина в составе альфа-цепей коллагена путем обработки исходного коллагенсодержащего сырья водным раствором гидроокиси лития, калия или натрия, в концентрации от 0,3 М до концентрации насыщенного раствора при температуре от 0 до 45°С в течение 8-168 часов,

- последующую стадию сшивания дезамидированного коллагенового материала карбодиимидом в водной, водно-органической или органической среде.

2. Способ по п. 1, где обработку исходного коллагенсодержащего сырья на стадии дезамидирования проводят при температуре в диапазоне 4-32°С, в течение 17-43 часов, предпочтительно в течение 24-36 часов.

3. Способ по п. 1 или 2, где проводят отделение полученного сшитого карбодиимидом коллагенового материала от промежуточных продуктов реакции сшивания и непрореагировавшего карбодиимида путем обработки материала водным раствором основания и последующей его промывки буферным раствором, а затем водой.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором в качестве исходного коллагенсодержащего сырья используют выделенный из тканей позвоночных животных, включая человека, или же полученный рекомбинантным путем фибриллярный коллаген I, II, III, V, XI, XXIV и XXVI типов.

5. Способ по любому из пп. 1-3, в котором в качестве исходного коллагенсодержащего сырья используют очищенный от клеточных компонентов внеклеточный матрикс соединительных тканей позвоночных животных, включая человека.

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором водный раствор гидроокиси щелочного металла может дополнительно содержать электролиты.

7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором отмывку дезамидированного коллагенового материала от водного раствора гидроокиси щелочного металла проводят водой, водным раствором солей сильных минеральных кислот, водным раствором слабых минеральных кислот, водным раствором слабых органических кислот, буферным раствором либо их различными комбинациями.

8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором в качестве карбодиимида используют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид, N, N’-диизопропилкарбодиимид, 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)карбодиимид, 1,3-дициклогексилкарбодиимид, а также их солевые формы.

9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором сшивание дезамидированного коллагенового материала карбодиимидом проводят в присутствии N-гидроксисукцинимида.

10. Продукт, предназначенный для имплантации в ткани организма, представляющий собой сшитый карбодиимидом коллагеновый материал, где продукт получен способом по любому из пп. 1-9.