RU2739515C1 - Method for preparing thrombocyte lysate with high content of growth factors - Google Patents

Method for preparing thrombocyte lysate with high content of growth factors Download PDF

Info

Publication number
RU2739515C1
RU2739515C1 RU2020115128A RU2020115128A RU2739515C1 RU 2739515 C1 RU2739515 C1 RU 2739515C1 RU 2020115128 A RU2020115128 A RU 2020115128A RU 2020115128 A RU2020115128 A RU 2020115128A RU 2739515 C1 RU2739515 C1 RU 2739515C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
platelets
platelet
plasma
growth factors
thrombocyte
Prior art date
Application number
RU2020115128A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Наталья Валерьевна Боровкова
Максим Сергеевич Макаров
Майя Викторовна Сторожева
Иван Николаевич Пономарев
Original Assignee
Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы "Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы" (ГБУЗ "НИИ СП ИМ. Н.В. СКЛИФОСОВСКОГО ДЗМ")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы "Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы" (ГБУЗ "НИИ СП ИМ. Н.В. СКЛИФОСОВСКОГО ДЗМ") filed Critical Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы "Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения города Москвы" (ГБУЗ "НИИ СП ИМ. Н.В. СКЛИФОСОВСКОГО ДЗМ")
Priority to RU2020115128A priority Critical patent/RU2739515C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2739515C1 publication Critical patent/RU2739515C1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/19—Platelets; Megacaryocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D21/00—Separation of suspended solid particles from liquids by sedimentation
    • B01D21/26—Separation of sediment aided by centrifugal force or centripetal force
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/491—Blood by separating the blood components

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: invention refers to medicine, namely to regenerative medicine, and can be used for preparation of thrombocyte lysate with high content of growth factors. Venous blood of the patient is taken, blood platelet counts with granules are evaluated, and samples containing at least 35 % of thrombocytes with granules are taken. That is followed by two-step centrifugation of the blood sample, first at 300–500 g for 5–10 minutes to obtain a plasma fraction with thrombocytes without leucocyte and erythrocyte impurities, then at 700–1000 g for 5–20 minutes for deposition of thrombocytes. Supernatant is removed with subsequent resuspension of thrombocytes with a phosphate-saline solution of PBS with pH equal to 7.3, or isotonic 0.9 % sodium chloride until the platelet conglomerates disappear. Then thrombocytes are cryodestructed with subsequent centrifugation of thrombosed samples of thrombocyte lysates at 3000–4000 g for 10–20 minutes at temperature of 4–6 °C for removing all cell fragments from the final preparation.
EFFECT: method enables to obtain a thrombocyte lysate in a plasma-free plasma medium with a high content of growth factors by preparing a platelet concentrate in a certain mode in a plasma-free plasma without cell quality disorders (thrombocyte and granule level, morphofunctional thrombocyte activity, thrombocyte adhesive activity) with high content of growth factors (PDGF, EGF, FGF) and low pro-inflammatory factors.
1 cl, 1 dwg, 4 tbl, 1 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеTechnical field to which the invention relates

Изобретение относится к области медицины, а именно регенеративной медицины, и может быть использовано для стимуляции репаративных и регенеративных процессов в поврежденных тканях.The invention relates to medicine, namely regenerative medicine, and can be used to stimulate reparative and regenerative processes in damaged tissues.

Уровень техникиState of the art

Тромбоциты человека содержат большое количество биологически активных веществ, включая факторы роста и дифференцировки клеток, факторы ангиогенеза, цитокины, которые потенциально имеют очень высокую ценность для различных направлений регенеративной медицины [Golebiewska E.M., Poole A.W. Platelet secretion: From hemostasis to wound healing and beyond // Blood Rev. 2015 May; 29(3):153-62]. В настоящее время в регенеративной медицине распространено использование тромбоцитарных лизатов, полученных путем разрушения аутологичных тромбоцитов пациента при низких или ультранизких температурах. Тромбоцитарные лизаты могут быть приготовлены из образцов с очень высоким содержанием тромбоцитов, что позволяет получать препараты, насыщенные ростовыми факторами. Процедура изготовления тромбоцитарного лизата позволяет одномоментно выделять из клеток все ростовые факторы.Human platelets contain a large number of biologically active substances, including growth and differentiation factors of cells, angiogenesis factors, cytokines, which are potentially very valuable for various areas of regenerative medicine [Golebiewska E.M., Poole A.W. Platelet secretion: From hemostasis to wound healing and beyond // Blood Rev. 2015 May; 29 (3): 153-62]. Currently, in regenerative medicine, the use of platelet lysates obtained by destroying autologous platelets of a patient at low or ultra-low temperatures is widespread. Platelet lysates can be prepared from samples with a very high platelet count, which allows for the preparation of preparations saturated with growth factors. The procedure for making platelet lysate allows the simultaneous isolation of all growth factors from the cells.

Известен способ получения ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток [Патент РФ № 2648162], включающий нормирование образца тромбоцитарной массы до заданной концентрации тромбоцитов посредством центрифугирования и ресуспендирования осадка в супернатанте заданного объема, трехкратный температурный лизис нормированного образца путем замораживания на сутки до -80°С и размораживания при +37°С, осаждение клеточного дебриса посредством центрифугирования, сбор супернатанта с получением индивидуального образца лизата тромбоцитов. Изобретение позволяет получить стандартизованные образцы нексеногенной ростовой добавки для культивирования клеток человека разных типов с функциональной активностью образцов, определяемой по скорости прироста тест-культур, различающейся не более чем на 10,0%. Однако данный способ требует нормирования исходной тромбоцитарной массы в очень узком диапазоне концентраций, включает 3-кратное замораживание и размораживание препарата, что может сопровождаться потерей биологически активных компонентов в плазме, требует пулирования готовых образцов лизата, не учитывает возможное разрушение тромбоцитарных компонентов в размороженной плазме.A known method of obtaining a growth supplement based on platelet lysate for increasing the cell mass of stem, progenitor, differentiated and tumor cells [RF Patent No. 2648162], including normalizing a sample of platelet mass to a given platelet concentration by centrifugation and resuspension of the sediment in the supernatant of a given volume, threefold temperature lysis normalized sample by freezing for a day to -80 ° C and thawing at + 37 ° C, precipitation of cell debris by centrifugation, collecting the supernatant to obtain an individual sample of platelet lysate. EFFECT: invention allows to obtain standardized samples of non-cenogenic growth additive for cultivation of human cells of different types with functional activity of samples, determined by the growth rate of test cultures, differing by no more than 10.0%. However, this method requires normalization of the initial platelet mass in a very narrow concentration range, includes 3-fold freezing and thawing of the drug, which may be accompanied by the loss of biologically active components in the plasma, requires the pooling of ready-made lysate samples, does not take into account the possible destruction of platelet components in thawed plasma.

Известен способ приготовления тромбоцитарного лизата, насыщенного ростовыми факторами, с целью ускорения репарации и регенерации связок [Klatte-Schulz F., Schmidt T., Uckert M., Scheffler S., Kalus U., Rojewski M., Schrezenmeier H., Pruss A., Wildemann B. Comparative Analysis of Different Platelet Lysates and Platelet Rich Preparations to Stimulate Tendon Cell Biology: An In Vitro Study. Int J Mol Sci. 2018 Jan 10;19(1). pii: E212], включающий заготовку тромбоцитных концентратов у доноров крови с помощью аферезного аппарата Trima Accel®, аликвотирование тромбоцитных концентратов на дозы объемом 5 мл, заморозку аликвот при -80°С в течение 30 минут, разморозку аликвот при 37°С на водяной бане и удаление клеточного дебриса путем центрифугирования при 1600 g. Однако предложенная методика требует предварительной заготовки тромбоцитных концентратов путем аппаратного афереза, не учитывает возможной деструкции ростовых факторов в процессе разморозки при 37°C, не позволяет удалить из плазмы вещества, разрушающие ростовые факторы, выделенные из тромбоцитов, не отражает уровень про-воспалительных цитокинов и хемокинов в составе готовых лизатов, не позволяет получить лизат с высоким содержанием факторов роста и репарации тканей и низким содержанием про-воспалительных факторов.A known method of preparing platelet lysate saturated with growth factors in order to accelerate the repair and regeneration of ligaments [Klatte-Schulz F., Schmidt T., Uckert M., Scheffler S., Kalus U., Rojewski M., Schrezenmeier H., Pruss A ., Wildemann B. Comparative Analysis of Different Platelet Lysates and Platelet Rich Preparations to Stimulate Tendon Cell Biology: An In Vitro Study. Int J Mol Sci. 2018 Jan 10; 19 (1). pii: E212], including the preparation of platelet concentrates from blood donors using an apheresis device Trima Accel®, aliquoting platelet concentrates into 5 ml doses, freezing aliquots at -80 ° C for 30 minutes, thawing aliquots at 37 ° C in a water bath and removal of cell debris by centrifugation at 1600 g. However, the proposed technique requires preliminary preparation of platelet concentrates by apparatus apheresis, does not take into account the possible destruction of growth factors during thawing at 37 ° C, does not allow removing substances that destroy growth factors isolated from platelets from the plasma, does not reflect the level of pro-inflammatory cytokines and chemokines as part of ready-made lysates, does not allow to obtain a lysate with a high content of growth factors and tissue repair and a low content of pro-inflammatory factors.

Наиболее близким к заявляемому решению является способ изготовления тромбоцитарного лизата из аутологичной крови для лечения пациентов с переломом шейки плеча [Патент РФ № 2681753], включающий забор у пациента 30 мл венозной крови в стерильные пробирки с антикоагулянтом ЭДТА, центрифугирование крови с ускорением 300 g в течение 5 минут, отбор плазмы в стерильных условиях таким образом, чтобы над осадком клеток ее осталось не менее 1 мм, перенос плазмы с тромбоцитами в новую стерильную градуированную пробирку, центрифугирование плазмы с ускорением 700 g в течение 17 минут с целью осаждения тромбоцитов, отбор в стерильных условиях верхней части плазмы в таком количестве, чтобы над осадком клеток ее осталось 3,1 мл, ресуспендирование осадка тромбоцитов в остаточной плазме с получением богатой тромбоцитами плазмы (БоТП), криодеструкцию тромбоцитов БоТП и хранение тромбоцитных лизатов при температуре от -40°С до -80°С, медленную разморозку лизатов при температуре 2-6°С, центрифугирование лизатов с ускорением 3000 g в течение 20 минут. Для изготовления лизата используют БоТП с концентрацией функционально полноценных тромбоцитов более 240×109/л, в случае меньшей концентрации - допускается дополнительное центрифугирование с ускорением 700 g в течение 17 минут, отбор излишка плазмы и повторное определение концентрации функционально полноценных тромбоцитов.The closest to the claimed solution is a method of making platelet lysate from autologous blood for the treatment of patients with a fracture of the neck of the shoulder [RF Patent No. 2681753], including taking 30 ml of venous blood from the patient into sterile tubes with anticoagulant EDTA, centrifuging the blood with acceleration of 300 g for 5 minutes, sampling plasma under sterile conditions so that at least 1 mm remains above the cell sediment, transfer of plasma with platelets into a new sterile graduated tube, centrifugation of plasma at 700 g for 17 minutes to precipitate platelets, selection in sterile conditions of the upper part of the plasma in such an amount that 3.1 ml remains above the cell sediment, resuspension of the platelet sediment in the residual plasma to obtain platelet-rich plasma (PRP), cryodestruction of PRP platelets and storage of platelet lysates at temperatures from -40 ° C to - 80 ° С, slow defrosting of lysates at 2-6 ° С, centrifugation or zatov with an acceleration of 3000 g for 20 minutes. For the manufacture of the lysate, PRP is used with a concentration of functionally complete platelets of more than 240 × 10 9 / L, in the case of a lower concentration, additional centrifugation with an acceleration of 700 g for 17 minutes, sampling of excess plasma and re-determination of the concentration of functionally complete platelets is allowed.

Однако предложенный способ не учитывает возможной деструкции ростовых факторов в плазме, не учитывает адсорбции ростовых факторов на белках плазмы с их последующей инактивацией, не позволяет получить лизат с высоким содержанием факторов роста и репарации тканей и низким содержанием про-воспалительных факторов. However, the proposed method does not take into account the possible destruction of growth factors in plasma, does not take into account the adsorption of growth factors on plasma proteins with their subsequent inactivation, does not allow obtaining a lysate with a high content of growth factors and tissue repair and a low content of pro-inflammatory factors.

Технической проблемой является разработка способа приготовления лизата тромбоцитов в бесплазменной среде с высоким содержанием ростовых факторов. A technical problem is the development of a method for preparing platelet lysate in a plasma-free environment with a high content of growth factors.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является получение концентрата тромбоцитов в бесплазменной среде без нарушения качества клеток (уровень тромбоцитов с гранулами, морфофункциональная активность тромбоцитов, адгезивная активность тромбоцитов) с высоким содержанием ростовых факторов (PDGF, EGF, FGF) и низким содержанием про-воспалительных факторов. The technical result to be achieved by the claimed invention is to obtain a platelet concentrate in a plasma-free environment without disturbing the quality of cells (the level of platelets with granules, morphofunctional activity of platelets, adhesive activity of platelets) with a high content of growth factors (PDGF, EGF, FGF) and a low content pro-inflammatory factors.

Технический результат достигается при осуществлении способа приготовления лизата тромбоцитов с высоким содержанием факторов роста (PDGF, FGF, EGF), включающего забор венозной крови пациента, оценку содержания в крови тромбоцитов с гранулами и отбор проб, содержащих не менее 35% тромбоцитов с гранулами от общего количества тромбоцитов, двухэтапное центрифугирование пробы крови, сначала при 300-500 g для получения фракции плазмы с тромбоцитами без примеси лейкоцитов и эритроцитов, затем 700-1000 g для осаждения тромбоцитов; удаление надосадка с последующим ресуспендированием (отмыванием) тромбоцитов фосфатно-солевым раствором PBS с pH=7,3 или изотоническим 0,9% раствором хлорида натрия до исчезновения тромбоцитарных конгломератов; далее осуществляют криодеструкцию полученных тромбоцитов, с последующим центрифугированием размороженных образцов тромбоцитарных лизатов при 3000-4000 g для удаления всех клеточных фрагментов из конечного препарата. Объем среды, вносимой для ресуспендирования, равен от 50%.до 200% объема удаленной плазмы. Technical resultachieved when implementing the method preparation of platelet lysate with a high content of growth factors (PDGF, FGF, EGF), including the collection of the patient's venous blood, assessment of the content of platelets with granules in the blood and sampling containing at least 35% of platelets with granules of the total number of platelets, two-stage centrifugation of the blood sample , first at 300-500 g to obtain a plasma fraction with platelets without admixture of leukocytes and erythrocytes, then 700-1000 g for platelet deposition; removal of the supernatant followed by resuspension (washing) of platelets with phosphate-saline PBS with pH = 7.3 or isotonic 0.9% sodium chloride solution until platelet conglomerates disappear; then cryodestruction of the obtained platelets is carried out, followed by centrifugation of thawed samples of platelet lysates at 3000-4000 g to remove all cell fragments from the final preparation. The volume of medium added for resuspension is 50% to 200% of the removed plasma volume.

Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings

Изобретение поясняется иллюстративным материалом, где на фиг. 1 представлены фотографии A-Г витально окрашенных (трипафлавином-родамином С) фибробластов человека линии М-22 через 3 суток культивирования в отсутствие и в присутствие разных доз лизата БоТП и ОтмТР. Увеличение х100. А - культура без лизата (контроль); Б - 20 мкл лизата БоТП; В - 50 мкл лизата БоТП; Г - 20 мкл лизата ОтмТР; Д - 50 мкл лизата ОтмТР. The invention is illustrated by illustrative material, where in FIG. 1 shows photographs A-D of vitally stained (trypaflavin-rhodamine C) human fibroblasts of the M-22 line after 3 days of cultivation in the absence and in the presence of different doses of PRP and OmTP lysate. Magnification x100. A - culture without lysate (control); B - 20 μl PRP lysate; B - 50 μl PRP lysate; D - 20 μl of TMTP lysate; D - 50 μl of TMTP lysate.

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

Получение бесплазменного лизата тромбоцитов с высоким содержанием ростовых факторов включает следующие этапы.Obtaining a plasma-free platelet lysate with a high content of growth factors includes the following steps.

1. Забор венозной крови пациента в стандартную пробирку с антикоагулянтом цитратом или ЭДТА.1. Taking the patient's venous blood into a standard tube with anticoagulant citrate or EDTA.

2. Оценка содержания в крови тромбоцитов с гранулами (%). Наиболее пригодными для получения лизата являются пробы, содержащие не менее 35% тромбоцитов с гранулами. При этом БоТП может быть исследована любыми известными из уровня техники способами, например, описанным в статье Amable PR et al. "Platelet-rich plasma preparation for regenerative medicine: optimization and quantification of cytokines and growth factors" (Stem Cell Res Ther. 2013 Jun 7;4(3):67), или в патенте на изобретение РФ №2485502 «Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека».2. Assessment of the content of platelets with granules in the blood (%). The most suitable for lysate production are samples containing at least 35% platelets with granules. In this case, PRP can be investigated by any methods known from the prior art, for example, described in the article by Amable PR et al. "Platelet-rich plasma preparation for regenerative medicine: optimization and quantification of cytokines and growth factors" (Stem Cell Res Ther. 2013 Jun 7; 4 (3): 67), or in the patent for invention of the Russian Federation No. human platelets ".

3. Центрифугирование крови при 300-500 g в течение 5-10 минут для получения фракции плазмы с тромбоцитами без примеси лейкоцитов и эритроцитов. 3. Centrifugation of blood at 300-500 g for 5-10 minutes to obtain a plasma fraction with platelets without admixture of leukocytes and erythrocytes.

4. Центрифугирование плазмы с тромбоцитами при 700-1000 g в течение 5-20 минут с целью осаждения тромбоцитов на дне пробирки.4. Centrifugation of plasma with platelets at 700-1000 g for 5-20 minutes in order to precipitate platelets at the bottom of the tube.

5. Удаление надосадка (плазменной части) из пробирки с тромбоцитами.5. Removal of the supernatant (plasma part) from the platelet tube.

6. Ресуспендирование тромбоцитов фосфатно-солевым раствором PBS (pH=7,3) или изотоническим 0,9% раствором хлорида натрия. Объем среды, вносимой для ресуспендирования, равен от 50% до 200% объема удаленной плазмы. Ресуспендирование тромбоцитов предпочтительно проводить с помощью автоматической пипетки со съемным пластиковым наконечником на 5-1000 мкл до полного исчезновения в пробе визуально различимых конгломератов тромбоцитов. Не рекомендуется ресуспендирование с помощью системы Vortex или с помощью горизонтального шейкера.6. Resuspension of platelets with phosphate-saline PBS (pH = 7.3) or isotonic 0.9% sodium chloride solution. The volume of medium added for resuspension is 50% to 200% of the removed plasma volume. The resuspension of platelets is preferably carried out using an automatic pipette with a removable plastic tip for 5-1000 μl until the visually distinguishable platelet conglomerates disappear completely in the sample. Resuspension with a Vortex system or a horizontal shaker is not recommended.

7. Заморозка тромбоцитов в буферном растворе при температуре -минус 40 - минус 80°С Замороженные тромбоциты хранят при температуре -минус 40- минус 80°С в течение 1-14 суток.7. Freezing of platelets in a buffer solution at a temperature of minus 40 - minus 80 ° C. Frozen platelets are stored at a temperature of minus 40 - minus 80 ° C for 1-14 days.

8. Разморозка тромбоцитов при температуре 2-6°С в течение 10-12 часов. Полученный продукт представляет собой суспензию лизированных тромбоцитов (лизат тромбоцитов) в буферном растворе.8. Defrosting platelets at a temperature of 2-6 ° C for 10-12 hours. The resulting product is a suspension of lysed platelets (platelet lysate) in a buffer solution.

9. Центрифугирование лизата тромбоцитов в буферном растворе при 3000-4000 g в течение 10-20 мин при температуре 4°-6С и отбор надосадка (буферный раствор, содержащий ростовые факторы тромбоцитов), который распределяют по стерильным пробиркам, герметично закрывают и помещают в холодильник до применения.9. Centrifugation of platelet lysate in a buffer solution at 3000-4000 g for 10-20 minutes at a temperature of 4 ° -6C and selection of the supernatant (buffer solution containing platelet growth factors), which is distributed into sterile tubes, hermetically closed and placed in a refrigerator before application.

Способ приготовления лизата тромбоцитов в бесплазменной среде с высоким содержанием ростовых факторов был разработан по итогам проведенных исследований по оценке влияния процедур выделения богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) на качество тромбоцитов и содержание факторов роста и их дифференцировки в тромбоцитах, полученных по способу-прототипу и по заявляемому способу, в соответствии с которым после двухэтапного центрифугирования перед криодеструкцией дополнительно осуществляют отмывку тромбоцитов от плазмы.A method for preparing platelet lysate in a plasma-free environment with a high content of growth factors was developed based on the results of studies conducted to assess the effect of platelet-rich plasma (PRP) isolation procedures on platelet quality and the content of growth factors and their differentiation in platelets obtained by the prototype method and by the claimed a method according to which, after two-stage centrifugation, before cryodestruction, the platelets are additionally washed from plasma.

В настоящее время во всех методиках получения БоТП используется центрифугирование. Ранее нами было показано, что при «мягком» центрифугировании (300-500g) не происходит видимого изменения морфофункционального статуса тромбоцитов. «Мягкое» центрифугирование позволяет получить плазму с тромбоцитами без примеси эритроцитов и лейкоцитов. Однако общая концентрация тромбоцитов в такой плазме обычно варьирует от 300 до 800×109/л, тогда как по общепринятым стандартам содержание тромбоцитов в БоТП должно быть не ниже 1000×109/л. Таким образом, после «мягкого» центрифугирования необходимо удалить избыток плазмы из суспензии тромбоцитов. В большинстве работ осаждение тромбоцитов проводится при ускорении 3000-4000 g. Однако наши исследования показывают, что центрифугирование крови или плазмы при 3000-4000 g снижает уровень тромбоцитов с гранулами в конечной БоТП на 20-25%, а также способно вызывать спонтанную активацию тромбоцитов. В производственной трансфузиологии выделение тромбоцитных концентратов проводится при ускорении 1000-1200 g, которое не снижает морфофункциональный статус тромбоцитов [Макаров М.С., Кобзева Е.Н., Высочин И.В., Боровкова Н.В. Хватов В.Б. Применение витального окрашивания для морфофункционального анализа тромбоцитов человека короткого хранения // Альманах клинической медицины. -2014. -№30. -С. 83-87.]. Наше наблюдение показало, что массовое осаждение тромбоцитов на дно флакона наблюдается уже при ускорении 700-800 g, при этом в супернатанте остаются только биологически неполноценные клетки, лишенные гранул, и не происходит нарушения качества тромбоцитов в осадке. При двухэтапном центрифугировании качество тромбоцитов снижается незначительно (табл. 1). Наше исследование показало, что двухэтапное центрифугирование при 300-500 g и 700-1000 g с последующим ресуспендированием осадка тромбоцитов плазмой позволяет получить БоТП с общей концентрацией клеток 1200-1800×109/л и нормальным уровнем их морфофункционального статуса (табл. 1). Таким образом, двухэтапное центрифугирование является адекватным для получения БоТП, ускорение 700-1000 g позволяет осаждать тромбоциты с гранулами без их массового повреждения или активации и может быть использовано для отмывания тромбоцитов от плазмы.Currently, centrifugation is used in all PRP production methods. We have previously shown that during "soft" centrifugation (300-500g) there is no visible change in the morphological and functional status of platelets. "Soft" centrifugation allows obtaining plasma with platelets without admixture of erythrocytes and leukocytes. However, the total concentration of platelets in such plasma usually varies from 300 to 800 × 10nine/ L, while according to generally accepted standards, the platelet content in PRP should be at least 1000 × 10nine/ l. Thus, after "soft" centrifugation, it is necessary to remove excess plasma from the platelet suspension. In most studies, platelet deposition is carried out at an acceleration of 3000-4000 g. However, our studies show that centrifugation of blood or plasma at 3000-4000 g reduces the level of platelets with granules in the final PRP by 20-25%, and can also induce spontaneous platelet activation. In industrial transfusiology, the release of platelet concentrates is carried out at an acceleration of 1000-1200 g, which does not reduce the morphological and functional status of platelets [Makarov MS, Kobzeva EN, Vysochin IV, Borovkova NV. Khvatov V.B. Application of vital staining for morphofunctional analysis of human platelets of short storage // Almanac of Clinical Medicine. -2014. -№30. -FROM. 83-87.]. Our observation showed that mass deposition of platelets to the bottom of the vial is observed already at an acceleration of 700-800 g, while only biologically defective cells, devoid of granules, remain in the supernatant, and the quality of platelets in the sediment is not disturbed. With two-stage centrifugation, the quality of platelets decreases slightly (Table 1). Our study showed that two-stage centrifugation at 300-500 g and 700-1000 g followed by resuspension of the platelet pellet with plasma makes it possible to obtain PRP with a total cell concentration of 1200-1800 × 10nine/ l and the normal level of their morphological and functional status (Table 1). Thus, two-stage centrifugation is adequate to obtain PRP, an acceleration of 700-1000 g allows platelets with granules to be precipitated without their massive damage or activation, and can be used to wash platelets from plasma.

Таблица 1. Влияние режимов центрифугирования на морфофункциональный статус тромбоцитов человекаTable 1. Influence of centrifugation regimes on the morphofunctional status of human platelets

Режим центрифугированияCentrifugation mode Морфофункциональные параметры тромбоцитов доноров крови (N=10), М ± σMorphofunctional parameters of blood donor platelets (N = 10), М ± σ Доля тромбоцитов с гранулами, %
(норма 35-75%)The proportion of platelets with granules,%
(norm 35-75%) Морфофункциональная
активность тромбоцитов, баллы
(норма 35-60 баллов)Morphofunctional
platelet activity, points
(norm 35-60 points) Адгезивная активность тромбоцитов, баллы
(норма 30-75 баллов)Platelet adhesive activity, points
(norm 30-75 points) Исходная кровьSource blood 50±550 ± 5 48±548 ± 5 47±647 ± 6 Однократное центрифугированиеSingle centrifugation 300 g в течение
5мин300 g during
5 minutes 50±450 ± 4 48±548 ± 5 47±547 ± 5 500 g в течение
10 мин500 g during
10 min 50±550 ± 5 48±548 ± 5 47±547 ± 5 700 g в течение
10-20 мин700 g during
10-20 minutes 47±447 ± 4 47±447 ± 4 46±446 ± 4 800 g в течение
5-20 мин800 g during
5-20 minutes 49±449 ± 4 46±446 ± 4 46±446 ± 4 1000 g в течение
5-10 мин 1000 g during
5-10 minutes 49±449 ± 4 46±346 ± 3 46±446 ± 4 Двукратное центрифугирование.
1-й этап - центрифугирование крови 300-500 g в течение 5-10 мин и отбор первичной плазмы с тромбоцитами
2-й этап - центрифугирование первичной плазмы с целью получения осадка тромбоцитов и ресуспендирование тромбоцитов в плазмеDouble centrifugation.
1st stage - centrifugation of blood 300-500 g for 5-10 minutes and collection of primary plasma with platelets
2nd stage - centrifugation of primary plasma in order to obtain platelet sediment and resuspension of platelets in plasma 700 g в течение 15-20 мин 700 g for 15-20 minutes 46±5* 46 ± 5 * 44±5* 44 ± 5 * 44±5* 44 ± 5 * 700 g в течение 30 мин700 g for 30 min 38±438 ± 4 34±334 ± 3 30±2*30 ± 2 * 1000 g в течение 5-10 мин1000 g for 5-10 minutes 47±6* 47 ± 6 * 45±5* 45 ± 5 * 45±5* 45 ± 5 * 1500 g в течение 5-10 мин1500 g for 5-10 minutes 42±6*42 ± 6 * 40±5*40 ± 5 * 40±4*40 ± 4 * 2000 в течение 5-10 мин2000 for 5-10 minutes 39±4*39 ± 4 * 35±3*35 ± 3 * 30±2*30 ± 2 * *Достоверно относительно исходной крови при p<0,05* Reliable relative to the initial blood at p <0.05

На следующем этапе оценивали содержание факторов роста и дифференцировки в тромбоцитах, отмытых от плазмы (ОтмТР). В норме гранулы тромбоцитов содержат большое количество веществ, обладающих протеолитической активностью (кислые фосфатазы, металлопротеазы, гликозидазы), которые в условиях плазмы крови могут вызывать быстрое расщепление факторов роста как при 37°C, так и при 20-22°C. Кроме того, значительная часть ростовых факторов может быть сорбирована молекулами альбумина. Показано, что альбуминовые наночастицы интенсивно сорбируют на своей поверхности лекарственные препараты, включая белки разных типов [Kreuter J., Gelperina S. Use of nanoparticles for cerebral cancer // Tumori. -2008. -94. -Р. 271-277]. Данные о содержании основных ростовых факторов в тромбоцитарных лизатах сильно варьируют у разных авторов: так, концентрации PDGF и EGF в лизатах, полученных разными исследователями, могут отличаться более чем в 10 раз. По всей видимости, этот эффект вызван недостаточной стабильностью ростовых факторов в составе плазмы. Также необходимо учитывать, что еще до криодеструкции тромбоцитов часть тромбоцитарных компонентов может выходить в плазму. По нашим данным, после центрифугирования плазмы с ускорением 700-1000 g в образующемся супернатанте (плазма, бедная тромбоцитами, БедПл) наблюдаются высокие концентрации про-воспалительных цитокинов - фактора некроза опухолей TNF-α, интерлейкинов 1/6/8. В конечных лизатах, полученных из БоТП и БедПл, уровень TNF-α и интерлейкинов 1/6/8 значимо не различался (p<0,05). Следовательно, концентрация этих про-воспалительных факторов в лизате определялась их содержанием в бесклеточной плазме, а не в составе тромбоцитов, подвергшихся криодеструкции. При этом концентрации PDGF и других ростовых факторов в БоТП были в 3-7 раз выше, чем в БедПл. Таким образом, после центрифугирования 700-1000 g основная часть ростовых факторов сохранялась в составе тромбоцитарных гранул и высвобождалась только после криодеструкции тромбоцитов, тогда как про-воспалительные факторы выходили в плазму еще до криодеструкции. Этот эффект является очень важным при получении тромбоцитарных лизатов с высоким содержанием факторов роста и низким содержанием про-воспалительных факторов. Таким образом, для удаления про-воспалительных факторов и повышения сохранности ростовых факторов необходимо отмывать тромбоциты от плазмы после центрифугирования 700-1000 g.At the next stage, the content of growth and differentiation factors in platelets, washed from plasma, was assessed. Normally, platelet granules contain a large amount of substances with proteolytic activity (acid phosphatases, metalloproteases, glycosidases), which under blood plasma conditions can cause rapid breakdown of growth factors both at 37 ° C and at 20-22 ° C. In addition, a significant part of growth factors can be sorbed by albumin molecules. It has been shown that albumin nanoparticles intensively sorb drugs on their surface, including proteins of different types [Kreuter J., Gelperina S. Use of nanoparticles for cerebral cancer // Tumori. -2008. -94. -R. 271-277]. The data on the content of the main growth factors in platelet lysates vary greatly among different authors: for example, the concentrations of PDGF and EGF in lysates obtained by different researchers can differ by more than 10 times. Apparently, this effect is caused by insufficient stability of growth factors in the plasma composition. It should also be borne in mind that even before platelet cryodestruction, part of the platelet components may enter the plasma. According to our data, after centrifugation of plasma with an acceleration of 700-1000 g in the resulting supernatant (plasma, poor in platelets, BedPl), high concentrations of pro-inflammatory cytokines are observed - tumor necrosis factor TNF-α, interleukins 1/6/8. In the final lysates obtained from PRP and BedPl, the level of TNF-α and interleukins 1/6/8 did not differ significantly (p <0.05). Consequently, the concentration of these pro-inflammatory factors in the lysate was determined by their content in acellular plasma, and not in the composition of platelets subjected to cryodestruction. At the same time, the concentrations of PDGF and other growth factors in PRP were 3-7 times higher than in BedPl. Thus, after centrifugation of 700-1000 g, the bulk of the growth factors remained in the composition of platelet granules and were released only after platelet cryodestruction, whereas pro-inflammatory factors were released into the plasma even before cryodestruction. This effect is very important in obtaining platelet lysates with a high content of growth factors and a low content of pro-inflammatory factors. Thus, in order to remove pro-inflammatory factors and increase the preservation of growth factors, it is necessary to wash platelets from plasma after centrifugation at 700-1000 g.

Ниже представлен конкретный пример реализации изобретения, демонстрирующий достижение заявленного результата.Below is a specific example of implementation of the invention, demonstrating the achievement of the claimed result.

Образцы крови доноров-добровольцев центрифугировали при 300-500 g, отбирали аликвоты плазмы с тромбоцитами и центрифугировали при 700-1000 g с целью осаждения тромбоцитов, затем удаляли весь надосадок и ресуспендировали тромбоциты фосфатно-солевым раствором PBS (pH=7,3) или изотоническим 0,9% раствором хлоридом натрия. Объем среды, вносимой для ресуспендирования, был равен объему удаленной плазмы. В полученных аликвотах ОтмТР общая концентрация тромбоцитов и их качество были сопоставимы с тем, что наблюдалось в БоТП (табл. 2). Также возможно ресуспендирование осадка тромбоцитов PBS (pH=7,3) или изотоническим 0,9% раствором хлоридом натрия в объемах, составляющих от 50 до 200% от исходного объема плазмы.Blood samples from volunteer donors were centrifuged at 300-500 g, aliquots of plasma with platelets were taken and centrifuged at 700-1000 g in order to precipitate platelets, then all the supernatant was removed and platelets were resuspended with phosphate-saline PBS (pH = 7.3) or isotonic 0.9% sodium chloride solution. The volume of medium added for resuspension was equal to the volume of plasma removed. In the obtained aliquots of MTBF, the total concentration of platelets and their quality were comparable to that observed in PRP (Table 2). It is also possible to resuspend the platelet pellet with PBS (pH = 7.3) or isotonic 0.9% sodium chloride solution in volumes ranging from 50 to 200% of the initial plasma volume.

Большое значение имеет отсутствие визуально различимых конгломератов тромбоцитов в суспензии. По нашим наблюдениям, при осаждении тромбоциты формируют очень тесные конгломераты, которые часто не распадаются при простом взбалтывании пробы. Такие структуры обычно имеют вид хлопьев и могут достигать диаметра 1000 мкм. Пребывание в составе конгломератов само по себе не влияет на морфофункциональные свойства тромбоцитов, с другой стороны, тесный контакт тромбоцитов увеличивает риск их спонтанной активации и дегрануляции, что приводит к снижению качества клеток и потере ими секреторных гранул. В частности, заготовка пулированных тромбоцитных концентратов, в процессе которой формируется очень большой осадок тромбоцитов, приводит к тому, что конечный продукт имеет более низкое качество клеток по сравнению с аферезным тромбоцитным концентратом или плазмой, выделенной из крови при 300-500 g. Тромбоцитарные конгломераты удерживают остаточную плазму и могут препятствовать адекватному выходу ростовых факторов в процесс криодеструкции тромбоцитов. Таким образом, для исследования тромбоцитов в бесплазменной среде, а также для получения лизата необходимо максимально снизить уровень тромбоцитарных конгломератов в бесплазменной суспензии. Наши наблюдения показывают, что система взбалтывания суспензии клеток Vortex и горизонтальные шейкеры для перемешивания крови и ее компонентов не являются эффективными для ресуспендирования тромбоцитов в бесплазменной среде. Для ресуспендирования отмытых тромбоцитов предпочтительно использовать автоматические или механические пипетки со съемным пластиковым наконечником на 5-1000 мкл до полного исчезновения в пробе визуально различимых конгломератов тромбоцитов. Перед заморозкой суспензии тромбоцитов желательно добиться полного исчезновения тромбоцитарных конгломератов.Of great importance is the absence of visually distinguishable platelet conglomerates in suspension. According to our observations, platelets form very tight conglomerates during deposition, which often do not disintegrate with simple agitation of the sample. Such structures are usually in the form of flakes and can reach a diameter of 1000 microns. Being in the composition of conglomerates does not in itself affect the morphofunctional properties of platelets; on the other hand, close contact of platelets increases the risk of their spontaneous activation and degranulation, which leads to a decrease in the quality of cells and their loss of secretory granules. In particular, the procurement of pooled platelet concentrates, during which a very large platelet precipitate is formed, leads to the fact that the final product has a lower cell quality compared to apheresis platelet concentrate or plasma isolated from blood at 300-500 g. Platelet conglomerates retain residual plasma and can prevent adequate release of growth factors in the process of platelet cryodestruction. Thus, to study platelets in a plasma-free environment, as well as to obtain a lysate, it is necessary to minimize the level of platelet conglomerates in a plasma-free suspension. Our observations show that the Vortex cell suspension agitation system and horizontal shakers for mixing blood and blood components are not effective for resuspending platelets in a plasma-free environment. For resuspension of washed platelets, it is preferable to use automatic or mechanical pipettes with a removable plastic tip for 5-1000 μL until the visually distinguishable platelet conglomerates disappear completely in the sample. Before freezing the platelet suspension, it is desirable to achieve the complete disappearance of platelet conglomerates.

Таблица 2. Оценка качества клеток в тромбоцитных концентратах до и после отмывания от плазмы (до этапа заморозки).Table 2. Assessment of the quality of cells in platelet concentrates before and after washing from plasma (before the freezing stage).

Тип образца.Sample type. Морфофункциональные параметры, М ± σMorphofunctional parameters, М ± σ Общая концентрация тромбоцитов, 109/лTotal platelet concentration, 10 9 / l Концентрация лейкоцитов, 109/лConcentration of leukocytes, 10 9 / l Доля тромбоцитов с гранулами, % (норма 35-75%)The proportion of platelets with granules,% (norm 35-75%) Адгезивная активность тромбоцитов, баллы
(норма 30-75 баллов)Platelet adhesive activity, points
(norm 30-75 points) БоТП (метод-прототип)PRP (prototype method) 1491±761491 ± 76 1,0 [0,2; 3,0]1.0 [0.2; 3.0] 44±544 ± 5 40±540 ± 5 Тромбоциты, отмытые от плазмы (предлагаемый метод)Plasma washed platelets (suggested method) 1433±681433 ± 68 1,0 [0; 2,0]1.0 [0; 2.0] 42±442 ± 4 40±540 ± 5 *Достоверно относительно БоТП при p<0,05* Significant relative to PRP at p <0.05

Тромбоцитарный лизат получали путем криодеструкции тромбоцитов в буферном растворе при -40 - -80°С с последующей разморозкой. Общее время хранения тромбоцитов в буферном растворе при -40 - -80°С составляло 1-14 суток. Замораживание и размораживание вызывает лизис тромбоцитов и выход из них ростовых факторов и других секреторных компонентов. Размораживание проб проводили при температуре +2 - +6°С в течение 10-12 часов (медленная разморозка). После разморозки полученные пробы представляют собой суспензию лизированных тромбоцитов в буферном растворе, который также содержит ростовые факторы, вышедшие из тромбоцитов в результате криодеструкции и разморозки. Образцы тромбоцитарных лизатов центрифугировали при 3000-4000 g в течение 10-20 мин и температуре 4-6°С для удаления всех клеточных фрагментов из конечного препарата. Ускорение 3500-4500 g является общепринятым при выделении бесклеточной плазмы из цельной крови. Наши наблюдения показывают, что после разморозки бесплазменных лизатов клеточный дебрис целиком удаляется при центрифугировании 3000-4000 g. Platelet lysate was obtained by cryodestruction of platelets in a buffer solution at -40 - -80 ° C, followed by thawing. The total storage time of platelets in a buffer solution at -40 - -80 ° C was 1-14 days. Freezing and thawing causes lysis of platelets and release of growth factors and other secretory components from them. The samples were thawed at a temperature of +2 - + 6 ° C for 10-12 hours (slow defrosting). After thawing, the obtained samples are a suspension of lysed platelets in a buffer solution, which also contains growth factors released from platelets as a result of cryodestruction and thawing. Samples of platelet lysates were centrifuged at 3000-4000 g for 10-20 min and a temperature of 4-6 ° C to remove all cell fragments from the final preparation. Acceleration of 3500-4500 g is generally accepted when isolating acellular plasma from whole blood. Our observations show that after thawing of plasma-free lysates, the cell debris is completely removed by centrifugation at 3000-4000 g.

Содержание цитокинов оценивали с помощью мультиплексного анализа на платформе Luminex 200 (технология xMAP). Определяли концентрацию тромбоцитарного фактора роста (PDGF), фактора роста фибробластов (FGF), фактора роста эндотелия (EGF), фактора некроза опухолей (TNF-α), интерлейкина 1-альфа, 6 и 8 (IL1-alfa, IL6, IL8), в пг/мл. В лизате БоТП концентрация исследуемых цитокинов варьировалась в широком диапазоне значений. После отмывания тромбоцитов от плазмы регистрируемая концентрация PDGF в конечном лизате ОтмТР была увеличена в 3,2 раза, FGF - в 1,2 раза, EGF - в 6,1 раза соответственно (р<0,05) по сравнению с БоТП (табл. 3). Одновременно с этим в лизатах ОтмТР значительно снижалось содержание про-воспалительных интерлейкинов - уровень IL1-alfa был снижен в 3 раза, IL6 - в 457 раз, IL8 - в 1,5 раза по сравнению с исходной БоТП (р<0,05). Уровень фактора TNF-α значимо не различался между БоТП и ОтмТР. Таким образом, отмывание тромбоцитов от плазмы позволило заметно увеличить содержание ростовых факторов и одновременно с этим снизить содержание про-воспалительных интерлейкинов в конечном тромбоцитарном лизате.The content of cytokines was assessed using multiplex analysis on the Luminex 200 platform (xMAP technology). The concentration of platelet growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (FGF), endothelial growth factor (EGF), tumor necrosis factor (TNF-α), interleukin 1-alpha, 6 and 8 (IL1-alfa, IL6, IL8) was determined, in pg / ml. The concentration of the studied cytokines in the PRP lysate varied over a wide range of values. After washing platelets from plasma, the recorded concentration of PDGF in the final lysate of OmTP was increased by 3.2 times, FGF - by 1.2 times, EGF - by 6.1 times, respectively (p <0.05) compared with PRP (table. 3). At the same time, the content of pro-inflammatory interleukins in the RTMTP lysates significantly decreased - the level of IL1-alfa was reduced 3 times, IL6 - 457 times, IL8 - 1.5 times compared with the initial PRP (p <0.05). The level of TNF-α did not differ significantly between PRP and TMTR. Thus, washing platelets from plasma made it possible to significantly increase the content of growth factors and, at the same time, to reduce the content of pro-inflammatory interleukins in the final platelet lysate.

Таблица 3. Содержание секретируемых тромбоцитами факторов в тромбоцитных лизатах до и после отмывания тромбоцитов от плазмыTable 3. Content of factors secreted by platelets in platelet lysates before and after washing platelets from plasma

Тип лизатаLysate type Концентрация тромбоцитарных цитокинов, пг/млPlatelet cytokine concentration, pg / ml PDGFPDGF FGF-2FGF-2 EGFEGF TNF-αTNF-α IL1-alfaIL1-alfa IL6IL6 IL8IL8 Лизат, полученный из БоТП (метод-прототип)Lysate obtained from PRP (prototype method) 1303
[918; 2591,]1303
[918; 2591,] 582
[316; 825]582
[316; 825] 695
[424; 929]695
[424; 929] 39,0
[23,0; 78,5]39.0
[23.0; 78.5] 11,4 [5,3;26,2]11.4 [5.3; 26.2] 18,3
[3,3; 54,4]18.3
[3.3; 54.4] 12,0
[7,2; 21,7]12.0
[7.2; 21.7] Лизат, полученный из тромбоцитов, отмытых от плазмы (предлагаемый метод)Lysate obtained from platelets washed from plasma (proposed method) 4110*
[2769; 5369]4110 *
[2769; 5369] 724*
[387; 1443]724 *
[387; 1443] 4297*
[4213; 8465]4297 *
[4213; 8465] 36,3
[22,5; 46,9]36.3
[22.5; 46.9] 3,8*
[3,8; 10,3]3.8 *
[3.8; 10.3] 0,04*
[0,01; 0,06]0.04 *
[0.01; 0.06] 7,9*
[7,8; 9,0]7.9 *
[7.8; 9.0] *Достоверно относительно БоТП при p<0,05* Significant relative to PRP at p <0.05

Необходимо особо подчеркнуть, что образцы бесплазменного тромбоцитарного лизата с высоким содержанием ростовых факторов были получены из проб с нормальным содержанием тромбоцитов с гранулами (35-75%). При многих патологиях содержание в крови тромбоцитов с гранулами снижается и одновременно с этим увеличивается число тромбоцитов с повреждениями мембран, способными разрушать форменные элементы крови, а также секретируемые ими вещества. По нашим данным, в лизатах, полученных из БоТП с уровнем тромбоцитов с гранулами ниже 20%, уровень PDGF и других ростовых факторов резко снижен по сравнению с лизатами здоровых доноров. Таким образом, для получения бесплазменного тромбоцитарного лизата с высоким содержанием ростовых факторов наиболее адекватно использовать кровь, содержащую не менее 35% тромбоцитов с гранулами.It should be emphasized that samples of plasma-free platelet lysate with a high content of growth factors were obtained from samples with a normal content of platelets with granules (35-75%). In many pathologies, the content of platelets with granules in the blood decreases and at the same time the number of platelets with membrane damage that can destroy blood cells, as well as substances secreted by them, increases. According to our data, in lysates obtained from PRP with the level of platelets with granules below 20%, the level of PDGF and other growth factors is sharply reduced compared to lysates from healthy donors. Thus, to obtain a plasma-free platelet lysate with a high content of growth factors, it is most appropriate to use blood containing at least 35% of platelets with granules.

Рост-стимулирующий эффект бесплазменных тромбоцитарных лизатов исследовали на примере культуры фибробластов человека линии М-22. Лизаты тромбоцитов вносили в лунки 12-луночного планшета с общим объемом среды 2 мл, содержавшие 8-10 тыс клеток. Клетки культивировали в среде DMEM добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Gibco, США) при 37°С и концентрации CO2 5% в течение 3 суток. Анализ клеток проводили с помощью метода, основанного на витальном окрашивании клеток и их исследовании во флуоресцентном микроскопе (Патент РФ на изобретение № 2484472). Оценивали содержание клеток на дне лунки (тыс/см2), общую структурную целостность клеточных мембран (ЦКМ) (в баллах). В норме ЦКМ диплоидных клеток человека составляет 28-42 балла. Лизаты БоТП и ОтмТр объемом 10-50 мкл вызывали стимуляцию роста клеток в 1,2-1,5 раза без нарушения их структурной целостности (табл. 4, рис. 1А, Б, Г). При использовании 50 мкл лизата БоТП отмечено незначительное снижение ЦКМ, при этом общее количество клеток достоверно не отличалось от контроля (табл. 4, рис. 1В). Напротив, в опытах с 50 мкл ОтмТр рост-стимулирующий эффект сохранялся и сопоставим с тем, что наблюдался 20 мкл, снижение ЦКМ не происходило (рис. 1Д). В присутствии 100-500 мкл БоТП в культуре М-22 отмечено доза-зависимое подавление роста клеток, а также заметное нарушение их структурной целостности. При 200-500 мкл БоТП практически все клетки в культуре имели измененную морфологию, не содержали секреторных везикул. Напротив, при использовании 100-500 мкл ОтмТр, рост-стимулирующий эффект сохранялся, как и при 10-50 мкл (табл. 4), выраженных структурных и функциональных изменений в клетках отмечено не было.The growth-stimulating effect of plasma-free platelet lysates was studied using the example of a culture of human fibroblasts of the M-22 line. Platelet lysates were added to the wells of a 12-well plate with a total volume of 2 ml of medium, containing 8-10 thousand cells. The cells were cultured in DMEM medium by adding 10% fetal bovine serum (Gibco, USA) at 37 ° C and 5% CO 2 for 3 days. The analysis of cells was carried out using a method based on vital staining of cells and their study in a fluorescent microscope (RF patent for invention No. 2484472). The content of cells at the bottom of the well (thousand / cm 2 ), the general structural integrity of cell membranes (CCM) (in points) were assessed. Normally, the CCM of human diploid cells is 28-42 points. Lysates of PRP and OtmTr in a volume of 10-50 µl stimulated cell growth by 1.2-1.5 times without disturbing their structural integrity (Table 4, Fig. 1A, B, D). When using 50 µl of PRP lysate, a slight decrease in CKM was noted, while the total number of cells did not significantly differ from the control (Table 4, Fig. 1B). On the contrary, in experiments with 50 μL of ElmTr, the growth-stimulating effect was retained and is comparable to that observed in 20 μL; there was no decrease in CKM (Fig.1E). In the presence of 100-500 μL of PRP in culture M-22, a dose-dependent suppression of cell growth was noted, as well as a noticeable violation of their structural integrity. At 200-500 μL of PRP, almost all cells in the culture had an altered morphology and did not contain secretory vesicles. On the contrary, when using 100-500 μl of ElmTr, the growth-stimulating effect was preserved, as with 10-50 μl (Table 4), no pronounced structural and functional changes in the cells were noted.

Таблица 4. Морфофункциональный анализ фибробластов линии М-22 через 3 суток культивирования в присутствии лизата тромбоцитовTable 4. Morphofunctional analysis of M-22 fibroblasts after 3 days of cultivation in the presence of platelet lysate

Объем лизата тромбоцитов, внесенный в культуру М-22The volume of platelet lysate introduced into the culture of M-22 Источник лизата тромбоцитовSource of platelet lysate Контроль
(без тромбоцитов)The control
(no platelets) Лизат, полученный из БоТП (метод-прототип)Lysate obtained from PRP (prototype method) Лизат, полученный из тромбоцитов, отмытых от плазмы (предлагаемый метод)Lysate obtained from platelets washed from plasma (proposed method) Тыс/см2 Thous / cm 2 ЦКМ, баллыCCM, points Тыс/см2 Thous / cm 2 ЦКМ, баллыCCM, points Тыс/см2 Thous / cm 2 ЦКМ, баллыCCM, points 10 мкл10 μl 15,015.0 35,235.2 18,0*18.0 * 35,335.3 18,8*18.8 * 35,035.0 20 мкл20 μl 21,2*21.2 * 35,035.0 20,7*20.7 * 35,035.0 50 мкл50 μl 15,015.0 33,1*33.1 * 20,0*20.0 * 34,934.9 100 мкл100 μl 10,8*10.8 * 31,0*31.0 * 19,5*19.5 * 34,534.5 200 мкл200 μl 6,0*6.0 * 29,0*29.0 * 22,0*22.0 * 35,035.0 500 мкл500 μl 2,9*2.9 * 27,3*27.3 * 21,7*21.7 * 34,734,7 *Достоверно относительно контроля при p<0,05* Reliable relative to control at p <0.05

Таким образом, заявляемый способ приготовления бесплазменных тромбоцитарных лизатов позволяет получать препараты с высоким уровнем ростовых факторов и обладающие рост-стимулирующим эффектом.Thus, the claimed method for the preparation of plasma-free platelet lysates makes it possible to obtain preparations with a high level of growth factors and having a growth-stimulating effect.

Claims (1)

Способ приготовления лизата тромбоцитов с высоким содержанием факторов роста, включающий забор венозной крови пациента, оценку содержания в крови тромбоцитов с гранулами и отбор проб, содержащих не менее 35% тромбоцитов с гранулами, двухэтапное центрифугирование пробы крови, сначала при 300-500 g в течение 5-10 минут для получения фракции плазмы с тромбоцитами без примеси лейкоцитов и эритроцитов, затем при 700-1000 g в течение 5-20 минут для осаждения тромбоцитов; удаление надосадка с последующим ресуспендированием тромбоцитов фосфатно-солевым раствором PBS с pH, равным 7,3, или изотоническим 0,9% раствором хлорида натрия до исчезновения тромбоцитарных конгломератов; далее осуществляют криодеструкцию полученных тромбоцитов с последующим центрифугированием размороженных образцов тромбоцитарных лизатов при 3000-4000 g в течение 10-20 минут при температуре 4-6 °С для удаления всех клеточных фрагментов из конечного препарата.A method for preparing a platelet lysate with a high content of growth factors, including sampling the patient's venous blood, assessing the content of platelets with granules in the blood and taking samples containing at least 35% of platelets with granules, two-stage centrifugation of a blood sample, first at 300-500 g for 5 -10 minutes to obtain a fraction of plasma with platelets without admixture of leukocytes and erythrocytes, then at 700-1000 g for 5-20 minutes to sediment platelets; removal of the supernatant followed by resuspension of platelets with phosphate-saline PBS with a pH of 7.3, or isotonic 0.9% sodium chloride solution until platelet conglomerates disappear; then cryodestruction of the obtained platelets is carried out, followed by centrifugation of thawed platelet lysates samples at 3000-4000 g for 10-20 minutes at a temperature of 4-6 ° C to remove all cell fragments from the final preparation.
RU2020115128A 2020-04-29 2020-04-29 Method for preparing thrombocyte lysate with high content of growth factors RU2739515C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020115128A RU2739515C1 (en) 2020-04-29 2020-04-29 Method for preparing thrombocyte lysate with high content of growth factors

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020115128A RU2739515C1 (en) 2020-04-29 2020-04-29 Method for preparing thrombocyte lysate with high content of growth factors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2739515C1 true RU2739515C1 (en) 2020-12-25

Family

ID=74062825

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020115128A RU2739515C1 (en) 2020-04-29 2020-04-29 Method for preparing thrombocyte lysate with high content of growth factors

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2739515C1 (en)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114921410A (en) * 2022-06-02 2022-08-19 上海交通大学医学院附属瑞金医院 Method for the separation of optimized and standardized microparticles, and the significance and use thereof
RU2790701C1 (en) * 2022-06-03 2023-02-28 Общество с ограниченной ответственностью "МеЛСиТек" Method for obtaining a solution of growth factors from platelets
WO2023052954A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 Miszewski Alexandra Grace Method of preparing a solution for activating platelets

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6649072B2 (en) * 2001-11-16 2003-11-18 Robert Brandt Method for producing autologous platelet-rich plasma
EP2073862B1 (en) * 2006-08-21 2016-08-03 Antoine Turzi Method for the preparation of platelet rich plasma for unprocessed use and combination thereof with skin and bone cells
RU2648162C2 (en) * 2016-04-21 2018-03-22 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ) Method for producing growth additive based on thrombocyte lysate from platelet of donors to medium for build-up of cellular weight of stem, progenitor, differentiated and tumor cells
RU2710367C2 (en) * 2018-05-29 2019-12-26 Общество с ограниченной ответственностью "Институт биотехнологий и фармакологии", ООО "ИНБИОФАРМА" Method for producing cytokines from umbilical blood thrombocytes as substrate for developing drugs for humans and animals
RU2732150C1 (en) * 2020-03-04 2020-09-11 Общество с ограниченной ответственностью "Центр клеточных технологий" Method for producing autologous thrombocyte lysate as a base for cellular biomedical preparations of veterinary medicine

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6649072B2 (en) * 2001-11-16 2003-11-18 Robert Brandt Method for producing autologous platelet-rich plasma
EP2073862B1 (en) * 2006-08-21 2016-08-03 Antoine Turzi Method for the preparation of platelet rich plasma for unprocessed use and combination thereof with skin and bone cells
RU2648162C2 (en) * 2016-04-21 2018-03-22 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ) Method for producing growth additive based on thrombocyte lysate from platelet of donors to medium for build-up of cellular weight of stem, progenitor, differentiated and tumor cells
RU2710367C2 (en) * 2018-05-29 2019-12-26 Общество с ограниченной ответственностью "Институт биотехнологий и фармакологии", ООО "ИНБИОФАРМА" Method for producing cytokines from umbilical blood thrombocytes as substrate for developing drugs for humans and animals
RU2732150C1 (en) * 2020-03-04 2020-09-11 Общество с ограниченной ответственностью "Центр клеточных технологий" Method for producing autologous thrombocyte lysate as a base for cellular biomedical preparations of veterinary medicine

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMABLE P.R. et al. Platelet-rich plasma preparation for regenerative medicine: optimization and quantification of cytokines and growth factors. Stem Cell Res Ther. 2013, 4(3):67. PEREZ A.G. et al. Relevant aspects of centrifugation step in the preparation of platelet-rich plasma. ISRN Hematol. 2014, 2014:176060. *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023052954A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 Miszewski Alexandra Grace Method of preparing a solution for activating platelets
RU2795058C1 (en) * 2022-05-04 2023-04-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства" Method for washing cryopreserved-thawed platelets from the enclosing solution
CN114921410A (en) * 2022-06-02 2022-08-19 上海交通大学医学院附属瑞金医院 Method for the separation of optimized and standardized microparticles, and the significance and use thereof
RU2790701C1 (en) * 2022-06-03 2023-02-28 Общество с ограниченной ответственностью "МеЛСиТек" Method for obtaining a solution of growth factors from platelets

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100915483B1 (en) Method of collecting placental stem cells
CN101909694A (en) The purposes of Cord blood in treatment premature labor complication
RU2739515C1 (en) Method for preparing thrombocyte lysate with high content of growth factors
US8679838B2 (en) Human serum for cell culture
EP3118307A1 (en) Activator for mesenchymal stem cells, activated mesenchymal stem cells, and method for producing same
CN113980894B (en) Method for preparing bone marrow condensed cells and application thereof in treating premature ovarian failure
CN114196619B (en) Mobilized peripheral blood concentrated cell therapeutic agent for treating premature ovarian failure
CN114177203B (en) Cell therapeutic agent for treating premature ovarian failure by umbilical cord blood concentrated cells
CN111973632B (en) Stem cell preparation for treating diabetes and preparation method thereof
Everts et al. A comparative quantification in cellularity of bone marrow aspirated with two new harvesting devices, and the non-equivalent difference between a centrifugated bone marrow concentrate and a bone marrow aspirate as biological injectates, using a bi-lateral patient model
CN113073078B (en) Universal platelet preparation prepared from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells and method
RU2679616C1 (en) Method for preparing a thrombofibrin clot with growth-stimulating properties
CN108949686B (en) Method for obtaining hematopoietic stem cells from placenta in hypoxic environment
US20120142104A1 (en) Supplement for cell cultivation media
RU2790701C1 (en) Method for obtaining a solution of growth factors from platelets
Fujiwara et al. Effect of platelet lysate on Schwann-like cell differentiation of equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells
CN115364201B (en) Bone marrow concentrated cell preparation composition for treating premature ovarian failure
CN114540296B (en) Preparation method of composite exosome and application of composite exosome in directional enhancement of angiogenesis capacity
WO2011145110A1 (en) A novel cord blood plasma nutrient formulation and a method for the preparation thereof
CN115531521B (en) Cell therapeutic agent, preparation method and application thereof
US10213465B1 (en) Method and system for repairing damaged tissue using nucleated plasma particles (Nuc-P2s) and mesodermal stem cells (MesoSCs)
López-Lozano et al. Preparation of adrenal medullary tissue for transplantation in Parkinson's disease: A new procedure
EP3439674A1 (en) Method and system for repairing damaged tissue using nucleated plasma particles (nuc-p2s) and mesodermal stem cells (mesoscs)
CN115531521A (en) Cell therapeutic agent, and preparation method and use thereof
CN115531522A (en) Umbilical cord blood concentrated cell preparation and application thereof in treating premature ovarian failure