RU2734484C1 - Method for non-invasive prenatal diagnostics of trisomy and a set for it - Google Patents

Method for non-invasive prenatal diagnostics of trisomy and a set for it Download PDF

Info

Publication number
RU2734484C1
RU2734484C1 RU2020108573A RU2020108573A RU2734484C1 RU 2734484 C1 RU2734484 C1 RU 2734484C1 RU 2020108573 A RU2020108573 A RU 2020108573A RU 2020108573 A RU2020108573 A RU 2020108573A RU 2734484 C1 RU2734484 C1 RU 2734484C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
chromosome
trisomy
dna
fetus
gene
Prior art date
Application number
RU2020108573A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Александр Владимирович Балацкий
Марк Джайн
Лариса Михайловна Самоходская
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ)
Priority to RU2020108573A priority Critical patent/RU2734484C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2734484C1 publication Critical patent/RU2734484C1/en

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.
SUBSTANCE: invention refers to biotechnology, particularly to clinical-laboratory diagnostics in the field of prenatal non-invasive diagnostics, and can be used for detection of trisomy on 21st chromosome in the early pregnancy (starting from 8th obstetric week of gestation).
EFFECT: technical result of the proposed method is non-invasive diagnosis of trisomy on 21st chromosome of the fetus, having high sensitivity (possibility of quantitative analysis at low concentrations of fetal DNA, starting from 6th week – not less than 0_7 copies/mcl); absence of risk of pregnancy termination due to absence of invasive contact with fetal tissues; simple application and interpretation of results in clinical diagnostic laboratories due to the absence of need for bioinformatic analysis; self-monitoring system both at the ssDNA restriction step, and at the stage of direct comparison of levels of 21st and the reference chromosomes.
5 cl, 9 dwg, 3 tbl, 2 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеThe technical field to which the invention relates

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к клинико-лабораторной диагностике в области пренатальной неинвазивной диагностики, и может быть использовано для выявления трисомии по 21-й хромосоме у плода на раннем сроке беременности (начиная с 8-й акушерской недели гестации).The present invention relates to medicine, in particular to clinical and laboratory diagnostics in the field of prenatal non-invasive diagnostics, and can be used to detect trisomy on chromosome 21 in a fetus at an early stage of pregnancy (starting from the 8th obstetric week of gestation).

Уровень техникиState of the art

Синдром Дауна (трисомия по 21-й хромосоме) - это геномная патология, при которой в большинстве случаев кариотип пациента представлен 47 хромосомами, в то время как в норме в ядре клетки присутствует лишь 46 хромосом, увеличение количества хромосом обусловлено появлением лишней (третьей) 21-й хромосомы [Asim А. и др. Down syndrome: an insight of the disease // J. Biomed. Sci. 2015. T. 22. №1. C. 41]. Также существуют дополнительные формы данного заболевания: транслокация участка 21-й хромосомы на другие хромосомы (чаще на хромосомы 14, 15, 21, 22, Y), мозаичный вариант.Down syndrome (trisomy on the 21st chromosome) is a genomic pathology in which in most cases the patient's karyotype is represented by 47 chromosomes, while normally only 46 chromosomes are present in the cell nucleus, an increase in the number of chromosomes is due to the appearance of an extra (third) 21 th chromosome [Asim A. et al. Down syndrome: an insight of the disease // J. Biomed. Sci. 2015. T. 22. No. 1. P. 41]. There are also additional forms of this disease: translocation of a section of chromosome 21 to other chromosomes (more often to chromosomes 14, 15, 21, 22, Y), a mosaic variant.

Синдром Дауна является весьма распространенной патологией - в среднем на 700 беременностей приходится 1 трисомия по 21-й хромосоме [Presson А.Р. и др. Current estimate of down syndrome population prevalence in the United States // J. Pediatr. 2013. T. 163. №4. C. 1163-1168]. Однако благодаря развитию пренатальной диагностики рождаемость детей с данной патологией в настоящее время находится на уровне 1:1100, так как при пренатальной постановке диагноза «трисомия по 21-й хромосоме» беременным женщинам предлагается прервать беременность. К факторам, оказывающим влияние на вероятность развития трисомии по 21-й хромосоме, следует относить возраст отца и матери, а также трисомию по 21-й хромосоме при прошлых беременностях. Так, при возрасте матери 20-24 лет вероятность развития трисомии по 21-й хромосоме составляет 1:1562, при возрасте матери 25-29 лет - 1:1000, в то время как при возрасте матери старше 45 лет - 1:19. Также возраст отца старше 42 лет существенно увеличивает риск развития данной патологии.Down syndrome is a very common pathology - on average, 700 pregnancies have 1 trisomy on the 21st chromosome [Presson A.R. et al. Current estimate of down syndrome population prevalence in the United States // J. Pediatr. 2013. T. 163. No. 4. C. 1163-1168]. However, due to the development of prenatal diagnostics, the birth rate of children with this pathology is currently at the level of 1: 1100, since with a prenatal diagnosis of trisomy on chromosome 21, pregnant women are encouraged to terminate the pregnancy. Factors affecting the likelihood of developing trisomy on chromosome 21 include the age of the father and mother, as well as trisomy on chromosome 21 in past pregnancies. So, with a mother's age of 20-24 years, the probability of developing trisomy on chromosome 21 is 1: 1562, with a mother's age of 25-29 years - 1: 1000, while with a mother's age over 45 years old - 1:19. Also, the age of the father over 42 years old significantly increases the risk of developing this pathology.

Циркулирующая в периферической крови матери фетальная ДНК (цфДНК) была обнаружена в 1997 году [Lo Y.M.D. и др. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum // Lancet. 1997. T. 350. №9076. C. 485-487]. Генетический материал плода попадает в материнские кровеносные сосуды во время физиологического цикла апоптоза в плаценте, необходимого для обновления трофобласта. цфДНК обладает уникальными свойствами, которые отличают ее от циркулирующей материнской ДНК и в некотором смысле затрудняют ее лабораторный анализ: высокая степень фрагментированности и относительно низкое содержание в крови по сравнению с ДНК матери (фракция). Известно, что фрагменты цфДНК по большей части короче, чем фрагменты материнской циркулирующей ДНК [Chan K.С.А. и др. Size Distributions of Maternal and Fetal DNA in Maternal Plasma // Clin. Chem. 2004. T. 50. №1. C. 88-92]. Также было продемонстрировано, что средняя фракция цфДНК в 1-м триместре беременности составляет всего 9%, а появляться в крови матери цфДНК начинает уже, начиная с 4-й недели беременности [Zhou Y. и др. Effects of Maternal and Fetal Characteristics on Cell-Free Fetal DNA Fraction in Maternal Plasma // Reprod. Sci. 2015. T. 22. №11. C. 1429-1435]. К особенностям цфДНК также можно отнести отличный от материнского паттерн эпигенетической регуляции, в частности степень метилирования промоторов некоторых генов [Kim S.Y. и др. Quantification of the placental epigenetic signature of the SERPINB5 gene in maternal plasma of pregnancies complicated by small for gestational age // Placenta. 2015. T. 36. №2. C. 131-137]. Таким образом, цфДНК не только является перспективным диагностическим материалом, не требующим инвазивного исследования ткани зародыша, но и обладает рядом особенностей, которые могут быть использованы для отделения ее от материнской циркулирующей ДНК.Fetal DNA (cfDNA) circulating in the peripheral blood of the mother was discovered in 1997 [Lo Y.M.D. et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum // Lancet. 1997. T. 350. No. 9076. C. 485-487]. The genetic material of the fetus enters the maternal blood vessels during the physiological cycle of apoptosis in the placenta, which is necessary for trophoblast renewal. cfDNA has unique properties that distinguish it from circulating maternal DNA and, in a way, complicate its laboratory analysis: a high degree of fragmentation and a relatively low content in the blood compared to the mother's DNA (fraction). It is known that cfDNA fragments are mostly shorter than fragments of maternal circulating DNA [Chan K.C.A. et al. Size Distributions of Maternal and Fetal DNA in Maternal Plasma // Clin. Chem. 2004. T. 50. No. 1. S. 88-92]. It was also demonstrated that the average fraction of cfDNA in the 1st trimester of pregnancy is only 9%, and cfDNA begins to appear in the mother's blood already starting from the 4th week of pregnancy [Zhou Y. et al. Effects of Maternal and Fetal Characteristics on Cell -Free Fetal DNA Fraction in Maternal Plasma // Reprod. Sci. 2015. T. 22. No. 11. C. 1429-1435]. The features of cfDNA can also be attributed to a different from the maternal pattern of epigenetic regulation, in particular the degree of methylation of some gene promoters [Kim S.Y. et al. Quantification of the placental epigenetic signature of the SERPINB5 gene in maternal plasma of pregnancies complicated by small for gestational age // Placenta. 2015. T. 36. No. 2. S. 131-137]. Thus, cfDNA is not only a promising diagnostic material that does not require invasive examination of the embryonic tissue, but also has a number of features that can be used to separate it from the maternal circulating DNA.

Из уровня техники известно, что стандартным в Российской Федерации методом исследования на наличие трисомии по 21-й хромосоме у беременной женщины являются скрининги I и II триместров (11-14 и 16-21 недель соответственно). В рамках скрининга I триместра проводится определение количества, ассоциированного с беременностью плазменного протеина А, свободной β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, а также ультразвуковое исследование. В то время как в рамках скрининга II триместра проводят определение уровней α-фетопротеина, свободной β-субъединицы хорионического гонадотропина человека, свободного эстриола, а также ультразвуковое исследование. При помощи данного подхода удается диагностировать трисомию по 21-й хромосоме с вероятностью, достигающей лишь 70% с частотой ложноположительных результатов 5% [Mujezinovic F., Alfirevic Z. Procedure-Related Complications of Amniocentesis and Chorionic Villous Sampling // Obstet. Gynecol. 2007. T. 110. №3. C. 687-694]. Поэтому диагноз необходимо верифицировать при помощи одного из инвазивных видов исследования, сопровождающихся забором ткани плода: аспирация ворсин хориона (8-14 недель), амниоцентез (14-18 недель), кордоцентез (с 18-й недели) [Tongsong Т. и др. Second-trimester cordocentesis and the risk of small for gestational age and preterm birth // Obstet. Gynecol. 2014. T. 124. №5. C. 919-925]. Несмотря на то, что инвазивные процедуры обладают сравнительно высокой точностью (более 90%), их проведение сопряжено с довольно высоким риском прерывания беременности (2%).It is known from the prior art that the standard method in the Russian Federation for testing for the presence of trisomy on the 21st chromosome in a pregnant woman is screenings of the first and second trimesters (11-14 and 16-21 weeks, respectively). As part of the first trimester screening, the amount of plasma protein A associated with pregnancy, the free β-subunit of human chorionic gonadotropin, is determined, as well as ultrasound examination. While in the framework of the second trimester screening, the levels of α-fetoprotein, free β-subunit of human chorionic gonadotropin, free estriol, as well as ultrasound examination are determined. Using this approach, it is possible to diagnose trisomy on chromosome 21 with a probability reaching only 70% with a false positive rate of 5% [Mujezinovic F., Alfirevic Z. Procedure-Related Complications of Amniocentesis and Chorionic Villous Sampling // Obstet. Gynecol. 2007. T. 110. No. 3. C. 687-694]. Therefore, the diagnosis must be verified using one of the invasive types of research, accompanied by fetal tissue sampling: chorionic villus aspiration (8-14 weeks), amniocentesis (14-18 weeks), cordocentesis (from the 18th week) [Tongsong T. et al. Second-trimester cordocentesis and the risk of small for gestational age and preterm birth // Obstet. Gynecol. 2014. T. 124. No. 5. C. 919-925]. Despite the fact that invasive procedures have a relatively high accuracy (over 90%), their implementation is associated with a rather high risk of abortion (2%).

Из уровня техники известен пример подхода к вышеобозначенной инвазивной диагностике, описанный в патенте CN108070639. В соответствии с данным способом биологическим субстратом для диагностики трисомии по 21-й хромосоме является амниотическая жидкость. При помощи цифровой полимеразной цепной реакции (ПЦР) и набора олигонуклеотидных праймеров и зондов, специфичных к 21-й и референсной хромосоме, в ДНК, выделенной из амниотической жидкости, проводится определение уровней вышеназванных хромосом с целью определить их соотношение.Данный способ обладает недостатками, характерными для инвазивных методов, описанными выше: амниотичекую жидкость, как правило, получают на 14-18-й неделе беременности, в результате чего диагностика трисомии по 21-й хромосоме происходит сравнительно поздно, и в случае прерывания беременности увеличиваются риски нежелательных последствий для пациента, также выполнение амниоцентеза, необходимого для получения данного биоматериала сопряжено с риском прерывания беременности, равным 2%.An example of an approach to the aforementioned invasive diagnosis is known from the prior art and is described in patent CN108070639. In accordance with this method, the amniotic fluid is the biological substrate for the diagnosis of trisomy on the 21st chromosome. Using digital polymerase chain reaction (PCR) and a set of oligonucleotide primers and probes specific to the 21st and reference chromosomes, the levels of the above chromosomes are determined in DNA isolated from the amniotic fluid in order to determine their ratio. for the invasive methods described above: amniotic fluid, as a rule, is obtained at 14-18 weeks of pregnancy, as a result of which the diagnosis of trisomy on chromosome 21 occurs relatively late, and in case of termination of pregnancy, the risks of unwanted consequences for the patient increase, also performing amniocentesis required to obtain this biomaterial carries a 2% risk of abortion.

Таким образом, к недостаткам вышеописанного подхода к пренатальной диагностике трисомии по 21-й хромосоме можно отнести поздний срок конечной постановки диагноза, что увеличивает возможные риски в случае решения о прерывании беременности, низкую точность неинвазивного этапа определения, высокий риск прерывания беременности во время проведения инвазивного этапа.Thus, the disadvantages of the above approach to prenatal diagnosis of trisomy on chromosome 21 can be attributed to the late term of the final diagnosis, which increases the possible risks in case of a decision to terminate pregnancy, low accuracy of the non-invasive stage of determination, high risk of termination of pregnancy during the invasive stage. ...

Из уровня техники известны подходы к неинвазивной пренатальной диагностике трисомии по 21-й хромосоме, основанные на методах секвенирования нового поколения. В частности, известен способ неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий плода, заключающийся в том, что у беременной женщины на раннем сроке (от 8-й недели гестации) проводится забор периферической крови, из который выделяется общая циркулирующая ДНК (оцДНК), которая затем подвергается анализу при помощи технологий секвенирования нового поколения (RU2627673). Данные подходы обладают высокой точностью, однако для работы на секвенаторах нового поколения и анализа данных необходимы высококвалифицированные специалисты с биоинформатическим образованием, а также обслуживание таких приборов требует куда больших затрат, чем обслуживание оборудования для различных видов ПЦР, для анализа результатов которой также нет необходимости в специалисте-биоинформатике. Вышеперечисленные факторы делают недоступным данный вид пренатальной неинвазивной диагностики для широких слоев населения ввиду высокой стоимости.The prior art known approaches to non-invasive prenatal diagnosis of trisomy on the 21st chromosome, based on sequencing methods of the new generation. In particular, there is a known method of non-invasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies, which consists in the fact that a pregnant woman at an early stage (from the 8th week of gestation) is sampled peripheral blood, from which total circulating DNA (ssDNA) is extracted, which is then analyzed when using new generation sequencing technologies (RU2627673). These approaches are highly accurate, however, highly qualified specialists with bioinformatics education are required to operate new-generation sequencers and data analysis, and the maintenance of such devices is much more expensive than maintaining equipment for various types of PCR, for the analysis of the results of which there is also no need for a specialist. -bioinformatics. The above factors make this type of prenatal non-invasive diagnostics inaccessible for the general population due to the high cost.

Из уровня техники известны методы неинвазивной пренатальной диагностики, основанные на ПЦР в реальном времени после проведения рестрикции, чувствительной к метилированию, например, способ получения ДНК-праймеров и зондов для малоинвазивной пренатальной ПЦР-диагностики трисомии 21-й хромосомы у плода по крови беременной женщины и диагностический набор для ее осуществления (RU2602366). Данный подход подразумевает после выделения циркулирующей ДНК из крови матери проведение рестрикции, чувствительной к метилированию, а затем ПЦР в реальном времени по дифференциально метилированным сайтам ДНК плода на 21-й и референсной хромосомах. Главным недостатком такого вида исследования является необходимость проведения параллельных количественных ПЦР в реальном времени, в результате чего на соотношение 21-й и референсной хромосом оказывает влияние не только погрешность пипетирования в рамках отдельных пробирок для параллельных ПЦР в реальном времени, но и ограниченная воспроизводимость ПЦР в реальном времени. Необходимо отметить, что при количественной ПЦР в реальном времени происходит определение уровня ДНК относительно стандарта, низкое качество которого способно существенно исказить результат, также точность ПЦР в реальном времени существенно падает при работе с низкими концентрациями ДНК, которые и имеют место быть в случае с цфДНК, и данный вид ПЦР малоустойчив к ингибиторам ПЦР при сравнении с более современными вариациями ПЦР - цифровой ПЦР [Quan P.L., Sauzade М., Brouzes Е. DPCR: A technology review // Sensors (Switzerland). 2018. Т. 18. №4]. К еще одному недостатку вышеописанного подхода к неинвазивной пренатальной диагностике трисомии можно отнести отсутствие системы проверки полноты рестрикции, чувствительной к метилированию. В случае ее неполного протекания в растворе ДНК останутся копии генетического материала матери, как 21-й хромосомы, так и референсной, что существенно исказит соотношение этих хромосом при наличии трисомии по 21-й хромосоме плода. Все вышеописанный недостатки такого подхода не позволили ему получить широкое распространение в пренатальной диагностике.The prior art knows methods of non-invasive prenatal diagnostics based on real-time PCR after restriction sensitive to methylation, for example, a method for obtaining DNA primers and probes for minimally invasive prenatal PCR diagnostics of trisomy of the 21st chromosome in a fetus from the blood of a pregnant woman and diagnostic kit for its implementation (RU2602366). This approach implies, after isolation of circulating DNA from the mother's blood, restriction sensitive to methylation, and then real-time PCR on differentially methylated sites of fetal DNA on the 21st and reference chromosomes. The main disadvantage of this type of study is the need for parallel quantitative real-time PCR, as a result of which the ratio of the 21st and the reference chromosomes is influenced not only by the pipetting error within individual tubes for parallel real-time PCR, but also by the limited reproducibility of real-time PCR. time. It should be noted that with quantitative real-time PCR, the level of DNA is determined relative to a standard, the low quality of which can significantly distort the result, and the accuracy of real-time PCR significantly decreases when working with low concentrations of DNA, which are the case with cfDNA. and this type of PCR is not very resistant to PCR inhibitors when compared with more modern PCR variations - digital PCR [Quan PL, Sauzade M., Brouzes E. DPCR: A technology review // Sensors (Switzerland). 2018. T. 18. No. 4]. Another disadvantage of the above-described approach to non-invasive prenatal diagnosis of trisomy is the absence of a restriction completeness check system that is sensitive to methylation. In the event of its incomplete flow, copies of the mother's genetic material, both the 21st chromosome and the reference, will remain in the DNA solution, which will significantly distort the ratio of these chromosomes in the presence of trisomy on the 21st chromosome of the fetus. All the above-described disadvantages of this approach did not allow it to be widely used in prenatal diagnosis.

Таким образом, в настоящее время существует необходимость в создании способа неинвазивной пренатальной диагностики трисомии по 21-й хромосоме, лишенного всех вышеперечисленных недостатков.Thus, there is currently a need to create a method for non-invasive prenatal diagnosis of trisomy on the 21st chromosome, devoid of all of the above disadvantages.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Техническая проблема, решаемая посредством заявляемого изобретения, заключается в устранении недостатков, таких как влияние ограниченной воспроизводимости методов количественного анализа ДНК и погрешности пипетирования на точность определения соотношения 21-й и референсной хромосом, а также фракции цфДНК, низкая точность количественного определения уровня ДНК при малых концентрациях генетического материала плода, наблюдаемых на ранних сроках беременности (6-12 недель), необходимость биоинформатического анализа результатов, отсутствие системы проверки полноты рестрикции, чувствительной к метилированию. Техническая проблема реализуется за счет создания набора реагентов и способа неинвазивной пренатальной диагностики трисомии по 21-й хромосоме при помощи определения соотношения 21-й и рефересной хромосомы в сумме циркулирующей в крови матери ДНК с последующим подтверждением результатов за счет определения фракции цфДНК, обеспечивающих высокий уровень статистической достоверности.The technical problem solved by the claimed invention is to eliminate disadvantages, such as the effect of limited reproducibility of quantitative DNA analysis methods and pipetting errors on the accuracy of determining the ratio of the 21st and reference chromosomes, as well as the cfDNA fraction, low accuracy of quantitative determination of the DNA level at low concentrations fetal genetic material observed in early pregnancy (6-12 weeks), the need for bioinformatic analysis of the results, the absence of a restriction completeness check system that is sensitive to methylation. The technical problem is realized by creating a set of reagents and a method for non-invasive prenatal diagnosis of trisomy on the 21st chromosome by determining the ratio of the 21st and reference chromosomes in the amount of DNA circulating in the mother's blood, followed by confirmation of the results by determining the cfDNA fraction, providing a high level of statistical reliability.

Техническим результатом заявляемого способа является проведение неинвазивной диагностики трисомии по 21-й хромосоме плода, обладающей высокой чувствительностью (возможность количественного анализа при низких концентрациях ДНК плода, начиная с 6-й недели - не менее 0,7 копий/мкл); отсутствием риска прерывания беременности ввиду отсутствия инвазивного контакта с тканями плода; простотой применения и интерпретации результатов в клинико-диагностических лабораториях ввиду отсутствия необходимости в биоинформатическом анализе; системой самоконтроля как на этапе рестрикции оцДНК, так и на этапе непосредственного сравнения уровней 21-й и референсной хромосом.The technical result of the proposed method is to conduct a non-invasive diagnosis of trisomy on the 21st chromosome of the fetus, which has high sensitivity (the possibility of quantitative analysis at low concentrations of fetal DNA, starting from the 6th week - at least 0.7 copies / μl); no risk of termination of pregnancy due to the absence of invasive contact with fetal tissues; ease of use and interpretation of results in clinical diagnostic laboratories due to the absence of the need for bioinformatics analysis; a self-control system both at the stage of ssDNA restriction and at the stage of direct comparison of the levels of the 21st and reference chromosomes.

Техническая проблема решается способом неинвазивного пренатального определения трисомии по 21-й хромосоме, включающим проведение забора крови беременной женщины, отделение плазмы, выделение из нее циркулирующей внеклеточной ДНК с последующим определением соотношения 21-й хромосомы и референсной и подтверждением результатов при помощи определения фракции цфДНК и ее соответствия увеличению вышеобозначенного соотношения; при повышенном соотношении 21-й хромосомы и референсной, подтвержденном фракцией цфДНК, делают заключение о наличии трисомии по 21-й хромосоме у плода.The technical problem is solved by the method of non-invasive prenatal determination of trisomy on the 21st chromosome, including taking blood from a pregnant woman, separating plasma, isolating circulating extracellular DNA from it, followed by determining the ratio of the 21st chromosome and the reference one and confirming the results by determining the cfDNA fraction and its compliance with the increase in the above ratio; with an increased ratio of the 21st chromosome and the reference, confirmed by the cfDNA fraction, a conclusion is made about the presence of trisomy on the 21st chromosome in the fetus.

Проблема также решается способом определения трисомии по 21-й хромосоме по фетальной ДНК в крови матери, включающим:The problem is also solved by the method of determining trisomy on the 21st chromosome by fetal DNA in the mother's blood, including:

- выделение ДНК из плазмы крови беременной женщины с получением двух аликвот;- isolation of DNA from the blood plasma of a pregnant woman with obtaining two aliquots;

- проведение цифровой ПЦР аликвоты №1 с количественным определением уровней 21-й и референсной хромосом по генам PRDM15 и EIF2C1 соответственно с расчетом их соотношения;- digital PCR of aliquot No. 1 with quantitative determination of the levels of the 21st and reference chromosomes for the PRDM15 and EIF2C1 genes, respectively, with the calculation of their ratio;

- при соотношении уровней 21-й и референсной хромосом менее или равном 1 делается вывод об отсутствии трисомии по 21-й хромосоме плода;- when the ratio of the levels of the 21st and reference chromosomes is less than or equal to 1, it is concluded that there is no trisomy on the 21st chromosome of the fetus;

- при получении соотношения уровней 21-й и референсной хромосом более 1 делается вывод о возможном наличии трисомии по 21-й хромосоме плода и рассчитывается фракция фетальной ДНК по 21-й хромосоме.- when the ratio of the levels of the 21st and reference chromosomes is more than 1, a conclusion is made about the possible presence of trisomy on the 21st chromosome of the fetus and the fraction of fetal DNA on the 21st chromosome is calculated.

При этом аликвота №2 используются для верификации полученных результатов, для этого:In this case, aliquot No. 2 is used to verify the results obtained, for this:

- аликвоту №2 обрабатывают эндонуклеазой рестрикции, чувствительной к метилированию;- aliquot # 2 is treated with a restriction endonuclease sensitive to methylation;

- подтверждают полноту рестрикции при помощи ПЦР в реальном времени по гену АСТВ, содержащему сайт рестрикции и лишенному гиперметилирования,- confirm the completeness of restriction by real-time PCR for the ASTV gene containing a restriction site and devoid of hypermethylation,

- при наличии сигнала от гена АСТВ повторяют процедуру рестрикции, чувствительной к метилированию,- in the presence of a signal from the ASTH gene, the restriction procedure sensitive to methylation is repeated,

- при отсутствии сигнала от гена АСТВ считают рестрикцию, чувствительную к метилированию, прошедшей в полной мере,- in the absence of a signal from the ASHF gene, a restriction sensitive to methylation is considered fully passed,

- проводят цифровую ПЦР аликвоты №2 с параллельным определением числа копий гиперметилированного у плода гена RASSF1A и гена EIF2C1, лишенного сайта рестрикции и представляющего сумму ДНК матери и плода, в одной реакционной смеси,- carry out digital PCR of aliquot No. 2 with parallel determination of the number of copies of the RASSF1A gene hypermethylated in the fetus and the EIF2C1 gene, devoid of the restriction site and representing the sum of the mother and fetus DNA, in one reaction mixture,

- определяют фракцию фетальной ДНК по соотношению чисел копий гена RASSF1A и гена EIF2C1.- determine the fraction of fetal DNA by the ratio of the copy numbers of the RASSF1A gene and the EIF2C1 gene.

- если расхождение между значениями фракции фетальной ДНК, вычисленными по результатам измерений аликвот №1 и №2 не превышает 10% от большего значения, результаты измерений считаются достоверными.- if the discrepancy between the values of the fetal DNA fraction calculated from the results of measurements of aliquots No. 1 and No. 2 does not exceed 10% of the larger value, the measurement results are considered reliable.

Проблема решается также созданием набора реагентов, предназначенного для реализации заявляемого способа, включающего праймеры и зонды, специфичные к генам PRDM15, EIF2C1, АСТВ, RASSF1A.The problem is also solved by creating a set of reagents intended for the implementation of the proposed method, including primers and probes specific to the genes PRDM15, EIF2C1, ASTV, RASSF1A.

Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings

На фиг. 1 представлены результаты ПЦР в реальном времени по гену АСТВ для подтверждения полноты рестрикции (пример 1).FIG. 1 shows the results of real-time PCR for the ASHB gene to confirm the completeness of restriction (example 1).

На фиг. 2 представлены результаты цифровой ПЦР чипа №1.1 по генам PRDM15 (хромосома 21) и EIF2C1 (хромосома 1) (пример 1).FIG. 2 shows the results of digital PCR chip # 1.1 for the PRDM15 (chromosome 21) and EIF2C1 (chromosome 1) genes (example 1).

На фиг. 3 представлены результаты цифровой ПЦР чипа №2.1 по гиперметилированному у плода гену RASSF1A (хромосома 3) и гену EIF2C1, лишенному сайта рестрикции и отражающему сумму ДНК матери и плода (хромосома 1) (пример 1).FIG. 3 shows the results of digital PCR chip # 2.1 on the RASSF1A gene hypermethylated in the fetus (chromosome 3) and the EIF2C1 gene, devoid of a restriction site and reflecting the sum of maternal and fetal DNA (chromosome 1) (example 1).

На фиг. 4 представлены результаты ПЦР в реальном времени по гену АСТВ для подтверждения полноты рестрикции (пример 2).FIG. 4 shows the results of real-time PCR for the ASHB gene to confirm the completeness of the restriction (example 2).

На фиг. 5 представлены результаты цифровой ПЦР чипа №1.1 по генам PRDM15 (хромосома 21) и EIF2C1 (хромосома 1) (пример 2).FIG. 5 shows the results of digital PCR chip # 1.1 for the PRDM15 (chromosome 21) and EIF2C1 (chromosome 1) genes (example 2).

На фиг. 6 представлены результаты цифровой ПЦР чипа №2.1 по гиперметилированному у плода гену RASSF1A (хромосома 3) и гену EIF2C1, лишенному сайта рестрикции и отражающему сумму ДНК матери и плода (хромосома 1) (пример 2).FIG. 6 shows the results of digital PCR chip No. 2.1 on the RASSF1A gene hypermethylated in the fetus (chromosome 3) and the EIF2C1 gene, devoid of a restriction site and reflecting the sum of maternal and fetal DNA (chromosome 1) (example 2).

На фиг. 7 представлены результаты ПЦР в реальном времени по гену АСТВ для подтверждения полноты рестрикции (пример 3).FIG. 7 shows the results of real-time PCR for the ASHB gene to confirm the completeness of the restriction (example 3).

На фиг. 8 представлены результаты цифровой ПЦР чипа №1.1 по генам PRDM15 (хромосома 21) и EIF2C1 (хромосома 1) (пример 3).FIG. 8 shows the results of digital PCR chip # 1.1 for the PRDM15 (chromosome 21) and EIF2C1 (chromosome 1) genes (example 3).

На фиг. 9 представлены результаты цифровой ПЦР чипа №2.1 по гиперметилированному у плода гену RASSF1A (хромосома 3) и гену EIF2C1, лишенному сайта рестрикции и отражающему сумму ДНК матери и плода (хромосома 1) (пример 3).FIG. 9 shows the results of digital PCR chip No. 2.1 on the RASSF1A gene hypermethylated in the fetus (chromosome 3) and the EIF2C1 gene, devoid of a restriction site and reflecting the sum of maternal and fetal DNA (chromosome 1) (example 3).

Осуществление изобретенияImplementation of the invention

Проведенный анализ биоматериала от 23 женщин на ранних сроках беременности (12-16 недель) с высоким риском развития трисомии по 21-й хромосоме у плода по результатам скрининга I триместра с использованием заявляемого способа показал, что у 11 пациенток имеет место быть трисомия по 21-й хромосоме.The analysis of biomaterials from 23 women in early pregnancy (12-16 weeks) with a high risk of developing trisomy on the 21st chromosome in the fetus according to the results of screening the first trimester using the proposed method showed that 11 patients have trisomy 21- th chromosome.

Пациенткам, участвовавшим в исследовании, была проведена процедура инвазивной пренатальной диагностики трисомии по 21-й хромосоме при помощи аспирации ворсин хориона и последующего кариотипирования. У 11 пациенток был подтвержден диагноз, что на 100% совпало с результатами определения по заявляемому способу.Patients participating in the study underwent invasive prenatal diagnosis of trisomy on chromosome 21 using chorionic villus aspiration and subsequent karyotyping. In 11 patients, the diagnosis was confirmed, which coincided 100% with the results of the determination according to the claimed method.

Таким образом, была подтверждена пригодность заявляемого способа для пренатальной неинвазивной диагностики трисомии по 21-й хромосоме по фетальной ДНК, циркулирующей в крови матери.Thus, the suitability of the proposed method for prenatal non-invasive diagnosis of trisomy on the 21st chromosome was confirmed by fetal DNA circulating in the mother's blood.

Заявляемый способ неинвазивного пренатального определения трисомии по 21-й хромосоме включает:The inventive method for non-invasive prenatal determination of trisomy on the 21st chromosome includes:

- получение образца периферической крови беременной женщины;- obtaining a sample of the peripheral blood of a pregnant woman;

- выделения плазмы крови из образца путем центрифугирования образца крови;- Isolation of blood plasma from the sample by centrifuging the blood sample;

- выделение ДНК из плазмы крови с получением раствора с выделенной ДНК;- isolation of DNA from blood plasma to obtain a solution with isolated DNA;

- отбор двух аликвот из полученного раствора;- selection of two aliquots from the resulting solution;

- обработка аликвоты №2 эндонуклеазой рестриции, чувствительной к метилированию;- treatment of aliquot No. 2 with a restriction endonuclease sensitive to methylation;

- проверка полноты рестрикции путем проведения ПЦР в реальном времени по гену АСТВ;- verification of the completeness of restriction by carrying out real-time PCR for the ASTV gene;

- при наличии сигнала от гена АСТВ повторяют процедуру рестрикции, чувствительной к метилированию,- in the presence of a signal from the ASTH gene, the restriction procedure sensitive to methylation is repeated,

- при отсутствии сигнала от гена АСТВ считают рестрикцию, чувствительную к метилированию, прошедшей в полной мере,- in the absence of a signal from the ASHF gene, a restriction sensitive to methylation is considered fully passed,

- проведение цифровой ПЦР:- conducting digital PCR:

1) аликвоты №1 из исходного раствора с выделенной ДНК по гену 21-й хромосомы PRDM15 и референсной - EIF2C1;1) aliquots No. 1 from the original solution with the isolated DNA for the gene of the 21st chromosome PRDM15 and the reference one - EIF2C1;

2) аликвоты №2, обработанной эндонуклеазой рестрикции, по гиперметилированному у плода гену RASSF1A и гену EIF2C1, лишенному сайта рестрикции и представляющему сумму ДНК матери и плода;2) aliquots No. 2, treated with restriction endonuclease, for the RASSF1A gene hypermethylated in the fetus and the EIF2C1 gene, devoid of the restriction site and representing the sum of the mother and fetus DNA;

- подсчет фракции фетальной ДНК по результатам цифровой ПЦР аликвоты №2 путем деления концентрации ДНК по гиперметилированному у плода гену RASSF1A на концентрацию ДНК по гену EIF2C1, лишенному сайта рестрикции и представляющему сумму ДНК матери и плода, по формуле:- calculation of the fetal DNA fraction according to the results of digital PCR of aliquot No. 2 by dividing the DNA concentration for the RASSF1A gene hypermethylated in the fetus by the DNA concentration for the EIF2C1 gene, devoid of a restriction site and representing the sum of the mother's and fetus's DNA, according to the formula:

Figure 00000001
Figure 00000001

где FR - фракция фетальной ДНК, определенная по гиперметилированному у плода гену RASSF1A; CR - концентрация ДНК по гену RASSF1A в аликвоте №2; СЕ - концентрация ДНК по гену EIF2C1 в аликвоте №2;where F R is the fetal DNA fraction determined by the RASSF1A gene hypermethylated in the fetus; C R - DNA concentration for the RASSF1A gene in aliquot # 2; C E - DNA concentration for the EIF2C1 gene in aliquot No. 2;

- анализ данных цифровой ПЦР аликвоты №1:- data analysis of digital PCR aliquot No. 1:

1) в случае, если при анализе соотношение уровней 21-й (ген PRDM15) и референсной хромосом (ген EIF2C1) менее или равном 1, то делается вывод об отсутствии трисомии по 21-й хромосоме плода;1) if, in the analysis, the ratio of the levels of the 21st chromosome (PRDM15 gene) and the reference chromosomes (EIF2C1 gene) is less than or equal to 1, then it is concluded that there is no trisomy on the 21st chromosome of the fetus;

2) в случае, если соотношение уровней 21-й (ген PRDM15) и референсной (ген EIF2C1) хромосом более 1, то делается вывод о возможном наличии трисомии по 21-й хромосоме плода и рассчитывается фракция фетальной ДНК по 21-й хромосоме, для этого необходимо воспользоваться формулой:2) if the ratio of the levels of the 21st (PRDM15 gene) and the reference (EIF2C1 gene) chromosomes is more than 1, then a conclusion is made about the possible presence of trisomy on the 21st chromosome of the fetus and the fetal DNA fraction on the 21st chromosome is calculated, for this you need to use the formula:

Figure 00000002
Figure 00000002

где FP - фракция фетальной ДНК, определенная по гену PRDM15; СР - концентрация ДНК по гену 21-й хромосомы PRDM15 в аликвоте №1; CE1 - концентрация ДНК по гену EIF2C1 в аликвоте №1;where F P is the fetal DNA fraction determined by the PRDM15 gene; С Р - DNA concentration for the gene of the 21st chromosome PRDM15 in aliquot No. 1; C E1 - DNA concentration for the EIF2C1 gene in aliquot # 1;

- при схождении значений FP и FR (разница между результатами не превышает 10% от большего значения; 10% является инструментальной погрешностью при проведении цифровой ПЦР на чипах) считают, что плод имеет трисомию по 21-й хромосоме.- when the F P and F R values converge (the difference between the results does not exceed 10% of the larger value; 10% is an instrumental error when conducting digital PCR on chips), it is believed that the fetus has trisomy on chromosome 21.

Процесс центрифугирования проводят в условиях достаточных для осаждения форменных элементов крови и получения плазмы. Предпочтительно проводить центрифугирование в течение 10 минут при 3000 g со средней скоростью разгона и низкой скоростью торможения; не рекомендуется отбирать нижний слой плазмы (10% от общего объема плазмы у дна пробирки).The centrifugation process is carried out under conditions sufficient to precipitate blood cells and obtain plasma. It is preferable to carry out centrifugation for 10 minutes at 3000 g with an average acceleration rate and a low deceleration rate; it is not recommended to take the lower plasma layer (10% of the total plasma volume at the bottom of the tube).

Выделение ДНК из плазмы крови осуществляют с использованием набора реагентов, обеспечивающих полное выделение генетического материала из образца и предназначенным для выделения внеклеточной ДНК из плазмы.Isolation of DNA from blood plasma is carried out using a set of reagents that ensure complete isolation of genetic material from a sample and is designed to isolate extracellular DNA from plasma.

Предпочтительно для проведения рестрикции использовать эндонуклеазу BstFN I, продолжительность рестрикции необходимо рассчитать, исходя из предполагаемой концентрации ДНК в растворе и активности фермента, указанной производителем.It is preferable to use the endonuclease BstFN I for restriction, the duration of the restriction must be calculated based on the expected concentration of DNA in solution and the enzyme activity indicated by the manufacturer.

Проведение цифровой ПЦР рекомендуется производить в соответствии с рекомендациями производителя оборудования для проведения цифровой ПЦР и с использованием реагентов, подходящих для данного оборудования, используемого для проведения цифровой ПЦР, например, из набора QuantStudio™ 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 (Thermo Fisher Scientific, США) с применением специфичных гидролизуемых зондов.Digital PCR is recommended to be performed in accordance with the recommendations of the manufacturer of digital PCR equipment and using reagents suitable for the equipment used for digital PCR, for example, from the QuantStudio ™ 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 (Thermo Fisher Scientific, USA ) using specific hydrolyzable probes.

Ниже приведены последовательности праймеров и зондов:Below are the sequences of primers and probes:

RASSF1A_F: 5'-AGCCTGAGCTCATTGAGCT-3' (SEQ ID NO: 1)RASSF1A_F: 5'-AGCCTGAGCTCATTGAGCT-3 '(SEQ ID NO: 1)

RASSF1A_R: 5'-ACCAGCTGCCGTGTG-3' (SEQ ID NO: 2)RASSF1A_R: 5'-ACCAGCTGCCGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 2)

RASSF1A_pr: 5'-6-FAM-CCAACGCGCTGCGCA-BHQ-1-3' (SEQ ID NO: 3)RASSF1A_pr: 5'-6-FAM-CCAACGCGCTGCGCA-BHQ-1-3 '(SEQ ID NO: 3)

EIF2C1_F: 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT-3' (SEQ ID NO: 4)EIF2C1_F: 5'-GTTCGGCTTTCACCAGTCT-3 '(SEQ ID NO: 4)

EIF2C1_F: 5'-CTCCATAGCTCTCCCCACTC-3' (SEQ ID NO: 5)EIF2C1_F: 5'-CTCCATAGCTCTCCCCACTC-3 '(SEQ ID NO: 5)

EIF2C1_pr: 5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ-1-3' (SEQ ID NO: 6)EIF2C1_pr: 5'-HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ-1-3 '(SEQ ID NO: 6)

PRDM15_F: 5'-GCACACTCCAGAATGACC-3' (SEQ ID NO: 7)PRDM15_F: 5'-GCACACTCCAGAATGACC-3 '(SEQ ID NO: 7)

PRDM15_R: 5'-GGAGGCTGGATTGAGTTG-3' (SEQ ID NO: 8)PRDM15_R: 5'-GGAGGCTGGATTGAGTTG-3 '(SEQ ID NO: 8)

PRDM15_pr: 5'-6-FAM-TGGGCAGTGGAGACGCATTGGCA-BHQ-1-3' (SEQ ID NO: 9)PRDM15_pr: 5'-6-FAM-TGGGCAGTGGAGACGCATTGGCA-BHQ-1-3 '(SEQ ID NO: 9)

ACTB_F: 5'-GCGCCGTTCCGAAAGT-3' (SEQ ID NO: 10)ACTB_F: 5'-GCGCCGTTCCGAAAGT-3 '(SEQ ID NO: 10)

ACTB_R: 5'-CGGCGGATCGGCAA-3' (SEQ ID NO: 11)ACTB_R: 5'-CGGCGGATCGGCAA-3 '(SEQ ID NO: 11)

ACTB_pr: 5'-HEX-ACCGCCGAGACCGCGT-BHQ-1-3' (SEQ ID NO: 12)ACTB_pr: 5'-HEX-ACCGCCGAGACCGCGT-BHQ-1-3 '(SEQ ID NO: 12)

Тест-система, предназначенная для неинвазивного пренатального определения трисомии по 21-й хромосоме, включает праймеры и зонды, специфичные к генам PRDM15, EIF2C1, RASSF1A на хромосомах 21, 1 и 3 соответственно. Указанные праймеры и зонды могут быть добавлены в реакционную смесь для проведения цифровой ПЦР.The test system, designed for non-invasive prenatal determination of trisomy on chromosome 21, includes primers and probes specific to the PRDM15, EIF2C1, RASSF1A genes on chromosomes 21, 1 and 3, respectively. These primers and probes can be added to the reaction mixture for digital PCR.

Ниже представлено более детальное описание заявляемого способа, которое не ограничивает объем притязаний заявляемого изобретения, а демонстрирует возможность осуществления изобретения с достижением заявляемого технического результата.Below is a more detailed description of the proposed method, which does not limit the scope of the claimed invention, but demonstrates the possibility of implementing the invention with the achievement of the claimed technical result.

1) Забор 10 мл крови у пациента в пробирку, содержащую ЭДТА для предотвращения коагуляции, соотношение кровь:ЭДТА 9:1.1) Taking 10 ml of blood from a patient into a tube containing EDTA to prevent coagulation, blood: EDTA ratio 9: 1.

2) Пробирку с кровью необходимо хранить при температуре 4°С не более чем 4 часа до осуществления дальнейших операций для предотвращения потерь генетического материала вследствие действия нуклеаз плазмы.2) The tube with blood must be stored at 4 ° C for no more than 4 hours before further operations to prevent the loss of genetic material due to the action of plasma nucleases.

3) Пробирку с кровью необходимо центрифугировать в течение 10 минут при 3000g со средней скоростью разгона и низкой скоростью торможения.3) The blood tube must be centrifuged for 10 minutes at 3000g with an average acceleration rate and a low deceleration rate.

4) По завершении центрифугирования отобрать 5 мл плазмы в отдельную пробирку, при этом нужно избегать забора из нижнего слоя плазмы.4) On completion of centrifugation, take 5 ml of plasma into a separate tube, while taking from the lower plasma layer should be avoided.

5) Выделение внеклеточной ДНК из плазмы при помощи набора QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen®, Германия) в соответствии с инструкцией.5) Isolation of DNA from extracellular plasma using a set QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen ® , Germany) in accordance with the instruction.

В пробирку на 50 мл вносили пипеткой 500 мкл QIAGEN® Протеиназы К, затем в эту же пробирку вносили 5 мл плазмы из исследуемого образца. Отдельно готовили carrier РНК в ACL буфере. Для этого в отдельную пробирку вносили 4,4 мл буфера ACL и 5,6 мкл carrier РНК, предварительно растворенную в AVE буфере в соответствии с указаниями на упаковке и перемешивали на вортексе в течение 30 с. В исходную пробирку на 50 мл, содержащую исследуемую плазму и QIAGEN® Протеиназу К, вносили 4 мл carrier РНК в ACL буфере. Пробирку с полученной смесью закрывали крышкой и перемешивали вортексированием 30 с. Затем пробирку инкубировали 30 мин при температуре 60°С на термостате (Eppendorf™ ThermoStat Plus, США) для лизирования всех белковых компонентов плазмы. После инкубирования добавляли 9 мл буфера АСВ к лизату, закрывали пробирку крышкой и перемешивали содержимое вортексированием в течение 30 с. Далее пробирку инкубировали 5 мин на льду. Далее к вакуумному насосу присоединяли колонку QIAmp Mini column, к которой затем присоединяли расширитель на 20 мл. После инкубирования на льду содержимое пробирки аккуратно переливали в расширитель колонки. Затем включали вакуумный насос. Когда жидкость полностью проходила через колонку, вакуумный насос отключали и доводили давление до 0 мбар. После этого удаляли расширитель колонки. Крышку колонки оставляли открытой. Далее в колонку пипеткой добавляли 600 мкл буфера ACW1, включали вакуумный насос. Когда жидкость полностью проходила через колонку, вакуумный насос отключали и доводили давление до 0 мбар. Затем в колонку вносили пипеткой 750 мкл буфера ACW2, включали вакуумный насос. Когда жидкость полностью проходила через колонку, вакуумный насос отключали и доводили давление до 0 мбар. После этого в пробирку вносили пипеткой 750 мкл этанола (96-100%) и включали вакуумный насос. Когда жидкость полностью проходила через колонку, вакуумный насос отключали и доводили давление до 0 мбар. Далее колонку закрывали крьппкой, отсоединяли от вакуумного насоса, помещали в пустую пробирку на 2 мл и центрифугировали при скорости 14.000 об./мин в течение 3 мин. Колонку помещали в новую пустую пробирку на 2 мл (прошлую пробирку выбрасывали), открывали крышку и инкубировали при температуре 56°С в течение 10 мин на термостате (Eppendorf™ ThermoStat Plus, США), чтобы высушить мембрану колонки. Далее колонку помещали в чистую пробирку на 1,5 мл (прошлую пробирку выбрасывали) и аккуратно пипеткой вносили 60 мкл буфера AVE в центр мембраны колонки, затем инкубировали при комнатной температуре 3 мин. Затем колонку в пробирке центрифугировали при скорости 14.000 об./мин в течение 1 мин, чтобы элюировать нуклеиновые кислоты. В случае, если к проведению дальнейшего анализа приступают не сразу, то выделенную ДНК хранят при температуре -80°С.In a 50 ml test tube were pipetted 500 l QIAGEN ® Proteinase K, then in the same tube were added 5 ml of plasma test sample. Carrier RNA was prepared separately in an ACL buffer. For this, 4.4 ml of ACL buffer and 5.6 μl of carrier RNA, previously dissolved in AVE buffer in accordance with the instructions on the package, were added to a separate tube and vortexed for 30 s. The initial 50 ml tube containing the plasma and investigated QIAGEN ® Proteinase K, was added 4 ml of carrier RNA ACL buffer. The tube with the resulting mixture was closed with a lid and mixed by vortexing for 30 s. Then the tube was incubated for 30 min at 60 ° C in a thermostat (Eppendorf ™ ThermoStat Plus, USA) to lyse all protein components of the plasma. After incubation, 9 ml of ACB buffer was added to the lysate, the tube was capped, and the contents were mixed by vortexing for 30 s. Then the tube was incubated on ice for 5 min. Next, a QIAmp Mini column was attached to a vacuum pump, to which a 20 ml expander was then attached. After incubation on ice, the contents of the tube were carefully poured into a column expander. Then the vacuum pump was turned on. When the liquid completely passed through the column, the vacuum pump was turned off and the pressure was brought to 0 mbar. The column expander was then removed. The column cover was left open. Next, 600 μL of ACW1 buffer was added to the column with a pipette, and the vacuum pump was turned on. When the liquid completely passed through the column, the vacuum pump was turned off and the pressure was brought to 0 mbar. Then, 750 μL of ACW2 buffer was pipetted into the column, the vacuum pump was turned on. When the liquid completely passed through the column, the vacuum pump was turned off and the pressure was brought to 0 mbar. After that, 750 μL of ethanol (96-100%) was pipetted into the test tube and the vacuum pump was turned on. When the liquid completely passed through the column, the vacuum pump was turned off and the pressure was brought to 0 mbar. Then the column was closed with a hook, disconnected from the vacuum pump, placed in an empty 2 ml tube, and centrifuged at 14,000 rpm for 3 minutes. The column was placed in a new empty 2 ml tube (the last tube was discarded), the lid was opened and incubated at 56 ° C for 10 min on a thermostat (Eppendorf ™ ThermoStat Plus, USA) to dry the column membrane. Then the column was placed in a clean 1.5 ml tube (the last tube was discarded) and 60 μl of buffer AVE was carefully pipetted into the center of the column membrane, then incubated at room temperature for 3 min. Then, the column in the tube was centrifuged at 14,000 rpm for 1 min to elute the nucleic acids. If the further analysis is not started immediately, the extracted DNA is stored at a temperature of -80 ° C.

6) Из раствора с выделенной ДНК отбирали 2 аликвоты.6) 2 aliquots were taken from the solution with isolated DNA.

Аликвота №1 - 15,7 мкл; аликвота №2 - 15,2 мкл. В свободное от манипуляций время все аликвоты хранили при температуре 4°С.Aliquot No. 1 - 15.7 μl; aliquot No. 2 - 15.2 μl. When free from manipulations, all aliquots were stored at 4 ° C.

7) В аликвоте №2 проводили рестрикцию в соответствии со следующей методикой.7) In aliquot # 2, restriction was performed in accordance with the following procedure.

К аликвоте №1 добавляли 1 мкл эндонуклеазы BstFN I (СибЭнзим, Россия) и 1,8 мкл буфера (Buffer Y 10Х concentrate, СибЭнзим, Россия). Смесь перемешивали вортексированием 30 с, а затем центрифугировали при скорости 6000 об./мин в течение 10 с. Пробирку помещали в амплификатор (Eppendorf™ Mastercycler gradient), на котором устанавливали программу: 60°С 40 мин (для проведения рестрикции) - 80°С 20 мин (для инактивации фермента).Aliquot No. 1 was supplemented with 1 μl of BstFN I endonuclease (SibEnzyme, Russia) and 1.8 μl of buffer (Buffer Y 10X concentrate, SibEnzyme, Russia). The mixture was vortexed for 30 seconds and then centrifuged at 6000 rpm for 10 seconds. The tube was placed in an amplifier (Eppendorf ™ Mastercycler gradient), on which the program was set: 60 ° C 40 min (for restriction) - 80 ° C 20 min (for enzyme inactivation).

8) Для проверки полноты рестрикции проводили ПЦР в реальном времени по гену АСТВ.8) To check the completeness of restriction, real-time PCR was performed for the ASHB gene.

Подготавливали 3 пробирки с оптически прозрачными крышками объемом 0,1 мл. В каждую из них вносили по 12,5 мкл TaqMan Maxima Probe qPCR Master Mix (2X) (Thermo Fisher Scientific, США), 0,75 мкл зондов на АСТВ при их концентрации 10 мкмоль/л, по 1 мкл праймеров на АСТВ при их концентрации 10 мкмоль/л, 8,75 мкл дистиллированной стерильной воды. В 1-ю из 3 пробирок вносили 1 мкл раствора из аликвоты №2, подвергшейся рестрикции. Во 2-ю пробирку вносили 1 мкл дистиллированной стерильной воды (отрицательный контроль). В 3-ю пробирку вносили 1 мкл раствора любой геномной ДНК, не подвергавшейся рестрикции. Пробирки с растворами центрифугировали при скорости 6000 об./мин в течение 1 мин. Затем их вносили в амплификатор для ПЦР в реальном времени Applied Biosystems® 7500 FAST Real-Time PCR System, на котором выставляли программу: денатурация (95°С, 10 мин) - 1 цикл, денатурация (95°С, 15 с), отжиг (60°С, 1 мин) и элонгация (70°С, 1 мин) - 60 циклов, конечная элонгация (70°С, 5 мин) - 1 цикл. По прошествии амплификации убеждались, что в пробирке с исследуемьм образцом не обнаружено следов гена АСТВ, то есть считали, что рестрикция прошла успешно. При обнаружении следов гена АСТВ повторяли процедуру рестрикции, после чего вновь повторяли процедуру ПЦР в реальном времени.Prepared 3 tubes with optically clear caps of 0.1 ml. Each of them was loaded with 12.5 μl TaqMan Maxima Probe qPCR Master Mix (2X) (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.75 μl probes for ASTH at a concentration of 10 μmol / L, 1 μl of primers for ASTH at their concentration 10 μmol / l, 8.75 μl of distilled sterile water. In 1 of 3 tubes, 1 μl of a solution from aliquot No. 2, subjected to restriction, was added. 1 μL of distilled sterile water (negative control) was added to the 2nd tube. In the third tube, 1 μL of a solution of any genomic DNA that was not subjected to restriction was added. The tubes with solutions were centrifuged at a speed of 6000 rpm for 1 min. Then they were introduced into an Applied Biosystems® 7500 FAST Real-Time PCR System for real-time PCR, on which the program was set: denaturation (95 ° C, 10 min) - 1 cycle, denaturation (95 ° C, 15 s), annealing (60 ° C, 1 min) and elongation (70 ° C, 1 min) - 60 cycles, final elongation (70 ° C, 5 min) - 1 cycle. After the amplification, it was made sure that no traces of the ASHB gene were found in the test tube with the test sample, that is, it was believed that the restriction was successful. When traces of the ASTF gene were found, the restriction procedure was repeated, after which the real-time PCR procedure was repeated.

9) Готовили смеси для цифровой ПЦР.9) Mixtures were prepared for digital PCR.

Для этого брали 2 пробирки на 1,5 мл. В каждую пробирку вносили по 17,4 мкл QuantStudio™ 3D Digital PCR Master Mix v2. В пробирку №1 вносили по 1,74 мкл заранее подготовленной смеси, содержащей праймеры и зонды на гены PRDM15 и EIF2C1 (концентрации праймеров 18 мкмоль/л, зондов - 5 мкмоль/л). В пробирку №2 вносили 1,74 мкл заранее подготовленной смеси, содержащей праймеры и зонды на гены RASSF1A и EIF2C1 (концентрации праймеров 18 мкмоль/л, зондов - 5 мкмоль/л). Последовательности праймеров и зондов указаны выше. Затем в пробирку №1 вносили 15,7 мкл ДНК из аликвоты №1, содержащей интактную сумму циркулирующей ДНК матери и плода; в пробирку №2 - 15,7 мкл ДНК из аликвоты №2, подвергшейся рестрикции. Пробирки с растворами центрифугировали при скорости 6000 об./мин в течение 10 с. For this, 2 tubes of 1.5 ml were taken. 17.4 μl QuantStudio ™ 3D Digital PCR Master Mix v2. 1.74 µl of a previously prepared mixture containing primers and probes for the PRDM15 and EIF2C1 genes (primer concentrations 18 µmol / L, probes 5 µmol / L) were added to test tube No. 1. In a test tube No. 2, 1.74 μl of a previously prepared mixture containing primers and probes for the RASSF1A and EIF2C1 genes (primer concentration 18 µmol / L, probes 5 µmol / L) was added. The sequences of primers and probes are indicated above. Then, 15.7 µl of DNA from aliquot No. 1, containing the intact sum of circulating DNA of the mother and the fetus, was introduced into test tube No. 1; in test tube No. 2 - 15.7 μl of DNA from aliquot No. 2, subjected to restriction. The tubes with solutions were centrifuged at 6000 rpm for 10 s.

10) Подготавливали 4 чипа для цифровой ПЦР (QuantStudio™ 3D Digital PCR Chip v2).10) Prepared 4 chips for digital PCR (QuantStudio ™ 3D Digital PCR Chip v2).

При помощи QuantStudio™ 3D Digital PCR Chip Loader на чипы №1.1 и №1.2 вносили раствор из пробирки №1; на чипы №2.1 и №2.2 - раствор из пробирки №2. Для этого вносили по 14,5 мкл смеси на каждый чип из соответствующей пробирки в съемный пластиковый дозатор QuantStudio™ 3D Digital PCR Chip Loader механической пипеткой, избегая образования пузырьков воздуха, а затем запускали дозирование нажатием на центральную кнопку QuantStudio™ 3D Digital PCR Chip Loader. Сразу же после дозирования матрицу чипа покрывали иммерсионной жидкостью из шприца, чтобы предотвратить испарение. Затем опускали и удерживали 15 с механическую ручку QuantStudio™ 3D Digital PCR Chip Loader с заранее вставленной крышкой от чипа (QuantStudio™ 3D Digital PCR Chip Lid v2). После этого в отверстие на крышке чипа аккуратно вводили иммерсионную жидкость из шприца, пока все содержимое шприца не заполнялось иммерсионной жидкостью и не оставалось лишь пузырька воздуха размером с отверстие на крышке чипа. Далее с неприклеевшейся части крышки снимали защитную пленку и надавливали на 15 с, пока чип не будет плотно закрыт. Затем чип откладывали в сторону, накрывали его поверхность металлической пластиной из комплекта поставки. Только после этого переходили к дозированию и подготовке следующего чипа.Using the QuantStudio ™ 3D Digital PCR Chip Loader, the solution was added to chips # 1.1 and # 1.2 from tube # 1; for chips # 2.1 and # 2.2 - solution from test tube # 2. To do this, 14.5 μL of the mixture was added to each chip from a corresponding tube into a removable plastic QuantStudio ™ 3D Digital PCR Chip Loader with a mechanical pipette, avoiding the formation of air bubbles, and then dosing was started by pressing the central button of the QuantStudio ™ 3D Digital PCR Chip Loader. Immediately after dispensing, the chip matrix was coated with immersion liquid from a syringe to prevent evaporation. Then, the QuantStudio ™ 3D Digital PCR Chip Loader with the chip cap inserted in advance (QuantStudio ™ 3D Digital PCR Chip Lid v2) was lowered and held for 15 seconds. After that, the immersion liquid from the syringe was carefully injected into the hole on the chip cover until the entire contents of the syringe were filled with the immersion liquid and only an air bubble the size of the hole on the chip cover remained. Next, the protective film was removed from the non-sticky part of the lid and pressed for 15 s until the chip was tightly closed. Then the chip was set aside and its surface was covered with a metal plate supplied. Only after that did we proceed to dispensing and preparing the next chip.

11) Проводили амплификацию 4 подготовленных чипов.11) Amplification of 4 prepared chips was carried out.

Для этого чипы переносили в амплификатор (ProFlex™ 2х Flat PCR System), установленный под углом 11° и накрывали мягкими накладками из комплекта поставки для лучшего соприкосновения с нагревательными элементами. В программе амплификатора устанавливали следующие параметры: денатурация (96°С, 10 мин) - 1 цикл, денатурация (98°С, 30 с), отжиг (63°С, 1 мин) и элонгация (70°С, 1 мин) - 60 циклов, удерживание при 10°С не дольше 24 ч. Затем запускали процесс амплификации.For this, the chips were transferred to an amplifier (ProFlex ™ 2x Flat PCR System) set at an angle of 11 ° and covered with the supplied soft pads for better contact with the heating elements. The following parameters were set in the amplifier program: denaturation (96 ° С, 10 min) - 1 cycle, denaturation (98 ° С, 30 s), annealing (63 ° С, 1 min) and elongation (70 ° С, 1 min) - 60 cycles, holding at 10 ° C for no longer than 24 hours. Then the amplification process was started.

12) Считывали результаты цифровой ПЦР на QuantStudio™ 3D Digital PCR Instrument. Для этого чипы после амплификации последовательно устанавливали в считывающее гнездо QuantStudio™ 3D Digital PCR Instrument. Результаты цифровой ПЦР считывали и обрабатывали в автоматическом режиме программным обеспечением системы.12) Read the results of digital PCR on a QuantStudio ™ 3D Digital PCR Instrument. For this, after amplification, the chips were sequentially installed into the reading slot of the QuantStudio ™ 3D Digital PCR Instrument. The results of digital PCR were read and processed automatically by the system software.

13) Проводили анализ результатов цифровой ПЦР чипов №2.1, №2.2.13) Analyzed the results of digital PCR chips # 2.1, # 2.2.

На облачном сервисе (QuantStudio™ 3D AnalysisSuite) в личном кабинете оператора записывали концентрации ДНК, копий/мкл (предварительно отмечали в системе, что зонды на RASSF1A дают сигнал в канале FAM, а на EIF2C1 - в канале VIC). Чипам №2.1 и №2.2 в системе давали одинаковое название для более точного определения концентрации ДНК в образце. Для определения фракции фетальной ДНК по гену RASSF1A полученные концентрации подставляли в выражение:On the cloud service (QuantStudio ™ 3D AnalysisSuite) in the operator's personal account, DNA concentrations, copies / μl, were recorded (it was previously noted in the system that the probes on the RASSF1A give a signal in the FAM channel, and on the EIF2C1 - in the VIC channel). Chips # 2.1 and # 2.2 in the system were given the same name for a more accurate determination of the DNA concentration in the sample. To determine the fraction of fetal DNA for the RASSF1A gene, the obtained concentrations were substituted into the expression:

Figure 00000003
Figure 00000003

где FR - фракция фетальной ДНК, определенная по гиперметилированному у плода гену RASSF1A; CR - концентрация ДНК по гену RASSF1A в аликвоте №2; СЕ - концентрация ДНК по гену EIF2C1 в аликвоте №2.where F R is the fetal DNA fraction determined by the RASSF1A gene hypermethylated in the fetus; C R - DNA concentration for the RASSF1A gene in aliquot # 2; C E - DNA concentration for EIF2C1 gene in aliquot No. 2.

14) Проводили анализ результатов цифровой ПЦР чипов №1.1 и №1.2.14) Analyzed the results of digital PCR chips # 1.1 and # 1.2.

На облачном сервисе (QuantStudio™ 3D AnalysisSuite) в личном кабинете оператора записывали концентрации ДНК, копий/мкл (предварительно отмечали в системе, что зонды на ген PRDM15 дают сигнал в канале FAM, а на EIF2C1 - в канале VIC). Чипам №1.1 и 13.2 в системе давали одинаковое название для более точного определения концентрации ДНК в образце.On the cloud service (QuantStudio ™ 3D AnalysisSuite) in the operator's personal account, DNA concentrations, copies / μl, were recorded (it was previously noted in the system that probes for the PRDM15 gene give a signal in the FAM channel, and on EIF2C1 - in the VIC channel). Chips No. 1.1 and 13.2 in the system were given the same name for more accurate determination of the DNA concentration in the sample.

15) В случае, если при анализе соотношение концентрации PRDM15 и EIF2C1 меньше или равно 1, то считали, что у плода нет трисомии по 21-й хромосоме;15) If, in the analysis, the ratio of the concentration of PRDM15 and EIF2C1 is less than or equal to 1, then it was considered that the fetus does not have trisomy on the 21st chromosome;

16) В случае, если при анализе соотношение концентрации PRDM15 и EIF2C1 больше 1, то считали, что у плода возможна трисомия по 21-й хромосоме и полученные концентрации подставляли в выражение:16) If, in the analysis, the ratio of the concentration of PRDM15 and EIF2C1 is greater than 1, then it was considered that trisomy on the 21st chromosome is possible in the fetus and the obtained concentrations were substituted into the expression:

Figure 00000004
Figure 00000004

где FP - фракция фетальной ДНК, определенная по гену PRDM15; СР - концентрация ДНК по гену 21-й хромосомы PRDM15 в аликвоте №1; CE1 - концентрация ДНК по гену EIF2C1 в аликвоте №1;where F P is the fetal DNA fraction determined by the PRDM15 gene; С Р - DNA concentration for the gene of the 21st chromosome PRDM15 in aliquot No. 1; C E1 - DNA concentration for the EIF2C1 gene in aliquot # 1;

При схождении значений FP и FR (разница между результатами не превышает 10% от большего значения; 10% является инструментальной погрешностью при проведении цифровой ПЦР на чипах) считали, что плод имеет трисомию по 21-й хромосоме.When the F P and F R values converge (the difference between the results does not exceed 10% of the larger value; 10% is an instrumental error when conducting digital PCR on chips), it was considered that the fetus has trisomy on the 21st chromosome.

Пример 1.Example 1.

Пациентка Ф., 41 год. Срок беременности составляет 13 недель. У пациентки был проведен забор 10 мл периферической крови в пробирку с ЭДТА. Были проведены выделение внеклеточной ДНК крови, отбор аликвот и рестрикция с последующим подтверждением ее полноты в соответствии с методикой, описанной в настоящем документе. На фиг. 1 представлены результаты ПЦР в реальном времени для подтверждения полноты рестрикции.Patient F., 41 years old. The gestation period is 13 weeks. The patient underwent a sample of 10 ml of peripheral blood in a tube with EDTA. Was carried out the isolation of extracellular DNA from blood, selection of aliquots and restriction with subsequent confirmation of its completeness in accordance with the method described in this document. FIG. 1 shows the results of real-time PCR to confirm the completeness of the restriction.

После подтверждения полноты рестрикции был проведен анализ методом цифровой ПЦР в соответствии с методикой, описанной в настоящем документе. На фиг. 2 и 3 графически представлены результаты цифровой ПЦР чипов №1.1 и №2.1 соответственно.After confirming the completeness of the restriction, digital PCR analysis was performed according to the method described herein. FIG. Figures 2 and 3 graphically represent the results of digital PCR chips # 1.1 and # 2.1, respectively.

По информации, представленной на фиг. 2, можно сделать вывод, что в исследуемом образце соотношение 21-й и референсной хромосом больше 1, что соответствует генотипу при трисомии плода по 21-й хромосоме. Таким образом, для подтверждения результатов необходимо применить формулу FP=(CP-CE2)*2/CE2.From the information presented in FIG. 2, it can be concluded that in the sample under study, the ratio of the 21st and reference chromosomes is greater than 1, which corresponds to the genotype in fetal trisomy on the 21st chromosome. Thus, to confirm the results, it is necessary to apply the formula F P = (C P -C E2 ) * 2 / C E2 .

По информации, представленной на фиг. 3, можно сделать вывод о наличии фетальной ДНК в образце. Для определения фракции фетальной ДНК необходимо применить формулу FR=CR/CE и сравнить полученные фракции.From the information presented in FIG. 3, it can be concluded that fetal DNA is present in the sample. To determine the fraction of fetal DNA, it is necessary to apply the formula F R = C R / C E and compare the resulting fractions.

Концентрации ДНК, полученные в ходе анализа методом цифровой ПЦР аликвот №1 и №2, а также результаты определения фракции фетальной ДНК как по гену RASSF1A, так и по гену PRDM15 (21-я хромосома) представлены в таблице 1.DNA concentrations obtained in the course of digital PCR analysis of aliquots No. 1 and No. 2, as well as the results of determining the fetal DNA fraction for both the RASSF1A gene and the PRDM15 gene (chromosome 21) are presented in Table 1.

Figure 00000005
Figure 00000005

По данным, представленным в таблице 1, вынесли заключение о наличии трисомии по 21-й хромосоме у плода, так как наблюдается схождение значений FP и FR.According to the data presented in table 1, a conclusion was made about the presence of trisomy on the 21st chromosome in the fetus, since there is a convergence of F P and F R values.

Основываясь на результатах скрининга I триместра беременности, пациентка Ф. была направлена на инвазивную диагностику трисомии по 21-й хромосоме при помощи аспирации ворсин хориона с последующим кариотипированием. По результатам инвазивной диагностики у пациентки Ф. была выявлена трисомия по 21-й хромосоме плода, что соответствует результатам неинвазивного определения трисомии по 21-й хромосоме с использованием заявляемых набора реагентов и технологии.Based on the results of screening for the first trimester of pregnancy, patient F. was referred for the invasive diagnosis of trisomy on chromosome 21 by aspiration of chorionic villi with subsequent karyotyping. According to the results of invasive diagnostics, patient F. revealed trisomy on the 21st chromosome of the fetus, which corresponds to the results of non-invasive determination of trisomy on the 21st chromosome using the claimed set of reagents and technology.

Пример 2.Example 2.

Пациентка Л., 39 лет. Срок беременности составляет 13 недель. У пациентки был проведен забор 10 мл периферической крови в пробирку с ЭДТА. Были проведены выделение внеклеточной ДНК крови, отбор аликвот и рестрикция с последующим подтверждением ее полноты в соответствии с методикой, описанной в настоящем документе. На фиг. 4 представлены результаты ПЦР в реальном времени для подтверждения полноты рестрикции.Patient L., 39 years old. The gestation period is 13 weeks. The patient underwent a sample of 10 ml of peripheral blood in a tube with EDTA. Was carried out the isolation of extracellular DNA from blood, selection of aliquots and restriction with subsequent confirmation of its completeness in accordance with the method described in this document. FIG. 4 shows the results of real-time PCR to confirm the completeness of the restriction.

После подтверждения полноты рестрикции был проведен анализ методом цифровой ПЦР в соответствии с методикой, описанной в настоящем документе. На фиг. 5 и 6 графически представлены результаты цифровой ПЦР чипов №1.1 и №2.1 соответственно.After confirming the completeness of the restriction, digital PCR analysis was performed according to the method described herein. FIG. 5 and 6 graphically show the results of digital PCR chips # 1.1 and # 2.1, respectively.

По информации, представленной на фиг. 5, можно сделать вывод, что в исследуемом образце соотношение 21-й и референсной хромосом менее 1, что не соответствует генотипу при трисомии плода по 21-й хромосоме.From the information presented in FIG. 5, it can be concluded that the ratio of the 21st and reference chromosomes in the test sample is less than 1, which does not correspond to the genotype in fetal trisomy on the 21st chromosome.

По информации, представленной на фиг. 6, можно сделать вывод о наличии фетальной ДНК в образце. Для определения фракции фетальной ДНК необходимо применить формулу FR=CR/CE.From the information presented in FIG. 6, it can be concluded that fetal DNA is present in the sample. To determine the fraction of fetal DNA, it is necessary to apply the formula F R = C R / C E.

Концентрации ДНК, полученные в ходе анализа методом цифровой ПЦР аликвот №1 и №2, а также результаты определения фракции фетальной ДНК по гену RASSF1A представлены в таблице 2.DNA concentrations obtained during the analysis by digital PCR of aliquots No. 1 and No. 2, as well as the results of determining the fraction of fetal DNA for the RASSF1A gene are presented in Table 2.

Figure 00000006
Figure 00000006

По данным, представленным в таблице 2, вынесли заключение об отсутствии трисомии по 21-й хромосоме у плода, так как значение соотношения уровней 21-й и референсной хромосом меньше 1.According to the data presented in Table 2, a conclusion was made about the absence of trisomy on the 21st chromosome in the fetus, since the value of the ratio of the levels of the 21st and reference chromosomes is less than 1.

Основываясь на результатах скрининга I триместра беременности, пациентка Ф. была направлена на инвазивную диагностику трисомии по 21-й хромосоме при помощи аспирации ворсин хориона с последующим кариотипированием. По результатам инвазивной диагностики у пациентки Ф. не была выявлена трисомия по 21-й хромосоме плода, что соответствует результатам неинвазивного определения трисомии по 21-й хромосоме с использованием заявляемых набора реагентов и технологии.Based on the results of screening for the first trimester of pregnancy, patient F. was referred for the invasive diagnosis of trisomy on chromosome 21 by aspiration of chorionic villi with subsequent karyotyping. According to the results of invasive diagnostics, patient F. did not reveal trisomy on the 21st chromosome of the fetus, which corresponds to the results of non-invasive determination of trisomy on the 21st chromosome using the claimed set of reagents and technology.

Пример 3.Example 3.

Пациентка В., 36 лет. Срок беременности составляет 14 недель. У пациентки был проведен забор 10 мл периферической крови в пробирку с ЭДТА. Были проведены выделение внеклеточной ДНК крови, отбор аликвот и рестрикция с последующим подтверждением ее полноты в соответствии с методикой, описанной в настоящем документе. На фиг. 7 представлены результаты ПЦР в реальном времени для подтверждения полноты рестрикции.Patient V., 36 years old. The gestation period is 14 weeks. The patient underwent a sample of 10 ml of peripheral blood in a tube with EDTA. Was carried out the isolation of extracellular DNA from blood, selection of aliquots and restriction with subsequent confirmation of its completeness in accordance with the method described in this document. FIG. 7 shows the results of real-time PCR to confirm the completeness of the restriction.

После подтверждения полноты рестрикции был проведен анализ методом цифровой ПЦР в соответствии с методикой, описанной в настоящем документе. На фиг. 8 и 9 графически представлены результаты цифровой ПЦР чипов №1.1 и №2.1 соответственно.After confirming the completeness of the restriction, digital PCR analysis was performed according to the method described herein. FIG. 8 and 9 graphically show the results of digital PCR chips # 1.1 and # 2.1, respectively.

По информации, представленной на фиг. 8, можно сделать вывод, что в исследуемом образце соотношение 21-й и референсной хромосом более 1, что соответствует генотипу при трисомии плода по 21-й хромосоме.From the information presented in FIG. 8, it can be concluded that the ratio of the 21st and reference chromosomes in the sample under study is more than 1, which corresponds to the genotype in fetal trisomy on the 21st chromosome.

По информации, представленной на фиг. 9, можно сделать вывод о наличии фетальной ДНК в образце. Для определения фракции фетальной ДНК необходимо применить формулу FR=CR/CE.From the information presented in FIG. 9, it can be concluded that fetal DNA is present in the sample. To determine the fraction of fetal DNA, it is necessary to apply the formula F R = C R / C E.

Концентрации ДНК, полученные в ходе анализа методом цифровой ПЦР аликвот №1 и №2, а также результаты определения фракции фетальной ДНК по гену RASSF1A представлены в таблице 3.DNA concentrations obtained during the analysis by digital PCR of aliquots No. 1 and No. 2, as well as the results of determining the fraction of fetal DNA for the RASSF1A gene are presented in Table 3.

Figure 00000007
Figure 00000007

По данным, представленным в таблице 3, вынесли заключение о наличии трисомии по 21-й хромосоме у плода, так как наблюдается схождение значений FP и FR.According to the data presented in table 3, a conclusion was made about the presence of trisomy on the 21st chromosome in the fetus, since there is a convergence of the F P and F R values.

Однако по результатам скрининга I триместра беременности у пациентки В. не было обнаружено признаков наличия трисомии по 21-й хромосоме, и она не была направлена на инвазивную диагностику. Наблюдалось расхождение в результатах между определением трисомии по 21-й хромосоме методикой, представленной в настоящем документе, и скринингом I триместра беременности.However, according to the results of screening for the first trimester of pregnancy, patient V. did not show signs of trisomy on chromosome 21, and she was not sent for invasive diagnostics. There was a discrepancy in the results between the determination of trisomy on the 21st chromosome by the method presented in this document and the screening of the first trimester of pregnancy.

С согласия пациентки В. был установлен контроль за исходом беременности. У новорожденного были признаки развития трисомии по 21-й хромосоме, на основании чего лечащим врачом было принято решение о проведении постнатального кариотипирования ребенку. По результатам кариотипирования новорожденному был поставлен диагноз синдром Дауна (трисомия по 21-й хромосоме), что соответствует пренатально определенному с помощью методики, заявляемой в настоящем документе, генотипу плода.With the consent of patient V., monitoring of the pregnancy outcome was established. The newborn had signs of the development of trisomy on the 21st chromosome, on the basis of which the attending physician decided to conduct postnatal karyotyping for the child. According to the results of karyotyping, the newborn was diagnosed with Down syndrome (trisomy on the 21st chromosome), which corresponds to the genotype of the fetus prenatally determined using the methodology claimed in this document.

Таким образом, заявляемый способ неинвазивной пренатальной диагностики позволяет с высокой точностью определять наличие трисомии по 21-й хромосоме по фетальной ДНК на ранних сроках беременности. Преимущество заявляемого способа состоит в том, что определения фракций фетальной ДНК происходят в одной реакционной смеси, благодаря чему соотношение не подвержено влиянию погрешности пипетирования и ограниченной воспроизводимости количественного определения уровня ДНК, а также представлена система для подтверждения полноты рестрикции. В клинической практике это позволит сделать неинвазивное пренатальное определение трисомии по 21-й хромосоме более точным и надежным.Thus, the claimed method of non-invasive prenatal diagnostics allows to determine with high accuracy the presence of trisomy on the 21st chromosome using fetal DNA in early pregnancy. The advantage of the proposed method is that the determination of fetal DNA fractions occurs in the same reaction mixture, due to which the ratio is not affected by pipetting error and limited reproducibility of quantitative determination of the DNA level, and a system for confirming the completeness of restriction is presented. In clinical practice, this will make the non-invasive prenatal determination of trisomy on chromosome 21 more accurate and reliable.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES

<110> Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ)<110> Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education "Lomonosov Moscow State University" (MSU)

<120>СПОСОБ НЕИНВАЗИВНОЙ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТРИСОМИИ И НАБОР ДЛЯ ЕЕ ПРОВЕДЕНИЯ<120> METHOD FOR NON-INVASIVE PRENATAL TRISOMY DIAGNOSTICS AND SET FOR ITS CARRYING OUT

<160> SEQ ID NО:1<160> SEQ ID NO: 1

<210> 1<210> 1

<211> 19<211> 19

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Human ras association domain-containing protein 1, RASSF1A_F<223> Human ras association domain-containing protein 1, RASSF1A_F

<400> 1<400> 1

1 AGCCTGAGCTCATTGAGCT1 AGCCTGAGCTCATTGAGCT

<160> SEQ ID NО:2<160> SEQ ID NO: 2

<210> 2<210> 2

<211> 15<211> 15

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Human ras association domain-containing protein 1, RASSF1A_R<223> Human ras association domain-containing protein 1, RASSF1A_R

<400> 2<400> 2

1 ACCAGCTGCCGTGTG1 ACCAGCTGCCGTGTG

<160> SEQ ID NО:3<160> SEQ ID NO: 3

<210> 3<210> 3

<211> 15<211> 15

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Human ras association domain-containing protein 1, RASSF1A_pr<223> Human ras association domain-containing protein 1, RASSF1A_pr

<400> 3<400> 3

1 6-FAM-CCAACGCGCTGCGCA-BHQ-11 6-FAM-CCAACGCGCTGCGCA-BHQ-1

<160> SEQ ID NО:4<160> SEQ ID NO: 4

<210> 4<210> 4

<211> 19<211> 19

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Human protein argonaute-1, EIF2C1_F<223> Human protein argonaute-1, EIF2C1_F

<400> 4<400> 4

1 GTTCGGCTTTCACCAGTCT1 GTTCGGCTTTCACCAGTCT

<160> SEQ ID NО:5<160> SEQ ID NO: 5

<210>5<210> 5

<211> 20<211> 20

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Human protein argonaute-1, EIF2C1_R<223> Human protein argonaute-1, EIF2C1_R

<400>5<400> 5

1 CTCCATAGCTCTCCCCACTC1 CTCCATAGCTCTCCCCACTC

<160> SEQ ID NО:6<160> SEQ ID NO: 6

<210> 6<210> 6

<211> 20<211> 20

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Human protein argonaute-1, EIF2C1_pr<223> Human protein argonaute-1, EIF2C1_pr

<400> 6<400> 6

1 HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ-11 HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ-1

<160> SEQ ID NО:7<160> SEQ ID NO: 7

<210> 7<210> 7

<211> 18<211> 18

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Human PR/SET domain 15 protein, PRDM15_F<223> Human PR / SET domain 15 protein, PRDM15_F

<400> 7<400> 7

1 GCACACTCCAGAATGACC1 GCACACTCCAGAATGACC

<160> SEQ ID NО:8<160> SEQ ID NO: 8

<210> 8<210> 8

<211> 18<211> 18

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Human PR/SET domain 15 protein, PRDM15_R<223> Human PR / SET domain 15 protein, PRDM15_R

<400> 8<400> 8

1 GGAGGCTGGATTGAGTTG1 GGAGGCTGGATTGAGTTG

<160> SEQ ID NО:9<160> SEQ ID NO: 9

<210> 9<210> 9

<211> 23<211> 23

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Human PR/SET domain 15 protein, PRDM15_pr<223> Human PR / SET domain 15 protein, PRDM15_pr

<400>9<400> 9

1 6-FAM-TGGGCAGTGGAGACGCATTGGCA-BHQ-11 6-FAM-TGGGCAGTGGAGACGCATTGGCA-BHQ-1

<160>SEQIDNО:10<160> SEQIDNO: 10

<210> 10<210> 10

<211> 16<211> 16

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Human beta-actin protein, ACTB_F<223> Human beta-actin protein, ACTB_F

<400> 10<400> 10

1 GCGCCGTTCCGAAAGT1 GCGCCGTTCCGAAAGT

<160> SEQ ID NО:11<160> SEQ ID NO: 11

<210> 11<210> 11

<211> 14<211> 14

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Human beta-actin protein, ACTB_R<223> Human beta-actin protein, ACTB_R

<400> 11<400> 11

1 CGGCGGATCGGCAA1 CGGCGGATCGGCAA

<160> SEQ ID NО:12<160> SEQ ID NO: 12

<210> 12<210> 12

<211> 16<211> 16

<212> DNA<212> DNA

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<223> Human beta-actin protein, ACTB_pr<223> Human beta-actin protein, ACTB_pr

<400>12<400> 12

1 HEX-ACCGCCGAGACCGCGT-BHQ-11 HEX-ACCGCCGAGACCGCGT-BHQ-1

<---<---

Claims (16)

1. Способ неинвазивной пренатальной диагностики трисомии по 21-й хромосоме плода по фетальной ДНК, характеризующийся тем, что проводят забор плазмы крови беременной женщины, выделяют из нее циркулирующую внеклеточную ДНК, с последующим определением соотношения уровней 21-й хромосомы и референсной с подтверждением результата по фракции фетальной ДНК, определенной при помощи чувствительной к метилированию рестрикции, и тем, что при подтвержденном повышенном соотношении 21-й хромосомы и референсной делают вывод о наличии трисомии по 21-й хромосоме у плода.1. A method of non-invasive prenatal diagnosis of trisomy by the 21st chromosome of the fetus by fetal DNA, characterized by the fact that the blood plasma of a pregnant woman is taken, circulating extracellular DNA is isolated from it, followed by the determination of the ratio of the levels of the 21st chromosome and the reference one with confirmation of the result by fraction of fetal DNA, determined using restriction sensitive to methylation, and by the fact that with a confirmed increased ratio of the 21st chromosome and the reference one, it is concluded that there is trisomy on the 21st chromosome in the fetus. 2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что для определения трисомии по 21-й хромосоме плода по фетальной ДНК в крови беременной женщины:2. The method according to claim 1, characterized in that to determine trisomy on the 21st chromosome of the fetus by fetal DNA in the blood of a pregnant woman: - выделяют ДНК из плазмы крови беременной женщины с получением двух аликвот;- DNA is isolated from the blood plasma of a pregnant woman to obtain two aliquots; - проводят цифровую ПЦР аликвоты №1 с количественным определением уровней 21-й и референсной хромосом по генам PRDM15 и EIF2C1 соответственно и расчетом их соотношения;- digital PCR of aliquot No. 1 is carried out with quantitative determination of the levels of the 21st and reference chromosomes for the PRDM15 and EIF2C1 genes, respectively, and the calculation of their ratio; - при получении соотношения 21-й и референсной хромосом, равного или менее 1, делается вывод об отсутствии трисомии по 21-й хромосоме плода;- when the ratio of the 21st and the reference chromosomes is equal to or less than 1, it is concluded that there is no trisomy on the 21st chromosome of the fetus; - при получении соотношения 21-й и референсной хромосом более 1 делается вывод о наличии трисомии по 21-й хромосоме плода;- when the ratio of the 21st and reference chromosomes is more than 1, a conclusion is made about the presence of trisomy on the 21st chromosome of the fetus; - вычисляется фракция фетальной ДНК по уровню избыточной 21-й хромосомы;- the fraction of fetal DNA is calculated by the level of excess chromosome 21; - аликвота №2 используется для верификации полученных результатов.- Aliquot # 2 is used to verify the results obtained. 3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что для верификации результатов:3. The method according to claim 2, characterized in that for verification of the results: - аликвота №2 обрабатывается эндонуклеазой рестрикции, чувствительной к метилированию;- aliquot No. 2 is processed with a restriction endonuclease sensitive to methylation; - полноту рестрикции проверяют при помощи ПЦР в реальном времени по гену АСТВ, лишенному метилирования у плода и у матери;- the completeness of the restriction is checked using real-time PCR for the ASTV gene, devoid of methylation in the fetus and mother; - проводят цифровую ПЦР аликвоты №2 после рестрикции с определением числа копий гиперметилированного у плода гена RASSF1A и лишенного сайта рестрикции гена EIF2C1, представляющего сумму ДНК матери и плода;- carry out digital PCR of aliquot No. 2 after restriction with determination of the number of copies of the RASSF1A gene hypermethylated in the fetus and devoid of the restriction site of the EIF2C1 gene, representing the sum of the mother and fetus DNA; - определяют фракцию фетальной ДНК по соотношению чисел копий гена RASSF1A и EIF2C1, полученных в результате измерений в аликвоте №2;- determine the fraction of fetal DNA by the ratio of the number of copies of the gene RASSF1A and EIF2C1, obtained as a result of measurements in aliquot No. 2; - если расхождение между значениями фракции фетальной ДНК, вычисленными по результатам измерений аликвот №1 и №2, не превышает 10% от большего значения, результаты измерений по п. 2 считаются достоверными.- if the discrepancy between the values of the fetal DNA fraction, calculated from the results of measurements of aliquots No. 1 and No. 2, does not exceed 10% of the larger value, the measurement results according to item 2 are considered reliable. 4. Набор реагентов, предназначенный для реализации способа по п. 1, включающий, по крайней мере, олигонуклеотидные праймеры - прямые и обратные, и зонды, специфичные к генам PRDM15, EIF2C1, RASSF1A и АСТВ, представленные в лиофилизированном виде или водном растворе.4. A set of reagents for implementing the method according to claim 1, including at least oligonucleotide primers - forward and reverse, and probes specific to the genes PRDM15, EIF2C1, RASSF1A and ASHB, presented in lyophilized form or in aqueous solution. 5. Набор по п. 4, характеризующийся тем, что используют олигонуклеотидные праймеры и зонды с последовательностями SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 12.5. The kit according to claim 4, characterized in that oligonucleotide primers and probes with the sequences SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 12 are used.
RU2020108573A 2020-02-28 2020-02-28 Method for non-invasive prenatal diagnostics of trisomy and a set for it RU2734484C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020108573A RU2734484C1 (en) 2020-02-28 2020-02-28 Method for non-invasive prenatal diagnostics of trisomy and a set for it

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020108573A RU2734484C1 (en) 2020-02-28 2020-02-28 Method for non-invasive prenatal diagnostics of trisomy and a set for it

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2734484C1 true RU2734484C1 (en) 2020-10-16

Family

ID=72940278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020108573A RU2734484C1 (en) 2020-02-28 2020-02-28 Method for non-invasive prenatal diagnostics of trisomy and a set for it

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2734484C1 (en)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8574842B2 (en) * 2009-12-22 2013-11-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Direct molecular diagnosis of fetal aneuploidy
RU2583830C2 (en) * 2014-04-21 2016-05-10 Закрытое акционерное общество "Геноаналитика" Non-invasive prenatal diagnosis of foetal aneuploidy

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8574842B2 (en) * 2009-12-22 2013-11-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Direct molecular diagnosis of fetal aneuploidy
US9719140B2 (en) * 2009-12-22 2017-08-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Direct molecular diagnosis of fetal aneuploidy
RU2583830C2 (en) * 2014-04-21 2016-05-10 Закрытое акционерное общество "Геноаналитика" Non-invasive prenatal diagnosis of foetal aneuploidy

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Tsui N. B. Y. et al. Detection of trisomy 21 by quantitative mass spectrometric analysis of single-nucleotide polymorphisms, Clinical chemistry, 2005, Т. 51, No. 12. pp. 2358-2362. *
Тимошевский В. А., Лебедев И. Н. Технологии молекулярного кариотипирования в практике быстрой пренатальной диагностики клинически значимых анеуплоидий, Медицинская генетика, 2010, Т. 9, номер. 8. стр. 13-23. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mouawia et al. Circulating trophoblastic cells provide genetic diagnosis in 63 fetuses at risk for cystic fibrosis or spinal muscular atrophy
GB2597379A (en) Methods and systems for determining a pregnancy-related state of a subject
Akolekar et al. Fetal RHD genotyping in maternal plasma at 11–13 weeks of gestation
Clausen et al. Noninvasive fetal RhD genotyping
Hahn et al. Determination of fetal chromosome aberrations from fetal DNA in maternal blood: has the challenge finally been met?
Stanghellini et al. Quantitation of fetal DNA in maternal serum during the first trimester of pregnancy by the use of a DAZ repetitive probe
WO2004087863A2 (en) Non-invasive prenatal genetic diagnosis using transcervical cells
US20080108071A1 (en) Methods and Systems to Determine Fetal Sex and Detect Fetal Abnormalities
JPWO2020168118A5 (en)
EP2419526A1 (en) Methods for selecting oocytes and competent embryos with high potential for pregnancy outcome
JP6707181B2 (en) Kits or packages for identifying pregnant women at risk of preterm birth and use of such kits or packages
Edlow et al. Tracking fetal development through molecular analysis of maternal biofluids
Katz‐Jaffe et al. DNA identification of fetal cells isolated from cervical mucus: potential for early non‐invasive prenatal diagnosis
Mortarino et al. Non‐invasive tool for foetal sex determination in early gestational age
Atef et al. Prenatal diagnosis of fetal aneuploidies using QF-PCR: the Egyptian study
Santacroce et al. Identification of fetal gender in maternal blood is a helpful tool in the prenatal diagnosis of haemophilia
RU2734484C1 (en) Method for non-invasive prenatal diagnostics of trisomy and a set for it
Mayo et al. Noninvasive prenatal testing: How far can we reach detecting fetal copy number variations
Kadam et al. Endocervical trophoblast for interrogating the fetal genome and assessing pregnancy health at five weeks
Avent et al. Non invasive prenatal diagnosis of aneuploidy: next generation sequencing or fetal DNA enrichment?
CN113755570B (en) Biomarker for predicting recurrent abortion caused by unknown reasons and application thereof
Bingulac-Popović et al. Prenatal RHD genotyping in Croatia: preliminary results
WO2016052405A1 (en) Noninvasive method and system for determining fetal chromosomal aneuploidy
CN113755571A (en) Biomarker for embryo implantation success rate detection and application
Mouawia Genotyping analysis of circulating fetal cells reveals high frequency of vanishing twin following transfer of multiple embryos