RU2733697C1

RU2733697C1 - Method for prediction of risk of developing distant metastases in patients with operable forms of breast cancer with metastases in regional lymph nodes

Info

Publication number: RU2733697C1
Application number: RU2020110486A
Authority: RU
Inventors: Елена Евгеньевна Шашова; Елена Сергеевна Колегова; Гелена Валерьевна Какурина; Наталья Анатольевна Тарабановская; Елена Михайловна Слонимская; Ирина Викторовна Кондакова
Priority date: 2020-03-11
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2020-10-06

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: present invention refers to medicine, namely to oncology, and concerns prediction of risk of developing distant metastases in patients with operable forms of breast cancer with metastases in regional lymph nodes. That is ensured by determining molecular-biological tumour parameters in breast tissue samples and evaluating the scores, considering the extent of regional lymph nodes (X1) involvement into the metastasis process, tumour proliferative activity marker value Ki67 (%) (X2); HER-2 receptor (X3) expression, oestrogen receptor (X4) expression, progesterone receptor (X5) expression, chymotrypsin-like activity of proteasomes in tumour tissue (CLA) (UE*10³ IU/mg protein) (X6); caspase-like activity of proteasomes (CALA) (UE*10³ IU/mg protein) and activity of calpaines (AC) (UE*10³ IU/mg protein) in tumour and intact tissue, coefficient of caspase-like activity of proteasomes (cCLA) (X7), and an coefficient of activity of calpaines (cAC) (X8). Values of logistic regression equation Y: Y = −140.77 + 253.314*X1 − 4.851*X2 + 375.064*X3 − 378.390*X4 + 2.537*X5 + 2.399*X6 + 49.752*X7+3.530*X8, (1) probability of developing hematogenic metastases P is determined by formula (2): P = 1/(1+e^-Y), (2) where e is a mathematical constant equal to 2.72. When P ≥ 50 % is high, and if P <50 %, low risk of developing distant metastases.

EFFECT: method provides high accuracy of diagnosis by taking into account pathogenetic involvement of said pathogenetic factors.

1 cl, 2 ex

Description

Изобретение относится к области медицины, онкологии и касается способов прогнозирования риска развития отдаленных метастазов у больных операбельными формами рака молочной железы с метастазами в регионарные лимфоузлы, комбинированное лечение которых было начато с хирургического этапа.The invention relates to medicine, oncology and relates to methods for predicting the risk of developing distant metastases in patients with operable forms of breast cancer with metastases in regional lymph nodes, the combined treatment of which was started from the surgical stage.

В настоящее время при планировании терапии с целью персонификации выделяют несколько молекулярных подтипов РМЖ: люминального А, люминального В, HER-2-позитивного и тройного негативного. При этом учитывается экспрессия опухолью рецепторов эстрогенов (ER), рецепторов прогестерона (PR), рецепторов эпидермального фактора роста 2-го типа (HER-2) и маркера пролиферативной активности Ki67. Данные молекулярные подтипы РМЖ отличаются по механизмам развития, прогрессии и исходом заболевания. Кроме того, учитываются традиционные факторы, такие как: размеры новообразования, характер и степень распространенности процесса. Тем не менее, даже внутри одного молекулярного подтипа РМЖ наблюдается гетерогенность как по патогенетическим особенностям, так и в прогностическом плане. Более того, прогностическая ценность перечисленных факторов далеко не всегда является однозначной и достаточной. В связи с этим необходим поиск иных информативных дополнительных способов прогноза, которые будут учитывать сочетанное влияние традиционно оцениваемых факторов, и отражать метаболические процессы в опухоли.Currently, when planning therapy for the purpose of personification, several molecular subtypes of breast cancer are distinguished: luminal A, luminal B, HER-2-positive and triple negative. This takes into account the tumor expression of estrogen receptors (ER), progesterone receptors (PR), epidermal growth factor 2 receptors (HER-2) and the proliferative activity marker Ki67. These molecular subtypes of breast cancer differ in the mechanisms of development, progression, and outcome of the disease. In addition, traditional factors are taken into account, such as: the size of the neoplasm, the nature and extent of the process. Nevertheless, even within one molecular subtype of breast cancer, heterogeneity is observed both in pathogenetic characteristics and in prognostic terms. Moreover, the predictive value of the listed factors is far from always unambiguous and sufficient. In this regard, it is necessary to search for other informative additional methods of prognosis, which will take into account the combined influence of traditionally evaluated factors and reflect metabolic processes in the tumor.

Известен способ прогнозирования течения люминального без гиперэкспрессии HER-2 первично-операбельного РМЖ у женщин в постменопаузе (патент РФ №2694843, опубл. 17.07.2019) [3]. Указанный способ основан на иммуногистохимическом определении в опухолевой ткани уровня экспрессии рецепторов андрогенов. При экспрессии андрогенов на уровне 0-4% и 5-20% прогнозируют агрессивное течение люминального без гиперэкспрессии Неr2nеu первично-операбельного РМЖ. Однако для применения данного метода существуют ограничения: метод не может быть применен при трижды негативном молекулярном подтипе РМЖ, либо у пациенток с сохраненной менструальной функцией. Взятый за прототип метод может быть использован только у пациенток с люминальным молекулярным подтипом рака молочной железы, и находящихся в состоянии постменопаузы. Кроме того, у пациенток не должна выявляться гиперэкспрессия рецептора HER-2.There is a method for predicting the course of luminal without overexpression of HER-2 of primary operable breast cancer in postmenopausal women (RF patent No. 2694843, publ. 07.17.2019) [3]. This method is based on immunohistochemical determination of the level of expression of androgen receptors in tumor tissue. With the expression of androgens at the level of 0-4% and 5-20%, an aggressive course of luminal, without overexpression of Her2neu, primary-operable breast cancer is predicted. However, there are limitations to the application of this method: the method cannot be applied in case of triple negative molecular subtype of breast cancer, or in patients with preserved menstrual function. The method taken as a prototype can only be used in patients with luminal molecular subtype of breast cancer, and who are in a postmenopausal state. In addition, patients should not be overexpressing the HER-2 receptor.

Новый технический результат - разработка нового способа прогнозирования риска развития отдаленных метастазов у больных операбельными формами рака молочной железы с метастазами в регионарные лимфоузлы, обладающего высокой специфичностью и информативностью.The new technical result is the development of a new method for predicting the risk of developing distant metastases in patients with operable forms of breast cancer with metastases to regional lymph nodes, which has a high specificity and information content.

Для достижения нового технического результата в способе прогнозирования риска развития отдаленных метастазов у больных операбельными формами рака молочной железы с метастазами в регионарные лимфоузлы, путем определяют молекулярно-биологические параметры опухоли в образцах тканей молочной железы и оценивают показатели в баллах, при этом определяют степень вовлеченности в процесс метастазирования регионарных лимфатических узлов (X1), причем, при вовлечении в процесс от 1 до 3 лимфатических узлов оценивают в 0 баллов, а при вовлечении в процесс 4-х и более лимфатических узлов оценивают в 1 балл; определяют значение маркера пролиферативной активности в опухоли Ki67(%) (Х2); также определяют экспрессию рецептора HER-2 (Х3), при этом, при ее выявлении оценивают в 1 балл, а при ее отсутствии оценивают как 0 баллов; определяют экспрессию рецепторов эстрогенов (Х4), при этом, при наличии положительной экспрессии оценивают в 1 балл, в случае отрицательной экспрессии оценивают как 0 баллов; далее определяют экспрессию рецепторов прогестерона (Х5), причем, при положительной экспрессии оценивают в 1 балл, в случае отрицательной экспрессии оценивают как 0 баллов; также определяют значение химотрипсинподобной активности протеасом в опухолевой ткани (ХПА) (УЕ*10³ МЕ/мг белка) (X6); а также в опухолевой и условно неизмененной ткани определяют значения каспазаподобной активности протеасом (КПА) (УЕ*10³ МЕ/мг белка) и активности кальпаинов (АК) (УЕ*10³ МЕ/мг белка), затем определяют коэффициент каспазаподобной активности протеасом (кКПА) (Х7), и коэффициент активности кальпаинов (кАК) (Х8), которые рассчитывают, как отношение соответствующей активности в опухолевой ткани к активности в условно неизмененной ткани; затем определяют значение уравнения логистической регрессии Y по формуле (1), которая имеет следующий вид:To achieve a new technical result in a method for predicting the risk of developing distant metastases in patients with operable forms of breast cancer with metastases to regional lymph nodes, the molecular biological parameters of the tumor in breast tissue samples are determined and the indicators are evaluated in points, while the degree of involvement in the process is determined metastasis of regional lymph nodes (X1), moreover, when 1 to 3 lymph nodes are involved in the process, they are estimated at 0 points, and when 4 or more lymph nodes are involved in the process, they are estimated at 1 point; determine the value of the marker of proliferative activity in the tumor Ki67 (%) (X2); the expression of the HER-2 (X3) receptor is also determined, while, when it is detected, it is evaluated at 1 point, and in its absence, it is evaluated as 0 points; determine the expression of estrogen receptors (X4), while, in the presence of positive expression, it is evaluated at 1 point, in the case of negative expression, it is evaluated as 0 points; then the expression of progesterone receptors (X5) is determined, and, in case of positive expression, it is estimated at 1 point, in the case of negative expression, it is estimated as 0 points; also determine the value of chymotrypsin-like activity of proteasomes in tumor tissue (CPA) (UE * 10 ³ IU / mg protein) (X6); as well as in tumor and conditionally unchanged tissue, the values of caspase-like proteasome activity (CPA) (VE * 10 ³ IU / mg protein) and the activity of calpains (AA) (VE * 10 ³ IU / mg protein) are determined, then the coefficient of caspase-like activity of proteasomes ( kKPA) (X7), and the activity coefficient of calpains (kAK) (X8), which are calculated as the ratio of the corresponding activity in the tumor tissue to the activity in the conditionally unchanged tissue; then the value of the logistic regression equation Y is determined by the formula (1), which has the following form:

гдеWhere

-140,77 - значение коэффициента регрессии свободного члена;-140.77 - value of the coefficient of regression of the intercept;

X1 - степень вовлеченности в процесс метастазирования регионарных лимфоузлов; в случае вовлечении в процесс метастазирования от 1 до 3 регионарных лимфатических узлов Х1=0; при поражении метастазами 4 и более регионарных лимфоузлов, X1=1;X1 - degree of involvement in the process of metastasis of regional lymph nodes; in case of involvement in the process of metastasis from 1 to 3 regional lymph nodes X1 = 0; with metastases affecting 4 or more regional lymph nodes, X1 = 1;

253,314 - значение коэффициента регрессии признака X1;253.314 - the value of the regression coefficient of the attribute X1;

Х2 - значение маркера пролиферативной активности в опухоли Ki67 (%);X2 - the value of the marker of proliferative activity in the tumor Ki67 (%);

-4,851 - значение коэффициента регрессии признака Х2;-4.851 - the value of the regression coefficient of the X2 attribute;

Х3 - экспрессия рецептора HER-2, в случае выявления экспрессия рецептора HER-2 Х3=1; при отсутсвии экспрессия рецептора HER-2 Х3=0);X3 - expression of the HER-2 receptor, in case of detection, the expression of the HER-2 receptor X3 = 1; in the absence of expression of the HER-2 receptor (X3 = 0);

375,064 - значение коэффициента регрессии признака Х3;375.064 - the value of the regression coefficient of the X3 attribute;

Х4 - экспрессия рецепторов эстрогенов, при положительной экспрессии эстрогенов Х4=1; при отрицательной экспрессия рецепторов эстрогенов Х4=0;X4 - expression of estrogen receptors, with positive expression of estrogen X4 = 1; with negative expression of estrogen receptors X4 = 0;

-378,390 - значение коэффициента регрессии признака Х4;-378.390 - the value of the regression coefficient of the X4 attribute;

Х5 - экспрессия рецепторов прогестерона, при положительной экспрессия рецепторов прогестерона Х5=1; при отрицательной экспрессия рецепторов прогестерона Х5=0;X5 - expression of progesterone receptors, with positive expression of progesterone receptors X5 = 1; with negative expression of progesterone receptors X5 = 0;

2,537 - значение коэффициента регрессии признака Х5;2.537 - the value of the regression coefficient of the X5 feature;

Х6 - значение ХПА протеасом в опухоли (УЕ*10³ МЕ/мг белка);X6 is the value of CPA of proteasomes in the tumor (YE * 10 ³ IU / mg protein);

2,399 - значение коэффициента регрессии признака Х6;2.399 - the value of the regression coefficient of the X6 feature;

Х7 - значение кКПА протеасом;X7 is the value of the kCPA of the proteasome;

49,752 - значение коэффициента регрессии признака Х7;49.752 - the value of the regression coefficient of the X7 attribute;

Х8 - значение кАК;X8 - kAK value;

3,530 - значение коэффициента регрессии признака Х8,3.530 - the value of the regression coefficient of the X8 feature,

вероятность развития гематогенных метастазов в отдаленном периоде у больных раком молочной железы Р определяют по формуле (2):The likelihood of developing hematogenous metastases in the long-term period in breast cancer patients P is determined by the formula (2):

где е - математическая константа, равная 2,72,where e is a mathematical constant equal to 2.72,

и при Р≥50% определяют высокий, а при Р<50% - низкий риск развития отдаленных метастазов.and at P≥50%, a high risk is determined, and at P <50%, a low risk of developing distant metastases.

Показания к применению метода: способ предназначен для прогнозирования исхода заболевания в отдаленные сроки наблюдения у больных с первично операбельным инвазивным раком молочной железы с метастазами в регионарные лимфоузлы, комбинированное лечение которых было начато с хирургического этапа.Indications for the use of the method: the method is intended to predict the outcome of the disease in the long-term follow-up in patients with primary operable invasive breast cancer with metastases to regional lymph nodes, the combined treatment of which was started from the surgical stage.

Критерии исключения: пациентки без метастазов в регионарных лимфоузлах (N0), метастатическая форма РМЖ (M1), проведение неоадьювантной химио- или гормонотерапии.Exclusion criteria: patients without metastases in regional lymph nodes (N0), metastatic breast cancer (M1), neoadjuvant chemotherapy or hormone therapy.

Способ осуществляют следующим образом:The method is carried out as follows:

Для прогнозирования риска развития отдаленных метастазов рака молочной железы определяют показатели вовлеченности в процесс метастазирования регионарных лимфоузлов (N), значение маркера пролиферативной активности в опухоли Кi67(%), экспрессию рецептора HER-2, экспрессию рецепторов к эстрогену, экспрессию рецептора к прогестерону, дополнительно в опухолевой ткани молочной железы проводят флюориметрическое определение химотрипсиноподобной активности протеасом (ХПА) (УЕ*10³ МЕ/мг белка), в опухолевой ткани и в условно неизмененной ткани молочной железы проводят флюориметрическое определение каспазаподобной активности проеасом (КПА) (УЕ*10³ МЕ/мг белка), активности кальпаинов (АК) (УЕ*10³ МЕ/мг белка).To predict the risk of developing distant metastases of breast cancer, indices of involvement in the process of metastasis of regional lymph nodes (N), the value of the marker of proliferative activity in the tumor Ki67 (%), the expression of the HER-2 receptor, the expression of estrogen receptors, the expression of the progesterone receptor, are determined. of breast tumor tissue, fluorimetric determination of chymotrypsin-like activity of proteasomes (CPA) (UE * 10 ³ IU / mg protein) is carried out, in tumor tissue and conditionally unchanged breast tissue, fluorimetric determination of caspase-like activity by proasome (CPA) (UE * 10 ³ IU / mg protein), activity of calpains (AK) (EU * 10 ³ IU / mg protein).

Для этого в течение 1-2 часов после операции из операционного материала берут образцы опухолевой и неизмененной ткани, располагающейся на расстоянии 1-3 см от первичного опухолевого узла, очищают от участков некроза, кровоизлияний и помещают в жидкий азот. Образцы тканей до определения активности протеасом и кальпаинов хранят не более 3 месяцев при температуре -70°С и размораживают не более 1 раза для исследования активности маркеров. Перед определением активности протеасом и кальпаинов из замороженной опухолевой и неизмененной ткани готовят осветленные гомогенаты. Для этого ткани измельчают до порошкообразного состояния с использованием ультразвукового гомогенизатора, затем ресуспендируют в 50 мМ трис-HCl буфере (рН=7,5), содержащем 2 мМ АТФ, 5 мМ хлорид магния, 1 мМ дитиотреитол, 1 мМ ЭДТА и 100 мМ хлорид натрия. Гомогенат центрифугируют 60 минут при 10000g и 4°С.To do this, within 1-2 hours after the operation, samples of tumor and unchanged tissue, located at a distance of 1-3 cm from the primary tumor node, are taken from the operating material, cleaned from areas of necrosis, hemorrhage and placed in liquid nitrogen. Before determining the activity of proteasomes and calpains, tissue samples are stored for no more than 3 months at a temperature of -70 ° C and thawed no more than 1 time to study the activity of markers. Before determining the activity of proteasomes and calpains, clarified homogenates are prepared from frozen tumor and unaltered tissue. For this, tissues are ground to a powder state using an ultrasonic homogenizer, then resuspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH = 7.5) containing 2 mM ATP, 5 mM magnesium chloride, 1 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA, and 100 mM chloride sodium. The homogenate is centrifuged for 60 minutes at 10000g and 4 ° C.

Химотрипсинподобную и каспазаподобную активности протеасом определяют в осветленных гомогенатах тканей, взятых от больных РМЖ, по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC и Cbz-LLG-AMC (Sigma, США), соответственно. Реакционная смесь для определения химотрипсинподобной и каспазаподобной активности протеасом должна содержать 20 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 1 мМ дитиотрейтола, 30 мкМ субстрата, 5 мМ MgCl₂ и 1 мМ АТФ. Образовавшийся продукт регистрируют на флуориметре при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. За единицу активности протеасом принимают количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль соответствующего субстрата в течение 1 мин. Для оценки активности примесных протеаз применяют специфический ингибитор протеасом - MG132 (Sigma).Chymotrypsin-like and caspase-like activities of proteasomes are determined in clarified tissue homogenates taken from breast cancer patients by hydrolysis of the fluorogenic oligopeptide Suc-LLVY-AMC and Cbz-LLG-AMC (Sigma, USA), respectively. The reaction mixture for the determination of chymotrypsin-like and caspase-like activity of proteasomes should contain 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM dithiothreitol, 30 μM substrate, 5 mM MgCl _2, and 1 mM ATP. The resulting product is recorded on a fluorometer at an excitation wavelength of 380 nm and an emission of 440 nm. A unit of proteasome activity is the amount of enzyme at which 1 nmol of the corresponding substrate is hydrolyzed within 1 min. To assess the activity of impurity proteases, a specific proteasome inhibitor MG132 (Sigma) is used.

Определение активности кальпаинов (АК) проводят в осветленных гомогенатах по гидролизу Suc-LLVY-AMC (Sigma, США). Реакционная смесь для определения активности кальпаинов должна содержать 100 мМ Tris-HCl (рН 7,3), 145 mM NaCl, 1 мМ дитиотрейтола и 30 мкМ Suc-LLVY-AMC, с добавлением 10 mM CaCl₂ или без него с 30 мкМ ингибитора кальпаинов ALLN (N-ацетил-лейцин-лейцин-норлейциналь) (Sigma). Активность протеасом и кальпаинов выражают в единицах активности на 1 мг белка (10³ Ед/мг белка). Содержание белка определяют по методу Лоури.Determination of the activity of calpains (AA) is carried out in clarified homogenates by hydrolysis of Suc-LLVY-AMC (Sigma, USA). The reaction mixture for determining the activity of calpains should contain 100 mM Tris-HCl (pH 7.3), 145 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol and 30 μM Suc-LLVY-AMC, with or without the addition of 10 mM CaCl ₂ with 30 μM calpain inhibitor ALLN (N-acetyl-leucine-leucine-norleucinal) (Sigma). The activity of proteasomes and calpains is expressed in units of activity per 1 mg of protein (10 ³ U / mg of protein). Protein content is determined by the Lowry method.

Далее, с учетом определения соответствующих активностей протеасом и кальпаинов в опухолевой и условно неизмененной тканях РМЖ, оценивают соответствующие коэффициенты: кКПА, кАК. Коэффициенты рассчитывают как отношение соответствующей активности в опухолевой ткани к активности в условно неизмененной ткани.Further, taking into account the determination of the corresponding activities of proteasomes and calpains in tumor and conditionally unchanged breast cancer tissues, the corresponding coefficients are estimated: cKPA, cAC. The coefficients are calculated as the ratio of the corresponding activity in the tumor tissue to the activity in the conditionally unchanged tissue.

На следующем этапе определяют значение уравнения логистической регрессии Y по формуле (1), которая имеет следующий вид:At the next stage, the value of the logistic regression equation Y is determined by the formula (1), which has the following form:

где Y - значение уравнения регрессии;where Y is the value of the regression equation;

Х3 - экспрессия рецептора HER-2, в случае выявления экспрессия рецептора HER-2 Х3=1; при отсутствии экспрессия рецептора HER-2 Х3=0;X3 - expression of the HER-2 receptor, in case of detection, the expression of the HER-2 receptor X3 = 1; in the absence of HER-2 receptor expression X3 = 0;

Х8 - значение кАК;X8 - kAK value;

вероятность развития отдаленных метастазов у больных раком молочной железы Р определяют по формуле (2):The likelihood of developing distant metastases in breast cancer patients P is determined by the formula (2):

Такой подход к оценке прогноза в отношении риска развития отдаленных метастазов при раке молочной железы обусловлен рядом предпосылок:This approach to assessing the prognosis regarding the risk of developing distant metastases in breast cancer is due to a number of prerequisites:

Прогрессирование опухолей является важной проблемой при лечении РМЖ [38]. В ряде работ распространенность процесса на регионарные лимфатические узлы ассоциирована с показателями отдаленной безметастатической выживаемости [24, 25, 35, 41]. Кроме того, характерная для данного заболевания высокая гетерогенность, обусловленная различными патогенетическими особенностями, осложняет контроль над поведением опухоли. В связи с этим необходим поиск иных информативных дополнительных маркеров прогноза, которые будут отражать метаболические процессы в опухоли.Tumor progression is an important problem in the treatment of breast cancer [38]. In a number of studies, the prevalence of the process on regional lymph nodes is associated with indicators of distant metastatic survival [24, 25, 35, 41]. In addition, the high heterogeneity characteristic of this disease, due to various pathogenetic features, complicates the control over tumor behavior. In this regard, it is necessary to search for other informative additional prognosis markers that will reflect metabolic processes in the tumor.

Новые предлагаемые прогностические маркеры должны быть ассоциированы с патогенетическими особенностями различных молекулярных подтипов рака молочной железы. В настоящий момент известно, что при реализации ответа на терапевтическое воздействие при люминальном А типе РМЖ зачастую отмечается активация сигнального каскада опосредованного рецепторами эстрогенов, что и определяет чувствительность большинства данных опухолей к эндокринной терапии [30, 31]. Прогноз при люминальном В РМЖ менее благоприятный и сравним с трижды негативными опухолями [34, 39, 53]. Для люминальных В опухолей характерна активация либо ER, либо HER-2 - опосредованных сигнальных каскадов [26]. Трижды негативные раки (ТНР) составляют 15-20% вновь диагностированных случаев инвазивного рака молочной железы [13, 54], характеризуются отсутствием специфических мишеней терапевтического воздействия для проведения гормональной и таргетной терапии, имеют специфический характер метастазирования (чаще в легкие и головной мозг) [15, 33, 44, 57], агрессивное течение и неблагоприятный прогноз в отношении безрецидивной и общей выживаемости [31]. При трижды-негативных опухолях описывается вероятное участие р53-зависимого сигнального пути [12]. Ген р53 мутирует примерно у 80% пациентов с ТНР и является потенциальной терапевтической мишенью для пациентов с этой формой РМЖ. Показано, что ингибирование мутантного р53 изменяет экспрессию генов, вовлеченных в процессы регулируемой гибели клеток, регуляции апоптоза, сигнальной трансдукции, рефолдинга белков и локомоции [40, 52]. Исследования механизмов прогрессии РМЖ так или иначе связаны с существующими и потенциальными мишенями терапевтического воздействия и путей, регулирующих их активность и доступность.The new proposed prognostic markers should be associated with the pathogenetic features of the different molecular subtypes of breast cancer. It is currently known that when the response to the therapeutic effect in luminal A type breast cancer is realized, the activation of the signaling cascade mediated by estrogen receptors is often noted, which determines the sensitivity of most of these tumors to endocrine therapy [30, 31]. The prognosis for luminal B breast cancer is less favorable and is comparable to thrice-negative tumors [34, 39, 53]. Luminal B tumors are characterized by activation of either ER or HER-2 mediated signaling cascades [26]. Triple negative cancers (THCs) account for 15-20% of newly diagnosed cases of invasive breast cancer [13, 54], are characterized by the absence of specific targets of therapeutic action for hormonal and targeted therapy, have a specific character of metastasis (more often to the lungs and the brain) [ 15, 33, 44, 57], aggressive course and poor prognosis in relation to disease-free and overall survival [31]. In triple-negative tumors, the likely involvement of the p53-dependent signaling pathway has been described [12]. The p53 gene is mutated in about 80% of patients with THR and is a potential therapeutic target for patients with this form of breast cancer. It has been shown that inhibition of mutant p53 changes the expression of genes involved in the processes of regulated cell death, regulation of apoptosis, signal transduction, protein refolding, and locomotion [40, 52]. Studies of the mechanisms of breast cancer progression are in one way or another related to the existing and potential targets of therapeutic effects and the ways that regulate their activity and availability.

Характеризуя процессы регуляции уровня и активности молекулярных маркеров, используемых в настоящее время для выделения молекулярных подтипов рака молочной железы с целью определения тактики лечения пациентов, выявлено, что внутриклеточные протеолитические системы, такие как протеасомная и кальпаиновая, активно вовлечены в данные процессы. В частности, рецепторы эстрогенов играют важную роль в передаче эстрогенного сигнала и в реализации эффектов гормонов. Большое значение в регуляции содержания рецепторов эстрогенов принадлежит убиквитин-протеасомной и кальпаиновой внутриклеточным протеолитическим системам, которые оказывают влияние на деградацию самих рецепторов и регуляторов их транскрипции, а также на экспрессию генов рецепторов [27, 36, 58]. Рецепторы прогестерона являются ключевыми модификаторами генов-мишеней рецепторов эстрогенов. Общее содержание рецепторов прогестерона является индикатором функциональной активности ER [26, 28, 45]. В опухолях рецепторы прогестерона действуют как молекулярные сенсоры для ненормально повышенных или активных сигнальных путей [18]. Деградация рецепторов прогестерона также частично опосредована протеасомами. Лиганд-зависимое снижение экспрессии прогестероновых рецепторов осуществляется через механизм, включающий фосфорилирование рецептора, его убиквитинирование и разрушение 26S протеасомами [57]. Показано, что активированные фосфо-PR рецепторы прогестерона подвержены более быстрому подавлению лиганд-зависимых рецепторов убиквитин-протеасомной системой по сравнению с дефосфорилированными видами PR [22, 23, 32]. HER-2 (human epidermal growth factor receptor 2, человеческий рецептор эпидермального фактора роста 2 типа, neu, ErbB-2, CD340) - мембранный белок, который является важным биомаркером и терапевтической мишенью рака молочной железы человека. Усиленная экспрессия рецептора HER-2 отмечается в 20-30% случаев этого заболевания, что часто связано с агрессивным течением и неблагоприятным прогнозом [29, 51]. Уровень экспрессии Ki67 является мерой для количественной оценки пролиферации клеток в опухолевых тканях [11]. В активации/инактивации рецептора HER-2 важная роль отводится протеасомной и кальпаиновой системам протеолиза [16]. Предполагается, что HER-2 ингибирует активность кальпаина-1 через повышающую регуляцию кальпастатина, эндогенного ингибитора кальпаина [10]. Показана непрерывная регуляция уровня Ki67 и его деградация протеасомной системой через влияние на циклин-зависимое фосфорилирование и дефосфорилирование [17, 19]. Кальпаины также принимают участие и в контроле клеточного цикла, опосредованно воздействуя на Ki67. Так, одним из субстратов для этих протеиназ является p27Kip1, важный негативный регулятор клеточного цикла, изменения в экспрессии которого при РМЖ описаны в ряде исследований [42, 43, 47]. К значимым субстратам для протеасом и кальпаинов можно отнести продукт протоонкогена р53 [14, 20]. Предполагается, что влияя на активность кальпаинов, можно воздействовать на прохождение клеткой клеточного цикла, способствуя гибели опухолевых клеток, в том числе и при РМЖ [20, 21, 55].Characterizing the processes of regulation of the level and activity of molecular markers currently used to isolate molecular subtypes of breast cancer in order to determine the tactics of treating patients, it was revealed that intracellular proteolytic systems, such as the proteasome and calpain systems, are actively involved in these processes. In particular, estrogen receptors play an important role in the transmission of estrogen signals and in the realization of the effects of hormones. Of great importance in the regulation of estrogen receptor content belongs to the ubiquitin-proteasome and calpain intracellular proteolytic systems, which affect the degradation of receptors themselves and regulators of their transcription, as well as the expression of receptor genes [27, 36, 58]. Progesterone receptors are key modifiers of estrogen receptor target genes. The total content of progesterone receptors is an indicator of ER functional activity [26, 28, 45]. In tumors, progesterone receptors act as molecular sensors for abnormally elevated or active signaling pathways [18]. Degradation of progesterone receptors is also partly mediated by proteasomes. Ligand-dependent decrease in the expression of progesterone receptors occurs through a mechanism that includes receptor phosphorylation, ubiquitination, and destruction by 26S proteasomes [57]. It has been shown that activated phospho-PR progesterone receptors are susceptible to more rapid suppression of ligand-dependent receptors by the ubiquitin-proteasome system as compared to dephosphorylated PR species [22, 23, 32]. HER-2 (human epidermal growth factor receptor 2, neu, ErbB-2, CD340) is a membrane protein that is an important biomarker and therapeutic target for human breast cancer. Increased expression of the HER-2 receptor is observed in 20-30% of cases of this disease, which is often associated with an aggressive course and poor prognosis [29, 51]. The expression level of Ki67 is a measure for quantifying cell proliferation in tumor tissues [11]. In the activation / inactivation of the HER-2 receptor, an important role is played by the proteasome and calpain systems of proteolysis [16]. It is assumed that HER-2 inhibits the activity of calpain-1 through upregulation of calpastatin, an endogenous inhibitor of calpain [10]. Continuous regulation of Ki67 level and its degradation by the proteasome system through the influence on cyclin-dependent phosphorylation and dephosphorylation have been shown [17, 19]. Calpains are also involved in the control of the cell cycle by indirectly affecting Ki67. Thus, one of the substrates for these proteinases is p27Kip1, an important negative regulator of the cell cycle, changes in the expression of which in breast cancer have been described in a number of studies [42, 43, 47]. The product of the p53 protooncogene can be referred to as significant substrates for proteasomes and calpains [14, 20]. It is assumed that by influencing the activity of calpains, it is possible to influence the passage of the cell through the cell cycle, contributing to the death of tumor cells, including in breast cancer [20, 21, 55].

Кроме того, участие убиквитин-протеасомной и кальпаиновой систем доказано на этапах патогенеза при многих онкологических патологиях, таких как рак эндометрия, рак щитовидной железы, рак легкого, рак толстой кишки, опухоли головы и шеи, рак почки, рак мочевого пузыря и др. [1, 2, 4, 5, 46]. Также в ряде работ обсуждается возможность использования компонентов протеасомной и кальпаиновой систем как прогностических или предиктивных маркеров. В частности, при плоскоклеточном раке головы и шеи высокая ХПА активность протеасом является благоприятным прогностическим признаком и ассоциируется с более высокими показателями 2-летней общей выживаемости [7]. У больных эпителиальным раком яичников III стадии со сниженной активностью внутриклеточных протеаз обнаружено прогрессирование заболевания после проведенного лечения и достигнутой стабилизации [8]. У больных раком почки отмечается изменение активности протеасом в опухоли после проводимого лечения эверолимусом и ингибиторами тирозинкиназ [6, 9]. Трансляционные исследования показали, что высокая экспрессия кальпаина-2 коррелирует с неблагоприятными исходами при тройном негативном раке молочной железы [48], а высокая экспрессия кальпаина-1 коррелирует с плохой безрецидивной выживаемостью при HER-2 + раке молочной железы [49]. Кроме того, показано, что потеря кальпаина-1/2 задерживает самопроизвольное возникновение HER-2 положительных опухолей, но не предотвращает прогрессирование в исследованиях, проводимых in vivo на модели HER-2(+) онкогенеза [37]. Высокие уровни кальпаина-2 также были связаны с устойчивостью к платине и низкой общей выживаемостью у пациентов с раком яичников [50]. При раке яичника продемонстрирована взаимосвязь высокой экспрессии кальпаина-2, низкой экспрессии кальпастатина (р=0,010) и кальпаина-4 (р=0,003) с худшими показателями общей и безметастатической выживаемости [56]. Таким образом, для понимания особенности течения различных молекулярных подтипов рака молочной железы, наряду с определением основных клинических параметров, в качестве дополнительных характеристик, вероятно, можно рассматривать показатели протеасомной системы.In addition, the participation of the ubiquitin-proteasome and calpain systems has been proven at the stages of pathogenesis in many oncological pathologies, such as endometrial cancer, thyroid cancer, lung cancer, colon cancer, head and neck tumors, kidney cancer, bladder cancer, etc. [ 1, 2, 4, 5, 46]. A number of works also discuss the possibility of using the components of the proteasome and calpain systems as prognostic or predictive markers. In particular, in squamous cell carcinoma of the head and neck, high CPA activity of proteasomes is a favorable prognostic sign and is associated with higher rates of 2-year overall survival [7]. In patients with stage III epithelial ovarian cancer with reduced activity of intracellular proteases, progression of the disease was found after treatment and stabilization achieved [8]. In patients with kidney cancer, there is a change in the activity of proteasomes in the tumor after treatment with everolimus and tyrosine kinase inhibitors [6, 9]. Translational studies have shown that high expression of calpain-2 correlates with unfavorable outcomes in triple-negative breast cancer [48], and high expression of calpain-1 correlates with poor disease-free survival in HER-2 + breast cancer [49]. In addition, the loss of calpain-1/2 has been shown to delay the spontaneous emergence of HER-2 positive tumors, but does not prevent progression in in vivo studies using the HER-2 (+) tumorigenesis model [37]. High levels of calpain-2 have also been associated with platinum resistance and low overall survival in patients with ovarian cancer [50]. In ovarian cancer, the relationship between high expression of calpain-2, low expression of calpastatin (p = 0.010) and calpain-4 (p = 0.003) with the worst overall and metastatic survival rates has been demonstrated [56]. Thus, in order to understand the peculiarities of the course of various molecular subtypes of breast cancer, along with the determination of the main clinical parameters, the indicators of the proteasome system can probably be considered as additional characteristics.

Предлагаемый способ разработан на основании исследования связи активности протеасом и кальпаинов с возникновением отдаленных метастазов при раке молочной железы, которое проводилось у 159 пациенток с первично операбельным инвазивным РМЖ (T_1-3N_0-3M₀), при этом люминальный А рак был диагностирован у 73 больных (46%), люминальный В - у 62 (39%) и у 24 человек (15%) был диагностирован трижды негативный молекулярный подтип рака. Комбинированное лечение пациентов начиналось с хирургического этапа, включало проведение оперативного вмешательства, выполняемого в объеме радикальной мастэктомии или органосохранной расширенной операции, и проводилось на базе отделения общей онкологии НИИ онкологии Томского НИМЦ с 2009 по 2019 год. В адъювантном режиме лечение пациентам назначалось по показаниям с учетом молекулярного подтипа опухоли. Адъювантная химиотерапия при люминальном А раке проводилась при большей распространенности процесса по схеме АС и таксотер в монорежиме. При люминальном В HER-2 отрицательном раке проводилась химиотерапия в виде 4-6 курсов по схеме АС или FAC. При люминальном В HER-2 положительном раке проводилась химиотерапия и анти-HER-2 терапия герцептином. Больные ТНР в адъювантном режиме получали 6-8 курсов химиотерапии по схеме АС+таксотер. При этом, обязательным компонентом системного лечения люминального А и люминального В рака являлась гормонотерапия тамоксифеном или ингибиторами ароматазы в течение 5 лет. Лучевая терапия выполнялась по показаниям.The proposed method was developed on the basis of a study of the relationship between the activity of proteasomes and calpains with the occurrence of distant metastases in breast cancer, which was carried out in 159 patients with primary operable invasive breast cancer (T _1-3 N _0-3 M ₀ ), while luminal A cancer was diagnosed in 73 patients (46%), luminal B - in 62 (39%) and in 24 people (15%), a triple negative molecular subtype of cancer was diagnosed. Combined treatment of patients began with the surgical stage, including surgical intervention performed in the volume of radical mastectomy or organ-preserving extended surgery, and was carried out on the basis of the General Oncology Department of the Research Institute of Oncology of the Tomsk National Research Medical Center from 2009 to 2019. In an adjuvant regimen, patients were treated according to indications, taking into account the molecular subtype of the tumor. Adjuvant chemotherapy for luminal A cancer was carried out with a higher prevalence of the process according to the AC scheme and Taxotere in mono-mode. For luminal B HER-2 negative cancer, chemotherapy was carried out in the form of 4-6 courses according to the AC or FAC scheme. For luminal B HER-2 positive cancer, chemotherapy and anti-HER-2 therapy with Herceptin were performed. Patients with THP in an adjuvant regimen received 6-8 courses of chemotherapy according to the AC + Taxotere regimen. At the same time, hormone therapy with tamoxifen or aromatase inhibitors for 5 years was an obligatory component of the systemic treatment of luminal A and luminal B cancer. Radiation therapy was performed as indicated.

Согласно распространенности опухолевого процесса на регионарные лимфоузлы, все больные были разделены на три группы: первая группа (N₀) - пациентки без признаков поражения метастазами регионарных лимфатических узлов; вторая группа (N₁) - обнаружено от 1 до 3 метастатически-измененных регионарных лимфоузла, третья группа (N_2-3) - больные, у которых обнаружено 4 и более метастатически-измененных регионарных лимфоузла. Следует отметить, что поражение 10 и более лимфатических узлов (N₃) у пациентов, включенных в данное исследование, устанавливалось только по результатам планового гистологического исследования после выполнения хирургического вмешательства. При оценке регионарной распространенности процесса выявлено, что в группе больных люминальным А раком у 36% наблюдалось вовлечение 1-3 лимфатических узлов (N₁), в 11% случаев метастазами было поражено более 4 лимфатических узлов (N_2-3). При люминальном В раке N₁ выявлена у 34% пациенток, у 18% больных было обнаружено N_2-3. При трижды негативном раке N₁ определялась у 21% пациенток, у 8% наблюдалось N_2-3. Метастатическое поражение аксиллярных лимфатических узлов отсутствовало (N₀) у 53% пациенток с люминальным А раком, у 48% пациенток люминальным В раком, и у 71% пациенток трижды негативным раком молочной железы.According to the prevalence of the tumor process in the regional lymph nodes, all patients were divided into three groups: the first group (N ₀ ) - patients without signs of metastatic regional lymph nodes; the second group (N ₁ ) - from 1 to 3 metastatic-altered regional lymph nodes were found, the third group (N _2-3 ) - patients who had 4 or more metastatic-changed regional lymph nodes. It should be noted that the lesion of 10 or more lymph nodes (N ₃ ) in patients included in this study was established only according to the results of a planned histological examination after performing a surgical intervention. When assessing the regional prevalence of the process, it was revealed that in the group of patients with luminal A cancer, 36% had involvement of 1-3 lymph nodes (N ₁ ), in 11% of cases, more than 4 lymph nodes were affected by metastases (N _2-3 ). In luminal B cancer N _{1 was} detected in 34% of patients, N _2-3 was found in 18% of patients. With three times negative cancer, N _{1 was} detected in 21% of patients, N _2-3 was observed in 8%. Metastatic involvement of axillary lymph nodes was absent (N ₀ ) in 53% of patients with luminal A cancer, 48% of patients with luminal B cancer, and 71% of patients with triple negative breast cancer.

Определение молекулярного подтипа РМЖ проводилось после оценки в биопсийном и операционном материале рецепторного статуса (экспрессия ER и к PR), HER-2 статуса и пролиферативной активности (экспрессия Ki67), которое выполнялось с использованием иммуногистохимического метода исследования.Determination of the molecular subtype of breast cancer was carried out after assessing the receptor status (expression of ER and to PR), HER-2 status and proliferative activity (expression of Ki67) in biopsy and surgical material, which was performed using an immunohistochemical study method.

Опухолевая и условно неизмененная ткань молочной железы забиралась из операционного материала в течении 1-2 часов после операции, замораживалась в жидком азоте. Затем в опухолевой и неизмененной ткани определялась химотрипсинподобная и каспазаподобная активность протеасом, а также активность кальпаинов, исходя из значений которых, рассчитывался коэффициент каспазаподобной активности протеасом кКПА и кАК.Tumor and conditionally unchanged breast tissue was taken from the surgical material within 1-2 hours after the operation, and was frozen in liquid nitrogen. Then, in the tumor and unchanged tissue, the chymotrypsin-like and caspase-like activities of the proteasomes, as well as the activity of calpains, were determined, based on the values of which, the coefficient of caspase-like activity of the proteasomes kCPA and kAA was calculated.

Сроки наблюдения за больными составили от 3 до 60 месяцев. Безметастатическую продолжительность жизни исчисляли в месяцах с момента проведенной радикальной мастэктомии или секторальной резекции молочной железы до времени последнего посещения пациентом онколога или выявления исхода (прогрессирование в виде развития гематогенных метастазов) на этапах динамического наблюдения. Показатели 5-летней общей выживаемости (ОВ) в группе больных РМЖ составили 91%, медиана - 54 месяца. Показатели 5-летней безметастатической выживаемости - 78%, медиана - 46 месяцев. В представленной выборке прогрессирование процесса в виде развития гематогенных метастазов (метастатическое поражение костей таза, костей позвоночника, костей черепа, метастатическое поражение печени, легких, мозга, множественные отдаленные метастазы) в течении 5-летнего периода наблюдалось у 16,5% пациентов люминальным А раком, у 29% пациентов люминальным В раком и у 21% больных ТНР. Построение математических прогностических моделей было выполнено с использованием метода логистической регрессии. При этом модель включает в себя наиболее информативные признаки и представляет собой уравнение логистической регрессии, где зависимая (выходная) переменная является линейной функцией независимых (входных) переменных. Затем на основании значения уравнения логистической регрессии определялась вероятность развития исхода, при этом учитывалась чувствительность и специфичность модели.The observation period for the patients ranged from 3 to 60 months. Metastatic-free life expectancy was calculated in months from the moment of radical mastectomy or sectoral resection of the mammary gland to the time of the patient's last visit to the oncologist or the identification of the outcome (progression in the form of the development of hematogenous metastases) at the stages of follow-up. The indicators of 5-year overall survival (OS) in the group of breast cancer patients were 91%, the median was 54 months. The 5-year metastatic-free survival rate was 78%, the median was 46 months. In the presented sample, the progression of the process in the form of the development of hematogenous metastases (metastatic lesions of the pelvic bones, spine bones, skull bones, metastatic lesions of the liver, lungs, brain, multiple distant metastases) during a 5-year period was observed in 16.5% of patients with luminal A cancer , in 29% of patients with luminal B cancer and in 21% of patients with THR. The construction of mathematical predictive models was performed using the logistic regression method. In this case, the model includes the most informative features and is a logistic regression equation, where the dependent (output) variable is a linear function of independent (input) variables. Then, based on the value of the logistic regression equation, the probability of the outcome development was determined, taking into account the sensitivity and specificity of the model.

При построении моделей рассматривались следующие независимые признаки: возраст, состояние менструальной функции, гистологический тип опухоли, размер первичного опухолевого узла (Т), распространенность процесса на регионарные лимфоузлы (N), наличие или отсутствие экспрессии рецепторов к эстрогену, рецепторов к прогестерону, экспрессии рецепторов HER-2, значение маркера пролиферативной активности в опухоли Кi67 (%), тип проводимого адъювантного лечения; значение химотрипсиноподобной активности протеасом в опухоли (ХПА) (УЕ*10³ МЕ/мг белка), значение коэффициента химотрипсиноподобной активности протеасом (кХПА), значение каспазаподобной активности протеасом в опухоли (КПА) (УЕ*10³ МЕ/мг белка), значение коэффициента каспазаподобной активности протеасом кКПА, значение активности кальпаинов в опухоли (АК) (УЕ*10³ МЕ/мг белка), значение коэффициента активности кальпаинов (кАК).When constructing the models, the following independent features were considered: age, menstrual function, histological type of tumor, size of the primary tumor node (T), extent of the process to regional lymph nodes (N), presence or absence of expression of estrogen receptors, progesterone receptors, expression of HER receptors -2, the value of the marker of proliferative activity in the tumor Ki67 (%), the type of adjuvant treatment performed; value of chymotrypsin-like activity of proteasomes in a tumor (CPA) (VE * 10 ³ IU / mg protein), value of coefficient of chymotrypsin-like activity of proteasomes (cCPA), value of caspase-like activity of proteasomes in a tumor (CPA) (VE * 10 ³ IU / mg protein), value the coefficient of caspase-like activity of proteasomes cCPA, the value of the activity of calpains in the tumor (AA) (VE * 10 ³ IU / mg protein), the value of the coefficient of activity of calpains (cAC).

Из всех рассматриваемых показателей в разработанную модель в качестве независимых признаков были включены следующие параметры: вовлеченность в процесс метастазирования регионарных лимфоузлов (N), значение маркера пролиферативной активности в опухоли Ki67 (%), экспрессия рецептора HER-2 (есть/нет); экспрессия рецепторов к эстрогену (ER) (есть/нет); экспрессия рецептора к прогестерону (PR) (есть/нет); значение химотрипсиноподобной активности протеасом в опухоли (ХПА) (УЕ*10³ МЕ/мг белка), значение коэффициента каспазаподобной активности протеасом кКПА, значение коэффициента активности кальпаинов кАК.Of all the parameters considered, the following parameters were included in the developed model as independent features: involvement of regional lymph nodes in the process of metastasis (N), the value of the marker of proliferative activity in the tumor Ki67 (%), expression of the HER-2 receptor (yes / no); Expression of estrogen receptors (ER) (yes / no); progesterone receptor (PR) expression (yes / no); the value of chymotrypsin-like activity of proteasomes in the tumor (CPA) (UE * 10 ³ IU / mg protein), the value of the coefficient of caspase-like activity of proteasomes kCPA, the value of the coefficient of activity of calpains kAK.

На основе этих признаков была разработана прогностическая модель, которая обладает высокими чувствительностью и специфичностью (χ2=30,119; р=0,000; чувствительность 88%, специфичность 96%). Следует отметить, что данная модель применимая только в группе больных с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы (N_1-3). Для прогнозирования вероятности развития прогрессирования у больных РМЖ без метастазов в регионарные лимфоузлы (N₀) могут быть применимы те же параметры, но модель будет отличаться значениями коэффициента регрессии свободного члена и значениями коэффициента регрессии признаков, при этом чувствительность способа составляет 47%, специфичность - 97%.On the basis of these features, a prognostic model was developed that has high sensitivity and specificity (χ2 = 30.119; p = 0.000; sensitivity 88%, specificity 96%). It should be noted that this model is applicable only in the group of patients with metastases to regional lymph nodes (N _1-3 ). To predict the likelihood of progression in breast cancer patients without metastases to regional lymph nodes (N ₀ ), the same parameters can be applied, but the model will differ in the values of the free penis regression coefficient and the values of the regression coefficient of signs, while the sensitivity of the method is 47%, the specificity is 97 %.

Информативность применения разработанного способа иллюстрируется следующими клиническими примерами:The information content of the developed method is illustrated by the following clinical examples:

Пример 1: Больная Р., 61 год. В ноябре 2013 года обратилась в НИИ онкологии СО РАМН, где по результатам обследования был поставлен диагноз: рак молочной железы, T₁N₁M₀. После определения иммуногистохимических параметров опухоли (экспрессия ER положительная, экспрессия PR положительная, Ki67-30%, экспрессия HER-2 - 3+-положительная), был установлен люминальный В HER-2 положительный молекулярный подтип опухоли. В январе 2014 г. больной была проведена радикальная мастэктомия. При гистологическом исследовании операционного материала диагностирован инвазивный протоковый рак 2 степени злокачественности. Из 10 исследованых лимфоузлов метастазы обнаружены в 2. Из анамнестических данных известно, что пациентка находится в состоянии постменопаузы (последняя менструация была 9 лет назад). В течение 1-2 часов после проведения радикального хирургического вмешательства из операционного материала были отобраны образцы опухолевой и условно неизмененной ткани молочной железы, в которых исследована химотрипсиноподобная, каспазаподобная активность протеасом и активность кальпаинов. Химотрипсинподобная активность протеасом (ХПА) в опухолевой ткани составила 59,01 (УЕ*10³ МЕ/мг белка), каспазаподобная активность протеасом в опухолевой ткани составила 53,15 (УЕ*10³ МЕ/мг белка), в неизмененной ткани - 18,38 (УЕ*10³ МЕ/мг белка), коэффициент каспазаподобной активности протеасом (кКПА) составил 2,89. Активность кальпаинов в опухолевой ткани составила 599,1 (УЕ*10³ МЕ/мг белка), в неизмененной - 322,65 (УЕ*10³ МЕ/мг белка), коэффициент активности кальпаинов (кАК) составил 1,86. С учетом определения молекулярных параметров и распространенности опухолевого процесса в адъювантном режиме в составе комплексной терапии пациентке проводилась комбинированная терапия (4 курса адъювантной химиотерапии по схеме FAC, герцептин и гормональное лечение ингибиторами ароматазы).Example 1: Patient R., 61 years old. In November 2013 she applied to the Research Institute of Oncology of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, where, according to the results of the examination, she was diagnosed with breast cancer, T ₁ N ₁ M ₀ . After determining the immunohistochemical parameters of the tumor (positive ER expression, positive PR expression, Ki67-30%, HER-2 expression 3 + -positive), the luminal B HER-2 positive molecular subtype of the tumor was established. In January 2014, the patient underwent a radical mastectomy. A histological examination of the surgical material diagnosed invasive ductal carcinoma of the 2nd degree of malignancy. Of the 10 examined lymph nodes, metastases were found in 2. From the anamnestic data it is known that the patient is in a postmenopausal state (the last menstruation was 9 years ago). Within 1-2 hours after the radical surgical intervention, samples of tumor and conditionally unchanged breast tissue were taken from the operating material, in which the chymotrypsin-like, caspase-like activity of proteasomes and the activity of calpains were studied. Chymotrypsin-like proteasome activity (CPA) in tumor tissue was 59.01 (PU * 10 ³ IU / mg protein), caspase-like proteasome activity in tumor tissue was 53.15 (PU * 10 ³ IU / mg protein), in unchanged tissue - 18 , 38 (YE * 10 ³ IU / mg protein), the coefficient of caspase-like proteasome activity (cCPA) was 2.89. The activity of calpains in tumor tissue was 599.1 (PU * 10 ³ IU / mg protein), in unchanged - 322.65 (PU * 10 ³ IU / mg protein), the activity coefficient of calpains (kAK) was 1.86. Taking into account the determination of the molecular parameters and the prevalence of the tumor process in the adjuvant mode, as part of the complex therapy, the patient underwent combination therapy (4 courses of adjuvant chemotherapy according to the FAC scheme, Herceptin and hormonal treatment with aromatase inhibitors).

Далее была проведено исследование согласно предлагаемому способу с использованием прогностических моделей. С учетом молекулярных параметров и распространенности процесса (N+), применили прогностическую модель (формула 1):Next, a study was conducted according to the proposed method using predictive models. Taking into account the molecular parameters and the prevalence of the process (N +), a predictive model was applied (formula 1):

Y=-140,77+253,314*Х1-4,851*Х2+375,064*Х3-378,390*Х4+2,537*Х5+2,399*Х6+49,752*Х7+3,530*Х8=-140,77+253,314*0-4,851*30+375,064*1-378,390*1+2,537*1+2,399*59,01+49,752*2,89+3,530*1,86.=4,827.Y = -140.77 + 253.314 * X1-4.851 * X2 + 375.064 * X3-378.390 * X4 + 2.537 * X5 + 2.399 * X6 + 49.752 * X7 + 3.530 * X8 = -140.77 + 253.314 * 0-4.851 * 30 + 375.064 * 1 - 378.390 * 1 + 2.537 * 1 + 2.399 * 59.01 + 49.752 * 2.89 + 3.530 * 1.86. = 4.827.

Далее определили значение вероятности развития гематогенных метастазов в отдаленном периоде по формуле: Р=1/(1+e^-Y)=0,99.Further, the value of the probability of developing hematogenous metastases in the long-term period was determined using the formula: P = 1 / (1 + e- ^Y ) = 0.99.

Вероятность прогрессирования в послеоперационном периоде у данной пациентки составляла 99%, что свидетельствовало о высоком риске развития отдаленных метастазов. При дальнейшем динамическом наблюдении за больной через 5 месяцев (июнь 2014 года) во время проведения комплексного лечения было выявлено прогрессирование заболевания: метастатическое поражение костей черепа. В дальнейшем пациентке проводилось лечение по поводу прогрессирования заболевания. Общий срок наблюдения за больной составил 23 месяца.The probability of progression in the postoperative period in this patient was 99%, which indicated a high risk of developing distant metastases. With further dynamic observation of the patient after 5 months (June 2014) during the complex treatment, the progression of the disease was revealed: metastatic lesions of the skull bones. In the future, the patient was treated for the progression of the disease. The total observation period for the patient was 23 months.

Пример 2: Больная Ю., 56 лет, менопауза 4 года. Образование в левой молочной железе обнаружила в марте 2013 года, обратилась в НИИ онкологии СО РАМН, где после комплексного обследования ей был поставлен диагноз: рак молочной железы ПВ стадия T₂N₁M₀. После определения иммуногистохимических параметров опухоли (экспрессия ER положительная, экспрессия PR положительная, Ki67 - 60%, экспрессия HER-2 - 3+-положительная), был установлен люминальный В HER-2 положительный молекулярный подтип опухоли. 3.09.13 г. была выполнена секторальная резекция молочной железы, интраоперационная лучевая терапия (10ГР), аксиллярная лимфаденектомия. При гистологическом исследовании операционного материала диагностирована инвазивная карцинома неспецифического типа 2 степени злокачественности с метастазами в 3 из 15 лимфоузлов. В операционном материале (опухолевая и неизмененная ткань молочной железы) была исследована химотрипсиноподобная, каспазаподобная активность протеасом и активность кальпаинов. ХПА в опухолевой ткани составила 92,31 (УЕ*10³ МЕ/мг белка), каспазаподобная активность протеасом в опухолевой ткани составила 30,20 (УЕ*10³ МЕ/мг белка), в неизмененной ткани - 7,90 (УЕ*10³ МЕ/мг белка), коэффициент каспазаподобной активности протеасом (кКПА) составил 3,82. Активность кальпаинов в опухолевой ткани составила 40,8 (УЕ*10³ МЕ/мг белка), в неизмененной - 41,8 (УЕ*10³ МЕ/мг белка), коэффициент активности кальпаинов (кАК) составил 0,98. С учетом определения молекулярных параметров и распространенности опухолевого процесса в адъювантном режиме в составе комплексной терапии пациентке проводилась комбинированная терапия (4 курса адъювантной химиотерапии по схеме FAC, герцептин и гормональное лечение тамоксифеном на протяжении 5 лет).Example 2: Patient Y., 56 years old, menopause 4 years old. She discovered an education in the left breast in March 2013, applied to the Oncology Research Institute of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, where, after a comprehensive examination, she was diagnosed with breast cancer PV stage T ₂ N ₁ M ₀ . After determining the immunohistochemical parameters of the tumor (positive ER expression, positive PR expression, Ki67 - 60%, HER-2 expression - 3 + -positive), the luminal B HER-2 positive molecular subtype of the tumor was established. On 3.09.13, sectoral resection of the mammary gland, intraoperative radiation therapy (10GR), axillary lymphadenectomy were performed. Histological examination of the surgical material diagnosed invasive carcinoma of nonspecific type 2 degree of malignancy with metastases in 3 of 15 lymph nodes. The chymotrypsin-like, caspase-like activity of proteasomes and the activity of calpains were studied in the operating material (tumor and unchanged breast tissue). CPA in tumor tissue was 92.31 (PU * 10 ³ IU / mg protein), caspase-like activity of proteasomes in tumor tissue was 30.20 (PU * 10 ³ IU / mg protein), in unchanged tissue - 7.90 (PU * 10 ³ IU / mg protein), the coefficient of caspase-like activity of proteasomes (cCPA) was 3.82. The activity of calpains in tumor tissue was 40.8 (PU * 10 ³ IU / mg protein), in unchanged - 41.8 (PU * 10 ³ IU / mg protein), the activity coefficient of calpains (cAC) was 0.98. Taking into account the determination of molecular parameters and the prevalence of the tumor process in the adjuvant mode, as part of the complex therapy, the patient underwent combination therapy (4 courses of adjuvant chemotherapy according to the FAC scheme, Herceptin and hormonal treatment with tamoxifen for 5 years).

Для определения вероятности развития отдаленных метастазов для данной пациентки, с учетом молекулярных параметров и распространенности процесса (N+), было проведено исследование согласно предлагаемому способу.To determine the likelihood of developing distant metastases for this patient, taking into account the molecular parameters and the prevalence of the process (N +), a study was carried out according to the proposed method.

Рассчитано значение уравнения логистической регрессии Y:The value of the logistic regression equation Y is calculated:

Y=-140,77+253,314*Х1-4,851*Х2+375,064*Х3-378,390*Х4+2,537*Х5+2,399*Х6+49,752*Х7+3,530*Х8=-140,77+253,314*0-4,851*60+375,064*1+378,390*1+2,537*1+2,399*92,31+49,752*3,82+3,530*0,98.=739,125.Y = -140.77 + 253.314 * X1-4.851 * X2 + 375.064 * X3-378.390 * X4 + 2.537 * X5 + 2.399 * X6 + 49.752 * X7 + 3.530 * X8 = -140.77 + 253.314 * 0-4.851 * 60 + 375.064 * 1 + 378.390 * 1 + 2.537 * 1 + 2.399 * 92.31 + 49.752 * 3.82 + 3.530 * 0.98. = 739.125.

Далее, определили значение вероятности развития гематогенных метастазов в отдаленном периоде по формуле: Р=1/(1+e^-Y)=0,000.Further, the value of the probability of developing hematogenous metastases in the long-term period was determined by the formula: P = 1 / (1 + e- ^Y ) = 0.000.

Риск развития отдаленных метастазов в послеоперационном периоде у данной пациентки отмечен крайне низкий. При дальнейшем динамическом наблюдении за больной на протяжении 60 месяцев не было выявлено прогрессирования заболевания. Общий срок наблюдения за больной составил 60 месяцев.The risk of developing distant metastases in the postoperative period in this patient is extremely low. With further dynamic observation of the patient for 60 months, no progression of the disease was detected. The total observation period for the patient was 60 months.

Таким образом, учет вклада показателей протеасомной и кальпаиновой систем дополнительно основными клинико-морфологическими параметрами позволяет с большей степенью вероятности предполагать возможный исход заболевания у больных РМЖ, что увеличивает точность и информативность прогноза.Thus, taking into account the contribution of the indicators of the proteasome and calpain systems in addition to the main clinical and morphological parameters makes it more likely to assume a possible outcome of the disease in patients with breast cancer, which increases the accuracy and information content of the prognosis.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания:Sources of information taken into account when compiling the description:

1. Иванова Э.В. Химотрипсинподобная активность протеасом и общая активность кальпаинов при раке желудка и толстой кишки / Э.В. Иванова, И.В. Кондакова, Л.В. Спирина и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2014. - Т. 157(6). - с. 753-756.1. Ivanova E.V. Chymotrypsin-like activity of proteasomes and general activity of calpains in gastric and colon cancer / E.V. Ivanova, I. V. Kondakova, L.V. Spirina et al. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2014 .-- T. 157 (6). - from. 753-756.

2. Колегова Е.С. Малые белки теплового шока и убиквитин-протеасомная система при злокачественных опухолях / Е.С. Колегова, И.В. Кондакова, А.А. Завьялов // Вопросы онкологии. - 2016. - №3. - с. 401-405.2. Kolegova E.S. Small proteins of heat shock and ubiquitin-proteasome system in malignant tumors / E.S. Kolegova, I.V. Kondakova, A.A. Zavyalov // Problems of Oncology. - 2016. - No. 3. - from. 401-405.

3. Кит О.И. Способ прогнозирования течения патологического процесса при первично-операбельном люминальном без гиперэкспрессии Her2neu раке молочной железы у женщин в постменопаузе / О.И. Кит, Ю.С. Шатова, Е.П. Ульянова, В.В. Токмаков // патент №2694843 от 17.07.2019. - Бюл. №20.3. Keith O.I. A method for predicting the course of a pathological process in primary operable luminal without Her2neu overexpression of breast cancer in postmenopausal women / O.I. Keith, Yu.S. Shatova, E.P. Ulyanov, V.V. Tokmakov // patent No. 2694843 dated 17.07.2019. - Bul. No. 20.

4. Родоман Г.В. Новый тест дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей щитовидной железы / Родоман, И.Р. Сумеди, Т.И. Шалаева [и др.] // Лечебное дело. - 2015. - №3. - с. 72-76.4. Rodoman G.V. New test for differential diagnosis of benign and malignant thyroid tumors / Rodoman, I.R. Sumedi, T.I. Shalaeva [et al.] // General Medicine. - 2015. - No. 3. - from. 72-76.

5. Спирина Л.В. Активность протеасом и их субъединичный состав при гиперпластических процессах и раке эндометрия / Л.В. Спирина, И.В. Кондакова, Л.А. Коломиец и др. // Опухоли женской репродуктивной системы. - 2011. - Т. 4. - с. 64-68.5. Spirina L.V. Proteasome activity and their subunit composition in hyperplastic processes and endometrial cancer / L.V. Spirina, I.V. Kondakova, L.A. Kolomiets et al. // Tumors of the female reproductive system. - 2011. - T. 4. - p. 64-68.

6. Спирина Л.В. Влияние таргетной терапии на содержание транскрипционных, ростовых факторов, протеинкиназы mTOR и активности внутриклеточных протеиназ у больных диссеменированным раком почки / Л.В. Спирина, Е.А. Усынин, И.В. Кондакова и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2015. - Т. 160(12). - с. 768-772.6. Spirina L.V. Influence of targeted therapy on the content of transcription and growth factors, mTOR protein kinase and intracellular proteinase activity in patients with disseminated kidney cancer / L.V. Spirina, E.A. Usynin, I.V. Kondakova et al. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2015 .-- T. 160 (12). - from. 768-772.

7. Чойнзонов Е.Л. Прогностическая значимость определения активности протеасом в тканях плоскоклеточных карцином головы и шеи / Е.Л. Чойнзонов, Л.В. Спирина, И.В. Кондакова и др. // Сибирский научный медицинский журнал. - 2014. - Т. 34(4). - с. 103-108.7. Choinzonov E.L. Prognostic significance of determining the activity of proteasomes in the tissues of squamous cell carcinomas of the head and neck / E.L. Choinzonov, L.V. Spirina, I.V. Kondakova et al. // Siberian Scientific Medical Journal. - 2014 .-- T. 34 (4). - from. 103-108.

8. Юнусова Н.В. Экспрессия и активность протеаз при метастазировании рака яичников / Н.В. Юнусова, Л.В. Спирина, И.В. Кондакова и др. // Известия Российской академии наук. Серия биологическая. - 2014. - №5. - с. 448-455.8. Yunusova N.V. Expression and activity of proteases during metastasis of ovarian cancer / N.V. Yunusova, L.V. Spirina, I.V. Kondakova et al. // Bulletin of the Russian Academy of Sciences. Biological series. - 2014. - No. 5. - from. 448-455.

9. Юрмазов З.А. Молекулярные показатели, связанные с эффективностью терапии эверолимусом у больных диссеменированным раком почки / З.А. Юрмазов, Л.В. Спирина, Е.А. Усынин, и др. // Сибирский онкологический журнал. - 2016. - т. 15(2)ю - с. 42-47.9. Yurmazov Z.A. Molecular indicators associated with the effectiveness of everolimus therapy in patients with disseminated kidney cancer / Z.A. Yurmazov, L.V. Spirina, E.A. Usynin, et al. // Siberian Journal of Oncology. - 2016. - vol. 15 (2) y - p. 42-47.

10. Ai М. HER-2 regulates Brk/PTK6 stability via upregulating calpastatin, an inhibitor of calpain / M. Ai, S. Qiu, Y. Lu [et al.] // Cell Signal. - 2013. - Vol. 25(9). - p. 1754-1761.10. Ai M. HER-2 regulates Brk / PTK6 stability via upregulating calpastatin, an inhibitor of calpain / M. Ai, S. Qiu, Y. Lu [et al.] // Cell Signal. - 2013. - Vol. 25 (9). - p. 1754-1761.

11. Andre F. Ki67 - no evidence for its use in node-positive breast cancer (Review) / F. Andre, M. Arnedos, A. Goubar [et al] // Nature Reviews Clinical Oncology. - 2015. - Vol. 12. - p. 296-301.11. Andre F. Ki67 - no evidence for its use in node-positive breast cancer (Review) / F. Andre, M. Arnedos, A. Goubar [et al] // Nature Reviews Clinical Oncology. - 2015. - Vol. 12. - p. 296-301.

12. Asher G. p53 proteasomal degradation: poly-ubiquitination is not the whole story / G. Asher, Y. Shaul // Cell Cycle. - 2005. - Vol. 4(8). - P. 1015.12. Asher G. p53 proteasomal degradation: poly-ubiquitination is not the whole story / G. Asher, Y. Shaul // Cell Cycle. - 2005. - Vol. 4 (8). - P. 1015.

13. Barton VN. Androgen receptor biology in triple negative breast cancer: a case for classification as AR+ or quadruple negative disease / Horm Cancer. - 2015. - Vol. 6(5-6). - p. 206-213.13. Barton VN. Androgen receptor biology in triple negative breast cancer: a case for classification as AR + or quadruple negative disease / Horm Cancer. - 2015. - Vol. 6 (5-6). - p. 206-213.

14. Bernaudo S. Epidermal growth factor promotes cyclin G2 degradation via calpain-mediated proteolysis in gynaecological cancer cells / S. Bernaudo, S. Khazai, E. Honarparvar [et al.] // PLoS One. - 2017. - Vol. 12(6). - p. e0179906.14. Bernaudo S. Epidermal growth factor promotes cyclin G2 degradation via calpain-mediated proteolysis in gynaecological cancer cells / S. Bernaudo, S. Khazai, E. Honarparvar [et al.] // PLoS One. - 2017. - Vol. 12 (6). - p. e0179906.

15. Biswas T. Inflammatory TNBC breast cancer: demography and clinical outcome in a large cohort of patients with TNBC / T. Biswas // Clin Breast Cancer. - 2016. - Vol. 16(3). - p. 212-216.15. Biswas T. Inflammatory TNBC breast cancer: demography and clinical outcome in a large cohort of patients with TNBC / T. Biswas // Clin Breast Cancer. - 2016. - Vol. 16 (3). - p. 212-216.

16. Castagnola P. Identification of an HSP90 modulated multi-step process for ERBB2 degradation in breast cancer cells / P. Castagnola, G. Bellese, F. Birocchi [et al.] // Oncotarget. - 2016. - Vol. 7(51). - p. 85411-85429.16. Castagnola P. Identification of an HSP90 modulated multi-step process for ERBB2 degradation in breast cancer cells / P. Castagnola, G. Bellese, F. Birocchi [et al.] // Oncotarget. - 2016. - Vol. 7 (51). - p. 85411-85429.

17. Chierico L. The role of the two splice variants and extranuclear pathway on Ki67 regulation in non-cancer and cancer cells / L. Chierico, L. Rizzello, L. Guan [et al.] // PLoS One. - 2017. - Vol. 12(2). - p. e0171815.17. Chierico L. The role of the two splice variants and extranuclear pathway on Ki67 regulation in non-cancer and cancer cells / L. Chierico, L. Rizzello, L. Guan [et al.] // PLoS One. - 2017. - Vol. 12 (2). - p. e0171815.

18. Clarke C.L. Non-overlapping progesterone receptor cistromes contribute to cell-specific transcriptional outcomes / C.L. Clarke, J.D. Graham // PLoS One. - 2012. - Vol. 7. - p. e35859.18. Clarke C.L. Non-overlapping progesterone receptor cistromes contribute to cell-specific transcriptional outcomes / C.L. Clarke, J.D. Graham // PLoS One. - 2012. - Vol. 7. - p. e35859.

19. Cortese K. Carnosic acid induces proteasomal degradation of Cyclin B1, RB and SOX2 along with cell growth arrest and apoptosis in GBM cells / K. Cortese, A. Daga, M. Monticone [et al.] // Phytomedicine. - 2016. - Vol. 23(7). - p. 679-685.19. Cortese K. Carnosic acid induces proteasomal degradation of Cyclin B1, RB and SOX2 along with cell growth arrest and apoptosis in GBM cells / K. Cortese, A. Daga, M. Monticone [et al.] // Phytomedicine. - 2016. - Vol. 23 (7). - p. 679-685.

20. Cui Q. P53-mediated cell cycle arrest and apoptosis through a caspase-3- independent, but caspase-9-dependent pathway in oridonin-treated MCF-7 human breast cancer cells / Q. Cui, J.H. Yu, J.N. Wu [et al.] // Acta Pharmacol Sin. - 2007. - Vol. 28(7). - p. 1057-1066.20. Cui Q. P53-mediated cell cycle arrest and apoptosis through a caspase-3- independent, but caspase-9-dependent pathway in oridonin-treated MCF-7 human breast cancer cells / Q. Cui, J.H. Yu, J.N. Wu [et al.] // Acta Pharmacol Sin. - 2007. - Vol. 28 (7). - p. 1057-1066.

21. Del Carmen Lafita-Navarro M. Identification of calpain-activated protein functions / M. Del Carmen Lafita-Navarro, M. Conacci-Sorrell // Methods Mol Biol. - 2019. - Vol. 1915. - p. 149-160.21. Del Carmen Lafita-Navarro M. Identification of calpain-activated protein functions / M. Del Carmen Lafita-Navarro, M. Conacci-Sorrell // Methods Mol Biol. - 2019. - Vol. 1915. - p. 149-160.

22. Daniel A.R. Lange phosphorylation-dependent antagonism of sumoylation derepresses progesterone receptor action in breast cancer cells / A.R. Daniel, E.J. Faivre, C.A. Lange [et al.] // Mol Endocrinol. - 2007. - Vol. 21. - p. 2890-2906.22. Daniel A.R. Lange phosphorylation-dependent antagonism of sumoylation derepresses progesterone receptor action in breast cancer cells / A.R. Daniel, E.J. Faivre, C.A. Lange [et al.] // Mol Endocrinol. - 2007. - Vol. 21. - p. 2890-2906.

23. Daniel A.R. Progesterone receptor-B enhances estrogen responsiveness of breast cancer cells via scaffolding PELP1 - and estrogen receptor-containing transcription complexes / A.R. Daniel, A.L. Gaviglio, T.P. Knutson [et al.] // Oncogene. - 2015. - Vol. 34. - p. 506-515.23. Daniel A.R. Progesterone receptor-B enhances estrogen responsiveness of breast cancer cells via scaffolding PELP1 - and estrogen receptor-containing transcription complexes / A.R. Daniel, A.L. Gaviglio, T.P. Knutson [et al.] // Oncogene. - 2015. - Vol. 34. - p. 506-515.

24. Durak M.G. Prognostic importance of tumor deposits in the ipsilateral axillary region of breast cancer patients / M.G. Durak, T. Canda, B. Yilmaz [et al.] // Pathol Oncol Res. - 2018. - Vol. 27. - p. 1-7.24. Durak M.G. Prognostic importance of tumor deposits in the ipsilateral axillary region of breast cancer patients / M.G. Durak, T. Canda, B. Yilmaz [et al.] // Pathol Oncol Res. - 2018. - Vol. 27. - p. 1-7.

25. Fu F. Subtype-specific associations between breast cancer risk polymorphisms and the survival of early-stage breast cancer / F. Fu, W. Guo, Y. Lin [et al.] // J Transl Med. - 2018. - Vol. 16(1). - p. 270.25. Fu F. Subtype-specific associations between breast cancer risk polymorphisms and the survival of early-stage breast cancer / F. Fu, W. Guo, Y. Lin [et al.] // J Transl Med. - 2018. - Vol. 16 (1). - p. 270.

26. Graham J. D. Progesterone receptor A and В protein expression in human breast cancer / J. D. Graham, C. Yeates, R.L. Balleine [et al.] // J. Steroid Biochem. and Mol. Biol. - 1996. - Vol. 56. - №1-6. P. 93-98.26. Graham J. D. Progesterone receptor A and B protein expression in human breast cancer / J. D. Graham, C. Yeates, R. L. Balleine [et al.] // J. Steroid Biochem. and Mol. Biol. - 1996. - Vol. 56. - No. 1-6. P. 93-98.

27. Helzer K.T. Ubiquitylation of nuclear receptors: new linkages and therapeutic implications / K.T. Helzer, C. Hooper, S. Miyamoto [et al.] // J Mol Endocrinol. - 2015. - Vol. 54. - p. R151-R167.27. Helzer K.T. Ubiquitylation of nuclear receptors: new linkages and therapeutic implications / K.T. Helzer, C. Hooper, S. Miyamoto [et al.] // J Mol Endocrinol. - 2015. - Vol. 54. - p. R151-R167.

28. Hilton H.N. Estrogen and progesterone signalling in the normal breast and its implications for cancer development / H.N. Hilton, C.L. Clarke, J.D. Graham // Mol Cell Endocrinol. - 2018. - Vol. 466. - p. 2-14.28. Hilton H.N. Estrogen and progesterone signaling in the normal breast and its implications for cancer development / H.N. Hilton, C.L. Clarke, J.D. Graham // Mol Cell Endocrinol. - 2018. - Vol. 466 .-- p. 2-14.

29. Hynes N.E. ErbB receptors and signaling pathways in cancer / N.E. Hynes, G. MacDonald // CurrOpin Cell Biol. - 2009. - Vol. 21. - p. 177-184.29. Hynes N.E. ErbB receptors and signaling pathways in cancer / N.E. Hynes, G. MacDonald // CurrOpin Cell Biol. - 2009. - Vol. 21. - p. 177-184.

30. Kastrati I. A novel strategy to co-target estrogen receptor and nuclear factor κВ pathways with hybrid drugs for breast cancer therapy / I. Kastrati, M.I. Siklos, S.D. Brovkovych [et al.] // Horm Cancer. - 2017. - Vol. 8(3). - p. 135-142.30. Kastrati I. A novel strategy to co-target estrogen receptor and nuclear factor κB pathways with hybrid drugs for breast cancer therapy / I. Kastrati, M.I. Siklos, S.D. Brovkovych [et al.] // Horm Cancer. - 2017. - Vol. 8 (3). - p. 135-142.

31. Kennecke H. Metastatic behavior of breast cancer subtypes / H. Kennecke, R. Yerushalmi, R. Woods [et al.] // J. Clin. Oncol. - 2010. - Vol. 28(20). - P. 3271-3277.31. Kennecke H. Metastatic behavior of breast cancer subtypes / H. Kennecke, R. Yerushalmi, R. Woods [et al.] // J. Clin. Oncol. - 2010. - Vol. 28 (20). - P. 3271-3277.

32. Knutson T.P. Phosphorylated and sumoylation-deficient progesterone receptors drive proliferative gene signatures during breast cancer progression / T.P. Knutson, A.R. Daniel, D. Fan [et al.] // Breast Cancer Res. - 2012. - Vol. 14. - p. R95.32. Knutson T.P. Phosphorylated and sumoylation-deficient progesterone receptors drive proliferative gene signatures during breast cancer progression / T.P. Knutson, A.R. Daniel, D. Fan [et al.] // Breast Cancer Res. - 2012. - Vol. 14. - p. R95.

33. Kuo W.-H. Molecular characteristics and metastasis predictor genes of triple-negative breast cancer: a clinical study of triple-negative breast carcinomas / W.-H. Kuo, Y.-Y. Chang, L.-C. Lai [et al.] // PLoS One. - 2012. - Vol. 7(9). - p. e45831.33. Kuo W.-H. Molecular characteristics and metastasis predictor genes of triple-negative breast cancer: a clinical study of triple-negative breast carcinomas / W.-H. Kuo, Y.-Y. Chang, L.-C. Lai [et al.] // PLoS One. - 2012. - Vol. 7 (9). - p. e45831.

34. Liu F. The ubiquitin ligase CHIP inactivates NF-κВ signaling and impairs the ability of migration and invasion in gastric cancer cells / F. Liu, J. Zhou, P. Zhou // Int J Oncol. - 2015. - Vol. 46(5). - P. 2096-2106.34. Liu F. The ubiquitin ligase CHIP inactivates NF-κB signaling and impairs the ability of migration and invasion in gastric cancer cells / F. Liu, J. Zhou, P. Zhou // Int J Oncol. - 2015. - Vol. 46 (5). - P. 2096-2106.

35. Lim Y.J. A Novel prognostic nomogram for predicting risks of distant failure in patients with invasive breast cancer following postoperative adjuvant radiotherapy / Y.J. Lim, S.W. Lee, N. Choi [et al.] // Cancer Res Treat. - 2018. - Vol. 50(4). - p. 1140-1148.35. Lim Y.J. A Novel prognostic nomogram for predicting risks of distant failure in patients with invasive breast cancer following postoperative adjuvant radiotherapy / Y.J. Lim, S.W. Lee, N. Choi [et al.] // Cancer Res Treat. - 2018. - Vol. 50 (4). - p. 1140-1148.

36. Iizuka M. Intrinsic ubiquitin E3 ligase activity of histone acetyltransferase Hbo1 for estrogen receptor α / M. Iizuka, T. Susa, M. Tamamori-Adachi [et al.] // Proc Jpn Acad Ser В Phys Biol Sci. - 2017. - Vol. 93(7). - p. 498-510.36. Iizuka M. Intrinsic ubiquitin E3 ligase activity of histone acetyltransferase Hbo1 for estrogen receptor α / M. Iizuka, T. Susa, M. Tamamori-Adachi [et al.] // Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. - 2017. - Vol. 93 (7). - p. 498-510.

37. MacLeod J.A. Genetic disruption of calpain-1 and calpain-2 attenuates tumorigenesis in mouse models of HER-2 + breast cancer and sensitizes cancer cells to doxorubicin and lapatinib / J.A. MacLeod, Y. Gao, C. Hall [et al.] // Oncotarget. - 2018. - Vol. 9(70). - p. 33382-33395.37. MacLeod J.A. Genetic disruption of calpain-1 and calpain-2 attenuates tumorigenesis in mouse models of HER-2 + breast cancer and sensitizes cancer cells to doxorubicin and lapatinib / J.A. MacLeod, Y. Gao, C. Hall [et al.] // Oncotarget. - 2018. - Vol. 9 (70). - p. 33382-33395.

38. van Maaren M.C. 10-year recurrence rates for breast cancer subtypes in the Netherlands: a large population-based study / M.C. van Maaren, L. de Munck, L.J. Strobbe [et al.] // Int J Cancer. - 2019. - Vol. 144(2). - p. 263-272.38. van Maaren M.C. 10-year recurrence rates for breast cancer subtypes in the Netherlands: a large population-based study / M.C. van Maaren, L. de Munck, L.J. Strobbe [et al.] // Int J Cancer. - 2019. - Vol. 144 (2). - p. 263-272.

39.

LA. Breast carcinoma subtypes show different patterns of metastatic behavior / LA.

,

, L.

[et al.] // Virchows Arch. - 2017. - Vol. 470(3). - p. 275-283.39.

,

, L.

[et al.] // Virchows Arch. - 2017. - Vol. 470 (3). - p. 275-283.

40. Pan Y. P53 and Ki67 as prognostic markers in triple-negative breast cancer patients / Y. Pan, Y. Yuan, G. Liu [et al] // PLoS One. - 2017. - Vol. 12(2). - p. e0172324.40. Pan Y. P53 and Ki67 as prognostic markers in triple-negative breast cancer patients / Y. Pan, Y. Yuan, G. Liu [et al] // PLoS One. - 2017. - Vol. 12 (2). - p. e0172324.

41. Park M.H. Elevated interleukin-13 receptor alpha 1 expression in tumor cells is associated with poor prognosis in patients with invasive breast cancer / M.H. Park, H.J. Kwon, J.R. Kim [et al.] // Ann Surg Oncol. - 2017. - Vol. 24(12). - p. 3780-3787.41. Park M.H. Elevated interleukin-13 receptor alpha 1 expression in tumor cells is associated with poor prognosis in patients with invasive breast cancer / M.H. Park, H.J. Kwon, J.R. Kim [et al.] // Ann Surg Oncol. - 2017. - Vol. 24 (12). - p. 3780-3787.

42. Patel P. Dual inhibition of CDK4 and CDK2 via targeting p27 Tyrosine Phosphorylation induces a potent and durable response in breast cancer cells / P. Patel, V. Tsiperson, S.R.S. Gottesman [et al.] // Mol Cancer Res. - 2018. - Vol. 16(3). - p. 361-377.42. Patel P. Dual inhibition of CDK4 and CDK2 via targeting p27 Tyrosine Phosphorylation induces a potent and durable response in breast cancer cells / P. Patel, V. Tsiperson, S.R.S. Gottesman [et al.] // Mol Cancer Res. - 2018. - Vol. 16 (3). - p. 361-377.

43. Peng F. PFKFB3 is involved in breast cancer proliferation, migration, invasion and angiogenesis / F. Peng, Q. Li, J.Y. Sun [et al.] // Int J Oncol. - 2018. - Vol. 52(3). - p. 945-954.43. Peng F. PFKFB3 is involved in breast cancer proliferation, migration, invasion and angiogenesis / F. Peng, Q. Li, J.Y. Sun [et al.] // Int J Oncol. - 2018. - Vol. 52 (3). - p. 945-954.

44. Rakha E.A. Breast cancer prognostic classification in the molecular era: the role of histological grade / E.A. Rakha, J.S. Reis-Filho, F. Baehner [et al.] // Breast Cancer Res. - 2010. - Vol. 12. - p. 207.44. Rakha E.A. Breast cancer prognostic classification in the molecular era: the role of histological grade / E.A. Rakha, J.S. Reis-Filho, F. Baehner [et al.] // Breast Cancer Res. - 2010. - Vol. 12. - p. 207.

45. Salem K. Sensitivity and isoform specificity of ¹⁸F-Fluorofuranylnorprogesterone for measuring progesterone receptor protein response to estradiol challenge in breast cancer / K. Salem, M. Kumar, Y. Yan [et al] // J Nucl Med. - 2018. - Jul 20. - p. 1-29.45. Salem K. Sensitivity and isoform specificity of ¹⁸ F-Fluorofuranylnorprogesterone for measuring progesterone receptor protein response to estradiol challenge in breast cancer / K. Salem, M. Kumar, Y. Yan [et al] // J Nucl Med. - 2018. - Jul 20. - p. 1-29.

46. Sharova N.P. Changes in proteasome pool in human papillary thyroid carcinoma development / N.P. Sharova, T.M. Astakhova, Y.D. Karpova, [et al.] // Central European Journal of Biology. - 2011. - Vol. 6. - №4. - p. 486-496.46. Sharova N.P. Changes in proteasome pool in human papillary thyroid carcinoma development / N.P. Sharova, T.M. Astakhova, Y.D. Karpova, [et al.] // Central European Journal of Biology. - 2011. - Vol. 6. - No. 4. - p. 486-496.

47. Seviour E.G. Functional proteomics identifies miRNAs to target a p27/Myc/phospho-Rb signature in breast and ovarian cancer. / E.G. Seviour, V. Sehgal, Y. Lu [et al.] // Oncogene. - 2016. - Vol. 35(6). - p. 691-701.47. Seviour E.G. Functional proteomics identifies miRNAs to target a p27 / Myc / phospho-Rb signature in breast and ovarian cancer. / E.G. Seviour, V. Sehgal, Y. Lu [et al.] // Oncogene. - 2016. - Vol. 35 (6). - p. 691-701.

48. Storr S.J. Calpain system protein expression in basal-like and triple-negative invasive breast cancer / S.J. Storr, K.W. Lee, C.M. Woolston [et al.] // Ann Oncol. - 2012. - Vol. 23(9). - p. 2289-2296.48. Storr S.J. Calpain system protein expression in basal-like and triple-negative invasive breast cancer / S.J. Storr, K.W. Lee, C.M. Woolston [et al.] // Ann Oncol. - 2012. - Vol. 23 (9). - p. 2289-2296.

49. Storr SJ, Woolston CM, Barros FF, Green AR, Shehata M, Chan SY, Ellis IO, Martin SG. Calpain-1 expression is associated with relapse-free survival in breast cancer patients treated with trastuzumab following adjuvant chemotherapy / S.J. Storr, C.M. Woolston, F.F. Barros [et al.] // Int J Cancer. - 2011. - Vol. 129. - p. 1773-1780.49. Storr SJ, Woolston CM, Barros FF, Green AR, Shehata M, Chan SY, Ellis IO, Martin SG. Calpain-1 expression is associated with relapse-free survival in breast cancer patients treated with trastuzumab following adjuvant chemotherapy / S.J. Storr, C.M. Woolston, F.F. Barros [et al.] // Int J Cancer. - 2011. - Vol. 129. - p. 1773-1780.

50. Storr S.J. Calpain-2 expression is associated with response to platinum based chemotherapy, progression-free and overall survival in ovarian cancer / S.J. Storr, S. Safuan, C.M. Woolston [et al.] // J.Cell Mol Med. - 2012. - Vol. 16. - p. 2422-2428.50. Storr S.J. Calpain-2 expression is associated with response to platinum based chemotherapy, progression-free and overall survival in ovarian cancer / S.J. Storr, S. Safuan, C.M. Woolston [et al.] // J. Cell Mol Med. - 2012. - Vol. 16. - p. 2422-2428.

51. Seo Y. PIK3СA Mutations and neoadjuvant therapy outcome in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer: a sequential analysis / Y. Seo, Y.H. Park, J.S. Ahn [et al.] // J Breast Cancer. - 2018. - Vol. 21(4). - p. 382-390.51. Seo Y. PIK3СA Mutations and neoadjuvant therapy outcome in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer: a sequential analysis / Y. Seo, Y.H. Park, J.S. Ahn [et al.] // J Breast Cancer. - 2018. - Vol. 21 (4). - p. 382-390.

52. Shiba E. Ca&sup2+; -dependent neutral protease (Calpain) activity in breast cancer tissue and estrogen receptor status / E. Shiba, J.I. Kambayashi, M. Sakon, [et. al.] // Breast Cancer. - 1996. - Vol. 3(1). - p. 13-17.52. Shiba E. Ca.sub2 +; -dependent neutral protease (Calpain) activity in breast cancer tissue and estrogen receptor status / E. Shiba, J.I. Kambayashi, M. Sakon, [et. al.] // Breast Cancer. - 1996. - Vol. 3 (1). - p. 13-17.

53. Synnott N.C Mutant p53: a novel target for the treatment of patients with triple-negative breast cancer? / N.C. Synnott, A. Murray, P.M. McGowan [et al.] // Int J Cancer. - 2017. - Vol. 140(1). - p. 234-246.53. Synnott N.C Mutant p53: a novel target for the treatment of patients with triple-negative breast cancer? / N.C. Synnott, A. Murray, P.M. McGowan [et al.] // Int J Cancer. - 2017. - Vol. 140 (1). - p. 234-246.

54. Thomas P. Identity of an estrogen membrane receptor coupled to a G protein in human breast cancer cells / P. Thomas, Y. Pang, E.J. Filardo [et al.] // Endocrinology. - 2005. - Vol. 146. - p. 624-632.54. Thomas P. Identity of an estrogen membrane receptor coupled to a G protein in human breast cancer cells / P. Thomas, Y. Pang, E. J. Filardo [et al.] // Endocrinology. - 2005. - Vol. 146 .-- p. 624-632.

55. Yu B.H. Cytoplasmic FOXP1 expression is correlated with ER and calpain II expression and predicts a poor outcome in breast cancer. / B.H. Yu, B.Z. Li, X.Y. Zhou [et al] // Diagn Pathol. - 2018. - Vol. 13(1). - p. 36-44.55. Yu B.H. Cytoplasmic FOXP1 expression is correlated with ER and calpain II expression and predicts a poor outcome in breast cancer. / B.H. Yu, B.Z. Li, X.Y. Zhou [et al] // Diagn Pathol. - 2018. - Vol. 13 (1). - p. 36-44.

56. Zhang S. Calpain system protein expression and activity in ovarian cancer / S. Zhang, S. Deen, S.J. Storr [et al.] // J Cancer Res Clin Oncol. - 2018. - doi: 10.1007/s00432-018-2794-2.56. Zhang S. Calpain system protein expression and activity in ovarian cancer / S. Zhang, S. Deen, S.J. Storr [et al.] // J Cancer Res Clin Oncol. - 2018.- doi: 10.1007 / s00432-018-2794-2.

57. Zhang P.J. CUE domain containing 2 regulates degradation of progesterone receptor by ubiquitin-proteasome / P.J. Zhang, J. Zhao, H.Y. Li [et al.] // EMBO J. - 2007. - Vol. 26. - P. 1831-1842.57. Zhang P.J. CUE domain containing 2 regulates degradation of progesterone receptor by ubiquitin-proteasome / P.J. Zhang, J. Zhao, H.Y. Li [et al.] // EMBO J. - 2007. - Vol. 26 .-- P. 1831-1842.

58. Zhou W. Links between oestrogen receptor activation and proteolysis: relevance to hormone-regulated cancer therapy / W. Zhou, J.M. Slingerland // Nat. Rev. Cancer. - 2014. - Vol. 14. - p. 26-38.58. Zhou W. Links between estrogen receptor activation and proteolysis: relevance to hormone-regulated cancer therapy / W. Zhou, J.M. Slingerland // Nat. Rev. Cancer. - 2014. - Vol. 14. - p. 26-38.

Claims

A method for predicting the risk of developing distant metastases in patients with operable forms of breast cancer with metastases to regional lymph nodes, characterized by the fact that they determine the molecular biological parameters of the tumor in breast tissue samples and evaluate the indicators in points, while determining the degree of involvement in the process of metastasis of regional lymph nodes nodes (X1), and when 1 to 3 lymph nodes are involved in the process, they are assessed at 0 points, and when 4 or more lymph nodes are involved in the process, they are assessed at 1 point; determine the value of the marker of proliferative activity in the tumor Ki67 (%) (X2); the expression of the HER-2 (X3) receptor is also determined, and when it is detected, it is evaluated at 1 point, and in its absence, it is evaluated as 0 points; determine the expression of estrogen receptors (X4), while in the presence of positive expression, it is estimated at 1 point, in the case of negative expression, it is estimated as 0 points; then the expression of progesterone receptors (X5) is determined, and in the case of positive expression, it is estimated at 1 point, in the case of negative expression, it is estimated as 0 points; also determine the value of chymotrypsin-like activity of proteasomes in tumor tissue (CPA) (UE * 10 ³ IU / mg protein) (X6); as well as in tumor and conditionally unchanged tissue, the values of caspase-like proteasome activity (CPA) (VE * 10 ³ IU / mg protein) and the activity of calpains (AA) (VE * 10 ³ IU / mg protein) are determined, then the coefficient of caspase-like activity of proteasomes ( kKPA) (X7), and the activity coefficient of calpains (kAK) (X8), which are calculated as the ratio of the corresponding activity in the tumor tissue to the activity in the conditionally unchanged tissue; then the value of the logistic regression equation Y is determined by the formula (1), which has the following form:

Where

-140.77 - value of the coefficient of regression of the intercept

X1 - degree of involvement in the process of metastasis of regional lymph nodes; in case of involvement in the process of metastasis from 1 to 3 regional lymph nodes X1 = 0; with metastases affecting 4 or more regional lymph nodes, X1 = 1;

253.314 - value of the regression coefficient of the attribute X1;

X2 - the value of the marker of proliferative activity in the tumor Ki67 (%);

-4.851 - the value of the regression coefficient of the X2 attribute;

X3 - expression of the HER-2 receptor, in case of detection of the expression of the HER-2 receptor X3 = 1; in the absence of expression of the HER-2 receptor X3 = 0);

375.064 - the value of the regression coefficient of the X3 attribute;

X4 - expression of estrogen receptors, with positive expression of estrogen X4 = 1; with negative expression of estrogen receptors X4 = 0;

-378.390 - the value of the regression coefficient of the X4 attribute;

X5 - expression of progesterone receptors, with positive expression of progesterone receptors X5 = 1; with negative expression of progesterone receptors X5 = 0;

2.537 - the value of the regression coefficient of the X5 feature;

X6 is the value of CPA of proteasomes in the tumor (YE * 10 ³ IU / mg protein);

2.399 - the value of the regression coefficient of the X6 feature;

X7 is the value of the kCPA of the proteasome;

49.752 - the value of the regression coefficient of the X7 attribute;

X8 - kAK value;

3.530 - the value of the regression coefficient of the X8 feature,

The likelihood of developing hematogenous metastases in the long-term period in breast cancer patients P is determined by the formula (2):

where e is a mathematical constant equal to 2.72,

and at P≥50%, a high risk is determined, and at P <50%, a low risk of developing distant metastases.