RU2728251C1 - Escherichia coli strain with inactivated yche gene - l-threonine producer - Google Patents
Escherichia coli strain with inactivated yche gene - l-threonine producer Download PDFInfo
- Publication number
- RU2728251C1 RU2728251C1 RU2019137673A RU2019137673A RU2728251C1 RU 2728251 C1 RU2728251 C1 RU 2728251C1 RU 2019137673 A RU2019137673 A RU 2019137673A RU 2019137673 A RU2019137673 A RU 2019137673A RU 2728251 C1 RU2728251 C1 RU 2728251C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- threonine
- yche
- escherichia coli
- inactivated
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности, к микробиологическому синтезу L-треонина с использованием бактерии вида Escherichia coli.The present invention relates to the microbiological industry, in particular, to the microbiological synthesis of L-threonine using bacteria of the species Escherichia coli.
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, выделенных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.Traditionally, L-amino acids on an industrial scale can be obtained by fermentation using strains of microorganisms isolated from natural sources, or their mutants, specially modified in order to increase the production of L-amino acids.
Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (US 4278765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (WO 9516042, US 5661012, US 6040160).Many methods have been described for increasing the production of L-amino acids, for example, by transforming the microorganism with recombinant DNA (US Pat. No. 4,278,765). These methods are based on increasing the activity of enzymes involved in the biosynthesis of amino acids and / or decreasing the sensitivity of the target enzyme to inhibition by the produced L-amino acid (WO 9516042, US 5661012, US 6040160).
Известны различные штаммы, использующиеся для производства L-треонина методом ферментации. Это штаммы с увеличенными активностями ферментов, вовлеченных в биосинтез L-треонина (US 5175107; US 5661012; US 5705371; US 5939307; ЕР 219027), штаммы, устойчивые к некоторым химических реагентам, таким как L-треонин и его аналоги (WO 0114525, ЕР 301572, US 5376538), штаммы с инактивированными ферментами системы деградации L-треонина (US 5939307 и US 6297031), штаммы, в которых устранена чувствительность целевого фермента к ингибированию продуцируемой аминокислотой или ее побочными продуктами по типу обратной связи (US 5175107 и US 5661012).Various strains are known that are used for the production of L-threonine by fermentation. These are strains with increased activities of enzymes involved in the biosynthesis of L-threonine (US 5175107; US 5661012; US 5705371; US 5939307; EP 219027), strains resistant to certain chemical reagents such as L-threonine and its analogs (WO 0114525, EP 301572, US 5376538), strains with inactivated enzymes of the L-threonine degradation system (US 5939307 and US 6297031), strains in which the sensitivity of the target enzyme to inhibition by the produced amino acid or its by-products is eliminated by feedback (US 5175107 and US 5661012 ).
Известен штамм-продуцент L-треонина Е. coli ВКПМ В-3996 (SU 1694643, US 5175107 и US 5705371), полученный путем введения в штамм Е. coli ВКПМ В-7 следующих мутаций и плазмиды:Known E. coli L-threonine-producing strain VKPM B-3996 (SU 1694643, US 5175107 and US 5705371), obtained by introducing the following mutations and plasmids into the E. coli strain VKPM B-7:
- мутантный ген thrA (мутация thrA442) кодирует белок аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, который устойчив к ингибированию треонином по типу обратной связи;- the mutant thrA gene (mutation thrA 442 ) encodes the protein aspartokinase-homoserine dehydrogenase I, which is resistant to feedback inhibition by threonine;
- мутантный ген ILvA (мутация ilvA442) кодирует белок треониндеаминазу, обладающую пониженной активностью, которая выражается в пониженном уровне биосинтеза изолейцина и в фенотипе с недостатком по изолейцину типа "leaky". В бактерии с мутацией ilvA442 транскрипция оперона thrABC не репрессируется изолейцином, что дает положительный эффект на продукцию L-треонина;- the mutant gene ILvA (mutation ilvA 442 ) encodes a protein threonine deaminase, which has a reduced activity, which is expressed in a reduced level of isoleucine biosynthesis and in a phenotype with isoleucine deficiency of the "leaky" type. In bacteria with the ilvA 442 mutation, transcription of the thrABC operon is not repressed by isoleucine, which has a positive effect on L-threonine production;
- инактивация гена tdh приводит к предотвращению деградации треонина, в указанный штамм была введена генетическая детерминанта ассимиляции сахарозы (гены scrKYABR);- inactivation of the tdh gene leads to the prevention of threonine degradation, the genetic determinant of sucrose assimilation (scrKYABR genes) was introduced into the specified strain;
- увеличение экспрессии генов, контролирующих биосинтез треонина, достигнута путем введения в штамм плазмиды pVIC40, содержащей мутантный треониновый оперон thrA442 ВС.- an increase in the expression of genes that control the biosynthesis of threonine was achieved by introducing into the strain the plasmid pVIC40 containing the mutant thrA 442 BC threonine operon.
Штамм Е. coli ВКПМ В-3996 в ходе ферментации пробирках продуцирует 13 г/л L-треонина (RU 2182173), при культивировании в ферментере - 85 г/л L-треонина (US 5175107).The E. coli strain VKPM B-3996 during fermentation in test tubes produces 13 g / L of L-threonine (RU 2182173), when cultured in a fermenter - 85 g / L of L-threonine (US 5175107).
При конструирования продуцентов важным является также поиск новых генов-мишеней, модификация которых приводит к увеличению продукции L-треонина.When designing producers, it is also important to search for new target genes, the modification of which leads to an increase in the production of L-threonine.
Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение является расширение арсенала штаммов Escherichia coli, способных к продукции L-треонина.The technical problem to be solved by the present invention is to expand the arsenal of Escherichia coli strains capable of producing L-threonine.
Поставленная задача решена тем, что получен штамм бактерии Escherichia coli с инактивированным геном ychE, обладающий способностью продуцировать треонин.The problem is solved by the fact that the obtained strain of the bacterium Escherichia coli with inactivated gene ychE, which has the ability to produce threonine.
Термин "ген ychE инактивирован" означает, что целевой ген модифицирован таким образом, что такой модифицированный ген кодирует мутантный белок со сниженной активностью, или полностью неактивный белок. Также возможно, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеции целевого гена или его части, сдвига рамки считывания данного гена или введения missense/nonsense мутации или модификации прилегающей к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промотор(ы), энхансер(ы), аттенуатор(ы), сайт(ы) связывания рибосомы, и т.д.The term "ychE gene is inactivated" means that the target gene has been modified such that such a modified gene encodes a mutant protein with reduced activity, or a completely inactive protein. It is also possible that natural expression of a modified DNA region is impossible due to deletion of the target gene or part of it, shift of the reading frame of this gene, or introduction of missense / nonsense mutations or modifications of gene-adjacent regions that include sequences that control gene expression, such as the promoter ( s), enhancer (s), attenuator (s), ribosome binding site (s), etc.
Инактивация гена может быть осуществлена любым известным способом, например, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный мутагенез, инактивации гена с помощью гомологичной рекомбинации, или/и инсерционно-делеционного мутагенеза (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83); (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45), также называемого "Red-зависимая интеграция".Gene inactivation can be accomplished by any known method, such as mutagenesis using UV radiation or treatment with nitrosoguanidine (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine), site-directed mutagenesis, gene inactivation by homologous recombination, or / and insertional deletion mutagenesis (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83); (Datsenko K. A. and Wanner B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45), also called "Red-dependent integration".
В данной работе инактивацию гена ychE проводят путем замены открытой рамки считывания гена на селективный маркер aadA, ген устойчивости к спекциномицину.In this work, the inactivation of the ychE gene is carried out by replacing the open reading frame of the gene with the selectable marker aadA, the gene for resistance to speccinomycin.
Полученный таким образом штамм не способен синтезировать белок YchE, кодируемый геном ychE.The thus obtained strain is unable to synthesize the YchE protein encoded by the ychE gene.
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графического изображения: Фиг. 1. Схема плазмиды pISA.The invention is illustrated by the following graphical figures: FIG. 1. Scheme of plasmid pISA.
Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным геном ychEExample 1. Construction of a ychE gene-inactivated strain
Инактивацию гена осуществляют в штамме ВКПМ В-13207, который получен на основе природного штамма Escherichia coli K-12 MG1655 (АТСС 47076) в результате проведения нескольких ступеней мутагеза различными мутирующими агентами с целью отбора мутантов наиболее устойчивых к L-треонину, и последующего введения направленных генетических модификаций: замена промотора генов треонинового оперона, введение десенсибилизирующей мутации в ген thrA, оверэспрессия rhtA, инактивация гена sstT, инактивация гена рохВ, кодирующего пируватоксидазу.Gene inactivation is carried out in the VKPM B-13207 strain, which is obtained on the basis of the natural strain of Escherichia coli K-12 MG1655 (ATCC 47076) as a result of several stages of mutagenesis with various mutating agents in order to select the mutants most resistant to L-threonine, and the subsequent introduction of targeted genetic modifications: replacement of the threonine operon gene promoter, introduction of a desensitizing mutation into the thrA gene, overexpression of rhtA, inactivation of the sstT gene, inactivation of the roxB gene encoding pyruvate oxidase.
Делецию гена ychE осуществляют путем замены его ORF (номер последовательности по базе данных GenBank NC_000913.3 U00096.3: 1298598…1299245) на селективный маркер устойчивости к спектиномицину, методом ПЦР с использованием следующих олигонуклеоти дов:Deletion of the ychE gene is carried out by replacing its ORF (sequence number according to the GenBank database NC_000913.3 U00096.3: 1298598 ... 1299245) with a selective marker of spectinomycin resistance, by PCR using the following oligonucleotides:
В качестве матрицы для синтеза используют плазмиду pISA (Выборная Т.В. и др, Биотехнология 2019 Т. 35 №4 с. 42-54). В своем составе эта плазмида (фиг. 1) несет следующие генетические элементы: ген aadA, обуславливающий устойчивость клеток к спектиномицину для прямого отбора трансформантов; последовательности фага λ attL и attR - сайты узнавания системы рекомбинации Int/Xis; rep А - репликон; ген bla, кодирующий бета-лактамазу, обуславливающий устойчивость к ампициллину. Амплификацию фрагмента проводят с использованием полимеразы КАРА (KAPAbiosystems) для того, чтобы избежать ошибок в последовательности. Используют следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3 мин; 25 циклов: 20 сек при 98°С, 20 сек при 60°С, 2 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 2 мин при 72°С. ПЦР продукт размером 2036 п.о. очищают путем экстракции из агарозного геля и далее используют для трансформации штамма ВКПМ В-13207, который предварительно трансформируют плазмидой pKD46, которая необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45) содержит фрагмент ДНК фага λ (инвентарный номер последовательности J02459 в базе данных GenBank) длиной 2,154 нуклеотида (31088-33241), а также содержит гены Red гомологичной системы рекомбинации (β, γ, ехо гены) под контролем промотора ParaB; индуцируемого арабинозой.The pISA plasmid is used as a matrix for synthesis (Vybornaya T.V. et al, Biotechnology 2019 Vol. 35 No. 4 pp. 42-54). In its composition, this plasmid (Fig. 1) carries the following genetic elements: the aadA gene, which determines the resistance of cells to spectinomycin for direct selection of transformants; phage sequences λ attL and attR - recognition sites of the Int / Xis recombination system; rep А - replicon; the bla gene, encoding beta-lactamase, which confers resistance to ampicillin. The fragment is amplified using KAPA polymerase (KAPAbiosystems) in order to avoid sequence errors. The following temperature profile was used for PCR: denaturation at 95 ° C for 3 min; 25 cycles: 20 sec at 98 ° C, 20 sec at 60 ° C, 2 min at 72 ° C; and final polymerization: 2 minutes at 72 ° C. PCR product with a size of 2036 bp. purified by extraction from an agarose gel and then used to transform the VKPM B-13207 strain, which is pre-transformed with the pKD46 plasmid, which is necessary for the integration of the PCR product into the chromosome of the strain. Plasmid pKD46 (Datsenko, KA and Wanner, BL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97: 12: 6640-45) contains a DNA fragment of λ phage (GenBank accession number J02459) 2.154 nucleotides long ( 31088-33241), and also contains the Red genes of the homologous recombination system (β, γ, exo genes) under the control of the ParaB promoter; induced by arabinose.
Электрокомпетентные клетки получают следующим образом: ночную культуру штамма Е. coli ВКПМ В-13207 выращивают при 30°С в жидкой среде LB (мас. %): триптон - 1, NaCl - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, вода - остальное, рН 7,0 с добавкой ампициллина (125 мг/л), разводят в 100 раз при помощи 5 мл среды SOB (мас. %): триптон 2, дрожжевой экстракт - 0,5, MgCl2 - 0,0956, MgSO4⋅7H2O - 0,252, NaCl - 0,0058, KCl - 0,0185, вода остальное с добавлением ампициллина (100 мг/л) и L-арабинозы (1 мМ). Полученную культуру растят с перемешиванием при 30°С до достижения оптической плотности ОП660нм 0,6 ед., после чего делают клетки электрокомпетентными путем концентрации в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной Н2О. Электропорацию проводят с использованием 40 мкл клеток и 1 мкг продукта ПЦР. После электропорации клетки инкубируют с 1 мл среды SOC (мас. %): триптон 2, дрожжевой экстракт - 0,5, глюкоза - 0,36, MgCl2 - 0,0956, MgSO4⋅7H2O - 0,252, NaCl - 0,0058, KCl - 0,0185, вода остальное при 37°С в течение 2,5 часов, после чего высевают на чашки со средой LA (мас. %): агар-агар - 2, триптон - 1, NaCl - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, вода - остальное, рН 7,0 с добавлением спектиномицина (75 мкг/мл).Electrocompetent cells are obtained as follows: an overnight culture of E. coli VKPM B-13207 is grown at 30 ° C in a liquid LB medium (wt%): tryptone - 1, NaCl - 1, yeast extract - 0.5, water - the rest, pH 7.0 with the addition of ampicillin (125 mg / l), diluted 100 times with 5 ml of SOB medium (wt%): tryptone 2, yeast extract - 0.5, MgCl 2 - 0.0956, MgSO 4 ⋅ 7H 2 O - 0.252, NaCl - 0.0058, KCl - 0.0185, water - the rest with the addition of ampicillin (100 mg / l) and L-arabinose (1 mM). The culture was grown with shaking at 30 ° C until the optical density OD 660 nm of 0.6 units., Then make electrocompetent by concentrating the cells 100 times, and three times laundering iced deionized H 2 O. Electroporation was performed using 40 l of cells and 1 microgram PCR product. After electroporation, cells are incubated with 1 ml of SOC medium (wt%): tryptone 2, yeast extract - 0.5, glucose - 0.36, MgCl 2 - 0.0956, MgSO 4 ⋅7H 2 O - 0.252, NaCl - 0 , 0058, KCl - 0.0185, water the rest at 37 ° C for 2.5 hours, then plated on plates with LA medium (wt%): agar-agar - 2, tryptone - 1, NaCl - 1, yeast extract - 0.5, water - the rest, pH 7.0 with the addition of spectinomycin (75 μg / ml).
Отбор трансформантов, несущих делецию в гене ychE, проводят на чашках со средой LA с добавлением спектиномицина. Наличие инсерции в локусе ychE у отобранных клонов подтверждают методом ПЦР. Для амплификации фрагмента используют полимеразу Taq (Thermo Fisher Scientific) и следующие олигонуклеотиды:The selection of transformants carrying a deletion in the ychE gene is carried out on plates with LA medium supplemented with spectinomycin. The presence of an insertion at the ychE locus in the selected clones was confirmed by PCR. To amplify the fragment, Taq polymerase (Thermo Fisher Scientific) and the following oligonucleotides are used:
Для проведения ПЦР используют следующий температурный профиль: денатурация при 94°С в течение 4 мин; 25 циклов: 20 сек при 94°С, 20 сек при 55°С, 1 мин 30 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.The following temperature profile is used for PCR: denaturation at 94 ° C for 4 min; 25 cycles: 20 sec at 94 ° C, 20 sec at 55 ° C, 1 min 30 sec at 72 ° C; and final polymerization: 5 min at 72 ° C.
Наличие продукта размером 2449 п.о. интерпретируют как интеграцию кассеты в целевой локус. Для удаления вспомогательной плазмиды pKD46, проводят 2 пассажа на L-arape со спектиномицином при 42°С и полученные колонии тестируют на чувствительность к ампициллину.Availability of 2449 bp product interpreted as integration of the cassette into the target locus. To remove the auxiliary plasmid pKD46, 2 passages are performed on L-arape with spectinomycin at 42 ° C and the resulting colonies are tested for sensitivity to ampicillin.
По результатам проверки отобрано 5 клонов, несущих делецию в гене ychE.Based on the verification results, 5 clones carrying a deletion in the ychE gene were selected.
Пример 2. Отбор наиболее продуктивного клонаExample 2. Selection of the most productive clone
Для оценки влияния делеции гена ychE на продукцию L-треонина проводят пробирочную ферментацию пяти отобранных клонов, в качестве контрольного штамма используют родительский штамм ВКПМ В-13207.To assess the effect of deletion of the ychE gene on L-threonine production, test-tube fermentation of five selected clones is carried out; the parental strain VKPM B-13207 is used as a control strain.
Биомассу клеток наращивают путем инкубирования на чашках со средой LA в течение 24 часов при 37°С. Для приготовления инокулята используют посевную среду следующего состава (мас. %)Cell biomass is increased by incubation on plates with LA medium for 24 hours at 37 ° C. To prepare the inoculum, use the inoculum medium of the following composition (wt%)
В пробирки объемом 50 мл с рабочим объемом 5 мл посевной среды вносят биомассу клеток до стартового значения оптической плотности равной ОП660нм 0,1 ед. Пробирки инкубируют на роторной качалке в течение 5 часов при 37°С и скорости перемешивания 220 об/мин. Для основного процесса ферментации используют среду следующего состава (мас. %):In test tubes with a volume of 50 ml with a working volume of 5 ml of the inoculum medium, the biomass of the cells is added to the starting value of the optical density equal to OD 660 nm 0.1 units. The tubes are incubated on a rotary shaker for 5 hours at 37 ° C and a stirring speed of 220 rpm. For the main fermentation process, a medium of the following composition (wt%) is used:
Растворы глюкозы, сульфата марганца и сульфата магния стерилизуют отдельно автоклавированием при 121°С в течение 40 мин. Навески СаСО3 по 40 мг стерилизуют в стеклянных пробирках автоклавированием при 121°С в течение 20 мин. рН доводят до значения 7,0. Раствор сульфата железа стерилизуют фильтрованием через мембрану диаметром пор 22 мкм.Solutions of glucose, manganese sulfate and magnesium sulfate are sterilized separately by autoclaving at 121 ° C for 40 minutes. Weighed portions of CaCO 3 , 40 mg each, are sterilized in glass tubes by autoclaving at 121 ° C for 20 min. The pH is adjusted to 7.0. The ferrous sulfate solution is sterilized by filtration through a 22 µm membrane.
Полученный инокулят вносят в пробирки объемом 50 мл с рабочим объемом 2 мл ферментационной среды до стартовой оптической плотности ОП660нм 0,1 ед. Клетки культивируют в течение 24 часов при 37°С на роторной качалке - 220 об/мин.The resulting inoculum is introduced into 50 ml test tubes with a working volume of 2 ml of the fermentation medium until the starting optical density OD 660 nm is 0.1 units. The cells are cultured for 24 hours at 37 ° C on a rotary shaker - 220 rpm.
После выращивания количество накопленного в среде L-треонина определяют с методом ВЭЖХ (Waters 2695, Alliance). Результаты ферментации пяти клонов приведены в табл. 1.After cultivation, the amount of L-threonine accumulated in the medium is determined by HPLC (Waters 2695, Alliance). The results of fermentation of five clones are shown in table. 1.
Как видно из табл. 1, клон 1, содержащий делецию гена ychE, накапливает большее количество L-треонина по сравнению с контрольным штаммом ВКПМ В-13207. Отобранный клон 1 был депонирован в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика как Escherichia coli ВКПМ В-13515.As you can see from the table. 1, clone 1, containing the deletion of the ychE gene, accumulates more L-threonine as compared to the control strain VKPM B-13207. The selected clone 1 was deposited in the Bioresource Center All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (BRC VKPM) NRC "Kurchatov Institute" - GosNIIgenetics as Escherichia coli VKPM B-13515.
Штамм Escherichia coli ВКПМ В-13515 характеризуется следующими признаками:The Escherichia coli strain VKPM B-13515 is characterized by the following features:
Культурально-морфологические характеристикиCultural and morphological characteristics
Грамм-отрицательная бактерия. Суточная культура в жидкой LB представлена слабо подвижными клетками округлой формы 1 мкм в диаметре. При культивировании на среде LA в течение 18-24 часов при 37°С образуются круглые, беловатый, полупрозрачные на свет колонии 1-2 мм, поверхность колонии гладкая, края ровные или слегка волнистые, центр колоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгируется. При культивировании агаризованной среде Эндо (мас. %: пептон - 1, лактоза - 1, Na2SO3 - 0,33, K2HPO4 - 0,25, фуксин основной - 0,03, агар-агар - 2%, вода - остальное) при 37°С образуются колонии, круглой формы с ровным четко очерченным краем малиново-красного цвета с металлическим блеском. Диаметр колоний 0,5-1,5 мм.Gram negative bacteria. Daily culture in liquid LB is represented by weakly motile cells of a round shape, 1 μm in diameter. When cultured on LA medium for 18-24 hours at 37 ° C, round, whitish, translucent colonies 1-2 mm are formed, the surface of the colony is smooth, the edges are even or slightly wavy, the center of the colonies is raised, the structure is homogeneous, the consistency is pasty, easy emulsifies. When cultivating Endo agar medium (wt%: peptone - 1, lactose - 1, Na 2 SO 3 - 0.33, K 2 HPO 4 - 0.25, basic fuchsin - 0.03, agar-agar - 2%, water - the rest) at 37 ° C, colonies are formed, round in shape with an even, well-defined edge of crimson-red color with a metallic sheen. The diameter of the colonies is 0.5-1.5 mm.
Физиолого-биохимические характеристикиPhysiological and biochemical characteristics
Факультативный анаэроб. Сахара не сбраживает. Ассимилирует: D-глюкозу, L-арабинозу, D-маннитол, D-ксилозу, в меньшей мере: D-галактозу, D-лактозу. Отсутствует способность к гидролизу крахмала. Отстутствует потребность в факторах роста. Штамм устойчив к хлорамфениколу. Оптимальное значение рН для роста 7,2-7,4. Не растет при температурах свыше 45°С. Оптимальная температура роста 37°С. Штамм не патогенен.Optional anaerobic. Sugar does not ferment. Assimilates: D-glucose, L-arabinose, D-mannitol, D-xylose, to a lesser extent: D-galactose, D-lactose. There is no ability to hydrolyze starch. There is no need for growth factors. The strain is resistant to chloramphenicol. The optimum pH for growth is 7.2-7.4. Does not grow at temperatures above 45 ° C. The optimum growth temperature is 37 ° C. The strain is not pathogenic.
Заявляемый штамм Escherichia coli ВКПМ В-13515 с инактивированным геном ychE, способный синтезировать до 17,2 г/л L-треонина при культивировании в пробирках.The inventive strain of Escherichia coli VKPM B-13515 with inactivated ychE gene, capable of synthesizing up to 17.2 g / l of L-threonine when cultured in test tubes.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019137673A RU2728251C1 (en) | 2019-11-22 | 2019-11-22 | Escherichia coli strain with inactivated yche gene - l-threonine producer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2019137673A RU2728251C1 (en) | 2019-11-22 | 2019-11-22 | Escherichia coli strain with inactivated yche gene - l-threonine producer |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2728251C1 true RU2728251C1 (en) | 2020-07-28 |
Family
ID=72085914
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019137673A RU2728251C1 (en) | 2019-11-22 | 2019-11-22 | Escherichia coli strain with inactivated yche gene - l-threonine producer |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2728251C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2758269C1 (en) * | 2020-10-05 | 2021-10-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Escherichia coli strain with the inactivated lysp gene - l-threonine producer |
| RU2774071C1 (en) * | 2021-10-01 | 2022-06-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт") | ESCHERICHIA COLI STRAIN WITH INACTIVATED sdaC GENE - L-THREONINE PRODUCER |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5175107A (en) * | 1988-10-25 | 1992-12-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacterial strain of escherichia coli bkiim b-3996 as the producer of l-threonine |
| RU2212447C2 (en) * | 2000-04-26 | 2003-09-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Strain escherichia coli as producer of amino acid (variants) and method for preparing amino acid (variants) |
| RU2546237C1 (en) * | 2013-11-07 | 2015-04-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроогранизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Recombinant strain of escherichia coli l-threonine-producer |
-
2019
- 2019-11-22 RU RU2019137673A patent/RU2728251C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5175107A (en) * | 1988-10-25 | 1992-12-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Bacterial strain of escherichia coli bkiim b-3996 as the producer of l-threonine |
| RU2212447C2 (en) * | 2000-04-26 | 2003-09-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Strain escherichia coli as producer of amino acid (variants) and method for preparing amino acid (variants) |
| RU2546237C1 (en) * | 2013-11-07 | 2015-04-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроогранизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Recombinant strain of escherichia coli l-threonine-producer |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2758269C1 (en) * | 2020-10-05 | 2021-10-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Escherichia coli strain with the inactivated lysp gene - l-threonine producer |
| RU2774071C1 (en) * | 2021-10-01 | 2022-06-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт") | ESCHERICHIA COLI STRAIN WITH INACTIVATED sdaC GENE - L-THREONINE PRODUCER |
| RU2787585C1 (en) * | 2022-10-18 | 2023-01-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Escherichia coli strain with inactive yhje gene producing l-threonine |
| RU2787583C1 (en) * | 2022-10-18 | 2023-01-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Escherichia coli strain with inactive yqeg gene producing l-threonine |
| RU2817252C1 (en) * | 2023-09-20 | 2024-04-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" | Strain escherichia coli - producer of l-threonine |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2144564C1 (en) | Dna fragment rhtb encoding synthesis of protein rhtb that determines resistance of bacterium escherichia coli to l-homoserine and method of l-amino acid producing | |
| RU2148642C1 (en) | Dna rhtc fragment encoding synthesis of rhtc protein that determines enhanced resistance of bacterium escherichia coli to l-threonine and method of l-amino acid producing | |
| ES2382473T3 (en) | L-threonine production procedure using a microorganism that has the inactivated galR gene | |
| KR100792095B1 (en) | - - genetically engineered l-tryptophan producing recombinant escherichia coli which has originally l-phenylalanine production character and the method for producing l-tryptophan using the microorganism | |
| US20090093030A1 (en) | fadR KNOCK-OUT MICROORGANISM AND METHODS FOR PRODUCING L-THREONINE | |
| RU2245919C2 (en) | Method for producing l-amino acid, strain escherichia coli tdh7δmlc::cat/pprt614 as producer of l-threonine | |
| CN1351660A (en) | directed evolution of microorganisms | |
| CN100582220C (en) | E.coli mutant containing mutant genes related with tryptophan biosynthesis and production method of tryptophan by using the same | |
| RU2697499C1 (en) | Bacterium of the form escherichia coli - an l-threonine producer, a method for microbiological synthesis of l-threonine using it | |
| RU2728251C1 (en) | Escherichia coli strain with inactivated yche gene - l-threonine producer | |
| CN109666617A (en) | The production bacterial strain and its construction method of a kind of L- homoserine and application | |
| RU2731282C1 (en) | Escherichia coli strain with inactivated ttdt gene - l-threonine producer | |
| RU2748676C1 (en) | Escherichia coli strain with inactivated ydgi gene - producer of l-threonine | |
| RU2787583C1 (en) | Escherichia coli strain with inactive yqeg gene producing l-threonine | |
| RU2774071C1 (en) | ESCHERICHIA COLI STRAIN WITH INACTIVATED sdaC GENE - L-THREONINE PRODUCER | |
| RU2758269C1 (en) | Escherichia coli strain with the inactivated lysp gene - l-threonine producer | |
| RU2787585C1 (en) | Escherichia coli strain with inactive yhje gene producing l-threonine | |
| RU2775206C1 (en) | Escherichia coli strain with inactivated yjem gene - l-threonine producer | |
| RU2728242C1 (en) | Escherichia coli strain - l-threonine producer | |
| WO2005075626A1 (en) | MICROORGANISM PRODUCING L-THREONINE HAVING INACTIVATED tyrR GENE, METHOD OF PRODUCING THE SAME AND METHOD OF PRODUCING L-THREONINE USING THE MICROORGANISM | |
| RU2697219C1 (en) | Recombinant escherichia coli bacterium strain - l-threonine producer | |
| US20090298138A1 (en) | Microorganism producing l-threonine having an inactivated lysr gene, method for producing the same and method for producing l-threonine using the microorganism | |
| RU2339699C2 (en) | RECOMBINANT PLASMID pT7ΔpckA::loxpcat, PROVIDING SYNTHESIS OF L-THREONINE IN CELLS OF Escherichia coli, AND RECOMBINANT STRAIN Escherichia coli FTR2717 (KCCM-10475)-PRODUCER OF L-THREONINE | |
| RU2817252C1 (en) | Strain escherichia coli - producer of l-threonine | |
| JP4582573B2 (en) | Method for producing pyruvic acid and method for producing L-valine |