RU2726208C1 - Способ определения реологических свойств крови - Google Patents
Способ определения реологических свойств крови Download PDFInfo
- Publication number
- RU2726208C1 RU2726208C1 RU2020111242A RU2020111242A RU2726208C1 RU 2726208 C1 RU2726208 C1 RU 2726208C1 RU 2020111242 A RU2020111242 A RU 2020111242A RU 2020111242 A RU2020111242 A RU 2020111242A RU 2726208 C1 RU2726208 C1 RU 2726208C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- deflection
- depth
- force
- blood
- membrane
- Prior art date
Links
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 36
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 38
- 238000000594 atomic force spectroscopy Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 35
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 abstract description 17
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 238000000418 atomic force spectrum Methods 0.000 description 11
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 10
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 10
- 102000005890 Spectrin Human genes 0.000 description 9
- 108010019965 Spectrin Proteins 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000518 rheometry Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000028399 Critical Illness Diseases 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XKVYZLLWKHGKMT-BEJOYRPXSA-N Gemin D Natural products O([C@@H]([C@@H](O)C=O)[C@@H]1[C@@H](O)COC(=O)c2c(c(O)c(O)c(O)c2)-c2c(O)c(O)c(O)cc2C(=O)O1)C(=O)c1cc(O)c(O)c(O)c1 XKVYZLLWKHGKMT-BEJOYRPXSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 238000005315 distribution function Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000005489 elastic deformation Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 229930192479 gemin Natural products 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
- G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу определения реологических свойств крови. Способ включает оценку деформируемости эритроцитов под давлением внешней силы без нарушения целостности клеток. Осуществляют исследование образца клеток в нативной среде с использованием атомно-силовой спектроскопии путем пошагового прогиба мембраны каждого эритроцита с помощью индентора до глубины h=1000-1200 нм, с шагом Δh=4-5 нм, фиксируют зависимость F(h), где F- сила воздействия, h- глубина прогиба, i=1, …N, N - число точек регистрации, определяют минимальную величину прогиба h, при которой зависимость силы воздействия от глубины прогиба перестает соответствовать формуле Герцагде F- сила воздействия, Е - модуль Юнга мембраны эритроцита, R - радиус индентора, h - глубина прогиба, определяют вероятность Р отклонения hот контрольных значений h=760±280 нм, соответствующих физиологическим условиям существования эритроцитов. Величина Р более 20% свидетельствует об ухудшении реологических свойств крови. Предложенный способ позволяет оценить упругие свойства мембран конкретных эритроцитов и может быть использован для диагностики различных патологических реологических процессов в крови. 5 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к способам оценки реологических свойств крови, в частности деформируемости эритроцитов (ДЭ), и может быть использовано для диагностики различных патологических реологических процессов в крови.
Уровень техники
К реологическим показателям крови относится, в частности, ДЭ. Для исследования ДЭ используются такие экспериментальные методы как центрифугирование, фильтрация, реоскопия. Однако они либо недостаточно информативны, либо трудоемки по выполнению.
Одним из наиболее удобных методов измерения ДЭ является лазерная дифрактометрия эритроцитов в сдвиговом потоке (эктацитометрия) (Bessis М., Mohandas N.A «Diffractometric method for the measurement of cellular deformability.» Blood Cells, 1975, v. 1, p. 307-313; Musielak M. «Red blood cell-deformability measurement: Review of techniques.» Clinical Hemorheology and Microcirculation, 2009, v. 42, p. 47-64). В частности известен метод, который позволяет провести оперативную и информативную оценку ДЭ, основанный на компьютерной эктацитометрии. Данный метод реализован в приборе, получившим название эктацитометр (А.П. Вохминцев, P.P. Сайфиев, О.В. Фролова «Деформируемость эритроцитов и способы ее клинической диагностики.» Современные наукоемкие технологии. - 2004. - №3 - С. 54-55).
Однако данный метод позволяют оценить среднюю деформируемость в ансамбле клеток, не позволяя провести измерения параметров конкретных клеток.
Известен способ оценки клеточной деформируемости с помощью атомной силовой микроскопии и спектроскопии, который базируется на измерении модуля Юнга мембран эритроцитов (Giovanna Tomaiuolo. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics // (Biomicrofluidics. 2014 Sep; 8(5): 051501. doi: 10.1063/1.4895755). Этот метод, основан на математическом анализе опытных данных и предположении, что коэффициент жесткости, модуль Юнга мембраны эритроцита одинаков для всех точек мембраны и не зависит от глубины прогиба.
Наиболее близким к заявляемому способу по совокупности существенных признаков является Methods and devices for assessing cell properties under controlled gas environments (US2018267021), в котором описан метод изучения ДЭ при перфузии жидкости, содержащей клетки крови, через специальную систему с несколькими последовательными сужениями, в том числе имеющими диаметр сужения меньше, чем диаметр клеток. Такая система является моделью неоднородного силового воздействия на эритроциты по ходу их движения в микроциркуляторном русле и позволяет изучать особенности биомеханических свойств клеток в условиях неодинакового прогиба мембран в результате постепенного увеличения на них внешнего давления. Предполагается, что данный метод может быть использован при изучении деформируемости клеток крови как в норме, так и при различных заболеваниях, при гематологических, терапевтических процедурах, в результате действия фармхимпрепаратов, различных газов.
Однако данный метод не позволяет оценивать свойства индивидуальных клеток крови, в частности упругих свойств мембран конкретных эритроцитов.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи определения реологических свойств крови на модели выявления патологических изменений ДЭ.
Использование в лабораторной и клинической практике заявляемого способа позволяет достичь нескольких технических результатов:
приближение исследуемого объекта к нативным условиям существования за счет сохранения целостности клетки и клеточной мембраны при исследовании;
обеспечение моделирования прогиба мембраны эритроцита, соизмеримого с величиной деформации при физиологических условиях в микроциркуляторном русле, за счет последовательного (шаг Δh=4-5 нм) прогиба мембраны эритроцита с помощью индентора на глубину от 10 до 1200 нм;
измерение и оценка глубины однородного линейного прогиба мембран эритроцитов в различных зонах клетки и измерение локального модуля Юнга мембраны.
возможность количественной оценки степени влияния патологического фактора на ДЭ и соответственно на реологические свойства крови.
Указанные технические результаты при осуществлении изобретения достигаются за счет того, что также как в известном способе, исследуют биомеханические эффекты в результате постепенной, последовательной ДЭ под давлением внешней силы, без нарушения целостности клеток.
Особенность заявляемого способа заключается в том, что прогиб мембраны эритроцита в капилляре in vivo моделируют in vitro индивидуальным четко пошаговым (шаг Δh=4-5 нм) локальным прогибом мембраны на глубину до 1000-1200 нм, что соизмеримо с физиологической деформацией в микроциркуляторном русле, путем последовательного силового воздействия индентора на клетку. Фиксируют результаты полученной зависимости Fi(hi)эксперим (силовой кривой), где Fi - сила воздействия, hi - глубина прогиба, i=1, …, N, N - число точек регистрации. Определяют минимальную величину прогиба hHz, при которой зависимость силы воздействия от глубины прогиба перестает соответствовать формуле Герца где: FГерц - сила воздействия, Е - модуль Юнга мембраны эритроцита, R - радиус индентора, h - глубина прогиба. Определяют вероятность Р отклонения hHz от контрольных значений hНzконтр=760±280 нм, соответствующих физиологическим условиям существования эритроцитов. Величина Р более 20% свидетельствует об ухудшении реологических свойств крови.
Раскрытие сущности изобретения
Эффективность периферического кровотока во многом определяется реологическими свойствами крови. Реологические параметры крови определяются прежде всего эритроцитами, которые составляют около 98% от общего объема форменных элементов крови. Изменения реологических свойств клеток крови могут привести к ухудшению ее текучести, блокированию участков капиллярной сети, недостаточному снабжению тканей организма кислородом. В микроциркуляторном русле эритроциты демонстрируют способность к деформируемости, т.е. к обратимому изменению размеров и формы при их прохождении через кровеносные капилляры. ДЭ - это способность эритроцитов изменять свою форму под действием приложенной внешней силы без гемолиза, то есть без разрыва мембраны. Диаметр эритроцитов (Dэp) составляет 7-10 мкм, в то время как диаметр мелких капилляров (Dкап) равен 3-5 мкм, что значительно меньше диаметра эритроцитов. Поэтому при прохождении в микроциркуляторном русле клетки крови должны быть способными к упругой деформации.
ДЭ является одним из основных микрореологических параметров крови (Шилов A.M., Авшалумов А.С., Синицина Е.Н., Марковский В.Б., Полещук О.И. «Изменения реологических свойств крови у больных с метаболическим синдромом.» Регулярные выпуски «РМЖ» №4 от 28.02.2008. С. 200; Левтов В.А., Регирер С.А., Шадрина Н.Х. «Реология крови», М.: Медицина, 1982; Муравьев А.В., Чепоров С.В. «Гемореология (экспериментальные и клинические аспекты реологии крови)» Ярославль, 2009).
При воздействии различных физико-химических факторов, а также при ряде патологических состояний деформационная способность эритроцитов претерпевает существенные изменения. Контроль ДЭ важен при диагностике и лечении заболеваний различного генеза.
ДЭ при прохождении по кровяному руслу обусловлена упругими свойствами мембраны этих клеток, в частности, наличием особой белковой структуры - спектринового матрикса, выстилающей внутреннюю сторону мембраны и называемой цитоскелетом (Нагорнов Ю.С. «Моделирование морфологии и жесткости мембраны эритроцитов после фемтосекундного лазерного облучения» //Российский журнал биомеханики. 2013. Т. 17. №3 (61), с. 112-121).
Под действием гидравлического давления эритроцит в капилляре изгибается за счет упругости спектрина. С учетом диаметра капилляра и эритроцита, каждый эритроцит должен изогнуться с каждой стороны и изменить поперечный размер в среднем на ΔDэр ср=1,2±0,5 мкм.
Схема деформации эритроцита при прохождении их в капилляре при условии, что диаметр капилляра меньше диаметра эритроцита, представлена на Фиг. 1. Механические характеристики мембран эритроцитов, в частности модуль Юнга, должны оставаться постоянными при таких прогибах, что соответствует сохранности конструкции мембраны после прохождения клетки через микрососуды. Нарушение же механических характеристик свидетельствует о нарушении структурных характеристик объекта, о нарушении линейности среды. В этом случае при выходе из капилляра эритроциты могут необратимо изменить механические свойства, что повлияет на реологические свойства крови.
При действии физико-химических факторов на кровь, в том числе при реанимационных мероприятиях, могут происходить конформационные изменения мембранных структур, в частности спектринового матрикса, белковых комплексов, что также приводит к изменению механических свойств эритроцитов и к уменьшению их деформируемости. Это, в свою очередь, приводит к нарушению прохождения эритроцитов через капилляры, ухудшает газообмен, а также может привести к образованию тромбов в микрососудах. В конечном счете, это может вызвать гипоксию тканей и даже их некроз.
ДЭ можно оценивать с помощью атомно-силовой спектроскопии, базируясь на измерении модуля Юнга мембран. В этом случае исследование механических свойств мембран эритроцитов сводится к оценке модуля Юнга мембраны (Е). Модуль Юнга вычисляют из формулы Герца (формула 1) (Giovanna Tomaiuolo. «Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics» //(Biomicrofluidics. 2014 Sep; 8(5): 051501. doi: 10.1063/1.4895755).
В формуле Герца подразумевается, что модуль Юнга (Е), характеризующий механические свойства мембраны клетки, является постоянной величиной (Е=const). То есть эта формула применима только для линейных однородных сред, у которых модуль Юнга не зависит от глубины прогиба мембраны.
Мембрана эритроцита в реальности не является однородной средой. Тем не менее, для оценки механических свойств мембран клеток возможно использование формулы Герца или аналогичных формул с учетом геометрии кантилевера.
Сущность заявляемого способа состоит в том, что оценивают минимальную глубину прогиба мембраны hHz, за пределами которого мембрану уже не правомерно рассматривать как однородную линейную упругую среду и соответственно уже нельзя применять формулу Герца (1), в которой модуль Юнга зависит только от собственных биомеханических свойств мембран клеток и не зависит от глубины прогиба мембран.
При h<hHz применима формула Герца (1) для описания деформации мембраны, в которой модуль Юнга остается постоянной величиной (Е=const), другими словами упругие свойства мембраны эритроцита не изменяются по мере прогиба, что свидетельствует об отсутствии нарушений спектринового матрикса. При h>hHz формула Герца (1) уже не применима, поскольку модуль Юнга мембраны не будет постоянной величиной, а будет зависеть от глубины прогиба E(h). Это будет свидетельствовать об изменении структуры и упругих свойств спектринового матрикса. ДЭ в капилляре на величину большую, чем hHz вызовет изменение структуры и упругих свойств спектринового матрикса, что приведет к изменению модуля Юнга мембраны клетки. В результате накопительного эффекта увеличения модуля Юнга мембраны при многократном прохождении каждого эритроцита в капиллярах произойдет снижение деформируемости клеток, а следовательно, изменение реологических свойств крови. Чем меньше глубина hHz, тем больше вероятность снижения ДЭ и нарушения реологических свойств крови.
Величину hHz можно рассматривать как биофизический параметр, описывающий механические свойства мембран эритроцитов. Уменьшение величины hHz в исследуемых образцах (эритроциты при патологии) по сравнению с контрольными (клетки без патологии) свидетельствует о нарушении биомеханических свойств эритроцитов (в частности, упругих характеристик спектринового матрикса), а следовательно, свидетельствует об уменьшении ДЭ, что влияет на реологические свойства крови.
Способ осуществляют следующим образом.
На стекло с полилизином осаждают монослой эритроцитов в фосфатном буфере (рН=7,4), при этом фиксаторы (например, глютаровый альдигид) не используют. Это позволяет приблизить условия измерения параметров деформируемости к нативным условиям существования эритроцитов в крови. Измерение экспериментальных силовых кривых Fi(hi)эксперим проводят с помощью атомно-силовой спектроскопии в жидкостной ячейке. Радиус индентора (зонда) R должен быть не меньше размера ячейки спектринового матрикса (характерный размер 120-150 нм), чтобы зонд мог локально прогнуть мембрану, но при этом не повредил липидный бислой. Оптимальный радиус зонда 150-200 нм.
Атомно-силовой микроскоп позволяет получить изображения клеток в монослое, выбрать среди них исследуемый эритроцит, измерить силовую кривую Fi(hi)эксперим в выбранной локальной области эритроцита. Для этого индентор подводят к поверхности клетки и под действием приложенной к нему силы начинают продавливать мембрану с шагом Δh=4-5 нм. Величину силы устанавливают так, чтобы максимальный прогиб достиг 1000-1200 нм, что соответствует деформации мембраны при физиологических условиях. Для этого устанавливают значение максимальной силы давления на мембрану со стороны индентора 20-50 нН.
На Фиг. 2А представлен прогиб мембраны на глубину h. На Фиг. 2Б схематично представлен пошаговый прогиб мембраны (шаг Δh=4-5 нм) под действием силы со стороны индентора. Показаны три последовательные стадии прогиба.
На Фиг. 3 представлены экспериментальная силовая кривая, полученная с помощью метода атомно-силовой спектроскопии (АСС) в виде отдельных точек Fi(hi)эксперим.
Для определения hHz аппроксимируют экспериментальные данные Fi(hi)эксперим теоретической функцией Fаппроксим(h) вида:
где:
h - глубина прогиба мембраны,
а - коэффициент аппроксимации, зависящий от модуля Юнга мембраны,
b - коэффициент аппроксимации, определяющий форму силовой кривой.
Подбирают коэффициенты аппроксимации а и b аппроксимирующей функции (2). Для нахождения этих коэффициентов и соответственно аппроксимирующей функции (2) используют метод нелинейной регрессии на базе стандартных программ статистической обработки экспериментальных данных (например, Origin Pro (USA)). При аппроксимации статус зависимой переменной присваивают Fi(hi)эксперим. Неизвестными параметрами аппроксимации являются а и b. Эти искомые коэффициенты находят в процессе аппроксимации так, чтобы кривая аппроксимации Fаппроксим(h) описывала бы экспериментальные данные Fi(hi)эксперим наилучшим образом (R-square>0,98).
На Фиг. 3 проиллюстрирована последовательность расчета глубины прогиба hHz. Сначала аппроксимацию экспериментальных данных начинают проводить для небольших глубин прогиба h1=100-150 нм. Находят коэффициент аппроксимации b1 и сопоставляют его с показателем степени 1,5 в формуле Герца (1). Для экспериментальных данных, представленных на Фиг. 3, при величине прогиба h1=150 нм получено, что коэффициент аппроксимации b1=1,5, что совпадает с показателем степени в формуле Герца (1). То есть экспериментальная кривая в диапазоне глубин прогиба от 0 до 150 нм описывается формулой Герца.
Далее увеличивают диапазон глубин прогиба. На Фиг. 3 указан диапазон до h2=250 нм, для которого найдено, что аппроксимирующий коэффициент - 1,5. То есть экспериментальная кривая в диапазоне глубин прогиба от 0 до 250 нм также описывается формулой Герца, причем рассчитанные модули Юнга совпадают при этих величинах прогибов, E1=Е2.
Однако при увеличении глубины прогиба кривая аппроксимации имеет показатель степени больше, чем 1,5. Так при h3=340 нм коэффициент b3=1,55. Это означает, что формула Герца уже не может адекватно описывать экспериментальные данные. Модуль Юнга (Е) уже не является постоянной величиной, он увеличивается, Е3>Е2, что свидетельствует о конформационных изменениях спектринового матрикса при достигнутой величине прогиба.
Таким образом, в данном примере установлено, что hHz=250 нм. Именно эта величина - минимальная глубина прогиба, при которой зависимость силы воздействия от глубины прогиба перестает соответствовать формуле Герца (1).
Установлено, что величина hHz зависит от состояния эритроцитов в результате воздействия на них различных факторов.
Определение hHzконтр для контрольных (нормальных) эритроцитов
В ходе экспериментов были определены контрольные (нормальные) значения hHzконтр для эритроцитов, полученных из крови здоровых доноров. Для этого были приготовлены по 3 образца (монослои клеток на трех стеклах с полилизином) для измерений hHzконтр у 10 здоровых доноров. В каждом образце были измерены hHzконтр для 30 клеток. Измерения показали, что hHzконтр=760±280 нм. Эта величина соизмерима с деформацией клетки в капилляре. Это означает, что после прохождения клеток по капилляру, мембраны эритроцитов не изменяют свои упругие свойства.
Измерение hHz эритроцитов важно для пациентов с различными заболеваниями, в процессе и после терапевтического или хирургического лечения. Особенно важно определение hHz для пациентов, находящихся в критическом состоянии - при сепсисе, при химиотерапии, при лучевой терапии. Наряду с модулем Юнга, величина hHz характеризует биомеханические свойства эритроцитов, а соответственно, деформационную способность клеток. Кроме того измерения hHz важны для модельных экспериментов по влиянию различных фармхимпрепаратов на биомеханические свойства клеток, а именно на ДЭ.
Для определения степени деформируемости мембран эритроцитов каждого образца крови величину hHz измеряют для 70-100 клеток. Этого количества клеток необходимо и достаточно для отражения свойств всего образца клеток.
Вычисляют средние значения hHzcp и средние квадратичные отклонения σHz этих глубин.
Вычисляют вероятность Р отклонения величин hHz в исследуемом образце от контрольных значений hHzконтр. Делают вывод о степени влияния данного фактора на ДЭ в исследуемом образце крови. Это позволяет дать количественную оценку пригодности для трансфузии донорской эритроцитарной взвеси при ее длительном хранении, пригодности крови для перфузии.
Величина вероятности Р указывает на факт отклонения глубины hHz от контрольных (нормальных) значений и позволяет количественно оценить степень воздействия данного фактора на биомеханические свойства, а именно на ДЭ:
величина Р более 20% свидетельствует о сильном воздействии фактора на величину hHz, а следовательно, на ДЭ;
Примеры осуществления изобретения
1. Изменение hHz при действии глютарового альдегида (ГА) различной концентрации на эритроциты in vitro.
ГА используют для фиксации мембран клеток. В результате его воздействия происходит кластеризация белков, в частности он воздействует на актиновые комплексы и белки полосы band 3. В результате воздействия ГА мембраны становятся жестче, модуль Юнга увеличивается.
Происходят изменения и величины hHz. Для проведения опытов использовали различные концентрации ГА.
Раствор ГА в концентрации 0% (контроль), 0.4%, 0.8% и 1.6% добавляли к эритроцитам в соотношении 1:1. Клеточную суспензию инкубировали в течение 5 минут. Затем на 4-х раздельных стеклах с полилизином осаждали из соответствующих суспензий с ГА различной концентрации монослой эритроцитов в фосфатном буфере (рН=7,4). Измерение экспериментальных силовых кривых Fi(hi)эксперим проводили с помощью атомно-силовой спектроскопии в жидкостной ячейке. Радиус зонда R=150 нм.
Измеряли силовую кривую Fi(hi)эксперим в выбранной локальной области эритроцита. Для этого индентор подводили к поверхности клетки и под действием приложенной к нему силы, продавливали мембрану с шагом Δh=4-5 нм (Фиг. 1А, Б). Величину силы устанавливали так, чтобы максимальный прогиб достиг 1000-1200 нм. Для этого устанавливали значение максимальной силы давления на мембрану со стороны кантилевера 30-50 нН. Значения hHz определяли на основе 100 силовых кривых, полученных для каждой концентрации ГА.
В таблице приведены значения hHz для различных значений концентраций ГА.
Для каждой концентрации ГА была определена вероятность Р (%) отклонения глубины hHz от контрольных (нормальных) значений, что позволило количественно оценить степень воздействия ГА в заданной концентрации на биомеханические свойства, а именно на ДЭ.
Для этого были построены графики функций распределения для величин hHz, для эритроцитов, на которые подействовали ГА с различной концентрацией (Фиг. 4). Около каждой кривой указана соответствующая концентрация ГА и указана вероятность того, что hHz>310 нм. Критерием выбора этой величины является то, что в контроле 95% клеток имеют hHz>310 нм, а соответственно hHz<310 нм только у 5% клеток. С ростом концентрации ГА доля клеток с hHz>310 нм уменьшается, а соответственно вероятность отклонения от контроля увеличивается, а следовательно возрастает вероятность снижения деформируемости и изменения реологических свойств крови.
Для ГА в концентрации 0,4% вероятность отклонения глубины hHz от нормальных (контрольных) значений составила Р=3%, а для ГА в концентрации 0,8% Р=10%, что свидетельствует о слабом/умеренном влиянии ГА в этом диапазоне концентраций на ДЭ. Для ГА в концентрации 1,6% величина Р=21%, что свидетельствует о сильном влиянии ГА на ДЭ.
2. Изменение hHz при действии гемина различной концентрации на эритроциты
Гемин образуется при действии соляной кислоты на гемоглобин. При окислении гемоглобина двухвалентное железо превращается в трехвалентное. Наличие гемина в крови может вызвать патологические эффекты.
Авторами были проведены модельные опыты, в которых в кровь in vitro добавляли раствор гемина. Для приготовления раствора 50 мг порошка гемина растворяли в 1 мл 0,5 М NaOH в дистиллированной воде. Затем к 1 части этого базового раствора добавляли 5 мл дистиллированной воды. 35 мкл этого раствора гемина добавляли в микроветты, содержащие 140 мкл цельной крови. Итоговая концентрация гемина в крови составила 2 мМ. Время инкубации гемина в крови составила 15 мин.
На Фиг. 5 представлен пример силовой кривой для мембраны одного эритроцита: экспериментальные данные (синие точки) и кривая аппроксимации (красная линия). Для мембраны данной клетки формула Герца перестает адекватно описывать силовую кривую на глубине прогиба, начиная с hHz=159 нм. В результате измерения силовых кривых для мембран 100 клеток получено, что после действия гемина hHz=420±110 нм.
Была определена вероятность Р (%) отклонения глубины hHz от контрольных (нормальных) значений, что позволило количественно оценить степень воздействия гемина в заданной концентрации и при заданном времени воздействия на биомеханические свойства, а именно на ДЭ. Р=59%, что свидетельствует о сильном влиянии гемина в данной концентрации на ДЭ.
Claims (3)
- Способ определения реологических свойств крови, включающий оценку деформируемости эритроцитов под давлением внешней силы без нарушения целостности клеток, отличающийся тем, что осуществляют исследование образца клеток в нативной среде с использованием атомно-силовой спектроскопии путем пошагового прогиба мембраны каждого эритроцита с помощью индентора до глубины h=1000-1200 нм, с шагом Δh=4-5 нм, фиксируют зависимость Fi(hi)эксперим, где Fi - сила воздействия, hi - глубина прогиба, i=1, …N, N - число точек регистрации, определяют минимальную величину прогиба hHz, при которой зависимость силы воздействия от глубины прогиба перестает соответствовать формуле Герца
- где FГерц - сила воздействия, Е - модуль Юнга мембраны эритроцита, R - радиус индентора, h - глубина прогиба, определяют вероятность Р отклонения hHz от контрольных значений hHzконтр=760±280 нм, соответствующих физиологическим условиям существования эритроцитов, величина Р более 20% свидетельствует об ухудшении реологических свойств крови.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020111242A RU2726208C1 (ru) | 2020-03-18 | 2020-03-18 | Способ определения реологических свойств крови |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020111242A RU2726208C1 (ru) | 2020-03-18 | 2020-03-18 | Способ определения реологических свойств крови |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2726208C1 true RU2726208C1 (ru) | 2020-07-09 |
Family
ID=71510549
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020111242A RU2726208C1 (ru) | 2020-03-18 | 2020-03-18 | Способ определения реологических свойств крови |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2726208C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2750362C1 (ru) * | 2020-12-31 | 2021-06-28 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Тюменский Государственный Медицинский Университет" Министерства Здравоохранения Российской Федерации | Способ определения степени венозной недостаточности от деформируемости эритроцитов |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2466401C1 (ru) * | 2011-03-15 | 2012-11-10 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет"(НИУ "БелГУ") | Способ определения упругости клеток крови |
US20180267021A1 (en) * | 2014-12-05 | 2018-09-20 | Carnegie Mellon University | Methods and devices for assessing cell properties under controlled gas environments |
-
2020
- 2020-03-18 RU RU2020111242A patent/RU2726208C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2466401C1 (ru) * | 2011-03-15 | 2012-11-10 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет"(НИУ "БелГУ") | Способ определения упругости клеток крови |
US20180267021A1 (en) * | 2014-12-05 | 2018-09-20 | Carnegie Mellon University | Methods and devices for assessing cell properties under controlled gas environments |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
KOZLOVA E. et al. Nonlinear Biomechanical Characteristics of Deep Deformation of Native RBC Membranes in Normal State and under Modifier Action, Scanning, 2018, v. 2018, Article ID 18105585, p. 1-13. * |
KOZLOVA E. et al. Nonlinear Biomechanical Characteristics of Deep Deformation of Native RBC Membranes in Normal State and under Modifier Action, Scanning, 2018, v. 2018, Article ID 18105585, p. 1-13. ЧЕРНЫШ А.М. и др. Нелинейные локальные деформации мембран эритроцитов: нормальные эритроциты (Часть 1), Общая реаниматология, 2017, т. 13, номер 5, с. 58-68. * |
ЧЕРНЫШ А.М. и др. Нелинейные локальные деформации мембран эритроцитов: нормальные эритроциты (Часть 1), Общая реаниматология, 2017, т. 13, номер 5, с. 58-68. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2750362C1 (ru) * | 2020-12-31 | 2021-06-28 | Федеральное Государственное Бюджетное Образовательное Учреждение Высшего Образования "Тюменский Государственный Медицинский Университет" Министерства Здравоохранения Российской Федерации | Способ определения степени венозной недостаточности от деформируемости эритроцитов |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2122212C1 (ru) | Способ определения системного воспаления | |
Gyawali et al. | Association of abnormal erythrocyte morphology with oxidative stress and inflammation in metabolic syndrome | |
Mukherjee et al. | Nanoscale surface characterization of human erythrocytes by atomic force microscopy: a critical review | |
Linka et al. | Unraveling the local relation between tissue composition and human brain mechanics through machine learning | |
US8027814B2 (en) | Methods for assessing a condition by analyzing blood in cerebrospinal fluid | |
RU2726208C1 (ru) | Способ определения реологических свойств крови | |
Sahin et al. | Plasma biomarkers of brain injury in COVID-19 patients with neurological symptoms | |
Gromadziński et al. | Red cell distribution width is an independent factor for left ventricular diastolic dysfunction in patients with chronic kidney disease | |
FI13179Y1 (fi) | Laite aivovamman havaitsemiseksi kohteessa | |
Kruchinina et al. | Possible differential diagnosis of the degrees of rheological disturbances in patients with type 2 diabetes mellitus by dielectrophoresis of erythrocytes | |
JP2018523092A (ja) | 星状細胞トラウマトーム(traumatome)および神経外傷のバイオマーカー | |
RU2425382C1 (ru) | Способ экспресс-определения кардиомиоглобина в плазме крови с помощью электрохимического иммуносенсора | |
Wu et al. | Label-free in vivo assessment of brain mitochondrial redox states during the development of diabetic cognitive impairment using Raman spectroscopy | |
CN112180093B (zh) | 危重病死亡率诊断性生物标志物tenascin-c及其应用 | |
Kajimura et al. | The effects of flow on the transport of potassium ions through the walls of single perfused frog mesenteric capillaries | |
RU2722898C1 (ru) | Способ выявления патологических изменений в структурных элементах мембран эритроцитов | |
CN107941722B (zh) | 血液样本分析测试系统 | |
Dulay et al. | Fetal ischemia monitoring with in vivo implanted electrochemical multiparametric microsensors | |
RU2542438C1 (ru) | Способ оценки качественных показателей эритроцитсодержащих сред в процессе их хранения | |
RU2703510C1 (ru) | Способ оценки состояния кислородно-транспортной функции крови у субъекта и ее отклонений от нормы | |
RU2763821C1 (ru) | Способ ранней диагностики хронических заболеваний околоносовых пазух и небных миндалин | |
RU2497107C2 (ru) | Способ измерения редокс потенциала биологических сред | |
Zilg et al. | A rapid method for postmortem vitreous chemistry-deadside analysis. Biomolecules. 2022; 12: 32 | |
Kozlova et al. | Structural configuration of blood cell membranes determines their nonlinear deformation properties | |
Lee et al. | Label‐free monitoring of inflammatory tissue conditions using a carrageenan‐induced acute inflammation rat model |