RU2724504C1 - Method of creating artificial reference dna samples for genetic testing and test system with samples obtained by said method - Google Patents

Method of creating artificial reference dna samples for genetic testing and test system with samples obtained by said method Download PDF

Info

Publication number
RU2724504C1
RU2724504C1 RU2019125956A RU2019125956A RU2724504C1 RU 2724504 C1 RU2724504 C1 RU 2724504C1 RU 2019125956 A RU2019125956 A RU 2019125956A RU 2019125956 A RU2019125956 A RU 2019125956A RU 2724504 C1 RU2724504 C1 RU 2724504C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
dna
mutant
normal
reference dna
pcr
Prior art date
Application number
RU2019125956A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Степан Николаевич Белякин
Даниил Александрович Максимов
Петр Павлович Лактионов
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "ВЕТГЕНОМИКА" (ООО "ВЕТГЕНОМИКА")
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "ВЕТГЕНОМИКА" (ООО "ВЕТГЕНОМИКА") filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "ВЕТГЕНОМИКА" (ООО "ВЕТГЕНОМИКА")
Priority to RU2019125956A priority Critical patent/RU2724504C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2724504C1 publication Critical patent/RU2724504C1/en

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102Mutagenizing nucleic acids
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1031Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology.SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology. Described is a group of inventions involving a method of creating artificial reference DNA samples and a test system using DNA samples obtained using said method. Method of producing reference DNA samples involves such steps as obtaining normal and mutant reference DNA fragments, obtaining a normal recombinant vector by cloning a normal reference DNA fragment into a genetic vector and a mutant recombinant vector by cloning a mutant reference DNA fragment into a genetic vector, verifying a nucleotide sequence of normal and mutant reference DNA fragments as part of recombinant vectors and obtaining such solutions of recombinant vectors, which in PCR exhibit kinetic properties indistinguishable from kinetic properties of natural DNA samples.EFFECT: invention extends the range of products for creating artificial reference DNA samples.19 cl, 1 ex, 7 dwg

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ FIELD OF TECHNOLOGY

Изобретение относится к области генетического тестирования и может быть использовано при выявлении мутаций, в том числе вызывающих наследственные заболевания у человека и других организмов.The invention relates to the field of genetic testing and can be used to detect mutations, including those causing hereditary diseases in humans and other organisms.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ DEFINITIONS

Аллель — различные формы одного и того же гена, расположенные в одинаковых участках гомологичных хромосом. Аллели отличаются друг от друга последовательностью нуклеотидов, причем эти отличия приводят к изменению аминокислотной последовательности белкового продукта гена и/или к изменению уровня экспрессии гена, что обусловливает фенотипические различия одного и того же наследственного признака организма.Allele - various forms of the same gene located in the same regions of homologous chromosomes. Alleles differ from each other in the sequence of nucleotides, and these differences lead to a change in the amino acid sequence of the protein product of the gene and / or to a change in the level of expression of the gene, which causes phenotypic differences of the same hereditary trait of the organism.

Амплификация — увеличение числа копий определенной последовательности нуклеотидов во время ПЦР.Amplification - an increase in the number of copies of a specific nucleotide sequence during PCR.

Биологический образец — органы, ткани (включая кровь), продукты секреции и экскреции, из которых может быть выделена ДНК для генетического тестирования.Biological sample - organs, tissues (including blood), secretion and excretion products from which DNA can be isolated for genetic testing.

Генетический вектор – кольцевая или линейная молекула ДНК, способная включать чужеродную ДНК, а также способная к репликации в бактериальной или эукариотической клетке. Рекомбинантным вектором называют генетический вектор, в который был клонирован референсный фрагмент ДНК. При этом нормальный рекомбинантный вектор содержит нормальный референсный фрагмент ДНК, а мутантный рекомбинантный вектор содержит мутантный референсный фрагмент ДНК. Genetic vector - a circular or linear DNA molecule that can include foreign DNA, as well as capable of replication in a bacterial or eukaryotic cell. A recombinant vector is a genetic vector into which a reference DNA fragment has been cloned. In this case, the normal recombinant vector contains a normal reference DNA fragment, and the mutant recombinant vector contains a mutant reference DNA fragment.

Генетический вариант — это вариант последовательности нуклеотидов конкретного участка ДНК, встречаемый в геноме конкретного вида. Как правило, генетические варианты затрагивают определенный ген или регуляторную область определенного гена. Различные генетические варианты могут приводить к различиям в уровне экспрессии определенного гена, к различиям в последовательности рибонуклеотидов в РНК, считываемой с этого гена, и/или аминокислотной последовательности белкового продукта этого гена, если этот ген кодирует белок. Однако различие генетических вариантов необязательно приводит к различиям продукта, кодируемого геном, или к различиям в уровне экспрессии гена. A genetic variant is a variant of the nucleotide sequence of a particular DNA region, found in the genome of a particular species. Typically, genetic variants affect a particular gene or regulatory region of a particular gene. Different genetic variants can lead to differences in the expression level of a particular gene, to differences in the sequence of ribonucleotides in the RNA read from this gene, and / or the amino acid sequence of the protein product of this gene, if this gene encodes a protein. However, differences in genetic variants do not necessarily lead to differences in the product encoded by the gene or differences in the level of gene expression.

Генетический вариант, который чаще всего встречается у определенного вида и ассоциирован с нормальным развитием и функционированием организма называют нормальным генетическим вариантом. Тот генетический вариант, который встречается в популяции с меньшей частотой, чем нормальный генетический вариант, называют мутантным генетическим вариантом. Некоторые мутантные генетические варианты ассоциированы с появлением полезных для организма признаков. Однако исследуются в большей степени мутантные генетические варианты ассоциированные с наследственными заболеваниями и нарушениями развития организма.The genetic variant, which is most often found in a certain species and is associated with the normal development and functioning of the body, is called the normal genetic variant. The genetic variant that occurs in a population with a lower frequency than the normal genetic variant is called the mutant genetic variant. Some mutant genetic variants are associated with the appearance of traits that are useful to the body. However, mutant genetic variants associated with hereditary diseases and developmental disorders are studied to a greater extent.

Если мутантный генетический вариант приводит к изменению аминокислотной последовательности белкового продукта определенного гена или изменению уровня экспрессии этого гена, то такой генетический вариант называют мутантным аллелем этого гена. А соответствующий нормальный генетический вариант называют нормальным аллелем этого гена.If a mutant genetic variant leads to a change in the amino acid sequence of the protein product of a particular gene or a change in the expression level of this gene, then this genetic variant is called the mutant allele of this gene. And the corresponding normal genetic variant is called the normal allele of this gene.

Генетическое тестирование – лабораторная процедура, направленная на выявление определенного генетического варианта в ДНК, выделенной из какого-либо биологического образца.Genetic testing - a laboratory procedure aimed at identifying a specific genetic variant in DNA isolated from any biological sample.

Геном — совокупность генетического материала гаплоидного набора хромосом данного вида.Genome - the totality of the genetic material of a haploid set of chromosomes of a given species.

Генотип — совокупность генов данного организма. В более узком смысле под генотипом понимают комбинацию определенных генетических вариантов у конкретной особи.Genotype - a set of genes of a given organism. In a narrower sense, a genotype is understood to mean a combination of certain genetic variants in a particular individual.

Гомозигота — особь, в генотипе которой присутствует один генетический вариант в двух копиях. Такая особь от обоих родителей получила одинаковые генетические варианты на гомологичных хромосомах.A homozygote is an individual in the genotype of which there is one genetic variant in two copies. Such an individual from both parents received the same genetic variants on homologous chromosomes.

Гетерозигота — особь, в генотипе которой присутствует два разных генетических варианта, каждый в одной копии. Такая особь от каждого из родителей получила различные генетические варианты на гомологичных хромосомах. В случае наследования генетических вариантов на половых хромосомах такие особи называют гемизиготами.Heterozygote is an individual in the genotype of which there are two different genetic variants, each in one copy. Such an individual from each of the parents received various genetic variants on homologous chromosomes. In the case of inheritance of genetic variants on sex chromosomes, such individuals are called hemizygotes.

ДНК-полимераза — имеется в виду ДНК-зависимая ДНК-полимераза — фермент, катализирующий полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль уже существующей цепи нуклеотидов, которую фермент использует в качестве шаблона. Тип нового нуклеотида определяется комплементарностью с нуклеотидом в составе уже существующей цепи. Таким образом ДНК-полимераза участвует в синтезе новой одноцепочечной молекулы ДНК, полностью комплементарной уже существующей одноцепочечной молекуле ДНК. При полимеризации нуклеотидов ДНК-полимераза способна катализировать только присоединение нуклеотида к 3’-концу уже существующей цепи нуклеотидов, поэтому для начала полимеризации ДНК-полимеразе необходим праймер, по крайней мере частично комплементарный участку существующей цепи нуклеотидов, причем критически важной для полимеризации является комплементарность крайнего нуклеотида, находящегося на 3’-конце праймера. ДНК-полимераза начинает синтез второй цепи ДНК от 3'-конца праймера, который связался с уже существующей цепью ДНК, синтезируя новую цепь ДНК в направлении от 5'- к 3'-концу.DNA polymerase — meaning DNA-dependent DNA polymerase — an enzyme that catalyzes the polymerization of deoxyribonucleotides along an existing nucleotide chain that the enzyme uses as a template. The type of new nucleotide is determined by complementarity with the nucleotide in the composition of an existing chain. Thus, DNA polymerase is involved in the synthesis of a new single-stranded DNA molecule that is fully complementary to an existing single-stranded DNA molecule. In the polymerization of nucleotides, DNA polymerase is capable of catalyzing only the attachment of a nucleotide to the 3'-end of an existing nucleotide chain; therefore, to start polymerization of a DNA polymerase, a primer is necessary, at least partially complementary to a portion of the existing nucleotide chain, and the complementarity of an extreme nucleotide is critical for polymerization located at the 3'-end of the primer. DNA polymerase begins the synthesis of a second DNA strand from the 3 ′ end of the primer, which binds to an existing DNA strand, synthesizing a new DNA strand in the direction from the 5 ′ to the 3 ′ end.

Кинетические свойства референсных образцов ДНК — это те свойства ДНК, которые определяют такие параметры ПЦР, как эффективность амплификации, время (в циклах) перехода роста количества продукта ПЦР в экспоненциальную стадию и в стадию плато, время (в циклах) достижения заданного уровня флуоресценции в количественной ПЦР (Ct), а также сам профиль кинетических кривых в количественной ПЦР.The kinetic properties of reference DNA samples are those properties of DNA that determine PCR parameters such as amplification efficiency, time (in cycles) of the increase in the amount of PCR product to the exponential stage and to the plateau stage, time (in cycles) to reach a given level of fluorescence in quantitative PCR (Ct), as well as the profile of kinetic curves in quantitative PCR.

Клонирование — здесь: интеграция определенного фрагмента ДНК в молекулу ДНК генетического вектора с получением рекомбинантного вектора.Cloning is here: the integration of a specific DNA fragment into the DNA molecule of a genetic vector to produce a recombinant vector.

Количественная ПЦР (или ПЦР в реальном времени, Real-time PCR) — лабораторный метод, который используется для измерения количества исходной ДНК-матрицы путем измерения кинетики прохождения ПЦР. Как и в классической ПЦР сначала количество специфического продукта ПЦР увеличивается экспоненциально. Экспоненциальный рост количества продукта ПЦР ограничен количеством реагентов, присутствием в реакционной смеси ингибиторов ПЦР, образованием побочных, неспецифических продуктов реакции. На последних циклах реакции рост замедляется, эта стадия ПЦР называется «стадией плато». Основное отличие количественной ПЦР от классической ПЦР состоит в том, что после каждого цикла амплификации косвенным образом измеряется количество амплифицированной ДНК. Для определения количества амплифицированной ДНК используют либо флюоресцентные красители, испускающие свет при интеркаляции в двуцепочечные молекулы ДНК, либо модифицированные олигонуклеотиды — например, TaqMan-зонды, которые флюоресцируют после их расщепления ДНК-полимеразой во время синтеза ДНК. И в том, и в другом случае флюоресценция усиливается с каждым циклом реакции по мере накопления продукта ПЦР в реакционной смеси. Для определения количества амплифицированной ДНК после каждого цикла измеряется общая флюоресценция, исходящая от реакционной смеси. Измерение флюоресценции, исходящей от реакционной смеси, происходит во время ПЦР в автоматическом режиме. По результатам измерений строится кривая, характеризующая зависимость флюоресценции в реакционной смеси от номера цикла амплификации. Тот цикл, на котором флюоресценция достигает заданного порогового уровня, называется пороговым циклом, или Ct (от англ. threshold cycle). Сравнивая величину Ct, полученную в ПЦР с исследуемым образцом ДНК, и величину Ct, полученную в ПЦР с референсным образцом ДНК, можно судить о наличии и количестве ДНК с определенной последовательностью нуклеотидов в исследуемом образце ДНК. При анализе данных количественной ПЦР помимо величины Ct важно учитывать профиль описанной кривой флюоресценции. Профиль кривой говорит об эффективности амплификации, которая зависит от таких параметров, как активность ДНК-полимеразы, эффективность гибридизации праймеров, чистота ДНК-матрицы от ингибиторов ПЦР, исходная концентрация ДНК-матрицы, сложность ДНК-матрицы, конформационные особенности ДНК-матрицы.Quantitative PCR (or real-time PCR, Real-time PCR) is a laboratory method that is used to measure the amount of the original DNA matrix by measuring the kinetics of PCR. As in classical PCR, the amount of a specific PCR product first increases exponentially. The exponential increase in the amount of PCR product is limited by the number of reagents, the presence of PCR inhibitors in the reaction mixture, and the formation of side, non-specific reaction products. In the last cycles of the reaction, growth slows down, this stage of PCR is called the "plateau stage". The main difference between quantitative PCR and classical PCR is that after each amplification cycle, the amount of amplified DNA is indirectly measured. To determine the amount of amplified DNA, either fluorescent dyes that emit light upon intercalation into double-stranded DNA molecules, or modified oligonucleotides, for example, TaqMan probes, which fluoresce after cleavage by DNA polymerase during DNA synthesis, are used. In both cases, fluorescence increases with each reaction cycle as the PCR product accumulates in the reaction mixture. To determine the amount of amplified DNA after each cycle, the total fluorescence from the reaction mixture is measured. The measurement of fluorescence emanating from the reaction mixture occurs during PCR in automatic mode. Based on the measurement results, a curve is constructed that characterizes the dependence of fluorescence in the reaction mixture on the amplification cycle number. The cycle at which fluorescence reaches a given threshold level is called the threshold cycle, or Ct (from the English threshold cycle). Comparing the Ct value obtained in PCR with the studied DNA sample and the Ct value obtained in PCR with the reference DNA sample, one can judge the presence and quantity of DNA with a specific nucleotide sequence in the studied DNA sample. When analyzing quantitative PCR data, in addition to the Ct value, it is important to take into account the profile of the described fluorescence curve. The profile of the curve indicates the amplification efficiency, which depends on parameters such as DNA polymerase activity, primer hybridization efficiency, the purity of the DNA template from PCR inhibitors, the initial concentration of the DNA template, the complexity of the DNA template, the conformational features of the DNA template.

Комплементарность — здесь: взаимное соответствие нуклеотидов, обеспечивающее образование водородных связей между двумя цепями, образующими спираль ДНК. Азотистые основания нуклеотидов способны вследствие образования водородных связей формировать парные комплексы аденин-тимин и гуанин-цитозин при взаимодействии цепей ДНК. Такое взаимодействие играет ключевую роль в синтезе новой цепи ДНК по шаблону уже существующей цепи ДНК.Complementarity - here: the nucleotide mutual correspondence, providing the formation of hydrogen bonds between the two chains forming a DNA helix. Due to the formation of hydrogen bonds, nitrogenous nucleotide bases are capable of forming paired complexes of adenine-thymine and guanine-cytosine during the interaction of DNA chains. This interaction plays a key role in the synthesis of a new DNA strand from the pattern of an existing DNA strand.

Мутациями называют любые изменения последовательности нуклеотидных остатков конкретного участка ДНК. Основные виды мутаций включают замены одних нуклеотидов другими с сохранением количества нуклеотидов, делеции — удаление нуклеотидов, инсерции — вставки нуклеотидов. При этом мутации, которые затрагивают один нуклеотид, называют точечными.Mutations are any changes in the sequence of nucleotide residues of a particular DNA region. The main types of mutations include replacing one nucleotide with another while maintaining the number of nucleotides, deletions - removal of nucleotides, insertion - insertion of nucleotides. In this case, mutations that affect one nucleotide are called point mutations.

Наследственное заболевание – патологическое состояние, вызванное мутацией или несколькими мутациями, нарушающими нормальное протекание физиологических процессов в организме. При этом для того, чтобы заболевание было именно наследственным, то есть передающимся от родителей потомству, мутации, вызывающие заболевание, должны произойти в половых клетках одного из родителей или в половых клетках обоих родителей. Hereditary disease - a pathological condition caused by a mutation or several mutations that disrupt the normal course of physiological processes in the body. Moreover, in order for the disease to be hereditary, that is, transmitted to the offspring of the parents, mutations that cause the disease must occur in the germ cells of one of the parents or in the sex cells of both parents.

Наследственный признак – свойство организма, передающееся по наследству от родителей потомству генетическими механизмами. Наследственные признаки определяются сочетанием генетических вариантов, полученных от родителей.An hereditary trait is a property of an organism that is inherited from parents to offspring by genetic mechanisms. Hereditary traits are determined by a combination of genetic variants obtained from parents.

Нуклеотиды — нуклеозидфосфаты, которые являются мономерами в составе нуклеиновых кислот, связанными 3′-5′-фосфодиэфирными связями. В настоящем тексте заявки под нуклеотидами понимаются дезоксирибонуклеотиды, из которых состоит ДНК. В ДНК всех организмов присутствуют 4 вида нуклеотидов: A – Аденин; G — Гуанин; C — Цитозин; T — Тимин. Последовательность чередования нуклеотидов в ДНК является физической основой генетической информации. Длину любого участка двуцепочечной ДНК указывают в парах нуклеотидов, подразумевая под этим элементарную единицу двуцепочечной молекулы ДНК, сложенную из двух комплементарных нуклеотоидов, соединенных друг с другом за счет водородных связей. Длину одноцепочечных молекул ДНК, например длину праймеров, указывают в нуклеотидах.Nucleotides are nucleoside phosphates, which are monomers in the composition of nucleic acids linked by 3′-5′-phosphodiester bonds. In the present application text, nucleotides are understood to mean deoxyribonucleotides of which DNA is composed. The DNA of all organisms contains 4 types of nucleotides: A - Adenine; G is guanine; C is cytosine; T - Timin. The sequence of nucleotide alternation in DNA is the physical basis of genetic information. The length of any portion of double-stranded DNA is indicated in pairs of nucleotides, meaning the elementary unit of a double-stranded DNA molecule, composed of two complementary nucleotides connected to each other by hydrogen bonds. The length of single-stranded DNA molecules, for example, the length of the primers, is indicated in nucleotides.

Праймеры — здесь: короткие одноцепочечные молекулы ДНК с заданной последовательностью нуклеотидов, которые используются в реакции ПЦР и определяют начало и конец фрагмента ДНК, амплифицируемого в ходе ПЦР. Как правило, в ПЦР используется два праймера — прямой и обратный. Прямой праймер соответствует крайним N нуклеотидам одной цепи амплифицируемого фрагмента ДНК, где N равно длине прямого праймера. Обратный праймер соответствует крайним М нуклеотидам комплементарной цепи амплифицируемого фрагмента ДНК, где М равно длине праймера.Primers are here: short single-stranded DNA molecules with a given nucleotide sequence that are used in the PCR reaction and determine the beginning and end of the DNA fragment amplified by PCR. As a rule, two primers are used in PCR - forward and reverse. The forward primer corresponds to the extreme N nucleotides of one strand of the amplified DNA fragment, where N is equal to the length of the forward primer. The reverse primer corresponds to the extreme M nucleotides of the complementary strand of the amplified DNA fragment, where M is equal to the length of the primer.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод молекулярной биологии, позволяющий амплифицировать определенный участок ДНК, который называется продуктом ПЦР. Границы продукта ПЦР задаются специфическими праймерами. Амплификация происходит в результате многократного повторения циклов изменения температуры реакционной смеси. Каждый цикл состоит из трех стадий: 1) на стадии денатурации реакционную смесь нагревают до 94-98 °C, при этом происходит разрушение водородных связей между двумя цепями ДНК; 2) на стадии отжига праймеров температуру реакционной смеси понижают, чтобы праймеры могли связаться с денатурированной одноцепочечной ДНК, при этом температура отжига зависит от состава и длины праймеров; 3) на стадии элонгации ДНК-полимераза, используя праймер в качестве затравки, синтезирует новую цепь ДНК по шаблону уже имеющейся цепи ДНК, которая называется ДНК-матрицей, при этом температура реакционной смеси зависит от используемой ДНК-полимеразы. Анализ продукта классической ПЦР проводят после окончания реакции. Как правило, для анализа используют электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле с красителем, интеркалирующим в ДНК. Такой анализ является полуколичественным и позволяет приблизительно оценить размер и количество полученного продукта ПЦР.Polymerase chain reaction (PCR) is a molecular biology method that allows you to amplify a specific section of DNA called the PCR product. The boundaries of the PCR product are set by specific primers. Amplification occurs as a result of repeated repetition of cycles of changes in the temperature of the reaction mixture. Each cycle consists of three stages: 1) at the stage of denaturation, the reaction mixture is heated to 94-98 ° C, and hydrogen bonds between the two DNA chains are destroyed; 2) at the stage of primer annealing, the temperature of the reaction mixture is lowered so that the primers can bind to denatured single-stranded DNA, while the annealing temperature depends on the composition and length of the primers; 3) at the stage of elongation of DNA polymerase, using a primer as a seed, synthesizes a new DNA chain according to the template of an existing DNA chain, which is called a DNA template, and the temperature of the reaction mixture depends on the DNA polymerase used. The analysis of the product of classical PCR is carried out after completion of the reaction. As a rule, agarose or polyacrylamide gel electrophoresis with a dye intercalating in DNA is used for analysis. Such an analysis is semi-quantitative and allows one to approximately estimate the size and quantity of the obtained PCR product.

Референсный образец ДНК – образец ДНК с известными свойствами, содержащий фрагмент ДНК с известной последовательностью нуклеотидов. При генетическом тестировании сравнение исследуемого образца ДНК с одним или несколькими референсными образцами ДНК позволяет определить наличие или отсутствие мутантного генетического варианта в исследуемом образце ДНК. Под естественными референсными образцами ДНК в описании настоящего изобретения подразумеваются ДНК, выделенные из организма, являющегося гомо- или гетерозиготой по определенному генетическому варианту. При этом в большинстве случаев речь идет о геномной ДНК. Под искусственными референсными образцами ДНК в описании настоящего изобретения подразумеваются приготовленные описанным способом растворы плазмидных векторов, содержащих референсные фрагменты ДНК. При этом нормальный искусственный референсный образец ДНК содержит нормальный референсный фрагмент ДНК, мутантный искусственный референсный образец ДНК содержит мутантный референсный фрагмент ДНК, а гетерозиготный искусственный референсный образец ДНК содержит в равных количествах нормальный и мутантный референсные фрагменты ДНК.Reference DNA Sample - A DNA sample with known properties that contains a DNA fragment with a known nucleotide sequence. In genetic testing, comparing the test DNA sample with one or more reference DNA samples allows you to determine the presence or absence of a mutant genetic variant in the test DNA sample. Under the natural reference DNA samples in the description of the present invention refers to DNA isolated from an organism that is homo- or heterozygous for a particular genetic variant. However, in most cases we are talking about genomic DNA. Under artificial reference DNA samples in the description of the present invention refers to prepared in the described manner solutions of plasmid vectors containing reference DNA fragments. In this case, a normal artificial reference DNA sample contains a normal reference DNA fragment, a mutant artificial reference DNA sample contains a mutant reference DNA fragment, and a heterozygous artificial reference DNA sample contains equal amounts of normal and mutant reference DNA fragments.

Референсный фрагмент ДНК — клонированный в плазмидный вектор фрагмент ДНК, содержащий нормальный или мутантный генетический вариант. Нормальный референсный фрагмент ДНК содержит нормальный генетический вариант. Мутантный референсный фрагмент ДНК содержит мутантный генетический вариант.Reference DNA fragment - a DNA fragment cloned into a plasmid vector containing a normal or mutant genetic variant. A normal reference DNA fragment contains a normal genetic variant. A mutant reference DNA fragment contains a mutant genetic variant.

Секвенирование — метод молекулярной биологии, позволяющий определять последовательность нуклеотидов в ДНК.Sequencing is a molecular biology method that allows you to determine the sequence of nucleotides in DNA.

Сверхспирализация ДНК — явление перескручивания кольцевых молекул ДНК, в результате которого ось двойной спирали ДНК сама закручивается в спираль более высокого порядка. Сверхспирализованная кольцевая ДНК может перейти в релаксированное состояние, если произвести разрыв одной или обеих цепей ДНК. При этом разрыв обеих цепей ДНК приводит к линеаризации, т. е. преобразование кольцевой молекулы ДНК в линейную. Чаще всего линеаризацию проводят путем гидролиза кольцевой молекулы ДНК эндонуклеазой рестрикции.DNA supercoiling is a phenomenon of twisting of circular DNA molecules, as a result of which the axis of the DNA double helix itself is twisted into a higher order spiral. Supercoiled circular DNA can go into a relaxed state if one or both DNA strands are broken. Moreover, the breakdown of both DNA chains leads to linearization, i.e., the conversion of the ring DNA molecule into a linear one. Most often, linearization is carried out by hydrolysis of a circular DNA molecule with a restriction endonuclease.

Тест-система – набор реактивов для генетического тестирования.Test system - a set of reagents for genetic testing.

Чужеродная ДНК — любая ДНК, которая не содержит последовательности нуклеотидов, комплементарной праймерам, используемым при генетическом тестировании.Foreign DNA is any DNA that does not contain a nucleotide sequence complementary to the primers used in genetic testing.

СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ ABBREVIATIONS AND CONVENTIONS

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислотаDNA - deoxyribonucleic acid

ПЦР — полимеразная цепная реакцияPCR - polymerase chain reaction

п.н. — пара нуклеотидовbp - a pair of nucleotides

E.coli — Escherichia coliE.coli - Escherichia coli

HRM — high resolution meltingHRM - high resolution melting

BAC — bacterial artificial chromosomeBAC - bacterial artificial chromosome

YAC — yeast artificial chromosomeYAC - yeast artificial chromosome

ДМСО — диметилсульфоксидDMSO - dimethyl sulfoxide

БСА — бычий сывороточный альбуминBSA - Bovine Serum Albumin

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ BACKGROUND

Генетическое тестирование в основном применяют для того, чтобы определить наличие в конкретном организме определенных генетических вариантов. Сочетание генетических вариантов определяет проявление наследственных признаков у конкретного организма. Согласно базе данных OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man, http://omim.org/), по состоянию на 15 Ноября 2018 года число исследованных генетических вариантов, ассоциированных с определенными наследственными признаками, у человека превышает 3600, причем большинство их них связаны с развитием или с предрасположенностями к развитию различных заболеваний. К подобным заболеваниям у человека, например, относятся наследственная глухота, наследственная слепота (болезнь Лебера), фенилкетонурия, прогерия и многие другие. Аналогичная база данных OMIA (Online Mendelian Inheritance In Animals, https://omia.org/home/) содержит информацию об изученных наследственных признаках у животных. Наиболее исследованным организмом среди животных является домашняя собака (243 исследованных наследственных признака), крупный рогатый скот (149 признаков), домашняя кошка и другие.Genetic testing is mainly used to determine the presence of certain genetic variants in a particular organism. The combination of genetic variants determines the manifestation of hereditary traits in a particular organism. According to the OMIM database (Online Mendelian Inheritance in Man, http://omim.org/), as of November 15, 2018, the number of investigated genetic variants associated with certain hereditary traits in humans exceeds 3600, most of which are associated with the development or predisposition to the development of various diseases. Such diseases in humans, for example, include hereditary deafness, hereditary blindness (Leber's disease), phenylketonuria, progeria, and many others. A similar OMIA database (Online Mendelian Inheritance In Animals, https://omia.org/home/) contains information about the studied hereditary traits in animals. The most studied organism among animals is a domestic dog (243 investigated hereditary traits), cattle (149 characters), a domestic cat and others.

Информацию о генетических вариантах используют в медицине, например, при выборе оптимального набора лекарственных препаратов для пациента, для коррекции питания и образа жизни, помогающих избежать или смягчить проявление наследственного заболевания и др. (Krontiras et al., 2018; Valente et al., 2018). Также информация о генетических вариантах родителей позволяет оценить риски рождения детей с наследственными заболеваниями (Handyside, 2018). Кроме того, в медицине генетическое тестирование используют для определения видовой принадлежности патогенных организмов. Information on genetic variants is used in medicine, for example, when choosing the optimal set of medications for a patient, to correct nutrition and lifestyle, helping to avoid or mitigate the manifestation of a hereditary disease, etc. (Krontiras et al., 2018; Valente et al., 2018 ) Information on the genetic variants of parents allows us to assess the risks of giving birth to children with hereditary diseases (Handyside, 2018). In addition, in medicine, genetic testing is used to determine the species affiliation of pathogenic organisms.

В сельском хозяйстве информацию о генетических вариантах используют при разведении животных, при выведении новых сортов растений. У домашних животных и культурных растений генетическое тестирование позволяет избежать появления потомства с нежелательными признаками (Leeb et al., 2017; Bellone, 2017; Poland and Rutkoski, 2016). Стоит отметить, что не все генетические варианты ассоциированы с заболеваниями и нарушениями развития организма. Некоторые генетические варианты ассоциированы с появлением полезных признаков, что активно используется при селекции сельскохозяйственных растений и животных. Также генетическое тестирование в сельском хозяйстве используют для определения видовой принадлежности животных и растений, для выявления генетически модифицированных организмов. In agriculture, information on genetic variants is used when breeding animals, when breeding new varieties of plants. In domestic animals and cultivated plants, genetic testing avoids the appearance of offspring with undesirable traits (Leeb et al., 2017; Bellone, 2017; Poland and Rutkoski, 2016). It is worth noting that not all genetic variants are associated with diseases and developmental disorders. Some genetic variants are associated with the appearance of useful traits, which is actively used in the selection of agricultural plants and animals. Also, genetic testing in agriculture is used to determine the species affiliation of animals and plants, to identify genetically modified organisms.

Следует отметить, что генетическое тестирование применяют для выявления как доминантных, так и рецессивных мутантных генетических вариантов, ассоциированных с наследственными заболеваниями. It should be noted that genetic testing is used to identify both dominant and recessive mutant genetic variants associated with hereditary diseases.

Методы генетического тестирования можно разделить на прямые и непрямые. В прямых методах генетический вариант определяют непосредственно с помощью секвенирования последовательности нуклеотидов участка ДНК, содержащего исследуемый генетический вариант. В случае непрямых методов наличие определенного генетического варианта определяют по косвенным признакам, таким как кинетика протекания биохимической реакции, размер продукта реакции и так далее. Несмотря на очевидные преимущества секвенирования, этот метод не всегда применяют на практике, поскольку он требует дорогостоящего оборудования и высокой квалификации персонала, а потому доступен не всем организациям специализирующимся на генетическом тестировании. Поэтому чаще используют непрямые методы генетического тестирования, основанные на ПЦР, которые гораздо проще в применении и существенно дешевле.Genetic testing methods can be divided into direct and indirect. In direct methods, the genetic variant is determined directly by sequencing the nucleotide sequence of a portion of DNA containing the genetic variant under study. In the case of indirect methods, the presence of a certain genetic variant is determined by indirect signs, such as the kinetics of the biochemical reaction, the size of the reaction product, and so on. Despite the obvious advantages of sequencing, this method is not always applied in practice, since it requires expensive equipment and highly qualified personnel, and therefore is not available to all organizations specializing in genetic testing. Therefore, they often use indirect methods of genetic testing based on PCR, which are much easier to use and much cheaper.

ПЦР используют для того, чтобы избирательно амплифицировать отдельный участок ДНК из всего генома тестируемого организма, что позволяет прицельно проанализировать этот участок ДНК различными методами, такими как определение длины амплифицированного участка ДНК, расщепление амплифицированного участка ДНК специфическими ферментами или определение термодинамических характеристик амплифицированного участка ДНК. В отличие от прямого секвенирования, методы, основанные на ПЦР, требуют параллельного анализа тестируемого образца ДНК и референсных образцов ДНК с известными характеристиками. В качестве референсных образцов ДНК чаще всего используют образцы ДНК, полученные от охарактеризованных организмов, у которых генетические варианты были ранее определены с помощью секвенирования. Для получения качественного результата в каждом тесте необходимо параллельно с тестируемым образцом ДНК проводить обработку первого референсного образца ДНК, содержащего мутантный генетический вариант, второго референсного образца ДНК, не содержащего мутантный генетический вариант, а также третьего референсного образца ДНК, содержащего смесь молекул ДНК с мутантным и нормальным генетическим вариантами в соотношении 1:1 (так называемый, гетерозиготный референсный образец ДНК). Такие референсные образцы ДНК используются для сравнения с тестируемым образцом ДНК при интерпретации результатов генетического тестирования.PCR is used to selectively amplify a single DNA region from the entire genome of the test organism, which allows one to analyze this DNA region precisely using various methods, such as determining the length of the amplified DNA region, splitting the amplified DNA region with specific enzymes, or determining the thermodynamic characteristics of the amplified DNA region. In contrast to direct sequencing, PCR-based methods require parallel analysis of the test DNA sample and reference DNA samples with known characteristics. The most commonly used DNA reference samples are DNA samples obtained from characterized organisms in which genetic variants have been previously determined by sequencing. To obtain a qualitative result in each test, it is necessary to process the first reference DNA sample containing the mutant genetic variant, the second reference DNA sample not containing the mutant genetic variant, and also the third reference DNA sample containing the mixture of DNA molecules with the mutant and parallel to the tested DNA sample. normal genetic variants in a 1: 1 ratio (the so-called heterozygous reference DNA sample). Such reference DNA samples are used for comparison with the test DNA sample in interpreting the results of genetic testing.

Как правило, при создании референсных образцов ДНК для тест-систем находят организмы, содержащие генетические варианты, обусловливающие исследуемый наследственный признак. Часто ограничиваются геномной ДНК, выделенной из гомозигот по нормальному генетическому варианту и гомозигот по мутантному генетическому варианту. Так, известен ряд методов и тест-систем на основе ПЦР для выявления точечных мутаций, делеций, инсерций и хромосомных перестроек у человека, где в качестве референсных образцов ДНК используется геномная ДНК человека, выделенная из образцов здоровых людей и/или людей, гомозиготных по мутантным генетическим вариантам (патенты № CN107400716, CN102660641, EP1329517).As a rule, when creating reference DNA samples for test systems, organisms are found that contain genetic variants that determine the studied hereditary trait. Often limited to genomic DNA isolated from homozygotes for the normal genetic variant and homozygotes for the mutant genetic variant. Thus, a number of PCR-based methods and test systems are known for detecting point mutations, deletions, insertions, and chromosomal rearrangements in humans, where human genomic DNA isolated from samples of healthy people and / or people homozygous for mutants is used as reference DNA samples genetic variants (patents No. CN107400716, CN102660641, EP1329517).

Получение референсных образцов может быть сопряжено с существенными трудностями при поиске организмов с соответствующими генотипами. Если какой-то генетический вариант редко встречается в популяции, поиск организмов, содержащих этот генетический вариант может занимать продолжительное время и требовать значительных финансовых затрат, поскольку поиск должен проводиться дорогостоящими методами секвенирования ДНК. Кроме того, даже при наличии организма с необходимым генотипом, количество ДНК в биологических образцах ограничено естественными причинами, что не может обеспечить постоянную доступность референсных образцов ДНК, особенно в случае крупномасштабных популяционных исследований.Obtaining reference samples can be fraught with significant difficulties in the search for organisms with the corresponding genotypes. If a genetic variant is rarely found in a population, the search for organisms containing this genetic variant can take a long time and require significant financial costs, since the search must be carried out using expensive DNA sequencing methods. In addition, even in the presence of an organism with the necessary genotype, the amount of DNA in biological samples is limited by natural causes, which cannot ensure the constant availability of reference DNA samples, especially in the case of large-scale population studies.

В связи с описанными трудностями получения естественных референсных образцов ДНК в тестах-системах используют искусственные референсные образцы ДНК, которые представляют собой клонированные в плазмидный вектор фрагменты ДНК, содержащие мутантный генетический вариант. Это позволяет получить практически неограниченное количество референсного образца ДНК в лабораторных условиях. Известны тест-системы на основе ПЦР с использованием описанных искусственных референсных образцов ДНК. При этом тест-системы применяются в различных ситуациях: для определения копийности гена при выборе таргетированной терапии рака груди и рака кишечника (заявка №WO2018086263); для определения химерности при трансплантации клеток костного мозга (заявка №CN101575643); для выявления вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани (заявка №WO2013129906); для выявления патогенных микроорганизмов в образце, взятом из раны пациента (заявка №WO2018156664); для выявления трансгенных организмов (заявка № CN101775440); для определения видовой принадлежности животных (заявка №WO2009083620).In connection with the described difficulties of obtaining natural reference DNA samples in test systems, artificial reference DNA samples are used, which are DNA fragments cloned into a plasmid vector containing a mutant genetic variant. This allows you to get an almost unlimited number of reference DNA sample in laboratory conditions. Known test systems based on PCR using the described artificial reference DNA samples. At the same time, test systems are used in various situations: to determine the copy number of a gene when choosing targeted therapy for breast and intestinal cancer (application No. WO2018086263); for determining chimera during bone marrow cell transplantation (application No. CN101575643); for the detection of hepatopoietic tissue infectious necrosis virus (application No. WO2013129906); to identify pathogens in a sample taken from a patient’s wound (application No. WO2018156664); to identify transgenic organisms (application No. CN101775440); to determine the species of animals (application No. WO2009083620).

При создании искусственных референсных образцов ДНК, фрагменты ДНК, содержащие мутантный генетический вариант, могут быть получены различными методами. Если доступен организм, содержащий мутантный генетический вариант, мутантный референсный фрагмент ДНК может быть получен методом ПЦР с использованием геномной ДНК данного организма в качестве матрицы. Если такой организм недоступен, мутантный референсный фрагмент ДНК может быть получен методом направленного мутагенеза или синтезирован химически.When creating artificial reference DNA samples, DNA fragments containing a mutant genetic variant can be obtained by various methods. If an organism containing a mutant genetic variant is available, a mutant reference DNA fragment can be obtained by PCR using the genomic DNA of the organism as a template. If such an organism is not available, a mutant reference DNA fragment can be obtained by directed mutagenesis or synthesized chemically.

Наиболее близким к заявленному изобретению является метод получения искусственных референсных образцов ДНК путем клонирования в плазмидный вектор одного или нескольких фрагментов ДНК, содержащих разные генетические варианты (патент №EP1601784). При этом мутантные последовательности могут быть выделены из мутантных организмов, получены методом ПЦР, синтезированы химически или получены направленным мутагенезом. Клонированные в векторы фрагменты ДНК проверяют секвенированием. Недостатком этого метода является непригодность получаемых искусственных референсных образцов ДНК для применения в тест-системах, основанных на количественной ПЦР, которые часто применяются для выявления мутантных генетических вариантов, появившихся в результате точечной мутации.Closest to the claimed invention is a method for producing artificial reference DNA samples by cloning into a plasmid vector of one or more DNA fragments containing different genetic variants (patent No. EP1601784). In this case, mutant sequences can be isolated from mutant organisms, obtained by PCR, synthesized chemically or obtained by directed mutagenesis. DNA fragments cloned into vectors are checked by sequencing. The disadvantage of this method is the unsuitability of the obtained artificial reference DNA samples for use in test systems based on quantitative PCR, which are often used to identify mutant genetic variants resulting from point mutations.

Количественная ПЦР — современная технология, позволяющая количественно измерять такие кинетические характеристики ПЦР, как эффективность амплификации, температура денатурации продукта ПЦР, и т. д. Измерение кинетики прохождения ПЦР является одним из косвенных способов выявления мутантных генетических вариантов при генетическом тестировании. Количественная ПЦР очень чувствительна к характеристикам ДНК-матрицы. С одной стороны, благодаря этой чувствительности количественная ПЦР позволяет быстро и надежно выявлять различия между генетическими вариантами, вызванными даже точечными мутациями. Но с другой стороны, та же чувствительность количественной ПЦР накладывает значительные ограничения на качество референсных образцов ДНК. Важно, чтобы референсные образцы ДНК были по своим биохимическим свойствам аналогичны тестируемым образцам. При этом, помимо линейной структуры референсного образца, важны абсолютное количество референсного образца в реакционной смеси, концентрация референсного образца в реакционной смеси, важна сложность состава ДНК в референсном образце ДНК, т. е. соотношение амплифицируемого участка ДНК и остальной ДНК, которая может влиять на кинетику ПЦР. Quantitative PCR is a modern technology that allows you to quantitatively measure such kinetic characteristics of PCR as amplification efficiency, PCR product denaturation temperature, etc. Measuring the kinetics of PCR is one of the indirect methods for identifying mutant genetic variants during genetic testing. Quantitative PCR is very sensitive to the characteristics of the DNA template. On the one hand, due to this sensitivity, quantitative PCR makes it possible to quickly and reliably identify differences between genetic variants caused even by point mutations. But on the other hand, the same sensitivity of quantitative PCR imposes significant limitations on the quality of reference DNA samples. It is important that the reference DNA samples are similar in biochemical properties to the tested samples. In addition to the linear structure of the reference sample, the absolute amount of the reference sample in the reaction mixture, the concentration of the reference sample in the reaction mixture are important, the complexity of the DNA composition in the reference DNA sample, i.e., the ratio of the amplified DNA region to the rest of the DNA, which can affect kinetics of PCR.

Таким образом, в области, связанной с разработкой тест-систем, основанных на количественной ПЦР, имеется потребность в технологии создания искусственных референсных образцов ДНК, которые обладают теми же свойствами, что и естественные референсные образцы ДНК.Thus, in the field associated with the development of test systems based on quantitative PCR, there is a need for a technology for creating artificial reference DNA samples that have the same properties as natural reference DNA samples.

Краткое описание изобретения SUMMARY OF THE INVENTION

Технической задачей изобретения является разработка способа создания искусственных референсных образцов ДНК для применения в тест-системах, основанных на методе ПЦР, в том числе количественной ПЦР.An object of the invention is to develop a method for creating artificial reference DNA samples for use in test systems based on the PCR method, including quantitative PCR.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание искусственных референсных образцов ДНК, которые характеризуются такой же кинетикой ПЦР, что и естественные референсные образцы ДНК, а также сокращение времени, необходимого для разработки тест-системы.The technical result of the claimed invention is the creation of artificial reference DNA samples, which are characterized by the same PCR kinetics as natural reference DNA samples, as well as reducing the time required to develop a test system.

Технический результат достигается тем, что способ создания искусственных референсных образцов ДНК включает следующие этапы. На первом этапе получают нормальный и мутантный референсные фрагменты ДНК. В одном из вариантов реализации, референсные фрагменты ДНК получают методом ПЦР, используя любые молекулы ДНК, содержащие необходимый генетический вариант. Чаще всего ДНК-матрица является геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по нормальному или мутантному генетическому варианту. Также в качестве ДНК-матрицы может быть использована геномная ДНК, выделенная из гетерозиготы, содержащей как нормальный, так и мутантный генетические варианты. Кроме геномной ДНК, в качестве ДНК-матрицы могут быть использованы продукты ПЦР, химически синтезированные молекулы или векторы различной природы, содержащие необходимый генетический вариант. В случае, когда ДНК, содержащая один из генетических вариантов, недоступна или ее получение связано со значительными временными, финансовыми или иными затратами, соответствующий референсный фрагмент ДНК может быть получен методом направленного мутагенеза. Направленный мутагенез может производиться любыми способами, известными специалистам в данной области. Однако предпочтительным является описанный далее способ, основанный на методе ПЦР, так как он не требует никаких реактивов и оборудования в дополнение к тем, которые используются на предыдущих и последующих этапах создания искусственных референсных образцов ДНК. Получение референсного фрагмента ДНК методом направленного мутагенеза позволяет значительно сэкономить время на поиске особи, содержащей мутантный генетический вариант, и сократить время разработки тест-системы. В одном из вариантов реализации один или оба референсных фрагментов ДНК могут быть полностью или частично синтезированы химически.The technical result is achieved in that the method of creating artificial reference DNA samples includes the following steps. At the first stage, normal and mutant reference DNA fragments are obtained. In one embodiment, reference DNA fragments are obtained by PCR using any DNA molecule containing the desired genetic variant. Most often, the DNA template is genomic DNA isolated from a homozygous for a normal or mutant genetic variant. Also, genomic DNA isolated from a heterozygous containing both normal and mutant genetic variants can be used as a DNA template. In addition to genomic DNA, PCR products, chemically synthesized molecules or vectors of various nature containing the necessary genetic variant can be used as a DNA template. In the case when DNA containing one of the genetic variants is not available or its preparation is associated with significant time, financial or other costs, the corresponding reference DNA fragment can be obtained by the method of directed mutagenesis. Directed mutagenesis can be carried out by any means known to specialists in this field. However, the method based on the PCR method described below is preferable, since it does not require any reagents and equipment in addition to those used in the previous and subsequent stages of creating artificial reference DNA samples. Obtaining a reference DNA fragment by directed mutagenesis can significantly save time on the search for individuals containing a mutant genetic variant, and reduce the time to develop a test system. In one embodiment, one or both of the reference DNA fragments can be fully or partially chemically synthesized.

На втором этапе создания искусственных референсных образцов ДНК референсные фрагменты ДНК клонируют в генетические векторы. В результате получают рекомбинантные векторы. Этот шаг, во-первых, позволяет в короткие сроки в лабораторных условиях получать референсные фрагменты ДНК в любых количествах, необходимых для дальнейшей работы. Во-вторых, этот шаг исключает необходимость каждый раз при приготовлении референсных образцов ДНК получать нормальный и мутантный референсные фрагменты ДНК и подтверждать секвенированием, что референсные фрагменты ДНК действительно содержат нормальный и мутантный генетические варианты.At the second stage of creating artificial reference DNA samples, reference DNA fragments are cloned into genetic vectors. The result is recombinant vectors. This step, firstly, allows in a short time in laboratory conditions to obtain reference DNA fragments in any quantities necessary for further work. Secondly, this step eliminates the need to obtain normal and mutant reference DNA fragments each time during the preparation of reference DNA samples and confirm by sequencing that the reference DNA fragments do contain normal and mutant genetic variants.

На третьем этапе создания искусственных референсных образцов ДНК последовательности нуклеотидов референсных фрагментов ДНК в составе рекомбинантных векторов, верифицируют методом секвенирования. Этот шаг необходим, чтобы гарантировать, что будущие референсные образцы ДНК действительно будут содержать нормальный и мутантный генетические варианты.At the third stage of creating artificial reference DNA samples, the nucleotide sequences of reference DNA fragments in recombinant vectors are verified by sequencing. This step is necessary to ensure that future reference DNA samples will indeed contain normal and mutant genetic variants.

Заключительным этапом является получение таких растворов рекомбинантных векторов, которые в ПЦР проявляют кинетические свойства, не отличимые от кинетических свойств естественных образцов ДНК, то есть таких образцов, которые проявляют кинетику амплификации в ПЦР (эффективность амплификации), не отличимую от кинетики амплификации естественных образцов.The final step is to obtain such solutions of recombinant vectors that exhibit kinetic properties in PCR that are indistinguishable from the kinetic properties of natural DNA samples, i.e., those samples that exhibit amplification kinetics in PCR (amplification efficiency), indistinguishable from the amplification kinetics of natural samples.

Варианты создания таких искусственных референсных образцов ДНК зависят от принципа работы тест-системы, для которой создаются искусственные референсные образцы ДНК. The options for creating such artificial reference DNA samples depend on the operating principle of the test system for which the artificial reference DNA samples are created.

В одном варианте реализации настоящего изобретения растворы, содержащие рекомбинантные векторы разбавляют до концентраций рекомбинантных векторов 100-10000 молекул в микролитре, что сопоставимо с концентрациями исследуемых образцов ДНК. При этом разбавителем может служить буферный раствор, который не препятствует прохождению ПЦР при генетическом тестировании. Однако в предпочтительном варианте исполнения растворы рекомбинантных векторов разбавляют очищенной водой. Разбавление позволяет снизить концентрацию ингибиторов ПЦР, которые могут попадать в раствор при выделении рекомбинантных векторов, а также облегчает дальнейший анализ и интерпретацию результатов генетического тестирования. In one embodiment of the present invention, solutions containing recombinant vectors are diluted to concentrations of recombinant vectors of 100-10000 molecules per microliter, which is comparable to the concentration of the studied DNA samples. In this case, a diluent can serve as a buffer solution, which does not interfere with the passage of PCR during genetic testing. However, in a preferred embodiment, the recombinant vector solutions are diluted with purified water. Dilution reduces the concentration of PCR inhibitors that can enter the solution when recombinant vectors are isolated, and also facilitates further analysis and interpretation of the results of genetic testing.

В результате указанного разбавления получают искусственные референсные образцы ДНК, пригодные для использования в тест-системах, основанных на классической ПЦР, с последующим анализом длины продуктов ПЦР и/или анализом паттерна расщепления продуктов ПЦР специфическими эндонуклеазами рестрикции.As a result of this dilution, artificial reference DNA samples are obtained suitable for use in test systems based on classical PCR, followed by analysis of the length of the PCR products and / or analysis of the pattern of cleavage of PCR products with specific restriction endonucleases.

В другом варианте реализации настоящего изобретения после верификации последовательности нуклеотидов референсных фрагментов ДНК в составе рекомбинантных векторов ДНК рекомбинантных векторов приводят в релаксированное состояние. Для этого используют любую подходящую нуклеазу, которая производит не менее одного разрыва ДНК в любом месте рекомбинантного вектора, кроме того участка референсного фрагмента ДНК, который будет амплифицирован в ходе ПЦР при генетическом тестировании. Внесение разрыва в ДНК рекомбинантного вектора позволяет убрать сверхспирализацию ДНК, свойственную кольцевым молекулам. В предпочтительном варианте изобретения для релаксации используют эндонуклеазу рестрикции, которая вносит двуцепочечный разрыв, что приводит к линеаризации рекомбинантных векторов. ДНК рекомбинантных векторов приводят в релаксированное состояние в том случае, если искусственные референсные образцы ДНК создают для тест-системы, направленной на выявление генетического варианта в образце ДНК, не подверженной сверхспирализации. Предпочтительно релаксацию ДНК рекомбинантных векторов проводят до описанного ниже разбавления растворов рекомбинантных референсных образцов, однако релаксация может быть проведена и после этого разбавления.In another embodiment, after verification of the nucleotide sequence of the reference DNA fragments in the recombinant DNA vectors, the recombinant vectors are brought into a relaxed state. To do this, use any suitable nuclease that produces at least one DNA break in any place of the recombinant vector, in addition to that portion of the reference DNA fragment that will be amplified during PCR during genetic testing. Bridging the DNA of the recombinant vector allows you to remove the DNA supercoiling, which is characteristic of ring molecules. In a preferred embodiment of the invention, a restriction endonuclease that introduces double-stranded cleavage is used for relaxation, which leads to the linearization of recombinant vectors. DNA of recombinant vectors is brought into a relaxed state if artificial reference DNA samples are created for a test system aimed at identifying a genetic variant in a DNA sample that is not susceptible to supercoiling. Preferably, the DNA relaxation of the recombinant vectors is carried out before the dilution of the solutions of the recombinant reference samples described below, however, relaxation can be carried out after this dilution.

На следующем этапе создания искусственных референсных образцов ДНК растворы, содержащие рекомбинантные векторы разбавляют до концентрации 100-10000 молекул в микролитре. Такая концентрация сопоставима с концентрацией исследуемых образцов ДНК. При этом разбавление проводят раствором, содержащим чужеродную ДНК. Разбавление раствором чужеродной ДНК позволяет получать воспроизводимые низкие концентрации рекомбинантных векторов, а также обеспечивает сложность состава искусственных референсных образцов ДНК, сопоставимую со сложностью состава тестируемых образцов ДНК.At the next stage of creating artificial reference DNA samples, solutions containing recombinant vectors are diluted to a concentration of 100-10000 molecules in a microliter. This concentration is comparable to the concentration of the studied DNA samples. In this case, the dilution is carried out with a solution containing foreign DNA. Dilution with a solution of foreign DNA allows you to get reproducible low concentrations of recombinant vectors, and also provides the complexity of the composition of artificial reference DNA samples, comparable with the complexity of the composition of the tested DNA samples.

В результате разбавления раствором чужеродной ДНК получают нормальный искусственный референсный образец ДНК, который по кинетическим свойствам соответствуют естественному образцу ДНК, полученному из гомозиготы по нормальному генетическому варианту, а также мутантный искусственный референсный образец ДНК, который по своим кинетическим свойствам соответствуют естественному образцу ДНК, полученному из гомозиготы по мутантному генетическому варианту.As a result of dilution with a solution of foreign DNA, a normal artificial reference DNA sample is obtained, which kinetic properties correspond to a natural DNA sample obtained from a homozygous normal genetic variant, as well as a mutant artificial DNA reference sample, which in its kinetic properties correspond to a natural DNA sample obtained from homozygotes for the mutant genetic variant.

На следующем этапе создают искусственный референсный образец ДНК, который имитирует гетерозиготное состояние мутантного генетического варианта. При необходимости искусственные референсные образцы ДНК, полученные на предыдущем этапе, дополнительно разбавляют так, чтобы концентрация нормального рекомбинантного вектора в разбавленном нормальном искусственном референсном образце ДНК не отличалась более, чем на 40%, от концентрации мутантного рекомбинантного вектора в разбавленном мутантном искусственном референсном образце ДНК. Затем разбавленные нормальный и мутантный искусственные референсные образцы ДНК смешивают между собой так, чтобы концентрации рекомбинантных векторов в смеси не отличались друг от друга более, чем на 40%. В результате получают гетерозиготный искусственный референсный образец ДНК, который по кинетическим свойствам соответствует естественному образцу ДНК, полученному из гетерозиготы, содержащей в своем генотипе нормальный и мутантный генетические варианты. Этот шаг позволяет сэкономить время на поиске гетерозиготы по мутантному генетическому варианту и значительно сократить время разработки тест-системы.The next step is to create an artificial reference DNA sample that mimics the heterozygous state of a mutant genetic variant. If necessary, the artificial reference DNA samples obtained in the previous step are further diluted so that the concentration of the normal recombinant vector in the diluted normal artificial reference DNA sample does not differ by more than 40% from the concentration of the mutant recombinant vector in the diluted mutant artificial reference DNA sample. Then, the diluted normal and mutant artificial reference DNA samples are mixed with each other so that the concentration of recombinant vectors in the mixture does not differ from each other by more than 40%. As a result, a heterozygous artificial reference DNA sample is obtained, which according to kinetic properties corresponds to a natural DNA sample obtained from a heterozygous containing normal and mutant genetic variants in its genotype. This step allows you to save time searching for heterozygotes for the mutant genetic variant and significantly reduce the development time of the test system.

Важно, что в любом случае для реализации способа используют искусственные референсные образцы ДНК, которые по своим кинетическим свойствам соответствуют естественным образцам ДНК, такие образцы могут быть использованы в том числе тест-системах, основанных на количественной ПЦР. В одном варианте реализации такие тест-системы включают флюоресцентный краситель, интеркалирующий в двуцепочечную ДНК. При этом для выявления определенного генетического варианта может быть использован вариант-специфический праймер или анализ кривых плавления высокого разрешения (метод HRM). В предпочтительном варианте реализации тест-системы на основе количественной ПЦР вместо интеркалирующего флюоресцентного красителя включают модифицированные олигонуклеотиды, содержащие флюорофоры, например TaqMan зонды. При этом каждому генетическому варианту однозначно соответствует определенный модифицированный олигонуклеотид.It is important that in any case, for the implementation of the method, artificial reference DNA samples are used, which according to their kinetic properties correspond to natural DNA samples, such samples can be used including test systems based on quantitative PCR. In one embodiment, such test systems include a fluorescent dye that intercalates into double-stranded DNA. Moreover, to identify a specific genetic variant, a variant-specific primer or analysis of high resolution melting curves (HRM method) can be used. In a preferred embodiment, quantitative PCR based test systems, instead of intercalating fluorescent dyes, include modified oligonucleotides containing fluorophores, such as TaqMan probes. Moreover, each genetic variant uniquely corresponds to a specific modified oligonucleotide.

Описанные выше тест-системы, основанные как на классической, так и на количественной ПЦР, содержат общие компоненты, необходимые для проведения ПЦР: буферный раствор, ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, праймеры, комплементарные нормальному и мутантному референсным фрагментам ДНК. Буферный раствор представляет собой смесь различных веществ, обеспечивающей оптимальные условия для работы ДНК-полимеразы. В указанной тест-системе используют термостабильную ДНК-полимеразу, которая катализирует реакцию полимеризации дезоксинуклеозидтрифосфатов и обеспечивает достраивание 3'-конца новой цепи ДНК согласно принципу комплементарности. Дезоксинуклеозидтрифосфаты представлены смесью дезоксиаденозинтрифосфата, дезоксигуанозинтрифосфата, дезоксицитозинтрифосфата и дезокситимидинтрифосфата. Праймеры в составе тест-систем комплементарны нормальному и мутантному референсным фрагментам ДНК. В одном варианте реализации тест-система может включать один или два праймера, комплементарных только одному референсному фрагменту ДНК. В этом случае тест-система включает более двух праймеров. В другом варианте реализации тест-система включает два праймера, составляющих пару, которые комплементарны как нормальному, так и мутантному референсному фрагменту ДНК.The test systems described above, based on both classical and quantitative PCR, contain the general components necessary for PCR: buffer solution, DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphates, primers complementary to normal and mutant reference DNA fragments. The buffer solution is a mixture of various substances, providing optimal conditions for the operation of DNA polymerase. The indicated test system uses thermostable DNA polymerase, which catalyzes the polymerization of deoxynucleoside triphosphates and ensures the completion of the 3'-end of a new DNA chain according to the principle of complementarity. Deoxynucleoside triphosphates are a mixture of deoxyadenosine triphosphate, deoxyguanosine triphosphate, deoxycytosine triphosphate and deoxythymidine triphosphate. The primers in the test systems are complementary to normal and mutant reference DNA fragments. In one embodiment, the test system may include one or two primers complementary to only one reference DNA fragment. In this case, the test system includes more than two primers. In another embodiment, the test system includes two primers that make up a pair that are complementary to both a normal and a mutant reference DNA fragment.

Краткое описание рисунков Brief Description of Drawings

Заявленное изобретения поясняется следующими рисунками:The claimed invention is illustrated by the following figures:

На Фиг.1А схематично показано взаимное расположение генетического варианта и фланкирующих праймеров.On figa schematically shows the relative position of the genetic variant and flanking primers.

На Фиг.1Б-В схематично показано взаимное расположение мутантного генетического варианта и праймеров, используемых для получения мутантного референсного фрагмента ДНК.On figb-C schematically shows the relative position of the mutant genetic variant and primers used to obtain the mutant reference DNA fragment.

Фиг.2 представляет один из возможных способов получения мутантного референсного фрагмента ДНК методов направленного мутагенеза.Figure 2 represents one of the possible ways to obtain a mutant reference DNA fragment of the methods of directed mutagenesis.

Фиг. 3А-В сравнение кинетических свойств искусственных референсных образцов ДНК с естественными образцами ДНК.FIG. 3A-B compares the kinetic properties of artificial reference DNA samples with natural DNA samples.

Подробное описание изобретения DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Особенности изобретения раскрыты в следующем описании. В рамках данного изобретения могут быть разработаны альтернативные варианты его реализации. Кроме того, хорошо известные элементы изобретения не будут описаны подробно или будут опущены, чтобы не перегружать подробностями описание настоящего изобретения. Features of the invention are disclosed in the following description. In the framework of this invention can be developed alternative options for its implementation. In addition, well-known elements of the invention will not be described in detail or will be omitted so as not to overload the description of the present invention in detail.

Изобретение описывает способ создания искусственных референсных образцов ДНК и тест-систем для генетического тестирования с применением искусственных референсных образцов ДНК, полученных описанным способом.The invention describes a method for creating artificial reference DNA samples and test systems for genetic testing using artificial reference DNA samples obtained by the described method.

Для создания искусственных референсных образцов ДНК получают нормальный и мутантный референсные фрагменты ДНК. To create artificial reference DNA samples, normal and mutant reference DNA fragments are obtained.

В одном варианте реализации настоящего изобретения, показанном на Фиг.1, референсные фрагменты ДНК 5 получают с помощью ПЦР, используя подходящую ДНК-матрицу 1 и специфические праймеры 3 и 4. Разработку дизайна последовательности нуклеотидов праймеров производят при помощи любой известной в данной области компьютерной программы. При разработке дизайна последовательности нуклеотидов специфических праймеров 3 и 4 учитывают следующие параметры: размер референсного фрагмента ДНК 5, полученного в результате ПЦР со специфическими праймерами 3 и 4, должен составлять 100-30000 п.н. Размер референсного фрагмента ДНК 5, с одной стороны, определяются тем, что референсный фрагмент ДНК 5 должен быть не меньше продукта ПЦР, получаемого в ходе применения тест-системы, для которой разрабатываются искусственные референсные образцы ДНК. С другой стороны, референсный фрагмент ДНК 5 должен быть удобен при клонировании в вектор и последующей наработке рекомбинантного вектора. Температура денатурации специфических праймеров 3 и 4 должна находиться в диапазоне 45-85°C. При этом длина последовательности нуклеотидов каждого специфического праймера обычно составляет 17-25, но может выходить за эти рамки, если позволяет получать специфический продукт ПЦР. Из списка предложенных компьютерной программой последовательностей нуклеотидов специфических праймеров выбирают те, которые имеют минимальное число неспецифических частично комплементарных участков в геноме того организма, для генетического тестирования которого разрабатывается тест-система.In one embodiment of the present invention, shown in FIG. 1, reference DNA fragments 5 are obtained by PCR using a suitable DNA template 1 and specific primers 3 and 4. The design of the primer nucleotide sequence is carried out using any computer program known in the art. . When designing the nucleotide sequence of specific primers 3 and 4, the following parameters are taken into account: the size of the reference DNA fragment 5 obtained by PCR with specific primers 3 and 4 should be 100-30000 bp The size of the reference DNA fragment 5, on the one hand, is determined by the fact that the reference DNA fragment 5 must be no less than the PCR product obtained by using a test system for which artificial reference DNA samples are developed. On the other hand, the reference DNA fragment 5 should be convenient when cloning into a vector and subsequent production of a recombinant vector. The denaturation temperature of specific primers 3 and 4 should be in the range of 45-85 ° C. Moreover, the nucleotide sequence length of each specific primer is usually 17-25, but may go beyond this if it allows to obtain a specific PCR product. From the list of specific primer nucleotide sequences proposed by the computer program, those are selected that have the minimum number of non-specific, partially complementary regions in the genome of the organism for which a test system is being developed for genetic testing.

В одном варианте реализации ДНК-матрица 1 является геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по нормальному или мутантному генетическому варианту. В другом варианте реализации ДНК-матрица 1 является геномной ДНК, выделенной из гетерозиготы, содержащей как нормальный, так и мутантный генетические варианты. Кроме геномной ДНК в качестве ДНК-матрицы 1 могут быть использованы любые молекулы ДНК, содержащие необходимый генетический вариант. Такие молекулы могут представлять собой продукты ПЦР, химически синтезированные молекулы или рекомбинантрные векторы различной природы, включая, но не ограничиваясь BAC, YAC, плазмидные или вирусные векторы.In one embodiment, the DNA template 1 is genomic DNA isolated from a homozygous for a normal or mutant genetic variant. In another embodiment, the DNA template 1 is genomic DNA isolated from a heterozygous containing both normal and mutant genetic variants. In addition to genomic DNA, any DNA molecule containing the desired genetic variant can be used as the DNA template 1. Such molecules may be PCR products, chemically synthesized molecules, or recombinant vectors of various nature, including but not limited to BAC, YAC, plasmid or viral vectors.

Специфические праймеры 3 и 4, используемые в ПЦР для получения референсных фрагментов ДНК 5, могут окружать генетический вариант 2, как показано на Фиг.1А. Такие праймеры называют фланкирующими. Если мутантный генетический вариант представляет собой замену, инсерцию или делецию такого количества нуклеотидов, что продукт ПЦР с фланкирующими праймерами 3 и 4 и ДНК, содержащей мутантный генетический вариант, имеет размер 100-30000 п.н., тогда для получения нормального и мутантного референсных фрагментов могут быть использованы одни и те же фланкирующие праймеры 3 и 4.Specific primers 3 and 4 used in PCR to obtain reference DNA fragments 5 may surround genetic variant 2, as shown in FIG. 1A. Such primers are called flanking. If the mutant genetic variant is a substitution, insertion, or deletion of such a number of nucleotides that the PCR product with flanking primers 3 and 4 and DNA containing the mutant genetic variant has a size of 100-30000 bp, then to obtain a normal and mutant reference fragments the same flanking primers 3 and 4 may be used.

В случае, если мутантный генетический вариант представляет собой такую делецию, что получение продукта ПЦР длиной 100-30000 п.н. с использованием фланкирующих праймеров оказывается невозможным, тогда для получения мутантного референсного фрагмента ДНК проводят ПЦР с использованием одного или двух дополнительных фланкирующих праймеров. На Фиг.1Б показан пример, когда делеция 7 удаляет последовательности нуклеотидов, комплементарные обоим фланкирующим праймерам 3 и 4. В этом случае мутантный референсный фрагмент ДНК 8 получают с помощью ПЦР с ДНК 6, содержащей мутантный генетический вариант, и двумя дополнительными фланкирующими праймерами 9 и 10. Если делеция удаляет последовательность нуклеотидов, комплементарную только одному из фланкирующих праймеров, тогда для получения мутантного референсного фрагмента ДНК может быть использован второй фланкирующий праймер в паре с подходящим дополнитеным фланкирующим праймером.If the mutant genetic variant is such a deletion that the PCR product is 100-30000 bp long. using flanking primers is not possible; then, to obtain a mutant reference DNA fragment, PCR is carried out using one or two additional flanking primers. FIG. 1B shows an example where a deletion 7 deletes nucleotide sequences complementary to both flanking primers 3 and 4. In this case, a mutant reference DNA fragment 8 is obtained by PCR with DNA 6 containing a mutant genetic variant, and two additional flanking primers 9 and 10. If a deletion deletes a nucleotide sequence complementary to only one of the flanking primers, then a second flanking primer can be used in conjunction with a suitable complemented flanking primer to obtain a mutant reference DNA fragment.

В том случае, когда мутантный генетический вариант представляет собой инсерцию 11 такого количества нуклеотидов, что размер продукта ПЦР с фланкирующими праймерами 3 и 4 с учетом инсерции значительно превышает 30000 п.н., тогда для получения мутантного референсного фрагмента ДНК 8 проводят ПЦР с ДНК 6, содержащей мутантный генетический вариант, и внутренним праймером 12 в паре с одним из фланкирующих праймеров, как показано на Фиг.1В. Полученный референсный фрагмент ДНК 8 имеет последовательность нуклеотидов, одна часть которой идентична последовательности нуклеотидов ДНК, расположенной с одной стороны инсерции, а вторая часть идентична части инсерции 11. ПЦР с внутренним праймером и одним из фланкирующих праймеров проводят для получения мутантного референсного фрагмента ДНК и в том случае, если мутантный генетический вариант представляет собой замену значительного количества нуклеотидов, включая нуклеотиды, комплементарные одному из фланкирующих праймеров.In the case when the mutant genetic variant is an insertion of 11 such a number of nucleotides that the size of the PCR product with flanking primers 3 and 4, taking into account the insertion, is significantly greater than 30,000 bp, then to obtain a mutant reference fragment of DNA 8, PCR with DNA 6 is performed containing a mutant genetic variant, and the internal primer 12 is paired with one of the flanking primers, as shown in Fig.1B. The obtained reference DNA fragment 8 has a nucleotide sequence, one part of which is identical to the DNA nucleotide sequence located on one side of the insertion, and the second part is identical to the insertion part 11. PCR with an internal primer and one of the flanking primers is carried out to obtain a mutant reference DNA fragment, and if the mutant genetic variant is a substitution of a significant number of nucleotides, including nucleotides complementary to one of the flanking primers.

В том случае, когда ДНК, содержащая один из генетических вариантов, недоступна или ее получение связано со значительными временными, финансовыми или иными затратами, референсный фрагмент ДНК, содержащий этот генетический вариант, может быть получен с помощью направленного мутагенеза. Направленный мутагенез может производиться любыми методами, известными специалистам в данной области техники. Однако предпочтительным является метод на основе ПЦР, представленный на Фиг.2. Указанный метод не требует никаких реактивов и оборудования в дополнение к тем, которые используются на предыдущих и последующих этапах создания искусственных референсных образцов ДНК. Чаще всего, недоступной бывает ДНК, содержащая мутантный генетический вариант, поэтому ниже описано применение метода направленного мутагенеза для получения мутантного референсного фрагмента ДНК.In the event that DNA containing one of the genetic variants is unavailable or its preparation is associated with significant time, financial or other costs, the reference DNA fragment containing this genetic variant can be obtained using directed mutagenesis. Directed mutagenesis can be carried out by any methods known to specialists in this field of technology. However, a PCR based method as shown in FIG. 2 is preferred. This method does not require any reagents and equipment in addition to those used in the previous and subsequent stages of creating artificial reference DNA samples. Most often, DNA containing a mutant genetic variant is inaccessible, therefore, the use of the directed mutagenesis method to obtain a mutant reference DNA fragment is described below.

В методе направленного мутагенеза, представленном на Фиг.2, в дополнение к фланкирующим праймерам используют пару центральных праймеров 14 и 15. Если мутантный генетический вариант 13 представляет собой замену или инсерцию такого количества нуклеотидов, которое может быть включено в последовательность праймера для ПЦР, тогда последовательности нуклеотидов центральных праймеров 14 и 15 содержат мутантный генетический вариант 13. В одном варианте реализации мутантный генетический вариант располагается на 5´-конце каждого центрального праймера, а остальная часть последовательности нуклеотидов каждого центрального праймера комплементарна последовательности нуклеотидов ДНК 16, содержащей нормальный генетический вариант. В другом варианте реализации мутантный генетический вариант 13 располагается максимально близко (±5 п.н.) к центру центральных праймеров 14 и 15, а остальная часть последовательности нуклеотидов центральных праймеров комплементарна последовательности нуклеотидов ДНК 16, содержащей нормальный генетический вариант. Общая длина каждого центрального праймера определяется длиной мутантного генетического варианта 13, а также длиной той части каждого центрального праймера, которая комплементарна участку ДНК 16, содержащей нормальный генетический вариант. Длина этой комплементарной части должна быть достаточной, чтобы однозначно задавать одну из границ специфического продукта ПЦР. Вторую границу специфического продукта ПЦР задает один из фланкирующих праймеров 3 и 4. При этом пару прямому фланкирующему праймеру 3 составляет обратный центральный праймер 14, а пару обратному фланкирующему праймеру 4 составляет прямой центральный праймер 15. Еще одним важным параметром, определяющим длину и состав центральных праймеров является длина области взаимной комплементарности центральных праймеров, которая должна в дальнейшем обеспечить устойчивую ренатурацию продуктов ПЦР 18 и 19, полученных при участии центральных праймеров. Область взаимной комплементарности включает в себя, как минимум, мутантный генетический вариант 13, а также может включать часть последовательности нуклеотидов, комплементарной ДНК 16, содержащей нормальный генетический вариант. При этом нуклеотиды, расположенные ближе к 3´-концу прямого центрального праймера 15, будут комплементарны нуклеотидам, расположенным ближе к 5´-концу обратного центрального праймера 14, и наоборот. В предпочтительном варианте реализации центральные праймеры полностью комплементарны друг другу, так как чем больше длина области взаимной комплементарности центральных праймеров, тем устойчивее в дальнейшем будет ренатурация продуктов ПЦР 18 и 19, полученных при участии центральных праймеров.In the directed mutagenesis method of FIG. 2, in addition to the flanking primers, a pair of central primers 14 and 15 are used. If mutant genetic variant 13 is a substitution or insertion of as many nucleotides as can be included in the PCR primer sequence, then the sequence the nucleotides of the central primers 14 and 15 contain a mutant genetic variant 13. In one embodiment, the mutant genetic variant is located at the 5´-end of each central primer, and the rest of the nucleotide sequence of each central primer is complementary to the nucleotide sequence of DNA 16 containing the normal genetic variant. In another embodiment, the mutant genetic variant 13 is located as close as possible (± 5 bp) to the center of the central primers 14 and 15, and the rest of the nucleotide sequence of the central primers is complementary to the nucleotide sequence of DNA 16 containing the normal genetic variant. The total length of each central primer is determined by the length of the mutant genetic variant 13, as well as the length of that part of each central primer that is complementary to the DNA portion 16 containing the normal genetic variant. The length of this complementary part must be sufficient to uniquely define one of the boundaries of a specific PCR product. The second boundary of the specific PCR product is determined by one of the flanking primers 3 and 4. In this case, the pair of the forward flanking primer 3 is the reverse central primer 14, and the pair of the reverse flanking primer 4 is the direct central primer 15. Another important parameter that determines the length and composition of the central primers is the length of the region of mutual complementarity of the central primers, which should further ensure stable renaturation of PCR products 18 and 19 obtained with the participation of the central primers. The region of mutual complementarity includes at least the mutant genetic variant 13, and may also include part of the nucleotide sequence complementary to DNA 16 containing the normal genetic variant. In this case, nucleotides located closer to the 3´-end of the direct central primer 15 will be complementary to nucleotides located closer to the 5´-end of the reverse central primer 14, and vice versa. In a preferred embodiment, the central primers are completely complementary to each other, since the longer the region of mutual complementarity of the central primers is, the more stable the renaturation of PCR products 18 and 19 will be, obtained with the participation of the central primers.

В случае, когда мутантный генетический вариант представляет собой делецию такого количества нуклеотидов, которое не может быть включено в последовательность праймера для ПЦР, тогда одна часть последовательности нуклеотидов каждого центрального праймера комплементарна участку ДНК, содержащей нормальный генетический вариант, примыкающему к одной границе делеции, а вторая часть последовательности нуклеотидов каждого центрального праймера комплементарна участку ДНК, содержащей нормальный генетический вариант, примыкающему ко второй границе делеции.In the case when the mutant genetic variant is a deletion of such a number of nucleotides that cannot be included in the PCR primer sequence, then one part of the nucleotide sequence of each central primer is complementary to the DNA region containing the normal genetic variant adjacent to one border of the deletion, and the second a portion of the nucleotide sequence of each central primer is complementary to a region of DNA containing the normal genetic variant adjacent to the second border of the deletion.

Для получения мутантного референсного фрагмента ДНК 8 проводят две независимые ПЦР с ДНК 16, содержащей нормальный генетический вариант 17. В одной ПЦР используется прямой фланкирующий праймер 3 и обратный центральный праймер 14, во второй ПЦР используется прямой центральный праймер 15 и обратный фланкирующий праймер 4. В результате получают два частично совпадающих продукта ПЦР 18 и 19, которые содержат мутантный генетический вариант 13. Длина совпадающего участка соответствует области взаимной комплементарности центральных праймеров. Продукты ПЦР 18 и 19 очищают от оставшихся праймеров и смешивают в эквимолярных концентрациях. Полученную смесь используют для проведения 8-15 ПЦР в отсутствие праймеров. В этой реакции продукты ПЦР 18 и 19 сначала денатурируют, а затем ренатурируют с образованием гетерокомплексов 20, в которых цепи ДНК денатурированных продуктов ПЦР 18 и 19 образуют водородные связи на комплементарном участке, соответствующем области взаимной комплементарности центральных праймеров. ДНК-полимераза использует 3´-конец каждой цепи ДНК гетерокомплекса в качестве праймера и достраивает одну цепь ДНК по шаблону другой цепи ДНК. В результате этой реакции получается мутантный референсный фрагмент ДНК 8, однако его количества недостаточно, для дальнейшего создания искусственного референсного образца ДНК. Поэтому реакционную смесь, содержащую мутантный референсный фрагмент ДНК 8, разбавляют в 100-1000 раз и используют в ПЦР с фланкирующими праймерами 3 и 4. В результате получают мутантный референсный фрагмент ДНК 8 в том количестве, которое необходимо для дальнейших этапов создания искусственного мутантного референсного образца ДНК.To obtain a mutant reference fragment of DNA 8, two independent PCRs are performed with DNA 16 containing the normal genetic variant 17. In one PCR, direct flanking primer 3 and reverse central primer 14 are used, in the second PCR, direct central primer 15 and reverse flanking primer 4 are used. B the result is two partially overlapping PCR products 18 and 19, which contain the mutant genetic variant 13. The length of the overlapping region corresponds to the region of mutual complementarity of the central primers. PCR products 18 and 19 are purified from the remaining primers and mixed in equimolar concentrations. The resulting mixture is used for 8-15 PCR in the absence of primers. In this reaction, the PCR products 18 and 19 are first denatured and then renatured to form heterocomplexes 20, in which the DNA strands of the denatured PCR products 18 and 19 form hydrogen bonds in a complementary region corresponding to the region of mutual complementarity of the central primers. DNA polymerase uses the 3´-end of each DNA strand of the heterocomplex as a primer and completes one DNA strand according to the template of another DNA strand. As a result of this reaction, a mutant reference fragment of DNA 8 is obtained, but its quantity is not enough to further create an artificial reference DNA sample. Therefore, the reaction mixture containing the mutant reference DNA fragment 8 is diluted 100-1000 times and used in PCR with flanking primers 3 and 4. As a result, the mutant reference DNA fragment 8 is obtained in the amount that is necessary for further steps to create an artificial mutant reference sample DNA

Если мутантный генетический вариант представляет собой делецию такого количества нуклеотидов, что получить мутантный референсный фрагмент ДНК 8 размером 100-1000 п.н в ПЦР с фланкирующими праймерами 3 и 4 оказывается невозможно, тогда в описанном методе направленного мутагенеза вместо одного или двух фланкирующих праймеров 3 и 4 могут быть использованы один или два дополнительных фланкирующих праймера 9 и 10. If the mutant genetic variant is a deletion of such a number of nucleotides that it is impossible to obtain a mutant reference DNA fragment of size 8 of 100-1000 bp in PCR with flanking primers 3 and 4, then in the described method of directed mutagenesis instead of one or two flanking primers 3 and 4, one or two additional flanking primers 9 and 10 may be used.

Получение мутантного референсного фрагмента ДНК методом направленного мутагенеза позволяет значительно сэкономить время на поиске особи, содержащей мутантный генетический вариант, и сократить время разработки тест-системы.Obtaining a mutant reference DNA fragment by the method of directed mutagenesis can significantly save time on the search for individuals containing the mutant genetic variant, and reduce the development time of the test system.

Понятно, что если доступна ДНК, содержащая мутантный генетический вариант, но недоступна ДНК, содержащая нормальный генетический вариант, тогда нормальный референсный фрагмент ДНК может быть получен с помощью метода направленного мутагенеза, описанного выше.It is understood that if DNA containing a mutated genetic variant is available, but DNA containing a normal genetic variant is not available, then a normal reference DNA fragment can be obtained using the directed mutagenesis method described above.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения, мутантный референсный фрагмент ДНК и/или нормальный референсный фрагмент ДНК могут быть синтезированы химически, получены методами клонирования или получены с помощью любой комбинации методов химического синтеза, клонирования и направленного мутагенеза.In one embodiment of the present invention, a mutant reference DNA fragment and / or a normal reference DNA fragment can be synthesized chemically, obtained by cloning, or obtained using any combination of chemical synthesis, cloning and directed mutagenesis methods.

На следующем этапе создания искусственных референсных образцов ДНК, полученные описанными выше способами референсные фрагменты ДНК клонируют в генетические векторы. Этот шаг позволяет в короткие сроки в лабораторных условиях получать референсные фрагменты ДНК в любых количествах, необходимых для дальнейшей работы. Для клонирования могут применяться любые методы, известные в данной области техники. Генетические векторы могут представлять собой плазмидные векторы, вирусные векторы (в том числе фаговые векторы), BAC, YAC, а также любые подходящие генетические векторы.In the next step in creating artificial reference DNA samples, the reference DNA fragments obtained by the methods described above are cloned into genetic vectors. This step allows in a short time in the laboratory to obtain reference DNA fragments in any quantities necessary for further work. For cloning, any methods known in the art can be used. Genetic vectors can be plasmid vectors, viral vectors (including phage vectors), BAC, YAC, as well as any suitable genetic vectors.

Последовательности нуклеотидов референсных фрагментов ДНК, клонированных в векторы, верифицируют методом секвенирования. Этот шаг необходим для того, чтобы гарантировать, что референсные фрагменты ДНК в составе рекомбинантных векторов действительно содержат нормальный и мутантный генетические варианты. Верификацию последовательности нуклеотидов референсных фрагментов ДНК достаточно провести один раз за все время создания искусственных референсных образцов ДНК, так как последовательности нуклеотидов референсных фрагментов ДНК в составе рекомбинантных векторов не меняются при дальнейших манипуляциях согласно настоящему изобретению. Для дальнейших этапов создания искусственных референсных образцов ДНК выбирают только те рекомбинантные векторы, которые содержат референсные фрагменты ДНК с ожидаемой последовательностью нуклеотидов, содержащей нормальный или мутантный генетические варианты.The nucleotide sequences of reference DNA fragments cloned into vectors are verified by sequencing. This step is necessary in order to ensure that the reference DNA fragments in the recombinant vectors do contain normal and mutant genetic variants. The verification of the nucleotide sequence of the reference DNA fragments is sufficient to carry out once for the entire time the creation of artificial reference DNA samples, since the nucleotide sequence of the reference DNA fragments in the composition of the recombinant vectors do not change during further manipulations according to the present invention. For the further stages of creating artificial reference DNA samples, only those recombinant vectors are selected that contain reference DNA fragments with the expected nucleotide sequence containing normal or mutant genetic variants.

Дальнейшие этапы создания искусственных референсных образцов ДНК зависят от принципа работы тест-системы, для которой создаются искусственные референсные образцы ДНК. В одном из вариантов реализации после выделения рекомбинантных векторов из клеток, концентрацию рекомбинантных векторов измеряют на высокоточном спектрофотометре (например, NanoDrop) или на любом другом подходящем приборе. После этого растворы рекомбинантных векторов разбавляют так, чтобы молярные концентрации рекомбинантных векторов были сопоставимы с концентрацией исследуемого образца. Разбавление необходимо для того, чтобы снизить концентрацию ингибиторов ПЦР, которые могут попалать в растворы рекомбинантных векторов при выделенных из клеток. Кроме того, разбавление облегчает дальнейший анализ и интерпретацию результата генетического тестирования. Если не проводить разбавления, то при электрофорезе можно перегрузить дорожку геля продуктами ПЦР, полученными при использовании неразбавленных растворов рекомбинантных векторов. При подобном перегрузе продукты ПЦР в геле будут двигаться иначе, чем фрагменты ДНК, нанесенные на гель без перегруза. В этом случае будет сложно сравнить размеры продуктов ПЦР, полученных при использовании искусственных референсных образцов ДНК и при использовании тестируемого образца ДНК. Слишком большое количество продуктов ПЦР, полученных при использовании неразбавленных растворов рекомбинантных векторов, может также исказить паттерн расщепления специфической эндонуклеазой рестрикции, какая-то часть продуктов ПЦР может оказаться нерасщепленной. Все это затрудняет интерпретацию результатов генетического тестирования, полученных при использовании тест-систем на основе классической ПЦР. В одном варианте реализации разбавление проводят очищенной водой, в другом варианте реализации разбавление проводят любым буферным раствором, который не препятствует прохождению ПЦР при дальнейшем генетическом тестировании. В результате получают искусственные референсные образцы ДНК, которые могут применяться в тест-системах, основанных на классической ПЦР.The further stages of creating artificial reference DNA samples depend on the principle of operation of the test system for which artificial reference DNA samples are created. In one embodiment, after isolation of the recombinant vectors from the cells, the concentration of the recombinant vectors is measured using a high-precision spectrophotometer (e.g., NanoDrop) or any other suitable device. After that, the solutions of the recombinant vectors are diluted so that the molar concentrations of the recombinant vectors are comparable with the concentration of the test sample. Dilution is necessary in order to reduce the concentration of PCR inhibitors that can enter the solutions of recombinant vectors when isolated from cells. In addition, dilution facilitates further analysis and interpretation of the result of genetic testing. If dilution is not carried out, then during electrophoresis it is possible to overload the gel path with PCR products obtained using undiluted solutions of recombinant vectors. With such an overload, the PCR products in the gel will move differently than DNA fragments deposited on the gel without overload. In this case, it will be difficult to compare the sizes of PCR products obtained using artificial reference DNA samples and when using a test DNA sample. Too many PCR products obtained using undiluted solutions of recombinant vectors can also distort the cleavage pattern of specific restriction endonuclease, some of the PCR products may be unsplit. All this makes it difficult to interpret the results of genetic testing obtained using test systems based on classical PCR. In one embodiment, the dilution is carried out with purified water, in another embodiment, the dilution is carried out with any buffer solution that does not interfere with the passage of PCR during further genetic testing. The result is artificial reference DNA samples that can be used in test systems based on classical PCR.

Для получения искусственных референсных образцов ДНК для тест-систем, основанных на количественной ПЦР, после выделения рекомбинантных векторов их ДНК приводят в релаксированное состояние. Релаксация ДНК рекомбинантных векторов позволяет избежать искажений кинетики ПЦР, связанных со сверхспирализацией ДНК, характерной для кольцевых молекул (Hou et al., 2010). Сверхспирализация влияет на температуру денатурации ДНК-матрицы, затрудняет комплементарное связывание праймера с ДНК-матрицей, затрудняет синтез новой цепи ДНК. Таким образом сверхспирализация ДНК-матрицы снижает эффективность амплификации. Если не проводить релаксацию ДНК рекомбинантных векторов, то в количественной ПЦР референсные образцы ДНК будут демонстрировать кинетические свойства, отличные от кинетических свойств тестируемых образцов ДНК, которые чаще всего представлены линейной геномной ДНК. Релаксацию ДНК рекомбинантных векторов проводят с помощью нуклеазы, которая вносит не менее одного разрыва в любом месте рекомбинантного вектора, кроме того участка референсного фрагмента ДНК, который будет амплифицирован в ПЦР в ходе использования тест-системы. В предпочтительном варианте исполнения используют эндонуклеазу, которая производит двуцепочечный разрыв ДНК, что приводит к лианеризации рекомбинантных векторов. Релаксация ДНК рекомбинантных векторов может проводиться как до, так и после разбавления растворов рекомбинантных векторов, которое описано ниже.To obtain artificial reference DNA samples for test systems based on quantitative PCR, after isolation of recombinant vectors, their DNA is brought into a relaxed state. DNA relaxation of recombinant vectors avoids distortions in the PCR kinetics associated with DNA supercoiling, which is characteristic of ring molecules (Hou et al., 2010). Supercoiling affects the temperature of denaturation of the DNA template, complicates the complementary binding of the primer to the DNA template, and complicates the synthesis of a new DNA strand. Thus, supercoiling of the DNA template decreases the amplification efficiency. If the DNA of the recombinant vectors is not relaxed, then in quantitative PCR the reference DNA samples will demonstrate kinetic properties different from the kinetic properties of the tested DNA samples, which are most often represented by linear genomic DNA. DNA relaxation of recombinant vectors is carried out using nuclease, which introduces at least one gap in any place of the recombinant vector, in addition to the portion of the reference DNA fragment that will be amplified by PCR during the use of the test system. In a preferred embodiment, an endonuclease that double-strand breaks the DNA is used, which leads to the lianerization of the recombinant vectors. DNA relaxation of recombinant vectors can be carried out both before and after dilution of the solutions of recombinant vectors, which is described below.

Рекомбинантные векторы разбавляют до концентрации 100-10000 молекул в микролитре, что сопоставимо с концентрациями тестируемых образцов ДНК. Для этого с раствором каждого рекомбинантного вектора проводят серию последовательных разведений. Затем проводят количественные ПЦР с растворами, полученными в результате последовательных разведений, и с естественным образцом ДНК. Выбирают тот раствор, Ct которого максимально близок к Ct естественного образца ДНК. Если необходимо, концентрацию рекомбинантного вектора в выбранном растворе корректируют так, чтобы Ct скорректированного раствора находился между 20 и 30 циклом. Recombinant vectors are diluted to a concentration of 100-10000 molecules in a microliter, which is comparable with the concentrations of the tested DNA samples. For this, a series of serial dilutions are carried out with a solution of each recombinant vector. Then carry out quantitative PCR with solutions obtained by serial dilutions, and with a natural DNA sample. Choose the solution whose Ct is as close as possible to the Ct of the natural DNA sample. If necessary, the concentration of the recombinant vector in the selected solution is adjusted so that the Ct of the adjusted solution is between 20 and 30 cycles.

Как правило, тестируемые образцы ДНК представляют собой геномную ДНК или митохондриальную ДНК, выделенную из биологических образцов, взятых у особи, в отношении которой проводится тестирование. Генетический вариант, на выявление которого направлена тест-система, составляет малую часть геномной или митохондриальной ДНК. Соответственно, количество участка ДНК, содержащего исследуемый генетический вариант, которое может быть использовано для генетического тестирования, очень мало и составляет приблизительно от 100 до 10000 копий в микролитре раствора. Как показал опыт, разбавление раствора рекомбинантных векторов чистой водой до концентрации приблизительно от 100 до 10000 молекул в микролитре дает плохо воспроизводимые результаты в количественной ПЦР: разница между Ct даже в двух технических повторах может достигать 7 циклов. Чтобы решить эту проблему, разбавление растворов рекомбинантных векторов проводят не чистой водой, а раствором чужеродной ДНК. В предпочтительном варианте реализации чужеродная ДНК является геномной ДНК, выделенной из особей эволюционно отдаленного биологического вида. При этом выбирают такую чужеродную ДНК, которая обеспечивает наилучший результат. После разбавления растворов рекомбинантных векторов раствором выбранной чужеродной ДНК разница между Ct в двух технических повторах не должна превышать 0,5 цикла. При этом концентрация чужеродной ДНК в разбавленных растворах рекомбинантных векторов составляет 1-10 нг/мкл. Помимо стабилизации кинетики ПЦР разбавление раствором чужеродной ДНК обеспечивает сложность состава ДНК референсных образцов, сопоставимую со сложностью исследуемых образцов ДНК.Typically, the tested DNA samples are genomic DNA or mitochondrial DNA isolated from biological samples taken from an individual for which testing is being conducted. The genetic variant, which the test system is aimed at, makes up a small part of genomic or mitochondrial DNA. Accordingly, the amount of DNA that contains the studied genetic variant, which can be used for genetic testing, is very small and ranges from about 100 to 10,000 copies in a microliter of the solution. Experience has shown that diluting a solution of recombinant vectors with pure water to a concentration of about 100 to 10,000 molecules in a microliter gives poorly reproducible results in quantitative PCR: the difference between Ct even in two technical repetitions can reach 7 cycles. To solve this problem, the dilution of solutions of recombinant vectors is carried out not with pure water, but with a solution of foreign DNA. In a preferred embodiment, the foreign DNA is genomic DNA isolated from individuals of an evolutionarily distant species. In this case, a foreign DNA is selected that provides the best result. After diluting the solutions of recombinant vectors with a solution of the chosen foreign DNA, the difference between Ct in two technical repeats should not exceed 0.5 cycle. The concentration of foreign DNA in dilute solutions of recombinant vectors is 1-10 ng / μl. In addition to stabilizing the kinetics of PCR, dilution with a solution of foreign DNA provides the complexity of the DNA composition of the reference samples, comparable with the complexity of the studied DNA samples.

В результате корректировки концентрации рекомбинантных векторов получают два искусственных референсных образца ДНК. Нормальный искусственный референсный образец ДНК содержит нормальный генетический вариант и по кинетическим свойствам соответствует естественному образцу ДНК, полученному из гомозиготы по нормальному генетическому варианту. Мутантный искусственный референсный образец ДНК содержит мутантный генетический вариант и по кинетическим свойствам соответствует естественному образцу ДНК, полученному из гомозиготы по мутантному генетическому варианту.As a result of adjusting the concentration of recombinant vectors, two artificial reference DNA samples are obtained. A normal artificial reference DNA sample contains a normal genetic variant and in kinetic properties corresponds to a natural DNA sample obtained from a homozygous for a normal genetic variant. A mutant artificial reference DNA sample contains a mutant genetic variant and in kinetic properties corresponds to a natural DNA sample obtained from a homozygous mutant genetic variant.

Для создания искусственного референсного образца ДНК, соответствующего гетерозиготному состоянию исследуемого генетического варианта, получают два раствора с приблизительно равными концентрациями релаксированных рекомбинантных векторов. Для этого при необходимости нормальный и мутантный искусственные референсные образцы ДНК разбавляют раствором чужеродной ДНК так, чтобы разница между Ct для разбавленных нормального и мутантного искусственных референсных образцов ДНК составляла не более 0,5 цикла, что при максимальной эффективности праймеров соответствует 40%. При этом Ct для разбавленных нормального и мутантного искусственных референсных образцов ДНК должны находится в пределах между 20 и 30 циклом. Разбавленные нормальный и мутантный искусственные референсные образцы ДНК смешивают между собой так, чтобы концентрации рекомбинантных векторов в смеси не отличались друг от друга более, чем на 40%. В результате получают гетерозиготный искусственный референсный образец ДНК, содержащий в равных количествах нормальный и мутантный генетические варианты. При этом кинетические свойства гетерозиготного искусственного референсного образца ДНК соответствуют естественному образцу ДНК, полученному из гетерозиготы, содержащей в своем генотипе нормальный и мутантный генетические варианты.To create an artificial reference DNA sample corresponding to the heterozygous state of the studied genetic variant, two solutions are obtained with approximately equal concentrations of relaxed recombinant vectors. To do this, if necessary, normal and mutant artificial reference DNA samples are diluted with a foreign DNA solution so that the difference between Ct for diluted normal and mutant artificial reference DNA samples is no more than 0.5 cycle, which corresponds to 40% at maximum primer efficiency. In this case, Ct for diluted normal and mutant artificial reference DNA samples should be between 20 and 30 cycles. Diluted normal and mutant artificial reference DNA samples are mixed with each other so that the concentration of recombinant vectors in the mixture does not differ from each other by more than 40%. The result is a heterozygous artificial reference DNA sample containing equal amounts of normal and mutant genetic variants. At the same time, the kinetic properties of the heterozygous artificial reference DNA sample correspond to the natural DNA sample obtained from a heterozygous containing normal and mutant genetic variants in its genotype.

Тест-системы, включающие искусственные референсные образцы ДНК, созданные способом, описанным в настоящем изобретенииTest systems comprising artificial reference DNA samples created by the method described in the present invention

Искусственные референсные образцы ДНК, полученные описанным способом используют в тест-системах, основанных на ПЦР. Такие тест-системы, помимо референсных образцов ДНК, содержат буферный раствор для проведения ПЦР, ДНК-полимеразу дезоксинуклеозидтрифосфаты и специфические праймеры.Artificial reference DNA samples obtained by the described method are used in PCR-based test systems. Such test systems, in addition to reference DNA samples, contain a buffer solution for PCR, DNA polymerase deoxynucleoside triphosphates and specific primers.

Буферный раствор представляет собой смесь различных солей, обеспечивающей оптимальные условия для работы ДНК-полимеразы, в том числе стабильное значение  рН 6-10 (при 25 °С). Основой буферного раствора могут служить такие буферные вещества, как соли трис(гидроксиметил)аминометана (Tris), HEPES, MOPS и др. Буферный раствор содержит ионы Mg2+, которые необходимы для ферментативной активности ДНК-полимеразы. Среди прочих солей буферный раствор может содержать КСl, который стимулирует активность ДНК-полимеразы. Буферный раствор может содержать детергенты, например, NP-40, Triton X-100 или Tween 20, предотвращающие адсорбцию ДНК-полимеразы на пластиковых поверхностях (пробирки или лунки планшета, в которой проходит реакция ПЦР). Кроме того, буферный раствор может содержать дополнительные компоненты, повышающие специфичность и/или эффективность амплификации, например, диметилсульфоксид (ДМСО), формамид, бетаин, ацетамид, бычий сывороточный альбумин (БСА), полиэтиленгликоль (PEG) и другие.The buffer solution is a mixture of various salts, providing optimal conditions for the operation of DNA polymerase, including a stable pH value of 6-10 (at 25 ° C). The basis of the buffer solution can serve as such buffer substances as salts of Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris), HEPES, MOPS, etc. The buffer solution contains Mg 2+ ions , which are necessary for the enzymatic activity of DNA polymerase. Among other salts, the buffer solution may contain KCl, which stimulates the activity of DNA polymerase. The buffer solution may contain detergents, for example, NP-40, Triton X-100 or Tween 20, which prevent the adsorption of DNA polymerase on plastic surfaces (tubes or wells of the plate in which the PCR reaction takes place). In addition, the buffer solution may contain additional components that increase the specificity and / or amplification efficiency, for example, dimethyl sulfoxide (DMSO), formamide, betaine, acetamide, bovine serum albumin (BSA), polyethylene glycol (PEG) and others.

ДНК-полимераза катализирует реакцию полимеризации дезоксинуклеозидтрифосфатов и обеспечивает достраивание 3'-конца новой цепи ДНК согласно принципу комплементарности. ДНК-полимераза для использования в ПЦР должна сохранять ферментативную активность при высокой температуре длительное время. Поэтому описанные тест-системы включают термостабильные ДНК-полимеразы, например, Taq-полимеразу, Pfu-полимеразу, Pwo-полимеразу, а также различные ДНК-полимеразы, полученные генно-инженерным путём.DNA polymerase catalyzes the polymerization of deoxynucleoside triphosphates and ensures the completion of the 3'-end of a new DNA chain according to the principle of complementarity. DNA polymerase for use in PCR should retain enzymatic activity at high temperature for a long time. Therefore, the described test systems include thermostable DNA polymerases, for example, Taq polymerase, Pfu polymerase, Pwo polymerase, as well as various DNA polymerases obtained by genetic engineering.

Дезоксинуклеозидтрифосфаты служат субстратом для ДНК-полимеразы при синтезе новой цепи ДНК. В тест-системах на основе ПЦР дезоксинуклеозидтрифосфаты представлены смесью дезоксиаденозинтрифосфата, дезоксигуанозинтрифосфата, дезоксицитозинтрифосфата и дезокситимидинтрифосфата, где указанные дезоксинуклеозидтрифосфаты смешаны в приблизительно равных пропорциях. При этом описанная смесь обеспечивает общую концентрацию дезоксинуклеозидтрифосфатов в конечной реакционной смеси при использовании тест-системы 10-500 микромоль/л.Deoxynucleoside triphosphates serve as a substrate for DNA polymerase in the synthesis of a new DNA strand. In PCR-based test systems, deoxynucleoside triphosphates are represented by a mixture of deoxyadenosine triphosphate, deoxyguanosine triphosphate, deoxycytosine triphosphate and deoxy thymidine triphosphate, wherein said deoxynucleoside triphosphates are mixed in approximately equal proportions. Moreover, the described mixture provides a total concentration of deoxynucleoside triphosphates in the final reaction mixture using a test system of 10-500 micromol / L.

Праймеры в составе тест-систем комплементарны нормальному и мутантному референсным фрагментам ДНК. В одном варианте реализации тест-система может включать один или два праймера, комплементарных только одному референсному фрагменту ДНК. В этом случае тест-система включает более двух праймеров. В другом варианте реализации тест-система включает два праймера, составляющих пару, которые комплементарны как нормальному, так и мутантному референсному фрагменту ДНК. В этом случае праймеры в составе тест-системы окружают генетические варианты. Праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы. Температура денатурации специфических праймеров 3 и 4 должна находиться в диапазоне 45-85°C. При этом длина последовательности нуклеотидов каждого специфического праймера обычно составляет 17-25, но может выходить за эти рамки, если позволяет получать специфический продукт ПЦР. В первую очередь праймеры должны быть специфичными. Особое внимание уделяют 3'-концам праймеров, так как именно с них ДНК-полимераза начинает достраивать комплементарную цепь ДНК. Если специфичность праймеров недостаточна, то высока вероятность образования неспецифического продукта ПЦР при использовании тест-системы, что может дать ложно-позитивный результат генетического тестирования.The primers in the test systems are complementary to normal and mutant reference DNA fragments. In one embodiment, the test system may include one or two primers complementary to only one reference DNA fragment. In this case, the test system includes more than two primers. In another embodiment, the test system includes two primers that make up a pair that are complementary to both a normal and a mutant reference DNA fragment. In this case, primers in the test system surround genetic variants. Primers provide specificity and sensitivity of the test system. The denaturation temperature of specific primers 3 and 4 should be in the range of 45-85 ° C. Moreover, the nucleotide sequence length of each specific primer is usually 17-25, but may go beyond this if it allows to obtain a specific PCR product. Primarily, primers must be specific. Particular attention is paid to the 3'-ends of the primers, since it is from them that DNA polymerase begins to complete the complementary DNA strand. If the specificity of the primers is insufficient, then the probability of the formation of a nonspecific PCR product when using a test system is high, which can give a false positive result of genetic testing.

В некоторых вариантах реализации в одном растворе могут быть смешаны в различных сочетаниях описанные выше буферный раствор, смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов и праймеры.In some embodiments, the above-described buffer solution, a mixture of deoxynucleoside triphosphates, and primers can be mixed in various combinations in one solution.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения тест-система может быть основана на классической ПЦР. Искусственные референсные образцы ДНК в такой тест-системе представляют собой рекомбинантные векторы, разбавленные очищенной водой или любым подходящим буферным раствором. При этом ДНК рекомбинантных векторов могут иметь релаксированную форму или кольцевую сверхспирализованную форму, а концентрации искусственных референсных образцов ДНК могут различаться между собой в 1-100 раз. В одном из вариантов реализации определение генетического варианта в тестируемом образце ДНК, проводят путем сравнения размера продукта ПЦР, полученного при использовании тестируемого образца ДНК, с размерами продуктов ПЦР, полученных при использовании искусственных референсных образцов ДНК. При этом размеры продуктов ПЦР чаще всего оценивают с помощью электрофореза. При этом буферный раствор в составе тест-системы может включать в себя инертные красители ДНК, позволяющие анализировать размер продуктов ПЦР с помощью электрофореза. Описанная тест-система может применяться для выявления мутантных генетических вариантов, представляющих собой делецию или инсерцию такого количества нуклеотидов, которое приведет к изменениям размера продукта ПЦР, которое можно однозначно детектировать с помощью электрофореза. В другом варианте реализации определение генетического варианта в тестируемом образце ДНК, может проводиться путем сравнения паттерна расщепления специфической эндонуклеазой рестрикции продукта ПЦР, полученного при использовании тестируемого образца ДНК, с паттерном расщепления этой же эндонуклеазой рестрикции продуктов ПЦР, полученных при использовании искусственных референсных образцов ДНК. В этом случае тест-система дополнительно включает специфическую эндонуклеазу рестрикции Для оценки паттерна расщепления продуктов ПЦР специфической эндонуклеазой рестрикции чаще всего используют электрофорез. В этом варианте реализации буферный раствор в составе тест-системы также может включать в себя инертные красители ДНК. Описанная тест-система может применяться для выявления мутантных генетических вариантов, представляющих собой делецию, инсерцию или замену нуклеотидов, которые приводят к исчезновению таких сайтов рестрикции специфической эндонуклеазы, что изменения паттерна расщепления продуктов ПЦР этой специфической эндонуклеазой рестрикции можно однозначно детектировать с помощью электрофореза.In one embodiment of the present invention, the test system may be based on classical PCR. Artificial reference DNA samples in such a test system are recombinant vectors diluted with purified water or any suitable buffer solution. In this case, the DNA of recombinant vectors can have a relaxed shape or an annular supercoiled form, and the concentrations of artificial reference DNA samples can vary by a factor of 1-100. In one embodiment, the determination of the genetic variant in the test DNA sample is carried out by comparing the size of the PCR product obtained using the test DNA sample with the sizes of the PCR products obtained using artificial reference DNA samples. Moreover, the sizes of PCR products are most often evaluated by electrophoresis. In this case, the buffer solution in the test system may include inert DNA dyes, which allow analyzing the size of PCR products using electrophoresis. The described test system can be used to detect mutant genetic variants representing a deletion or insertion of such a number of nucleotides that will lead to changes in the size of the PCR product, which can be unambiguously detected by electrophoresis. In another embodiment, the determination of the genetic variant in the test DNA sample can be carried out by comparing the pattern of cleavage with a specific restriction endonuclease of the PCR product obtained using the test DNA sample with the cleavage pattern of the restriction endonuclease of PCR products obtained using the artificial reference DNA samples. In this case, the test system additionally includes a specific restriction endonuclease. To evaluate the pattern of cleavage of PCR products by a specific restriction endonuclease, electrophoresis is most often used. In this embodiment, the buffer solution in the test system may also include inert DNA dyes. The described test system can be used to identify mutant genetic variants, which are a deletion, insertion or replacement of nucleotides that lead to the disappearance of such restriction sites of a specific endonuclease that changes in the cleavage pattern of PCR products of this specific restriction endonuclease can be unambiguously detected by electrophoresis.

Еще в одном воплощении настоящего изобретения тест-система, включающая искусственные референсные образцы ДНК, созданные описанным выше способом, может быть основана на количественной ПЦР. Искусственные референсные образцы ДНК в такой тест-системе представляют собой растворы рекомбинантных векторов, разбавленные раствором чужеродной ДНК. При этом ДНК рекомбинантных векторов могут быть в релаксированном состоянии для того, чтобы воспроизводить свойства естественных образцов ДНК. При этом кинетические свойства нормального искусственного референсного образца ДНК соответствуют кинетическим свойствам естественного образца ДНК, полученного от гомозиготы по нормальному генетическому варианту, а кинетические свойства мутантного искусственного референсного образца ДНК соответствуют кинетическим свойствам естественного образца ДНК, полученного от гомозиготы по мутантному генетическому варианту. Указанная тест-система может содержать гетерозиготный искусственный референсный образец ДНК, содержащий в приблизительно равных количествах линеаризованные плазмидные векторы с клонированными в них нормальным и мутантным референсными фрагментами ДНК. При этом кинетические свойства гетерозиготного искусственного референсного образца ДНК соответствуют кинетическим свойствам естественного образца ДНК, полученного из гетерозиготы, содержащей в своем генотипе нормальный и мутантный генетические варианты.In yet another embodiment of the present invention, a test system comprising artificial reference DNA samples generated by the method described above can be based on quantitative PCR. Artificial reference DNA samples in such a test system are solutions of recombinant vectors diluted with a solution of foreign DNA. Moreover, DNA of recombinant vectors can be in a relaxed state in order to reproduce the properties of natural DNA samples. In this case, the kinetic properties of a normal artificial reference DNA sample correspond to the kinetic properties of a natural DNA sample obtained from a homozygous normal genetic variant, and the kinetic properties of a mutant artificial reference DNA sample correspond to the kinetic properties of a natural DNA sample obtained from a homozygous mutant genetic variant. The specified test system may contain a heterozygous artificial reference DNA sample containing approximately equal amounts of linearized plasmid vectors with normal and mutant reference DNA fragments cloned in them. In this case, the kinetic properties of a heterozygous artificial reference DNA sample correspond to the kinetic properties of a natural DNA sample obtained from a heterozygous containing normal and mutant genetic variants in its genotype.

В одном из воплощений настоящего изобретения тест-система на основе количественной ПЦР в дополнение к перечисленным выше компонентам содержит любой подходящий краситель, интеркалирующий в двуцепочечную ДНК. Чаще всего таким красителем является SYBR Green. При этом в одном из вариантов реализации определенный генетический вариант в тестируемом образце ДНК выявляют за счет использования праймеров, специфических только этого определенного генетического варианта. В другом варианте реализации для определения генетического варианта в тестируемом образце ДНК используют метод HRM (high-resolution melting).In one embodiment of the present invention, a quantitative PCR based test system, in addition to the above components, contains any suitable dye that intercalates into double-stranded DNA. Most often, such a dye is SYBR Green. Moreover, in one embodiment, a specific genetic variant in the test DNA sample is detected through the use of primers specific only to this particular genetic variant. In another embodiment, the HRM (high-resolution melting) method is used to determine the genetic variant in the test DNA sample.

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения тест-система на основе количественной ПЦР в дополнение к общим компонентам содержит флюорофор-содержащие олигонуклеотиды, например, Taq-Man зонды, которые флюоресцируют после расщепления ДНК-полимеразой во время синтеза каждой новой цепи ДНК. При этом в тест-системе используют Taq-Man зонды, каждый из которых специфичен для одного определенного генетического варианта. Соответственно, Taq-Man зонды отличаются друг от друга последовательностью нуклеотидов, могут отличаться флюорофорами и гасителями, поглощающими свет, испускаемый флюорофорами. In a preferred embodiment of the present invention, a quantitative PCR-based test system in addition to common components contains fluorophore-containing oligonucleotides, for example, Taq-Man probes, which fluoresce after cleavage with DNA polymerase during the synthesis of each new DNA strand. At the same time, Taq-Man probes are used in the test system, each of which is specific for one specific genetic variant. Accordingly, Taq-Man probes differ from each other in the sequence of nucleotides, can differ in fluorophores and dampers, absorbing the light emitted by the fluorophores.

Пример 1: Создание искусственных референсных образцов для выявления мутантного генетического варианта, ассоциированного с дегенеративной миелопатией у собак.Example 1: Creation of artificial reference samples to identify a mutant genetic variant associated with degenerative myelopathy in dogs.

Дегенеративная миелопатия - это тяжёлое прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, приводящее к параличу задних конечностей у собак, гомозиготных по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1. Этот мутантный аллель с разной частотой встречается у многих пород собак. Например, у собак породы Вельш корги пемброк только около 7% особей являются гомозиготами по нормальному аллелю гена SOD1. Около 28% особей являются гетерозиготами по указанному мутантному аллелю, а 65% особей являются гомозиготами по указанному мутантному аллелю и с высокой вероятностью (около 60% после 10 года жизни) проявляют признаки дегенеративной миелопатии (Zheng et al., 2014).Degenerative myelopathy is a severe progressive neurodegenerative disease leading to hind limb paralysis in dogs homozygous for the c.118G> A (p.E40K) mutant allele of the SOD1 gene. This mutant allele with different frequencies is found in many dog breeds. For example, in dogs of the Welsh Corgi Pembroke breed, only about 7% of individuals are homozygotes for the normal allele of the SOD1 gene. About 28% of individuals are heterozygotes for the indicated mutant allele, and 65% of individuals are homozygotes for the indicated mutant allele and with a high probability (about 60% after 10 years of life) show signs of degenerative myelopathy (Zheng et al., 2014).

Участок геномной последовательности гена SOD1, содержащий мутантный генетический вариант c.118G>A (p.E40K) приведен ниже:The plot of the genomic sequence of the SOD1 gene containing the mutant genetic variant c.118G> A (p.E40K) is shown below:

5'-gtatcaggaaccattacagggctgactG/Aaaggcgagcatggattccacgt-3'5'-gtatcaggaaccattacagggctgactG / Aaaggcgagcatggattccacgt-3 '

Положение, в котором находится мутантный генетический вариант, отмечено жирным шрифтом, заглавными буквами. В нормальном аллеле в этом положении находится нуклеотид G, а в мутантном аллеле он заменен на нуклеотид A. The position in which the mutant genetic variant is located is indicated in bold, in capital letters. In the normal allele, nucleotide G is in this position, and in the mutant allele it is replaced by nucleotide A.

В приведенном примере поиск ДНК, содержащей мутантный генетический вариант, был связан с большими временными затратами, поэтому мутантный референсный фрагмент ДНК получали методом направленного мутагенеза. Дизайн последовательностей нуклеотидов пары фланкирующих и пары центральных праймеров разрабатывали с использованием программы Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi) с учетом параметров, приведенных в подробном описании изобретения. Прямой фланкирующий праймер SOD1-F имел длину 20 нуклеотидных остатков и температуру денатурации 56.7ºC. Обратный фланкирующий праймер SOD1-seq имел длину 20 нуклеотидных остатков и температуру денатурации 56.4ºC. Прямой центральный праймер DM-m-for имел длину 20 нуклеотидных остатков и температуру денатурации 59.9ºC. Обратный центральный праймер DM-m-rev имел длину 20 нуклеотидных остатков и температуру денатурации 59.9ºC.In the above example, the search for DNA containing a mutant genetic variant was associated with a large time expenditure; therefore, a mutant reference DNA fragment was obtained by the method of directed mutagenesis. The design of the nucleotide sequences of the flanking pair and the pair of central primers was developed using the Primer-BLAST program (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi) taking into account the parameters given in the detailed description of the invention . The direct flanking primer SOD1-F had a length of 20 nucleotide residues and a denaturation temperature of 56.7ºC. The reverse flanking primer SOD1-seq had a length of 20 nucleotide residues and a denaturation temperature of 56.4 ° C. The DM-m-for direct central primer had a length of 20 nucleotide residues and a denaturation temperature of 59.9 ° C. The reverse central primer DM-m-rev had a length of 20 nucleotide residues and a denaturation temperature of 59.9 ° C.

Для получения нормального референсного фрагмента ДНК использовали геномную ДНК домашней собаки, в которой наличие нормального генетического варианта было подтверждено секвенированием. Нормальный референсный фрагмент ДНК длиной 354 п.н. получили при помощи ПЦР с фланкирующими праймерами SOD1-F и SOD1-seq. Нормальный референсный фрагмент ДНК клонировали в плазмидный вектор pGEM-T Easy (№ A1360, Promega, USA). Полученный нормальный рекомбинантный вектор размножили в бактериях E. coli и выделили из бактериальных клеток. Последовательность нуклеотидов нормального референсного фрагмента ДНК в составе нормального рекомбинантного вектора верифицировали секвенированием. To obtain a normal reference DNA fragment, the genomic DNA of a domestic dog was used in which the presence of a normal genetic variant was confirmed by sequencing. A normal reference DNA fragment of 354 bp in length obtained by PCR with flanking primers SOD1-F and SOD1-seq. The normal reference DNA fragment was cloned into the pGEM-T Easy plasmid vector (No. A1360, Promega, USA). The resulting normal recombinant vector was propagated in E. coli bacteria and isolated from bacterial cells. The nucleotide sequence of the normal reference DNA fragment in the normal recombinant vector was verified by sequencing.

Для получения мутантного референсного фрагмента ДНК параллельно проводили две ПЦР с геномной ДНК домашней собаки, содержащей нормальный генетический вариант. При этом в одной ПЦР использовали прямой фланкирующий праймер SOD1-F и обратный центральный праймер DM-m-rev, а в другой ПЦР использовали обратный фланкирующий праймер SOD1-seq и прямой центральный праймер DM-m-for. В результате получали два продукта ПЦР, которые имели совпадающий участок длиной 20 п.н. Этот совпадающий участок участок соответствовал центральным праймерам и содержал мутантный генетический вариант. Полученные продукты ПЦР очищали от оставшихся праймеров и смешивали в эквимолярных концентрациях. Полученную смесь использовали для проведения 10 циклов ПЦР в отсутствие праймеров. На следующем этапе реакционную смесь разбавляли в 1000 раз и использовали в качестве ДНК-матрицы в ПЦР с фланкирующими праймерами SOD1-F и SOD1-seq. В результате был получен мутантный референсный фрагмент ДНК, который затем клонировали в плазмидный вектор pGEM-T Easy (№ A1360, Promega, USA). Полученный мутантный рекомбинантный вектор размножили в бактериях E.coli, выделили из бактериальных клеток. Последовательность нуклеотидов мутантного референсного фрагмента ДНК в составе мутантного рекомбинантного вектора верифицировали секвенированием.To obtain a mutant reference DNA fragment, two PCRs were performed in parallel with the genomic DNA of a domestic dog containing a normal genetic variant. Moreover, in one PCR, the direct flanking primer SOD1-F and the reverse central primer DM-m-rev were used, and in the other PCR, the reverse flanking primer SOD1-seq and the direct central primer DM-m-for were used. As a result, two PCR products were obtained that had a matching region of 20 bp in length. This coincident site, the site corresponded to the central primers and contained a mutant genetic variant. The resulting PCR products were purified from the remaining primers and mixed in equimolar concentrations. The resulting mixture was used to carry out 10 PCR cycles in the absence of primers. In the next step, the reaction mixture was diluted 1000 times and used as a DNA template in PCR with flanking primers SOD1-F and SOD1-seq. As a result, a mutant reference DNA fragment was obtained, which was then cloned into the pGEM-T Easy plasmid vector (No. A1360, Promega, USA). The obtained mutant recombinant vector was propagated in E. coli bacteria, isolated from bacterial cells. The nucleotide sequence of the mutant reference DNA fragment of the mutant recombinant vector was verified by sequencing.

Рекомбинантные векторы линеаризовали, используя эндонуклеазу рестрикции MluI, которая вносит один двуцепочечный разрыв в ДНК рекомбинантных векторов. При этом точка разрыва находится за пределами клонированных референсных фрагментов ДНК.Recombinant vectors were linearized using the MluI restriction endonuclease, which introduced one double-stranded break in the DNA of the recombinant vectors. In this case, the break point is outside the cloned reference DNA fragments.

На следующем этапе линеаризованные рекомбинантные векторы разбавили до концентрации 100-10000 молекул в микролитре. Разбавления проводили раствором геномной ДНК лососевых рыб, фрагментированной ультразвуком до фрагментов со средней длиной 500-1000 пар нуклеотидов. Концентрация раствора геномной ДНК лососевых рыб в разбавленных растворах рекомбинантных векторов составляла приблизительно 3-5 нг/мкл.In the next step, linearized recombinant vectors were diluted to a concentration of 100-10000 molecules in a microliter. Dilutions were carried out with a salmon fish genomic DNA solution fragmented by ultrasound into fragments with an average length of 500-1000 nucleotide pairs. The concentration of the salmon fish genomic DNA solution in dilute solutions of the recombinant vectors was approximately 3-5 ng / μl.

Концентрации линеаризованных рекомбинантных векторов, содержащих референсные фрагменты ДНК, измеряли с помощью количественной ПЦР с праймерами, используемыми в тест-системе. Последовательности нуклеотидов этих праймеров не имеют отношения к настоящему изобретению, поэтому здесь не приводятся. По результатам количественной ПЦР концентрации линеаризованных рекомбинантных векторов, содержащих референсные фрагменты ДНК, скорректировали так, что разница между Ct для нормального и мутантного искусственных референсных образцов ДНК составляла 0,3 цикла. В результате были получены нормальный и мутантный искусственные референсные образцы ДНК.Concentrations of linearized recombinant vectors containing reference DNA fragments were measured by quantitative PCR with primers used in the test system. The nucleotide sequences of these primers are not related to the present invention, therefore, are not given here. According to the results of quantitative PCR, the concentrations of linearized recombinant vectors containing reference DNA fragments were adjusted so that the difference between Ct for normal and mutant artificial reference DNA samples was 0.3 cycles. As a result, normal and mutant artificial reference DNA samples were obtained.

На Фиг.3А на графике 27 представлены кинетические кривые, полученные в количественной ПЦР с использованием нормального искусственного референсного образца ДНК. На графике 28 представлены кинетические кривые, полученные в количественной ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по нормальному аллелю гена SOD1. Кривые 21 и 21´ отражают кинетику реакции с зондом Taq-Man, специфическим для нормального генетического варианта. Кривые 22 и 22´отражают кинетику реакции с зондом Taq-Man, специфическим для мутантного генетического варианта. Видно, что профиль соответствующих кинетических кривых, а также Ct, полученные в ПЦР с нормальным искусственным референсным образцом ДНК и с геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по нормальному аллелю гена SOD1, очень похожи. Это говорит о том, что нормальный искусственный референсный образец ДНК по кинетическим характеристикам соответствует геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по нормальному аллелю гена SOD1.On figa on a graph 27 presents the kinetic curves obtained in quantitative PCR using a normal artificial reference DNA sample. Figure 28 shows the kinetic curves obtained in quantitative PCR using genomic DNA isolated from homozygous for the normal allele of the SOD1 gene. Curves 21 and 21´ reflect the kinetics of the reaction with a Taq-Man probe specific for the normal genetic variant. Curves 22 and 22 represent the kinetics of the reaction with a Taq-Man probe specific for the mutant genetic variant. It can be seen that the profile of the corresponding kinetic curves, as well as Ct, obtained in PCR with a normal artificial reference DNA sample and with genomic DNA isolated from homozygous for the normal allele of the SOD1 gene, are very similar. This suggests that the normal artificial reference DNA sample according to kinetic characteristics corresponds to genomic DNA isolated from homozygous for the normal allele of the SOD1 gene.

На Фиг.3Б на графике 29 представлены кинетические кривые, полученные в количественной ПЦР с использованием мутантного искусственного референсного образца ДНК. На графике 30 представлены кинетические кривые, полученные в количественной ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1. Кривые 24 и 24´ отражают кинетику реакции с зондом Taq-Man, специфическим для нормального генетического варианта. Кривые 23 и 23´отражают кинетику реакции с зондом Taq-Man, специфическим для мутантного генетического варианта. Видно, что профиль соответствующих кинетических кривых, а также Ct, полученные в ПЦР с мутантным искусственным референсным образцом ДНК и с геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1, очень похожи. Это говорит о том, что мутантный искусственный референсный образец ДНК по кинетическим характеристикам соответствует геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1. Геномная ДНК, выделенная из гомозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1, оказалась доступна намного позже, чем был получен мутантный искусственный референсный образец ДНК. До этого результаты генетического тестирования приходилось дополнительно верифицировать с помощью секвенирования. В результате очередного генетического тестирования была найдена особь, гомозиготная по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1. После того, как было показано соответствие кинетических характеристик мутантного искусственного референсного образца ДНК и геномной ДНК, выделенной из гомозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1, необходимость в верификации с помощью секвенирования отпала. Это значительно ускорило и удешевило процедуру генетического тестирования, не снизив достоверности ее результатов. On figb on the graph 29 presents the kinetic curves obtained in quantitative PCR using a mutant artificial reference DNA sample. Figure 30 shows the kinetic curves obtained by quantitative PCR using genomic DNA isolated from the homozygous c.118G> A (p.E40K) mutant allele of the SOD1 gene. Curves 24 and 24´ reflect the kinetics of the reaction with the Taq-Man probe, specific for the normal genetic variant. Curves 23 and 23 show the kinetics of the reaction with a Taq-Man probe specific for the mutant genetic variant. It can be seen that the profile of the corresponding kinetic curves, as well as Ct, obtained in PCR with a mutant artificial reference DNA sample and with genomic DNA isolated from homozygous c.118G> A (p.E40K) mutant allele of the SOD1 gene are very similar. This suggests that the mutant artificial reference DNA sample according to kinetic characteristics corresponds to genomic DNA isolated from the homozygous c.118G> A (p.E40K) mutant allele of the SOD1 gene. Genomic DNA isolated from homozygous for the c.118G> A (p.E40K) mutant allele of the SOD1 gene was available much later than the mutated artificial reference DNA sample was obtained. Prior to this, the results of genetic testing had to be additionally verified by sequencing. As a result of the next genetic testing, an individual was found homozygous for the mutant allele c.118G> A (p.E40K) of the SOD1 gene. After the correspondence of the kinetic characteristics of the mutant artificial reference DNA sample and genomic DNA isolated from the homozygous c.118G> A (p.E40K) mutant allele of the SOD1 gene was shown, the need for verification by sequencing was no longer necessary. This significantly accelerated and reduced the cost of the genetic testing procedure, without reducing the reliability of its results.

Полученные нормальный и мутантный искусственные референсные образцы ДНК частично использовали для приготовления гетерозиготного искусственного референсного образца ДНК, имитирующего гетерозиготное состояние мутантного аллеля c.118G>A (p.E40K) гена SOD1. Для этого нормальный и мутантный референсные образцы ДНК смешали в равных объемах. На Фиг.3В на графике 31 представлены кинетические кривые, полученные в количественной ПЦР с использованием гетерозиготного искусственного референсного образца ДНК. На графике 32 представлены кинетические кривые, полученные в количественной ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из гетерозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1. Кривые 25 и 25´ отражают кинетику реакции с зондом Taq-Man, специфическим для нормального генетического варианта. Кривые 26 и 26´отражают кинетику реакции с зондом Taq-Man, специфическим для мутантного генетического варианта. Видно, что профиль соответствующих кинетических кривых, а также Ct, полученные в ПЦР с гетерозиготным искусственным референсным образцом ДНК и с геномной ДНК, выделенной из гетерозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1, очень похожи. Это говорит о том, что гетерозиготный искусственный референсный образец ДНК по кинетическим характеристикам соответствует геномной ДНК, выделенной из гетерозиготы по мутантному аллелю c.118G>A (p.E40K) гена SOD1.The obtained normal and mutant artificial reference DNA samples were partially used to prepare a heterozygous artificial reference DNA sample simulating the heterozygous state of the c.118G> A (p.E40K) mutant allele of the SOD1 gene. For this, normal and mutant reference DNA samples were mixed in equal volumes. 3B, graph 31 shows kinetic curves obtained by quantitative PCR using a heterozygous artificial reference DNA sample. Figure 32 shows the kinetic curves obtained in quantitative PCR using genomic DNA isolated from a heterozygous c.118G> A (p.E40K) mutant allele for the SOD1 gene. Curves 25 and 25´ reflect the kinetics of the reaction with a Taq-Man probe specific for the normal genetic variant. Curves 26 and 26 represent the kinetics of the reaction with a Taq-Man probe specific for the mutant genetic variant. It can be seen that the profile of the corresponding kinetic curves, as well as Ct, obtained in PCR with a heterozygous artificial reference DNA sample and with genomic DNA isolated from a heterozygous c.118G> A (p.E40K) mutant allele of the SOD1 gene are very similar. This suggests that the heterozygous artificial reference DNA sample according to kinetic characteristics corresponds to genomic DNA isolated from the heterozygous c.118G> A (p.E40K) mutant allele of the SOD1 gene.

Описанные в тексте данной заявки варианты реализации последовательности действий в способе и составе тест-системы подтверждены испытаниями в лабораториях заявителя, но не являются единственно возможными и приведены с целью наиболее наглядного раскрытия сути изобретения. The options for the implementation of the sequence of actions described in the text of this application in the method and composition of the test system are confirmed by tests in the laboratories of the applicant, but are not the only ones possible and are presented with the aim of most clearly disclosing the essence of the invention.

Заявляемое изобретение является технологичным и простым в использовании и изготовлении относительно иных способов и тест-систем, известных в настоящий момент из уровня техники. The claimed invention is technologically advanced and easy to use and manufacture with respect to other methods and test systems currently known in the art.

Claims (27)

1. Способ создания искусственных референсных образцов ДНК, который включает следующие этапы:1. A method of creating artificial reference DNA samples, which includes the following steps: получают нормальный и мутантный референсные фрагменты ДНК;normal and mutant reference DNA fragments are obtained; получают нормальный рекомбинантный вектор путем клонирования нормального референсного фрагмента ДНК в генетический вектор и мутантный рекомбинантный вектор путем клонирования мутантного референсного фрагмента ДНК в генетический вектор;receive a normal recombinant vector by cloning a normal reference DNA fragment into a genetic vector and a mutant recombinant vector by cloning a mutant reference DNA fragment into a genetic vector; верифицируют последовательности нуклеотидов нормального и мутантного референсных фрагментов ДНК в составе рекомбинантных векторов;verify the nucleotide sequence of the normal and mutant reference DNA fragments in the composition of recombinant vectors; получают такие растворы рекомбинантных векторов, которые в ПЦР проявляют кинетические свойства, не отличимые от кинетических свойств естественных образцов ДНК.receive solutions of recombinant vectors that exhibit kinetic properties in PCR that are indistinguishable from the kinetic properties of natural DNA samples. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере один референсный фрагмент ДНК получают методом ПЦР.2. The method according to p. 1, characterized in that at least one reference DNA fragment is obtained by PCR. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве ДНК-матрицы используют геномную ДНК, выделенную из организма, содержащего нормальный генетический вариант и/или мутантный генетический вариант.3. The method according to p. 2, characterized in that the genomic DNA isolated from the body containing the normal genetic variant and / or mutant genetic variant is used as the DNA template. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере один референсный фрагмент ДНК получают методом направленного мутагенеза.4. The method according to p. 1, characterized in that at least one reference DNA fragment is obtained by directed mutagenesis. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере один референсный фрагмент ДНК получают методом химического синтеза.5. The method according to p. 1, characterized in that at least one reference DNA fragment is obtained by chemical synthesis. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что верификацию последовательностей нуклеотидов нормального и мутантного референсных фрагментов ДНК в составе рекомбинантных векторов производят методом секвенирования.6. The method according to p. 1, characterized in that the verification of the nucleotide sequences of the normal and mutant reference DNA fragments in the composition of recombinant vectors is carried out by sequencing. 7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что получают такие растворы рекомбинантных векторов, которые содержат 100-10000 молекул рекомбинантных векторов в микролитре раствора.7. The method according to p. 1, characterized in that receive such solutions of recombinant vectors that contain 100-10000 molecules of recombinant vectors in a microliter of solution. 8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что получают такие растворы рекомбинантных векторов, которые дополнительно содержат чужеродную ДНК.8. The method according to p. 6, characterized in that receive such solutions of recombinant vectors that additionally contain foreign DNA. 9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что получают такие растворы рекомбинантных векторов, в которых концентрации различных рекомбинантных векторов отличаются друг от друга не более чем на 40%.9. The method according to p. 7, characterized in that receive such solutions of recombinant vectors in which the concentrations of various recombinant vectors differ from each other by no more than 40%. 10. Способ по п. 6, отличающийся тем, что ДНК рекомбинантных векторов дополнительно приводят в релаксированное состояние путем расщепления ДНК рекомбинантных векторов нуклеазой.10. The method according to p. 6, characterized in that the DNA of the recombinant vectors is additionally brought into a relaxed state by cleavage of the DNA of the recombinant vectors with nuclease. 11. Тест-система, основанная на ПЦР, включающая: буферный раствор, ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, праймеры, искусственные референсные образцы ДНК, при этом искусственные референсные образцы ДНК получены следующим способом:11. A test system based on PCR, including: a buffer solution, DNA polymerase, deoxynucleoside triphosphates, primers, artificial reference DNA samples, while artificial reference DNA samples were obtained in the following way: получают нормальный и мутантный референсные фрагменты ДНК;normal and mutant reference DNA fragments are obtained; получают нормальный рекомбинантный вектор путем клонирования нормального референсного фрагмента ДНК в генетический вектор и мутантный рекомбинантный вектор путем клонирования мутантного референсного фрагмента ДНК в генетический вектор;receive a normal recombinant vector by cloning a normal reference DNA fragment into a genetic vector and a mutant recombinant vector by cloning a mutant reference DNA fragment into a genetic vector; верифицируют последовательности нуклеотидов нормального и мутантного референсных фрагментов ДНК в составе рекомбинантных векторов;verify the nucleotide sequence of the normal and mutant reference DNA fragments in the composition of recombinant vectors; получают такие растворы рекомбинантных векторов, которые в ПЦР проявляют кинетические свойства, не отличимые от кинетических свойств естественных образцов ДНК.receive solutions of recombinant vectors that exhibit kinetic properties in PCR that are indistinguishable from the kinetic properties of natural DNA samples. 12. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что искусственные референсные образцы содержат 100-10000 молекул рекомбинантных векторов в микролитре.12. The test system according to claim 11, characterized in that the artificial reference samples contain 100-10000 molecules of recombinant vectors in a microliter. 13. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что искусственные референсные образцы дополнительно содержат чужеродную ДНК.13. The test system according to claim 11, characterized in that the artificial reference samples additionally contain foreign DNA. 14. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что ДНК искусственных референсных образцов находится в релаксированном состоянии.14. The test system according to claim 11, characterized in that the DNA of the artificial reference samples is in a relaxed state. 15. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что дополнительно включает не менее одной эндонуклеазы рестрикции.15. The test system according to claim 11, characterized in that it further includes at least one restriction endonuclease. 16. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что дополнительно включает флюорофорсодержащий олигонуклеотид, комплементарный нормальному генетическому варианту, и флюорофорсодержащий олигонуклеотид, комплементарный мутантному генетическому варианту.16. The test system according to claim 11, characterized in that it further includes a fluorophore-containing oligonucleotide complementary to the normal genetic variant, and a fluorophore-containing oligonucleotide complementary to the mutant genetic variant. 17. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что дополнительно включает искусственный референсный образец, полученный путем смешивания нормального и мутантного искусственных референсных образцов в таком соотношении, что количество нормального рекомбинантного вектора отличается от количества мутантного рекомбинантного вектора не более чем на 40%.17. The test system according to claim 11, characterized in that it further includes an artificial reference sample obtained by mixing normal and mutant artificial reference samples in such a ratio that the amount of a normal recombinant vector differs from the amount of a mutant recombinant vector by no more than 40% . 18. Тест-система по п. 11, отличающаяся тем, что дополнительно включает флюоресцентный краситель, интеркалирующий в двуцепочечную ДНК.18. The test system according to claim 11, characterized in that it further includes a fluorescent dye intercalating into double-stranded DNA. 19. Тест-система по п. 15, отличающаяся тем, что дополнительно включает искусственный референсный образец, полученный путем смешивания нормального и мутантного искусственных референсных образцов в таком соотношении, что количество нормального рекомбинантного вектора отличается от количества мутантного рекомбинантного вектора не более чем на 40%.19. The test system according to p. 15, characterized in that it further includes an artificial reference sample obtained by mixing normal and mutant artificial reference samples in such a ratio that the amount of a normal recombinant vector differs from the amount of a mutant recombinant vector by no more than 40% .
RU2019125956A 2019-08-16 2019-08-16 Method of creating artificial reference dna samples for genetic testing and test system with samples obtained by said method RU2724504C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019125956A RU2724504C1 (en) 2019-08-16 2019-08-16 Method of creating artificial reference dna samples for genetic testing and test system with samples obtained by said method

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019125956A RU2724504C1 (en) 2019-08-16 2019-08-16 Method of creating artificial reference dna samples for genetic testing and test system with samples obtained by said method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2724504C1 true RU2724504C1 (en) 2020-06-23

Family

ID=71136039

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019125956A RU2724504C1 (en) 2019-08-16 2019-08-16 Method of creating artificial reference dna samples for genetic testing and test system with samples obtained by said method

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2724504C1 (en)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1329517A1 (en) * 2002-01-22 2003-07-23 Wolfgang Prof. Holzgreve Method for the non-invasive prenatal diagnosis of chromosomal and/or genetic abnormalities
EP1601784B1 (en) * 2001-07-09 2012-01-11 Children's Hospital Medical Center of Akron Multiple controls for molecular genetic analyses
WO2018086263A1 (en) * 2016-11-10 2018-05-17 三生国健药业(上海)股份有限公司 Real-time fluorescent quantitative pcr detection method, and standard sample and detection kit thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1601784B1 (en) * 2001-07-09 2012-01-11 Children's Hospital Medical Center of Akron Multiple controls for molecular genetic analyses
EP1329517A1 (en) * 2002-01-22 2003-07-23 Wolfgang Prof. Holzgreve Method for the non-invasive prenatal diagnosis of chromosomal and/or genetic abnormalities
WO2018086263A1 (en) * 2016-11-10 2018-05-17 三生国健药业(上海)股份有限公司 Real-time fluorescent quantitative pcr detection method, and standard sample and detection kit thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Каспирович, Д.А. Молекулярные механизмы генетических процессов: методы изучения геномов : методическое пособие / Д.А. Каспирович, Н.А. Глинская, Е.М. Волкова. - Пинск : ПолесГУ, 2015. - 52 с. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Varshney et al. A high-throughput functional genomics workflow based on CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in zebrafish
US10538807B2 (en) Compositions and methods for detecting rare nucleic acid molecule mutations
EP2660331B1 (en) Method for single cell genome analysis and kit therefor
Almeida et al. Mouse cell line authentication
US20150126376A1 (en) Compositions and methods for sensitive mutation detection in nucleic acid molecules
CN110964814B (en) Primers, compositions and methods for nucleic acid sequence variation detection
KR20190053818A (en) Multi-resolution analysis method of cell-free nucleic acid
WO2020249111A1 (en) Method and kit for detecting genome editing and application thereof
CN111020031A (en) Method for detecting tumor gene mutation by combining sequence specific blocker with specific PCR (polymerase chain reaction) program
Lindner et al. Reliable and robust droplet digital PCR (ddPCR) and RT-ddPCR protocols for mouse studies
US20190233889A1 (en) Method for producing dna library and method for analyzing genomic dna using the dna library
US20220090204A1 (en) Dna reference standard and use thereof
JP2022516307A (en) Quantitative amplicon sequencing for multiple copy mutation detection and allelic ratio quantification
GB2435928A (en) Spinal muscular atrophy screening
JP2019088234A (en) Genetic sex determination marker and genetic sex determination method for bluefin tuna
Ahmed et al. Detection of a single nucleotide polymorphism for insecticide resistance using recombinase polymerase amplification and lateral flow dipstick detection
McTaggart et al. Rates of recombination in the ribosomal DNA of apomictically propagated Daphnia obtusa lines
RU2724504C1 (en) Method of creating artificial reference dna samples for genetic testing and test system with samples obtained by said method
KR102084965B1 (en) Qualitative or quantitative mutant genotyping methods and real-time PCR kits for performing the methods
JPH05506998A (en) Genome mapping method by direct haplotyping using intron sequence analysis method
CN114561475A (en) Method for breeding chicken by using molecular marker and application and kit thereof
TWI686482B (en) Set of random primers and method for preparing dna library using the same
Liu et al. Rapid identification of homologous recombinants and determination of gene copy number with reference/query pyrosequencing (RQPS)
US8586309B2 (en) Methods of determining copy number of a genetic locus
KR101820048B1 (en) Standard plasmid for detecting of genetically modified organisms and analysis method using the same