JP2019088234A - Genetic sex determination marker and genetic sex determination method for bluefin tuna - Google Patents
Genetic sex determination marker and genetic sex determination method for bluefin tuna Download PDFInfo
- Publication number
- JP2019088234A JP2019088234A JP2017219660A JP2017219660A JP2019088234A JP 2019088234 A JP2019088234 A JP 2019088234A JP 2017219660 A JP2017219660 A JP 2017219660A JP 2017219660 A JP2017219660 A JP 2017219660A JP 2019088234 A JP2019088234 A JP 2019088234A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- base
- dna
- bluefin tuna
- sex
- male
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
本発明は、クロマグロの性別特異的なＤＮＡ多型を含む遺伝的性判別マーカーおよび当該ＤＮＡ多型を検出するクロマグロの遺伝的性判別方法に関する。 The present invention relates to a genetic sex discrimination marker containing a sex-specific DNA polymorphism of bluefin tuna and a genetic sex discrimination method for bluefin tuna which detects the DNA polymorphism.
日本は世界最大のマグロ消費国であることから、マグロ類の資源管理や持続的利用に関して国際的な責任を負っている。資源管理施策の立案には、漁獲物や資源調査サンプルから取得された各種の生物情報を必要とし、体長、年齢、種等のデータとともに、性別データは重要な情報の１つである。 As Japan is the world's largest tuna consumer, it has an international responsibility for resource management and sustainable use of tunas. The formulation of resource management measures requires various biological information acquired from catches and resource survey samples, and gender data is one of the important information along with data such as length, age and species.
現在、クロマグロ（Ｔｈｕｎｎｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）の性判別は、生殖腺の目視あるいは組織学的切片観察という古典的な手法により行われている。しかし、これらの手法には、１）生殖腺が発達していない稚仔魚および若齢個体、並びに市場流通する内臓処理済み個体の性判別には利用できない、２）検査に労力と時間がかかる、３）個体を生かした状態で性判別することが困難である、という欠点がある。そのため、クロマグロ資源調査サンプルの大部分で性別データが欠損したままとなり、クロマグロ生活史における時間的・空間的な移動・分布と性別との関連性は全く分かっていない。また、近年のマグロ養殖では、天然ヨコワから人工種苗への転換が進められているが、飼育個体を生かした状態で性判別することが困難であるため、養成中の親魚群が産卵に適した性比で構成されているかどうかを調べることも出来ない。このような理由から、クロマグロの簡便で高精度な性判別方法の開発が望まれている。 At present, sex determination of bluefin tuna (Thunnus orientalis) is performed by the classical method of visual or histological section observation of the gonads. However, these methods can not be used for sex determination of 1) juveniles and juveniles whose gonads have not developed and juveniles and marketed visceral processed individuals, 2) labor and time for examination, 3 ) There is a drawback that it is difficult to discriminate sex while keeping the individual alive. As a result, most of the bluefin tuna stock survey samples have been deficient in gender data, and the relationship between temporal and spatial movement and distribution in the bluefin tuna life history and gender is unknown at all. In addition, in tuna aquaculture in recent years, conversion from natural Yokogawa to artificial seedling has been promoted, but it is difficult to determine the sex in a state where the breeding individual is used, so the parent fish school being trained is suitable for egg laying It is not possible to check if it is composed of sex ratio. For these reasons, development of a simple and highly accurate sex determination method for bluefin tuna is desired.
これまでに、継代Ｆ３世代のクロマグロの雄特異的な６塩基のＤＮＡ欠失領域を用いてクロマグロの性判別を行う方法が知られている（非特許文献１）。 Until now, there has been known a method of sexing a bluefin tuna using a male-specific 6-base DNA deletion region of passage F3 generation bluefin tuna (Non-patent Document 1).
しかしながら、当該領域を利用したクロマグロの性判別は、特定の経代Ｆ３世代における成功率は９４％と高いものの、天然魚では成功率が３９％と低く、天然魚を含むクロマグロの性判別方法として利用できる十分な精度を有していない。一般に、少数の親から作出された経代群や家系においては、天然集団に殆ど見つからないような低頻度のＤＮＡ多型が偶然広まってしまうことがある。当該領域は、経代飼育の過程において、ごく一部の雄個体が持つＹ染色体上の塩基配列がその子孫である経代群に広まったものであると考えられる。 However, sex determination of bluefin tuna using this region has a high success rate of 94% for a specific generation of F3 generations, but a low success rate of 39% for natural fish and a method for sex determination of bluefin tuna including natural fish It does not have sufficient accuracy available. In general, low-frequency DNA polymorphisms, such as those rarely found in natural populations, may occasionally be propagated in progeny groups and families created from a small number of parents. The region is considered to be one in which the base sequence on the Y chromosome possessed by only a few male individuals has spread to the progeny group, the progeny group, in the process of breeding breeding.
よって、本発明の課題は、簡便で精度の高いクロマグロの遺伝的性判別方法を提供することにある。 Therefore, an object of the present invention is to provide a simple and highly accurate genetic sex discrimination method for bluefin tuna.
そこで、本発明者らは、上記課題を解決するために、天然クロマグロ３１個体の全ゲノムリシーケンス解析により塩基配列を網羅的に探索した結果、クロマグロゲノム配列のスキャフォルド６４番中に、性別特異的なＤＮＡ多型を複数見出した。また、当該ＤＮＡ多型の存在する領域は、非特許文献１で用いる領域とは異なる領域であることを見出した。本発明者らは、かかる知見に基づきさらに検討した結果、当該ＤＮＡ多型を用いることで、クロマグロの遺伝的性を簡便にかつ高い精度で判別できることを見出し、本発明を完成した。 Therefore, as a result of exhaustive search of the nucleotide sequence by whole genome resequence analysis of 31 natural bluefin tunas in order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found sex-specific in the 64th scaffold of the bluefin tuna genome sequence. Found several unique DNA polymorphisms. In addition, it has been found that the region in which the DNA polymorphism is present is a region different from the region used in Non-Patent Document 1. As a result of further studies based on such findings, the present inventors have found that the genetics of bluefin tuna can be distinguished simply and with high accuracy by using the DNA polymorphism, and completed the present invention.
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔７〕を提供するものである。
〔１〕配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１および５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６〜１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を含む、クロマグロの性判別マーカー。
〔２〕クロマグロ被検体のゲノムＤＮＡを含有する試料の、配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１および５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６〜１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を検出する、クロマグロの性判別方法。
〔３〕さらに、前記ＤＮＡ多型が下記表に示される雌の遺伝子型を有する場合にクロマグロ被検体が雌であると判別し、前記ＤＮＡ多型が下記表に示される雄の遺伝子型を有する場合にクロマグロ被検体が雄であると判別するものである、上記〔２〕記載の方法。
That is, the present invention provides the following [1] to [7].
[1] The 501st base, 561 and 562 bases, the 564th base, the 595th base, the 644th base, the 769th base, the 770th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 The 789th base, the 1198th base, the 1200th base, the 1213th base, the 1275th base, the 1280th base, the 1338th base, the 1344th base, the 1416th to 1423th bases, the 1472th Base, 1493th base, 1866th base, 1867th base, 1899th base, 1913th base, 2583th base, 2588th base, 2589th base, 2611th base, 2622th Base, 2634th base, 2643nd base, 2687th base, 2693th base, 27 Second base, 2753 base, 2756 base, 2801 base, 2817 base, 2855 base, 2874 base, 2901 base, 3057 base, 3093 base, The 3139th base, 3146th base, 3148th base, 3196th base, 3199th base, 3249th base, 3251th base, 3368th base, 3404th base, 3407th base, 3426th base, 3433th base, 3442th base, 3470th base, 3479th base, 3545th base, 3546th base, 3735th base, 3756th base, 3769th base, The 3788th base, the 6256th base, the 6312th base, the 6455th Base, base 6585, base 6781, base 6879, base 6930, base 6933, base 6940, base 6941, base 6987 and base 7014. A bluefin tuna sex discrimination marker comprising one or more DNA polymorphisms selected from the group consisting of existing DNA polymorphisms.
[2] The 501st base, the 561st and 562nd bases, the 564th base, the 595th base, the 644th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the sample containing the genomic DNA of the bluefin tuna subject Base: 769th base, 770th base, 789th base, 1198th base, 1200th base, 1213th base, 1275th base, 1280th base, 1338th base, 1344th base Base, bases 1416 to 1423, base 1472, base 1493, base 1866, base 1867, base 1899, base 1913, base 2583, base 2588, base 2589 The second base, the 2611th base, the 2622th base, the 2634th base, the 2643th salt , 2687th base, 2693th base, 2752nd base, 2753th base, 2756th base, 2801th base, 2817th base, 2855th base, 2874th base, 2901th base , 3057th base, 3093th base, 3139th base, 3146th base, 3148th base, 3196th base, 3199th base, 3249th base, 3251th base, 3368th base , 3404th base, 3407th base, 3426th base, 3433th base, 3442th base, 3470th base, 3479th base, 3545th base, 3546th base, 3735th base , 3756th base, 3769th base, 3788th base, 6 The 56th base, the 6312th base, the 6455th base, the 6585th base, the 6781th base, the 6879th base, the 6930th base, the 6933th base, the 6940th base, the 6941th base, A bluefin tuna sex discrimination method for detecting one or more DNA polymorphisms selected from the group consisting of the 6987th base and the DNA polymorphism present at the 7014th base position.
[3] Further, when the DNA polymorphism has a female genotype shown in the following table, it is determined that the bluefin tuna subject is female, and the DNA polymorphism has a male genotype shown in the following table The method according to the above [2], wherein the bluefin tuna subject is determined to be male.
〔４〕前記ＤＮＡ多型の検出をＰＣＲにより行うものである、〔２〕または〔３〕記載の方法。
〔５〕配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１および５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６〜１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を含む領域を増幅することができる、クロマグロの性判別用プライマー。
〔６〕配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基、５６１および５６２番目の塩基、５６４番目の塩基、５９５番目の塩基、６４４番目の塩基、７６９番目の塩基、７７０番目の塩基、７８９番目の塩基、１１９８番目の塩基、１２００番目の塩基、１２１３番目の塩基、１２７５番目の塩基、１２８０番目の塩基、１３３８番目の塩基、１３４４番目の塩基、１４１６〜１４２３番目の塩基、１４７２番目の塩基、１４９３番目の塩基、１８６６番目の塩基、１８６７番目の塩基、１８９９番目の塩基、１９１３番目の塩基、２５８３番目の塩基、２５８８番目の塩基、２５８９番目の塩基、２６１１番目の塩基、２６２２番目の塩基、２６３４番目の塩基、２６４３番目の塩基、２６８７番目の塩基、２６９３番目の塩基、２７５２番目の塩基、２７５３番目の塩基、２７５６番目の塩基、２８０１番目の塩基、２８１７番目の塩基、２８５５番目の塩基、２８７４番目の塩基、２９０１番目の塩基、３０５７番目の塩基、３０９３番目の塩基、３１３９番目の塩基、３１４６番目の塩基、３１４８番目の塩基、３１９６番目の塩基、３１９９番目の塩基、３２４９番目の塩基、３２５１番目の塩基、３３６８番目の塩基、３４０４番目の塩基、３４０７番目の塩基、３４２６番目の塩基、３４３３番目の塩基、３４４２番目の塩基、３４７０番目の塩基、３４７９番目の塩基、３５４５番目の塩基、３５４６番目の塩基、３７３５番目の塩基、３７５６番目の塩基、３７６９番目の塩基、３７８８番目の塩基、６２５６番目の塩基、６３１２番目の塩基、６４５５番目の塩基、６５８５番目の塩基、６７８１番目の塩基、６８７９番目の塩基、６９３０番目の塩基、６９３３番目の塩基、６９４０番目の塩基、６９４１番目の塩基、６９８７番目の塩基並びに７０１４番目の塩基の位置に存在するＤＮＡ多型からなる群から選択される１以上のＤＮＡ多型を検出することができる、クロマグロの性判別用プローブ。
〔７〕〔５〕記載のプライマーおよび／または〔６〕記載のプローブを含む、クロマグロの性判別用キット。
[4] The method according to [2] or [3], wherein the detection of the DNA polymorphism is performed by PCR.
[5] The 501st base, 561 and 562 bases, the 564th base, the 595th base, the 644th base, the 769th base, the 770th base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 The 789th base, the 1198th base, the 1200th base, the 1213th base, the 1275th base, the 1280th base, the 1338th base, the 1344th base, the 1416th to 1423th bases, the 1472th Base, 1493th base, 1866th base, 1867th base, 1899th base, 1913th base, 2583th base, 2588th base, 2589th base, 2611th base, 2622th Base, 2634th base, 2643nd base, 2687th base, 2693th base, 27 Second base, 2753 base, 2756 base, 2801 base, 2817 base, 2855 base, 2874 base, 2901 base, 3057 base, 3093 base, The 3139th base, 3146th base, 3148th base, 3196th base, 3199th base, 3249th base, 3251th base, 3368th base, 3404th base, 3407th base, 3426th base, 3433th base, 3442th base, 3470th base, 3479th base, 3545th base, 3546th base, 3735th base, 3756th base, 3769th base, The 3788th base, the 6256th base, the 6312th base, the 6455th Base, base 6585, base 6781, base 6879, base 6930, base 6933, base 6940, base 6941, base 6987 and base 7014. A bluefin tuna sex discrimination primer capable of amplifying a region containing one or more DNA polymorphisms selected from the group consisting of existing DNA polymorphisms.
[6] The 501st base, 561 and 562 bases, the 564th base, the 595th base, the 644th base, the 769th base, the 770th base, of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 The 789th base, the 1198th base, the 1200th base, the 1213th base, the 1275th base, the 1280th base, the 1338th base, the 1344th base, the 1416th to 1423th bases, the 1472th Base, 1493th base, 1866th base, 1867th base, 1899th base, 1913th base, 2583th base, 2588th base, 2589th base, 2611th base, 2622th Base, 2634th base, 2643nd base, 2687th base, 2693th base, 27 Second base, 2753 base, 2756 base, 2801 base, 2817 base, 2855 base, 2874 base, 2901 base, 3057 base, 3093 base, The 3139th base, 3146th base, 3148th base, 3196th base, 3199th base, 3249th base, 3251th base, 3368th base, 3404th base, 3407th base, 3426th base, 3433th base, 3442th base, 3470th base, 3479th base, 3545th base, 3546th base, 3735th base, 3756th base, 3769th base, The 3788th base, the 6256th base, the 6312th base, the 6455th Base, base 6585, base 6781, base 6879, base 6930, base 6933, base 6940, base 6941, base 6987 and base 7014. A bluefin tuna sex discrimination probe capable of detecting one or more DNA polymorphisms selected from the group consisting of existing DNA polymorphisms.
A kit for sex determination of bluefin tuna comprising the primer according to [7] [5] and / or the probe according to [6].
本発明によれば、クロマグロの遺伝的性の判別を可能とするＤＮＡ多型を含む性判別マーカー、当該ＤＮＡ多型を検出するクロマグロの性判別方法、当該方法に利用するプライマー、プローブおよびキットが提供される。本発明によれば、天然魚および養殖魚を含むクロマグロ由来の細胞、組織、体表粘液といった試料を用いて、クロマグロの性別を簡便かつ高い精度で判別することができる。これにより、漁獲物もしくは資源調査サンプルから、または個体を生かしたまま採取したサンプルから、性別データを簡便かつ高い精度で取得できるようになり、クロマグロの生態の解明や人工種苗生産のための親魚養成の計画的な実施に資することができる。 According to the present invention, a sex discrimination marker containing a DNA polymorphism that enables discrimination of the genetic character of bluefin tuna, a sex discrimination method of bluefin tuna for detecting the DNA polymorphism, primers, probes and kits used for the method Provided. According to the present invention, the sex of bluefin tuna can be determined simply and with high accuracy using samples such as cells derived from bluefin tuna including natural fish and cultured fish, tissues, and mucus on the surface. As a result, gender data can be obtained easily and with high accuracy from samples collected from fishery products or stock surveys or from individuals while keeping the animals alive, and parent fish training for elucidation of bluefin tuna ecology and artificial seedling production Contribute to the planned implementation of
本明細書における塩基配列（ヌクレオチド配列）、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ規定（IUPAC-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138:9-37, 1984）、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（特許庁編）などの、当該分野で慣用される記号で記載されている。本明細書において「デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）」は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖という各１本鎖ＤＮＡを包含する。 In the present specification, designations by abbreviations such as a nucleotide sequence (nucleotide sequence), nucleic acid, etc. are defined in IUPAC-IUB regulations (IUPAC-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9-37, 1984), “Base Sequences or amino acid sequences are described by symbols that are commonly used in the art, such as "Guidelines for preparation of specifications including amino acid sequences" (edited by the Patent Office). In the present specification, "deoxyribonucleic acid (DNA)" includes not only double stranded DNA but also single stranded DNA of each of sense strand and antisense strand constituting it.
また、本明細書において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、核酸と同義であって、ＤＮＡ、およびＲＮＡの両方を含むものとする。当該ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また当該ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよび合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。また、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。 Also, as used herein, "nucleotide", "oligonucleotide" and "polynucleotide" are synonymous with nucleic acid, and include both DNA and RNA. The DNA includes any of cDNA, genomic DNA and synthetic DNA. The RNA also includes total RNA, mRNA, rRNA and synthetic RNA. In addition, "nucleotide", "oligonucleotide" and "polynucleotide" may be double-stranded or single-stranded, and have "nucleotide" (or "oligonucleotide", "polynucleotide") having a certain sequence. And the like, unless otherwise stated, "nucleotide" (or "oligonucleotide", "polynucleotide") having a sequence complementary thereto is also meant to be comprehensive.
本明細書において「ＤＮＡ多型」とは、個体間でゲノムＤＮＡ塩基配列上の特定部位の塩基配列が異なり、その頻度が集団の１％以上であるものを指し、具体的には、クロマグロ雌雄間でゲノムＤＮＡ塩基配列上の特定部位の塩基配列が異なるものを指す。当該多型としては置換、欠失、重複、挿入、逆位等が挙げられる。特に、１個の塩基が他の塩基に置換されたことによる多型を一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）という。以下、ＤＮＡ多型の遺伝子型を対立遺伝子１／対立遺伝子２のように表すことがある。例えば、Ａ／Ａのように両対立遺伝子が同じ場合、遺伝子型はホモ接合型であり、Ａ／Ｔのように両対立遺伝子が異なる場合、遺伝子型はヘテロ接合型である。本明細書において「ＤＮＡ多型」は、対立遺伝子１、対立遺伝子２およびそれらの相補鎖のいずれをも含むものである。 In the present specification, the term "DNA polymorphism" refers to those having different base sequences at specific sites on genomic DNA base sequences among individuals, the frequency of which is 1% or more of the population, and more specifically, bluefin tuna males and females It refers to one that differs in the base sequence of a specific site on the genomic DNA base sequence among them. The polymorphism includes substitution, deletion, duplication, insertion, inversion and the like. In particular, polymorphism resulting from substitution of one base by another base is referred to as Single Nucleotide Polymorphism (SNP). Hereinafter, the genotype of the DNA polymorphism may be expressed as allele 1 / allele 2. For example, the genotype is homozygous if both alleles are the same, such as A / A, and the genotype is heterozygous if both alleles are different, such as A / T. As used herein, "DNA polymorphism" is intended to include allele 1, allele 2, and their complements.
本明細書において「クロマグロ」は、Ｔｈｕｎｎｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓを指す。クロマグロの染色体数は１組２４本であり、ゲノムサイズは約８億塩基対である。このうち、クロマグロゲノム配列のスキャフォルド６４番に含まれる約７．５ｋｂのゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。「スキャフォルド」とは、ゲノム解析により得られた多数の断片的な配列を用いてゲノム配列を構築した結果まとめられた配列のことを指す。なお、配列番号１の塩基配列は雌の塩基配列である。配列番号１の４２２番目から３５９５番目、３７３５番目から３７８８番目、６２４０番目から６６４２番目、および６６９８番目から７１９７番目は、それぞれ、組換えが強く抑制された連鎖不平衡ブロックを形成している。本明細書において、配列番号１で表される塩基配列中、１３０９〜１４５８番目の塩基からなる配列を領域１、３０５９〜３２８８番目の塩基からなる配列を領域２と称する。 As used herein, "bluefin tuna" refers to Thunnus orientalis. The number of chromosomes of bluefin tuna is 24 in one set, and the genome size is about 800 million base pairs. Among them, the base sequence of the approximately 7.5 kb genomic DNA contained in the No. 64 of the bluefin tuna genome sequence is shown in SEQ ID NO: 1. The term "scaffold" refers to a sequence assembled as a result of constructing a genomic sequence using a large number of fragmentary sequences obtained by genomic analysis. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is a female nucleotide sequence. The 422nd to the 3595th, the 3735th to the 3788th, the 6240th to the 6642nd, and the 6698th to the 7197th of SEQ ID NO: 1 respectively form a linkage disequilibrium block in which recombination is strongly suppressed. In the present specification, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, a sequence consisting of bases 1309 to 1458 is referred to as region 1, and a sequence consisting of bases 3059 to 3288 is referred to as region 2.
本発明は、クロマグロのゲノムＤＮＡの配列番号１で表される塩基配列における特定のＤＮＡ多型がクロマグロの遺伝的性と強く相関しており、当該ＤＮＡ多型を性判別マーカーとして検出することによって、クロマグロの遺伝的性を簡便にかつ高精度に判別できるという事実の発見に基づいて完成されている。ここで、「遺伝的性」とは、遺伝によって決まる性別のことをいい、以下、単に「性」あるいは「性別」ともいう。 In the present invention, a specific DNA polymorphism in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the bluefin tuna genomic DNA is strongly correlated with the genetics of bluefin tuna, and by detecting the DNA polymorphism as a sex discrimination marker It has been completed based on the discovery of the fact that the genetics of bluefin tuna can be determined easily and with high accuracy. Here, "geneticity" refers to a gender determined by inheritance, and hereinafter also simply referred to as "sex" or "gender".
本発明において、クロマグロの性判別の指標として、すなわち性判別マーカーとして用いられるＤＮＡ多型には、以下の表２に示す（１）〜（７４）のＤＮＡ多型が含まれる。各ＤＮＡ多型は全て、雌の遺伝子型がホモ接合型であり、雄の遺伝子型がヘテロ接合型である。 In the present invention, DNA polymorphisms used as an index for sex determination of bluefin tuna, that is, as sex discrimination markers include the DNA polymorphisms (1) to (74) shown in Table 2 below. All DNA polymorphisms are all homozygous for female genotypes and heterozygous for male genotypes.
性判別マーカーとして用いられるＤＮＡ多型の性判別率は、９３％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは１００％である。ここで、性判別率とは、後記実施例で示す性判別率を指す。具体的には、表２の（１）〜（７４）のＤＮＡ多型のうち、（１）、（４）〜（１３）、（１５）、（１６）、（２３）〜（３１）、（３５）〜（４３）、（４５）〜（４７）、（４９）、（５４）〜（５７）、（５９）〜（６３）、（６５）〜（６７）および（７１）〜（７４）のＤＮＡ多型からなる群より選択される１以上のＤＮＡ多型を性判別マーカーとして用いることが、性判別の精度の観点から好ましい。また、性判別の実施のしやすさの観点からは、（１６）のＤＮＡ多型が好ましい。なお、表２の（１）〜（７４）のＤＮＡ多型のうち、（１）〜（５８）のＤＮＡ多型、（５９）〜（６２）のＤＮＡ多型、（６３）〜（６６）のＤＮＡ多型、および（６７）〜（７４）のＤＮＡ多型は、それぞれ、連鎖不平衡ブロックに含まれている。本発明においては、上記のＤＮＡ多型のうち、１つのＤＮＡ多型のみを性判別の指標として用いてもよいし、２以上のＤＮＡ多型を組み合わせて性判別の指標として用いてもよい。２以上のＤＮＡ多型を組み合わせて指標として用いることで、性判別の精度はより高まるため好ましい。 The sex discrimination rate of the DNA polymorphism used as a sex discrimination marker is 93% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, and further preferably 100%. Here, the sex discrimination rate refers to the sex discrimination rate shown in Examples described later. Specifically, among the DNA polymorphisms (1) to (74) in Table 2, (1), (4) to (13), (15), (16), (23) to (31), (35) to (43), (45) to (47), (49), (54) to (57), (59) to (63), (65) to (67) and (71) to (74) It is preferable from the viewpoint of sex discrimination accuracy to use one or more DNA polymorphisms selected from the group consisting of the DNA polymorphisms of) as a sex discrimination marker. Also, from the viewpoint of easiness of sex determination, the DNA polymorphism of (16) is preferable. Among the DNA polymorphisms (1) to (74) in Table 2, the DNA polymorphisms (1) to (58), the DNA polymorphisms (59) to (62), and (63) to (66) The DNA polymorphism of and the DNA polymorphisms of (67) to (74) are respectively included in the linkage disequilibrium block. In the present invention, among the above-mentioned DNA polymorphisms, only one DNA polymorphism may be used as a sex discrimination index, or two or more DNA polymorphisms may be combined and used as a sex discrimination index. It is preferable to use two or more DNA polymorphisms in combination as an index, because the accuracy of sex determination is further enhanced.
また、配列番号１で表される塩基配列の部分塩基配列であって、表２の（１）〜（７４）のＤＮＡ多型からなる群より選択される１以上のＤＮＡ多型を含む連続する塩基配列からなる部分塩基配列を含むオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはその相補鎖を、性判別マーカーとして用いることもできる。このとき、ＤＮＡ多型部位の塩基は、配列番号１で表される塩基配列に含まれる対立遺伝子１の塩基であってもよいし、対立遺伝子２の塩基であってもよく、検出の目的に応じて適宜選択できる。これらのオリゴまたはポリヌクレオチドあるいはそれらの相補鎖の長さ（塩基長）は、クロマグロゲノム上で特異的に認識される長さであればよく、その限りにおいて特に制限されない。通常約１０〜１０００塩基であり、好ましくは約２０〜５００塩基であり、より好ましくは約２０〜１００塩基である。 In addition, a partial base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, which is one or more consecutive DNA polymorphisms selected from the group consisting of DNA polymorphisms (1) to (74) in Table 2 An oligo or polynucleotide containing a partial base sequence consisting of a base sequence or its complementary strand can also be used as a sex discrimination marker. At this time, the base of the DNA polymorphic site may be the base of allele 1 contained in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or may be the base of allele 2, and for the purpose of detection It can be selected accordingly. The length (base length) of these oligos or polynucleotides or their complementary strands may be any length that can be specifically recognized on the bluefin tuna genome, and is not particularly limited in that regard. Usually, it is about 10 to 1000 bases, preferably about 20 to 500 bases, and more preferably about 20 to 100 bases.
本発明のクロマグロの性判別方法について、以下に詳述する。
本発明の方法は、クロマグロ被検体由来のゲノムＤＮＡを含有する試料において、表２のＤＮＡ多型の１以上を検出するものである。ここで「ＤＮＡ多型の検出」とは、ＤＮＡ多型部位の塩基を検出、同定すること、ＤＮＡ多型部位の雄特異的対立遺伝子を検出すること、および／またはＤＮＡ多型の遺伝子型がホモ接合型であるかヘテロ接合型であるかを検出することを含む。検出結果に応じて、被検体が雌であるか雄であるかを判別する。被検体の性別は、表２に記載の所定のＤＮＡ多型部位で検出される塩基、雄特異的対立遺伝子および／または遺伝子型の情報に基づいて判断できる。例えば、表２の（１）のＤＮＡ多型は、配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基に存在する一塩基多型であり、雌の遺伝子型はＡ／Ａのホモ接合型であり、雄の遺伝子型はＡ／Ｔのヘテロ接合型である。配列番号１で表される塩基配列の５０１番目の塩基としてＡのみが検出されれば、試料が由来する被検体は雌であり、ＡおよびＴが検出されれば、被検体は雄であると判別できる。あるいは、当該一塩基多型部位の雄特異的対立遺伝子であるＴアレルが検出されなければ、試料が由来する被検体は雌であり、Ｔアレルが検出されれば、雄であると判別できる。あるいは、当該一塩基多型部位の遺伝子型がＡ／Ａのホモ接合型であれば、試料が由来する被検体は雌であり、Ａ／Ｔのヘテロ接合型であれば、雄であると判別できる。表２の（２）〜（７４）のＤＮＡ多型を用いた場合も、表２に基づき、同様に判別できる。
The sex determination method of the bluefin tuna of the present invention is described in detail below.
The method of the present invention is to detect one or more of the DNA polymorphisms in Table 2 in a sample containing genomic DNA from a bluefin tuna subject. Here, "detection of DNA polymorphism" refers to detection and identification of a nucleotide at a DNA polymorphism site, detection of a male-specific allele at a DNA polymorphism site, and / or genotype of a DNA polymorphism. Including detecting whether it is homozygous or heterozygous. Whether the subject is female or male is determined according to the detection result. The sex of the subject can be determined based on the base, male-specific allele and / or genotype information detected at a predetermined DNA polymorphism site described in Table 2. For example, the DNA polymorphism of (1) in Table 2 is a single nucleotide polymorphism present at the 501st base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the female genotype is A / A homozygous The male genotype is A / T heterozygous. If only A is detected as the 501st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, the analyte from which the sample is derived is a female, and if A and T are detected, the analyte is a male It can be determined. Alternatively, if the T allele which is a male specific allele of the single nucleotide polymorphism site is not detected, the subject from which the sample is derived is a female, and if the T allele is detected, it can be determined as a male. Alternatively, if the genotype of the single nucleotide polymorphism site is A / A homozygous, the sample from which the sample is derived is a female, and if it is a heterozygous A / T, it is a male. it can. Also when the DNA polymorphisms of (2) to (74) in Table 2 are used, the discrimination can be similarly made based on Table 2.
本発明の方法においては、より具体的には、まず、クロマグロ被検体よりＤＮＡを含有する試料を採取する。クロマグロ被検体は、天然魚であってもよいし、養殖魚であってもよい。クロマグロ被検体より採取されるＤＮＡ含有試料としては、特に制限されないが、例えば、各種細胞、組織、これらに由来する培養細胞などを例示できる。また、ヒレ、筋肉、内臓、体表粘液等を例示することができる。次に、必要に応じて当該試料に含まれるゲノムＤＮＡを抽出する。ＤＮＡ含有試料からのゲノムＤＮＡの抽出は、公知の方法を用いて行うことができる。ゲノムＤＮＡの抽出法としては、例えば、フェノール法、ＣＴＡＢ法、アルカリＳＤＳ法等が挙げられる。ゲノムＤＮＡは、粗抽出物をそのまま使用してもよいし、必要に応じて、公知の方法により精製してもよい。ゲノムＤＮＡ抽出のための試薬やキットは市販されており、これを用いてもよい。 More specifically, in the method of the present invention, first, a sample containing DNA is collected from a bluefin tuna sample. The bluefin tuna subject may be a natural fish or a cultured fish. The DNA-containing sample collected from the bluefin tuna subject is not particularly limited, and examples thereof include various cells, tissues, and cultured cells derived therefrom. In addition, fins, muscles, internal organs, body surface mucus and the like can be exemplified. Next, genomic DNA contained in the sample is extracted as necessary. Extraction of genomic DNA from a DNA-containing sample can be performed using a known method. Examples of genomic DNA extraction methods include phenol method, CTAB method, alkaline SDS method and the like. The genomic DNA may be used crude as it is, or may be purified by a known method as needed. Reagents and kits for genomic DNA extraction are commercially available and may be used.
次いで、性判別の指標として用いられるＤＮＡ多型を検出する。ＤＮＡ多型の検出は、公知の方法を用いて行うことができる。ＤＮＡ多型の検出法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＰ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、ＰＣＲ−ＲＬＦＰ、ＰＣＲ−ＳＳＯ、ＰＣＲ−ＡＳＰ、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法、サイクリングプローブ法、モレキュラービーコン法、ＨＲＭ法、ＤＯＬ法、ＴＤＩ法、ダイレクトシークエンス法、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ｄＨＰＬＣ、インベーダー法、Ｓｎｉｐｅｒ法、マイクロアレイ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法などを用いた方法が挙げられる。こうした方法は、当業者に周知である（例えば、野島博編、「ゲノム創薬の最前線」、ｐ４４−５４、羊土社、２００１を参照）。ＤＮＡ多型検出のための試薬やキットも市販されており、これを用いてもよい。ＤＮＡ多型の検出法は、これらに限定されるものではなく、他の公知の方法を利用してもよい。また、これらの方法を単独で用いても、２以上の方法を組み合わせて用いてもよい。 Next, DNA polymorphisms used as an index of sex discrimination are detected. Detection of DNA polymorphism can be performed using a known method. The detection method of DNA polymorphism includes, for example, PCR-SSP, PCR-SSCP, PCR-RLFP, PCR-SSO, PCR-ASP, TaqMan PCR method, cycling probe method, molecular beacon method, HRM method, DOL method, TDI Methods using direct sequencing method, SNaP shot, dHPLC, invader method, Sniper method, microarray method, MALDI-TOF / MS method and the like can be mentioned. Such methods are well known to those skilled in the art (see, for example, Nojima, ed., "Forefront of genomic drug discovery," p44-54, Yodosha, 2001). Reagents and kits for detecting DNA polymorphism are also commercially available, and may be used. Methods for detecting DNA polymorphisms are not limited to these, and other known methods may be used. In addition, these methods may be used alone, or two or more methods may be used in combination.
本発明の方法において、性判別の指標として用いられるＤＮＡ多型を検出する場合、当該検出のためのプライマー、プローブ等は、当該ＤＮＡ多型を特異的に検出するように設計されることが好ましい。本発明の方法で性判別の指標として用いられるＤＮＡ多型は、全て配列番号１で表される塩基配列上に存在する。当業者は、配列番号１で表される塩基配列および表２のＤＮＡ多型部位の各対立遺伝子の情報に基づき、増幅サイズ、プライマーの塩基長、ＧＣ含有率、Ｔｍ値、検出原理等を考慮して、検出すべきＤＮＡ多型のための適切なプライマーやプローブを設計することができる。 In the method of the present invention, when detecting a DNA polymorphism used as an index of sex discrimination, it is preferable that a primer, a probe or the like for the detection is designed to specifically detect the DNA polymorphism. . The DNA polymorphisms used as an index of sex discrimination in the method of the present invention are all present on the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. Those skilled in the art consider amplification size, primer base length, GC content, Tm value, detection principle, etc. based on the information of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and each allele of DNA polymorphic site in Table 2. Then, appropriate primers and probes for DNA polymorphism to be detected can be designed.
本発明のクロマグロの性判別方法は、単独で実施しても、他の性判別方法と組み合わせて行ってもよい。他の性判別方法としては、生殖腺の目視、組織学的切片観察等が挙げられる。 The sex determination method of the bluefin tuna of the present invention may be carried out alone or in combination with other sex determination methods. Other sex determination methods include visual inspection of gonads, histological section observation and the like.
後記実施例では、本発明の方法の好適な実施形態の一つとして、ＰＣＲ−ＳＳＰを用いた方法を示す。ＰＣＲ−ＳＳＰは、３’末端が目的のＤＮＡ多型部位となるように設計したプライマーを用いてＰＣＲを行い、プライマーの３’末端が鋳型ＤＮＡと相補的であるか否かによってＰＣＲによる増幅効率に著しい差があることを利用して、当該ＤＮＡ多型を検出する方法である。具体的には、ゲノムＤＮＡを鋳型とし、３’末端が目的のＤＮＡ多型の対立遺伝子の塩基配列となるように設計されたプライマーを用いて、当該ＤＮＡ多型部位を含む約５０〜１０００ｂｐ、好ましくは約１００〜５００ｂｐの領域をＰＣＲで増幅し、次いで電気泳動を行う。所望のサイズのバンドが見られる場合には、当該対立遺伝子が存在すると判断でき、バンドが見られない場合には、当該対立遺伝子が存在しないと判断することができる。本発明の性判別マーカーは、全て、雌の場合に遺伝子型がホモ接合型であり、雄の場合に遺伝子型がヘテロ接合型であることから、雄特異的な対立遺伝子を検出対象として、所望のサイズのバンドが見られる場合には雄、バンドが見られない場合には雌と判断することができる。このとき、バンドが見られないことがＰＣＲの失敗に起因するものでないと示すため、コントロールとして、雌雄の別なく存在する遺伝子やＤＮＡ配列を同時にＰＣＲ増幅してもよい。このような例として、ミトコンドリアのＣＯＩ遺伝子、ＮＤ４遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＰＣＲ増幅に用いるプライマーは、目的とするＤＮＡ多型に応じて適宜設計され、プライマーの塩基長は、通常１５〜５０塩基であり、好ましくは１５〜３５塩基である。当該プライマーは、目的のＤＮＡ断片を増幅できる限りにおいて、鋳型のＤＮＡ配列と１〜数個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個のミスマッチを有していてもよい。 In Examples described later, a method using PCR-SSP is shown as one of the preferred embodiments of the method of the present invention. PCR-SSP performs PCR using a primer designed so that the 3 'end is the target DNA polymorphism site, and amplification efficiency by PCR is determined depending on whether the 3' end of the primer is complementary to the template DNA or not This method is a method of detecting the DNA polymorphism by making use of the significant difference between Specifically, using a primer designed to use genomic DNA as a template and the 3 'end being the base sequence of the allele of the target DNA polymorphism, about 50 to 1000 bp containing the DNA polymorphism site, Preferably, a region of about 100-500 bp is amplified by PCR followed by electrophoresis. If a band of the desired size is observed, it can be determined that the allele is present, and if no band is observed, it can be determined that the allele is absent. Since all sex discrimination markers of the present invention are homozygous for females and heterozygous for males, it is desirable to detect male-specific alleles. It can be judged as male if a band of the size of is seen, and female if no band is seen. At this time, since it indicates that the absence of bands is not due to PCR failure, as a control, PCR amplification may be performed simultaneously on genes and DNA sequences that are present in both sexes. Such examples include, but are not limited to, the mitochondrial COI gene, the ND4 gene, and the like. The primer used for PCR amplification is appropriately designed according to the target DNA polymorphism, and the base length of the primer is usually 15 to 50 bases, preferably 15 to 35 bases. The primer may have one to several, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3 mismatches with the DNA sequence of the template as long as the target DNA fragment can be amplified.
また、後記実施例では、本発明の方法の好適な実施形態の一つとして、ＰＣＲを用いた方法を示す。当該方法は、目的のＤＮＡ多型が塩基の欠失や挿入である場合に適用でき、目的のＤＮＡ多型を挟むように設計したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅サイズの違いに基づいて当該ＤＮＡ多型を検出する方法である。具体的には、ゲノムＤＮＡを鋳型とし、目的のＤＮＡ多型部位の上流および下流に設計されたプライマーを用いて、当該ＤＮＡ多型部位を含む約５０〜１０００ｂｐ、好ましくは約１００〜５００ｂｐ、より好ましくは約１００〜３００ｂｐの領域をＰＣＲで増幅し、次いで電気泳動を行う。本発明の性判別マーカーは、全て、雌の場合に遺伝子型がホモ接合型であり、雄の場合に遺伝子型がヘテロ接合型であることから、雌雄共通のバンドのみが見られる場合には雌と判別でき、雌雄共通のバンドと当該バンドより欠失あるいは挿入領域に相当する塩基長分が短いあるいは長い雄特異的なバンドが見られる場合には雄と判別できる。ＰＣＲ増幅に用いるプライマーは、目的とするＤＮＡ多型に応じて適宜設計され、プライマーの塩基長は、通常１５〜５０塩基であり、好ましくは１５〜３５塩基である。当該プライマーは、目的のＤＮＡ断片を増幅できる限りにおいて、鋳型のＤＮＡ配列と１〜数個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個のミスマッチを有していてもよい。 In addition, in Examples described later, a method using PCR is shown as one of the preferred embodiments of the method of the present invention. The method is applicable when the target DNA polymorphism is a deletion or insertion of a base, and PCR is performed using primers designed to sandwich the target DNA polymorphism, and the PCR is performed based on the difference in amplification size. It is a method of detecting DNA polymorphism. Specifically, using genomic DNA as a template and using primers designed upstream and downstream of the DNA polymorphism site of interest, about 50 to 1000 bp, preferably about 100 to 500 bp, including the DNA polymorphism site, more preferably Preferably, a region of about 100-300 bp is amplified by PCR and then electrophoresed. The sex discrimination markers of the present invention are all homozygous in the case of females and heterozygous in the case of males. A male-specific band can be identified if a band common to both male and female and a short or long male-specific band corresponding to the deletion or insertion region from the band is found. The primer used for PCR amplification is appropriately designed according to the target DNA polymorphism, and the base length of the primer is usually 15 to 50 bases, preferably 15 to 35 bases. The primer may have one to several, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3 mismatches with the DNA sequence of the template as long as the target DNA fragment can be amplified.
本発明の方法は、リアルタイムＰＣＲ検出法、例えばＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法によっても簡便に実施することができる。具体的には、ゲノムＤＮＡ（鋳型）、５’末端が蛍光色素で、３’末端がクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されたプローブ、当該プローブとハイブリダイズする領域を含むゲノムＤＮＡの部分配列を増幅するように設計されたプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼとともにＰＣＲを行う。反応中、プローブは鋳型ＤＮＡとハイブリダイズし、同時にＰＣＲプライマーからの伸長反応が起こる。伸長反応が進むと、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により鋳型ＤＮＡとハイブリダイズしたプローブが切断されるため、プローブの蛍光色素が遊離してクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光が検出される。鋳型の増幅により、蛍光強度は指数関数的に増大する。標識からの蛍光の強度を測定することで、ＤＮＡ多型を検出する。
プライマーおよびプローブは、目的とするＤＮＡ多型に応じて適宜設計される。当該プライマーは、その塩基長が通常約１５〜５０塩基であり、好ましくは約１５〜３５塩基である。目的のＤＮＡ断片を増幅できる限りにおいて、鋳型のＤＮＡ配列と１〜数個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個のミスマッチを有していてもよい。当該プローブは、その塩基長が通常約１５〜５０塩基であり、好ましくは約１５〜３５塩基であり、５’末端がＦＩＴＣやＶＩＣなどの蛍光色素で、３’末端がＴＡＭＲＡなどのクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されている。目的のＤＮＡ多型を含む領域と特異的にハイブリダイズできる限りにおいて、鋳型のＤＮＡ配列と１〜数個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個のミスマッチを有していてもよい。また、目的のＤＮＡ多型のそれぞれの対立遺伝子について、異なるレポーター蛍光色素で標識されたプローブを用いることで、ＤＮＡ多型の両対立遺伝子を１度に検出することもできる。本発明の方法で使用され得るプローブとしては、配列番号１で表される塩基配列の部分配列であって、目的のＤＮＡ多型部位の対立遺伝子の塩基を含み、かつその塩基長が通常約１５〜５０塩基であり、好ましくは約１５〜３５塩基である塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補鎖が例示される。
The method of the invention can also be conveniently carried out by real time PCR detection, eg TaqMan PCR. Specifically, a partial sequence of genomic DNA including a probe labeled with genomic DNA (template), a fluorescent dye at the 5 'end and a quencher (quencher) at the 3' end, and a region that hybridizes with the probe The PCR is performed with primers designed to amplify and DNA polymerase. During the reaction, the probe hybridizes to the template DNA, and at the same time, the extension reaction from the PCR primer occurs. When the extension reaction proceeds, the probe hybridized with the template DNA is cleaved by the 5 'to 3' exonuclease activity of the DNA polymerase, so the fluorescent dye of the probe is released and is not affected by the quencher, and the fluorescence is detected. Be done. The amplification of the template causes the fluorescence intensity to increase exponentially. DNA polymorphism is detected by measuring the intensity of fluorescence from the label.
Primers and probes are appropriately designed according to the target DNA polymorphism. The base length of the primer is usually about 15 to 50 bases, preferably about 15 to 35 bases. As long as the target DNA fragment can be amplified, it may have one to several, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3 mismatches with the DNA sequence of the template. The probe has a base length of usually about 15 to 50 bases, preferably about 15 to 35 bases, a 5 'end is a fluorescent dye such as FITC or VIC, and a 3' end is a quencher such as TAMRA ( Each is labeled with a quencher). As long as it can hybridize specifically with the region containing the target DNA polymorphism, it may have one to several, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3 mismatches with the DNA sequence of the template Good. In addition, both alleles of the DNA polymorphism can also be detected at one time by using probes labeled with different reporter fluorescent dyes for each allele of the DNA polymorphism of interest. The probe that can be used in the method of the present invention is a partial sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, which contains the base of the allele at the DNA polymorphic site of interest, and its base length is usually about 15 The oligonucleotide which consists of a base sequence which is 50 bases, Preferably it is about 15-35 bases or its complementary strand is illustrated.
本発明は、ＰＣＲ法を採用する本発明判別（検出）方法において用いられるＤＮＡ多型検出用プライマーまたはプローブとしてのオリゴヌクレオチドをも提供する。当該オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ多型を含む特定配列部分を特異的に増幅できるまたはＤＮＡ多型を含む特定配列部分に特異的にハイブリダイズできるものである限り特に制限はない。該オリゴヌクレオチドは配列番号１で表される塩基配列および表２のＤＮＡ多型の各対立遺伝子の情報に基いて常法に従って適宜合成、構築することができる。 The present invention also provides an oligonucleotide as a DNA polymorphism detection primer or probe used in the present invention discrimination (detection) method employing PCR. The oligonucleotide is not particularly limited as long as it can specifically amplify a specific sequence portion containing a DNA polymorphism or can specifically hybridize to a specific sequence portion containing a DNA polymorphism. The oligonucleotide can be appropriately synthesized and constructed according to a conventional method based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the information of each allele of the DNA polymorphism of Table 2.
その合成は、より具体的には通常のホスホルアミダイト法、リン酸トリエステル法などの化学合成法によることもでき、また市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置などを使用して合成することもできる。二本鎖断片は、化学合成した一本鎖生成物とその相補鎖を合成し、両者を適当な条件下でアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列とＤＮＡポリメラーゼとを用いて、上記一本鎖生成物に相補鎖を付加させることによって、得ることができる。 More specifically, the synthesis can be carried out by a chemical synthesis method such as a conventional phosphoramidite method or phosphate triester method, or can be synthesized using a commercially available automated oligonucleotide synthesizer or the like. it can. The double stranded fragment synthesizes the chemically synthesized single stranded product and its complementary strand, and both are annealed under appropriate conditions, or using the appropriate primer sequence and DNA polymerase, It can be obtained by adding a complementary strand to the product.
ＰＣＲで用いられるＤＮＡ増幅用のプライマー対として好適なものは、目的のＤＮＡ多型部位を含む約５０〜１０００ｂｐ、好ましくは約１００〜５００ｂｐの領域を増幅できるように設計されたオリゴヌクレオチド対である。このようなプライマー対としては、目的のＤＮＡ多型部位を挟むように設計されたオリゴヌクレオチド対や、少なくとも一方のプライマーの３’末端がＤＮＡ多型部位となるように設計されたオリゴヌクレオチド対が例示される。当該プライマーは、通常約１０〜５０個、好ましくは約１５〜３５塩基の連続した塩基配列を有するものが例示される。
ＤＮＡ多型を検出するためのプローブとして好適なものは、目的のＤＮＡ多型の対立遺伝子を含む約１０〜５０塩基、好ましくは約１５〜３５塩基の配列を有するオリゴヌクレオチドまたはその相補鎖が例示される。当該プローブは、５’末端がＦＩＴＣやＶＩＣのような蛍光色素で標識されていてもよく、３’の末端がＴＡＭＲＡのようなクエンチャー物質で標識されていてもよい。また、オリゴヌクレオチド中にＲＮＡ部位を有していてもよい。
Preferred as a primer pair for DNA amplification used in PCR are oligonucleotide pairs designed to amplify a region of about 50 to 1000 bp, preferably about 100 to 500 bp, containing the DNA polymorphism site of interest. . As such a primer pair, an oligonucleotide pair designed so as to sandwich a target DNA polymorphism site, or an oligonucleotide pair designed such that the 3 'end of at least one primer is a DNA polymorphism site It is illustrated. The primer is exemplified by one having a continuous base sequence of usually about 10 to 50, preferably about 15 to 35 bases.
An example of a suitable probe for detecting a DNA polymorphism is an oligonucleotide having a sequence of about 10 to 50 bases, preferably about 15 to 35 bases containing the allele of the DNA polymorphism of interest, or a complementary strand thereof Be done. The probe may be labeled at the 5 'end with a fluorescent dye such as FITC or VIC, or may be labeled at the 3' end with a quencher substance such as TAMRA. In addition, it may have an RNA site in the oligonucleotide.
プライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドの好適なものとしては、表２の（１）〜（７４）のＤＮＡ多型から選択される１以上のＤＮＡ多型を含む領域を増幅できるプライマーを挙げることができる。その具体例としては、後記実施例に示される配列番号２、３、６および７で示されるフォワードプライマーおよびリバースプライマーを挙げることができる。
また、プローブとしては、表２の（１）〜（７４）のＤＮＡ多型から選択される１以上のＤＮＡ多型を検出できるものを挙げることができる。
As a suitable thing of the oligonucleotide used as a primer, the primer which can amplify the area | region containing one or more DNA polymorphisms selected from DNA polymorphism of (1)-(74) of Table 2 can be mentioned. Specific examples thereof include the forward primer and the reverse primer shown in SEQ ID NOs: 2, 3, 6 and 7 shown in the following Examples.
Moreover, as a probe, what can detect the 1 or more DNA polymorphism selected from DNA polymorphism of (1)-(74) of Table 2 can be mentioned.
本発明判定（検出）方法は、試料中のＤＮＡ多型の検出のための試薬キットを利用することによって、より簡便に実施することができる。本発明はかかる判定用キットをも提供する。 The determination (detection) method of the present invention can be more simply carried out by using a reagent kit for detecting DNA polymorphism in a sample. The present invention also provides such a determination kit.
本発明キットの一つは、表２の（１）〜（７４）のＤＮＡ多型から選択される１以上のＤＮＡ多型を含む領域を増幅できるプライマーおよび／または当該ＤＮＡ多型を検出できるプローブを含む。 One of the kits of the present invention is a primer capable of amplifying a region containing one or more DNA polymorphisms selected from the DNA polymorphisms of (1) to (74) in Table 2 and / or a probe capable of detecting the DNA polymorphisms. including.
本発明キットにおける他の成分としては、標識剤、ＰＣＲ法に必須な試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰなど）を例示することができる。標識剤としては、放射性同位元素、発光物質、蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられ、ＤＮＡ断片自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていてもよい。更に当該キットには、測定の実施の便益のために適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液、制限酵素などが含まれていてもよい。 As other components in the kit of the present invention, labeling agents and reagents essential for PCR (eg, Taq DNA polymerase, dNTP, etc.) can be exemplified. The labeling agent includes radioisotopes, luminescent substances, chemical modifiers such as fluorescent substances, and the like, and the DNA fragment itself may be conjugated beforehand with the labeling agent. Furthermore, the kit may contain a reaction diluent, a standard antibody, a buffer, a detergent, a reaction stopping solution, a restriction enzyme and the like, which are suitable for the benefit of performing the measurement.
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will next be described in more detail by way of examples, which should not be construed as limiting the invention thereto.
実施例１ クロマグロの性別特異的な塩基配列の同定
天然クロマグロ成魚の雌１６個体および雄１５個体（生殖腺による性判別済み）の全ゲノムリシーケンスデータと新たに作成したクロマグロドラフトゲノム配列を用いて変異解析を実施し、性別特異的な複数のＤＮＡ多型を見出した。当該ＤＮＡ多型が存在するスキャフォルド６４番の約７．５ｋｂのゲノム領域の配列を配列番号１に示す。また、配列番号１で表される塩基配列中の各ＤＮＡ多型の位置、雌の遺伝子型、雄の遺伝子型、性判別率を表３に示す。各ＤＮＡ多型の遺伝子型は、雌においてはホモ接合型であり、雄においてはヘテロ接合型である。性判別率は、データの取得できた個体数における、雌または雄特異的遺伝子型を有する個体数の割合である。各ＤＮＡ多型は、その性判別率が９３．５％以上と高く、性判別マーカーとして有用である。
さらに、スキャフォルド６４番のゲノム配列をＨａｐｌｏｖｉｅｗ（ｖ４．２）を用い、ＬＤ−ｂａｓｅｄ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍで解析したところ、配列番号１の４２２番目から３５９５番目、３７３５番目から３７８８番目、６２４０番目から６６４２番目、および６６９８番目から７１９７番目の領域が、それぞれ、連鎖不平衡ブロックであることが明らかとなった。
Example 1 Identification of sex-specific base sequences of bluefin tuna Mutations using whole genome resequence data of 16 females and 15 males of adult natural bluefin tuna (already sexed by gonads) and newly prepared bluefin tuna draft genome sequences Analysis was performed to find multiple gender-specific DNA polymorphisms. The sequence of the approximately 7.5-kb genome region of scaffold No. 64 in which the DNA polymorphism is present is shown in SEQ ID NO: 1. Further, Table 3 shows the position of each DNA polymorphism in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, female genotype, male genotype, and sex discrimination rate. The genotype of each DNA polymorphism is homozygous in females and heterozygous in males. The sex discrimination rate is the ratio of the number of individuals having a female or male specific genotype in the number of individuals for which data can be obtained. Each DNA polymorphism has a high sex discrimination rate of 93.5% or more, and is useful as a sex discrimination marker.
Furthermore, when the genome sequence of scaffold No. 64 was analyzed by LD-based partitioning algorithm using Haploview (v 4.2), 422 to 3595, 3735 to 3788, 6240 to 6642 of SEQ ID NO: 1 , And 6698th to 7197th regions are revealed to be linkage disequilibrium blocks, respectively.
配列番号１で表される塩基配列中の２領域、具体的には配列番号１で表される塩基配列の１３０９〜１４５８番目の塩基（１５０塩基）からなる領域１と、配列番号１で表される塩基配列の３０５９〜３２８８番目の塩基（２３０塩基）からなる領域２について、リシーケンス解析に用いた雌１６個体、雄１５個体、計３１個体の塩基配列をアライメントした結果を、それぞれ図１および２に示す。アライメント中の矢印または四角で示される各ＤＮＡ多型は、雄に特異的または極めて特異性の高い変異であることが明らかとなった。 SEQ ID NO: 1 represents two regions in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, specifically, region 1 consisting of bases 1 to 1 in bases 1 to 1 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (150 bases); The results of alignment of the nucleotide sequences of 16 females and 15 males, totaling 31 individuals, used in resequencing analysis for region 2 consisting of bases 3059 to 3288 (230 bases) of the nucleotide sequence shown in FIG. Shown in 2. Each DNA polymorphism indicated by an arrow or a square in the alignment was found to be a male-specific or extremely specific mutation.
実施例２ 雄特異的プライマーを用いたＰＣＲおよびアガロース電気泳動による性判別方法：領域１
領域１には、雄に特異的または極めて特異性の高い変異として、配列番号１で表される塩基配列の１３３８および１３４４番目（領域１の３０および３６番目に相当）の塩基に位置する一塩基多型と、１４１７〜１４２３番目（領域１の１０９〜１１５番目に相当）の塩基の欠失が存在する。したがって、クロマグロ被検体のゲノムＤＮＡを鋳型とし、これらの変異に基づいて設計した表４に示す雄特異的プライマーであるＹ３＿Ｆ１プライマー（配列番号２）およびＹ３＿Ｒ１プライマー（配列番号３）を用いたＰＣＲ増幅およびゲル電気泳動によって、１１３ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた場合に被検体の遺伝的性は雄であると判定でき、ＤＮＡ断片の増幅が認められなかった場合に被検体の遺伝的性は雌であると判定することができる。ここで、Ｙ３＿Ｆ１プライマーの３’末端および３’末端から７塩基目は一塩基多型の雄特異的対立遺伝子の塩基を有し、Ｙ３＿Ｒ１プライマーは欠失領域の上流および下流の配列を有する。
そこで、天然クロマグロの雌４個体と雄４個体（生殖腺による性判別済み）について、Ｙ３＿Ｆ１プライマーおよびＹ３＿Ｒ１プライマーによるＰＣＲを行い、増幅産物をゲル電気泳動した。陰性対照として、塩基配列を確認済の雌個体を用い、陽性対照として、塩基配列を確認済の雄個体を用いた。また、ネガティブコントロール（ＮＴＣ）として、ＤＮＡなしでＰＣＲを行った。具体的な方法は、以下の通りである。各個体より、筋肉をハサミ等を用いて採取し、ＴＮＥＳ・Ｕｒｅａ ６Ｍ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、６Ｍ Ｕｒｅａ）中でプロテアーゼ処理を行い、自動ＤＮＡ抽出装置（Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣシステム、Ｍａｘｗｅｌｌ ＲＳＣ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ ｋｉｔ、プロメガ株式会社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡ（最終濃度０．５ｎｇ／μｌ）を鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）とＹ３＿Ｆ１プライマーおよびＹ３＿Ｒ１プライマー（最終濃度各０．４μＭ）を用いて、Ｐｒｏｆｌｅｘ ＰＣＲ システム（アプライドバイオシステムズ製）によりＰＣＲ反応（９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１５秒の反応を３５サイクル）を行い、得られたＰＣＲ増幅産物を３％アガロースゲルにアプライし、１００Ｖで２０分間、電気泳動を行った。なお、人為的ミスでＰＣＲ増幅に失敗し、雄個体から１１３ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されずに、雌と誤判定されてしまう偽陰性を防止するため、内部陽性対照としてミトコンドリアＤＮＡのＮＤ４遺伝子（２６８ｂｐ）を、表４に示すＮＤ４＿ＦプライマーおよびＮＤ４＿Ｒプライマー（最終濃度各０．０５μＭ）を用いた以外は上述の条件に従って、ＰＣＲにて増幅した。
Example 2 Method of sex determination by PCR and agarose electrophoresis using male specific primers: Region 1
Region 1 is a single nucleotide located at the 1338th and 1344th bases (corresponding to the 30th and 36th positions of the region 1) of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a male-specific or very specific mutation in the region 1 There is a polymorphism and a deletion of bases 1417-1423 (corresponding to the 109th to 115th regions in Region 1). Therefore, PCR amplification using Y3_F1 primer (SEQ ID NO: 2) and Y3_R1 primer (SEQ ID NO: 3), which are male specific primers shown in Table 4 designed based on these mutations, using the genomic DNA of the bluefin tuna subject as a template When the amplification of the 113 bp DNA fragment is observed by PCR and gel electrophoresis, the genetic nature of the subject can be determined to be male, and when the amplification of the DNA fragment is not recognized, the genetic nature of the subject is It can be determined to be female. Here, the 3 'end of the Y3_F1 primer and the seventh base from the 3' end have the bases of the male-specific allele of the single nucleotide polymorphism, and the Y3_R1 primer has the upstream and downstream sequences of the deleted region.
Therefore, PCR was performed using Y3_F1 primer and Y3_R1 primer for 4 females of natural bluefin tuna and 4 males (already sexed by gonads), and the amplified product was subjected to gel electrophoresis. As a negative control, a female individual whose base sequence was confirmed was used, and as a positive control, a male individual whose base sequence was confirmed was used. In addition, PCR was performed without DNA as a negative control (NTC). The specific method is as follows. Muscles are collected from each individual using scissors etc., protease-treated in TNES · Urea 6 M solution (10 mM Tris-HCl, 125 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% SDS, 6 M Urea), and automatic DNA extraction Genomic DNA was prepared using an apparatus (Maxwell RSC system, Maxwell RSC Blood DNA kit, manufactured by Promega Corp.). Using this genomic DNA (final concentration 0.5 ng / μl) as a template and the PrimeSTAR GXL kit (Takara Bio Inc.) and Y3_F1 and Y3_R1 primers (final concentration 0.4 μM each), Proflex PCR system (Applied Bio) PCR reaction (98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 15 seconds, 68 ° C. for 15 seconds for 35 cycles) is performed, and the resulting PCR amplification product is applied to a 3% agarose gel and subjected to 100 V for 20 minutes. Electrophoresis was performed. In addition, in order to prevent false negatives in which PCR amplification fails due to human error and a 113 bp DNA fragment is not amplified from a male individual and is falsely judged as a female, the ND4 gene (268 bp) of mitochondrial DNA is used as an internal positive control. ) Was amplified by PCR according to the conditions described above except using the ND4_F primer and the ND4_R primer (final concentration of 0.05 μM each) shown in Table 4.
結果を図３ａに示す。１１３ｂｐのＤＮＡ断片は、雌個体（レーン１〜４）および陰性対照には認められず、雄個体（レーン５〜８）および陽性対照に特異的に認められた。また、内部陽性対照であるＮＤ遺伝子由来の２６８ｂｐの増幅産物は全てのレーンで確認された。これらの結果は、被験体の性判別に成功したことを示している。以上の結果は、天然クロマグロの雌３９個体、雄４８個体（生殖腺による性判別済み）においても再現されたため、領域１に含まれるＤＮＡ多型を指標とするクロマグロの性判別方法が有効であることが明らかとなった。 The results are shown in FIG. 3a. The 113 bp DNA fragment was not found in female individuals (lanes 1-4) and negative controls, but specifically in male individuals (lanes 5-8) and positive controls. In addition, an amplification product of 268 bp derived from the ND gene, which is an internal positive control, was confirmed in all lanes. These results indicate that the sex determination of the subject was successful. The above results were also reproduced in 39 females of natural bluefin tuna and 48 males (sex-discriminated by gonads). Therefore, it is effective that the method for sex determination of bluefin tuna using DNA polymorphism included in Region 1 as an index It became clear.
実施例３ 雄特異的プライマーを用いたＰＣＲおよびアガロース電気泳動による性判別方法：領域２
領域２には、雄に特異的または極めて特異性が高い変異として、配列番号１で表される塩基配列の３０９３、３１３９、３１４６、３１４８、３１９６、３１９９、３２４９、３２５１番目（領域２の３５、８１、８８、９０、１３８、１４１、１９１、１９３番目）の塩基に位置する一塩基多型が存在する。したがって、クロマグロ被験体のゲノムＤＮＡを鋳型とし、これらの変異に基づいて設計した表４に示す雄特異的プライマーであるＹ２＿Ｆ１プライマー（配列番号６）およびＹ２＿Ｒ２プライマー（配列番号７）を用いたＰＣＲ増幅およびゲル電気泳動によって、１４３ｂｐのＤＮＡ断片の増幅が認められた場合に被験体の遺伝的性は雄であると判定でき、ＤＮＡ断片の増幅が認められなかった場合に被験体の遺伝的性は雌であると判定することができる。ここで、Ｙ２＿Ｆ１プライマーの３’末端並びに３’末端から３および１０塩基目は一塩基多型の雄特異的対立遺伝子の塩基を有し、Ｙ２＿Ｒ２プライマーの５’末端から７塩基目は雌雄共通の低頻度多型（Ａ／Ｔ）に対応する塩基Ｗを、３’末端から２および４塩基目は一塩基多型の雄特異的対立遺伝子の塩基を有する。
そこで、天然クロマグロの雌４個体と雄４個体（生殖腺による性判別済み）について、Ｙ２＿Ｆ１プライマーおよびＹ２＿Ｒ２プライマーを用いた以外は実施例２と同様にして、ＰＣＲおよび電気泳動を行った。
Example 3 Method of sex determination by PCR and agarose electrophoresis using male specific primers: Region 2
Region 2 is a 3093, 3139, 3146, 3148, 3196, 3199, 3249, 3251 th position of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a mutation specific or extremely specific to male (region 35 of 35, There are single nucleotide polymorphisms located at bases 81, 88, 90, 138, 141, 191 and 193). Therefore, PCR amplification using the Y2_F1 primer (SEQ ID NO: 6) and the Y2_R2 primer (SEQ ID NO: 7), which are male specific primers shown in Table 4 designed based on these mutations, using the genomic DNA of the bluefin tuna subject as a template The subject's geneticity can be determined to be male when amplification of the 143 bp DNA fragment is observed by gel electrophoresis and gel electrophoresis, and the subject's geneticity is when amplification of the DNA fragment is not observed. It can be determined to be female. Here, the 3 'end of the Y2_F1 primer and the third and third bases from the 3' end have single-nucleotide polymorphism male-specific allele bases, and the fifth base from the 5 'end of the Y2_R2 primer is common to male and female The base W corresponds to the low frequency polymorphism (A / T), and the 2nd and 4th bases from the 3 'end have a base of a male-specific allele of a single nucleotide polymorphism.
Therefore, PCR and electrophoresis were performed in the same manner as in Example 2 except for using four Y2_F1 and Y2_R2 primers for four females of natural bluefin tuna and four males (having been sex-discriminated by gonads).
結果を図３ｂに示す。１４３ｂｐのＤＮＡ断片は、雌個体（レーン１〜４）および陰性対照には認められず、雄個体（レーン５〜８）および陽性対照に特異的に認められた。また、内部陽性対象であるＮＤ遺伝子由来の２６８ｂｐの増幅産物は全てのレーンで確認された。これらの結果は、被験体の性判別に成功したことを示している。以上の結果は、天然クロマグロの雌３９個体、雄４８個体（生殖腺による性判別済み）においても再現されたため、領域２に含まれるＤＮＡ多型を指標とするクロマグロの性判別方法が有効であることが明らかとなった。 The results are shown in FIG. 3b. A 143 bp DNA fragment was not found in female individuals (lanes 1-4) and negative controls, but specifically in male individuals (lanes 5-8) and positive controls. In addition, an amplification product of 268 bp derived from the ND gene which is an internal positive target was confirmed in all lanes. These results indicate that the sex determination of the subject was successful. The above results were also reproduced in 39 females of natural bluefin tuna and 48 males (sex-discriminated by gonads). Therefore, it is effective that the method of sex determination of bluefin tuna using DNA polymorphism included in Region 2 as an index It became clear.
実施例４ 雄特異的欠失領域を対象としたＰＣＲおよびマイクロチップ電気泳動による性判別方法：領域１
領域１には、雄に特異的な変異として、配列番号１で表される塩基配列の１４１７〜１４２３番目（領域１の１０９〜１１５番目）の連続７塩基の欠失が存在する。したがって、クロマグロ被験体のゲノムＤＮＡを鋳型とし、この欠失領域を含むＤＮＡ断片を増幅するように設計した表２に示す雌雄共通プライマーであるＹ３＿ＤＥＬ＿Ｆ２プライマー（配列番号８）およびＹ３＿ＤＥＬ＿Ｒ１プライマー（配列番号９）を用いたＰＣＲによって、１４９ｂｐの雌雄共通ＤＮＡ断片のみが認められた場合に被験体の遺伝的性は雌であると判定でき、１４９ｂｐの雌雄共通ＤＮＡ断片と７塩基短い１４２ｂｐの雄特異的欠失型ＤＮＡ断片が認められた場合に被験体の遺伝的性は雄であると判定することができる。
そこで、天然クロマグロの雌４個体と雄４個体（生殖腺による性判別済み）について、Ｙ３＿ＤＥＬ＿Ｆ２プライマーおよびＹ３＿ＤＥＬ＿Ｒ１プライマーを用いたＰＣＲを行い、増幅産物をマイクロチップ電気泳動装置を用いて電気泳動した。マイクロチップ電気泳動は、通常のアガロースゲル電気泳動よりも分解能が高いため、たった７塩基の長さの違うＤＮＡ断片を明確に区別することができる。陰性対照として、塩基配列を確認済の雌個体を用い、陽性対照として、塩基配列を確認済の雄個体を用いた。また、ネガティブコントロール（ＮＴＣ）として、ＤＮＡなしでＰＣＲを行った。具体的な方法は、以下の通りである。各個体より、実施例２と同様にしてゲノムＤＮＡを調製した。このゲノムＤＮＡ（最終濃度０．５ｎｇ／μｌ）を鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）とＹ３＿ＤＥＬ＿Ｆ２プライマーおよびＹ３＿ＤＥＬ＿Ｒ１プライマーを用いて、Ｐｒｏｆｌｅｘ ＰＣＲ システム（アプライドバイオシステムズ製）によりＰＣＲ反応（９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃１５秒の反応を３５サイクル）を行い、得られたＰＣＲ増幅産物をマイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置、ＤＮＡ−５００キット、島津製作所製）を用いて電気泳動した。
Example 4 Sex discrimination method by PCR and microchip electrophoresis for male specific deletion region: Region 1
In region 1, as a male-specific mutation, there is a deletion of 7 consecutive bases 1417 to 1423 (109 to 115 in region 1) of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Therefore, Y3_DEL_F2 primer (SEQ ID NO: 8) and Y3_DEL_R1 primer (SEQ ID NO: 9) which are male and female common primers shown in Table 2 designed to amplify a DNA fragment containing this deleted region using the genomic DNA of the bluefin tuna subject as a template Can be determined to be female if only a 149 bp male and female common DNA fragment is found, and the 149 bp male and female common DNA fragment and a 7 bp short 142 bp male-specific deficiency can be determined by PCR using The genetic identity of a subject can be determined to be male if a mistyped DNA fragment is observed.
Therefore, PCR was performed using four Y3_DEL_F2 primers and Y3_DEL_R1 primers for four females of natural bluefin tuna and four males (having been sex-discriminated by gonads), and the amplification products were electrophoresed using a microchip electrophoresis apparatus. Since microchip electrophoresis has higher resolution than conventional agarose gel electrophoresis, it is possible to clearly distinguish different DNA fragments of only 7 bases in length. As a negative control, a female individual whose base sequence was confirmed was used, and as a positive control, a male individual whose base sequence was confirmed was used. In addition, PCR was performed without DNA as a negative control (NTC). The specific method is as follows. Genomic DNA was prepared from each individual in the same manner as in Example 2. Using this genomic DNA (final concentration 0.5 ng / μl) as a template, PCR reaction (98) by Proflex PCR system (manufactured by Applied Biosystems) using PrimeSTAR GXL kit (manufactured by Takara Bio Inc.), Y3_DEL_F2 primer and Y3_DEL_R1 primer The PCR amplification product obtained was subjected to 35 cycles of reaction at 10 ° C., 60 ° C. for 15 seconds and 68 ° C. for 15 seconds, and the resulting PCR amplification product was used for a microchip electrophoresis apparatus (microchip electrophoresis apparatus for MultiNA DNA / RNA analysis, DNA-500). Electrophoresis was performed using a kit (manufactured by Shimadzu Corporation).
結果を図４に示す。１４９ｂｐの雌雄共通ＤＮＡ断片は、全検査個体（レーン１〜８）、陰性対照および陽性対照に認められた。一方、１４２ｂｐの雄特異的欠失型ＤＮＡ断片は、雄個体（レーン５〜８）および陽性対照に特異的に認められた。これらの結果は、被験体の性判別に成功したことを示している。なお、本実施例では、目的とする１４９ｂｐと１４２ｂｐのＤＮＡ断片の他に、約１８０ｂｐのＤＮＡ断片が雄特異的に認められた。このＤＮＡ断片は、上記雌雄共通プライマーによる目的外のＰＣＲ増幅産物であるが、雄特異的かつ安定して認められるＤＮＡ断片であり、性判別において支障はない。以上の結果は、天然クロマグロの雌３９個体、雄４８個体（生殖腺による性判別済み）においても再現されたため、領域１の上記ＤＮＡ多型を指標とするクロマグロの性判別方法が有効であることが明らかとなった。 The results are shown in FIG. A 149 bp male and female common DNA fragment was found in all test individuals (lanes 1 to 8), negative control and positive control. On the other hand, a 142 bp male specific deletion type DNA fragment was specifically observed in male individuals (lanes 5 to 8) and a positive control. These results indicate that the sex determination of the subject was successful. In the present example, in addition to the target 149 bp and 142 bp DNA fragments, a DNA fragment of about 180 bp was observed in a male-specific manner. Although this DNA fragment is a PCR amplification product other than the target by the common male and female primers, it is a male specific and stably recognized DNA fragment, and there is no problem in sex discrimination. The above results were also reproduced in 39 females of natural bluefin tuna and 48 males (sex-discriminated by gonads). Therefore, it is effective that the bluefin tuna sex discrimination method using the above DNA polymorphism of region 1 as an index It became clear.
実施例５ 雄特異的欠失領域を対象としたＰＣＲおよびマイクロチップ電気泳動による性判別方法：領域１
養殖クロマグロの雌６個体と雄４個体（生殖腺による性判別済み）について、体表粘液サンプルを用いた以外は実施例４と同様にして、ＰＣＲおよびマイクロチップ電気泳動を行った。体表粘液サンプルは、魚体の体表を綿棒で擦って採取した。体表粘液の付着した綿部のみをＴＮＥＳ・Ｕｒｅａ ６Ｍ溶液中でプロテアーゼ処理を行い、自動ＤＮＡ抽出装置（前述）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。
Example 5 Sex discrimination method by PCR and microchip electrophoresis for male specific deletion region: Region 1
PCR and microchip electrophoresis were performed in the same manner as in Example 4 except for using body surface mucus samples for six female cultured bluefin tuna and four males (having been sex-discriminated by gonads). Body surface mucus samples were collected by rubbing the surface of the fish with a cotton swab. Only the cotton section to which mucus on the surface was adhered was treated with protease in TNES · Urea 6 M solution, and genomic DNA was prepared using an automatic DNA extraction apparatus (described above).
結果を図５に示す。１４９ｂｐの雌雄共通ＤＮＡ断片は、全個体（レーン１〜１０）に認められた。一方、１４２ｂｐの雄特異的欠失型ＤＮＡ断片は、雄個体（レーン２、４、８および１０）に特異的に認められた。これらの結果は、被験体の性判別に成功したことを示している。本実施例で用いたクロマグロ個体は、継代Ｆ２世代の養殖魚であることから、領域１の上記ＤＮＡ多型を指標とするクロマグロの性判別方法は、天然魚だけでなく養殖魚でも有効であることが明らかとなった。また、本実施例で用いた試料はクロマグロ個体の体表粘液サンプルであることから、個体より採取したサンプルを用いることで、個体を生かしたままの性判別が可能であることが明らかとなった。 The results are shown in FIG. A 149 bp male and female common DNA fragment was found in all individuals (lanes 1 to 10). On the other hand, a 142 bp male specific deletion type DNA fragment was specifically observed in male individuals (lanes 2, 4, 8 and 10). These results indicate that the sex determination of the subject was successful. Since the individual bluefin tuna used in this example is a cultured F2 generation farmed fish, the sex determination method of bluefin tuna using the above DNA polymorphism of region 1 as an index is effective not only for natural fish but also for cultured fish. It became clear that there was. In addition, since the sample used in the present example is a body surface mucus sample of a bluefin tuna individual, it has become clear that sex determination while keeping the individual active is possible by using a sample collected from the individual .
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017219660A JP7007710B2 (en) | 2017-11-15 | 2017-11-15 | Bluefin tuna hereditary sex marker and hereditary sex discrimination method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017219660A JP7007710B2 (en) | 2017-11-15 | 2017-11-15 | Bluefin tuna hereditary sex marker and hereditary sex discrimination method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2019088234A true JP2019088234A (en) | 2019-06-13 |
| JP7007710B2 JP7007710B2 (en) | 2022-01-25 |
Family
ID=66835121
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017219660A Active JP7007710B2 (en) | 2017-11-15 | 2017-11-15 | Bluefin tuna hereditary sex marker and hereditary sex discrimination method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7007710B2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110669836A (en) * | 2019-11-15 | 2020-01-10 | 集美大学 | Molecular marker for identifying hereditary sex of Oxytropis myriophylla and application thereof |
| JP2020184917A (en) * | 2019-05-14 | 2020-11-19 | 国立研究開発法人水産研究・教育機構 | Methods for determining sex of tunas by high resolution melting (hrm) analysis |
| CN113215280A (en) * | 2021-06-08 | 2021-08-06 | 集美大学 | Genetic sex molecular marker and primer universal for identifying south-north population of echinocandis japonicus and application thereof |
-
2017
- 2017-11-15 JP JP2017219660A patent/JP7007710B2/en active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NIPPON SUISAN GAKKAISHI, 2011, VOL.77, NO.4,P.639-646, JPN6021032888, ISSN: 0004576969 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020184917A (en) * | 2019-05-14 | 2020-11-19 | 国立研究開発法人水産研究・教育機構 | Methods for determining sex of tunas by high resolution melting (hrm) analysis |
| JP7362054B2 (en) | 2019-05-14 | 2023-10-17 | 国立研究開発法人水産研究・教育機構 | Genetic sex determination method for tuna using high resolution melting (HRM) analysis |
| CN110669836A (en) * | 2019-11-15 | 2020-01-10 | 集美大学 | Molecular marker for identifying hereditary sex of Oxytropis myriophylla and application thereof |
| CN113215280A (en) * | 2021-06-08 | 2021-08-06 | 集美大学 | Genetic sex molecular marker and primer universal for identifying south-north population of echinocandis japonicus and application thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7007710B2 (en) | 2022-01-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101823368B1 (en) | SNP marker regulating polyunsaturated fatty acid level in the pork and uses thereof | |
| RU2012125961A (en) | PLANTS OF SOY, RESISTANT TO HERBICIDES, AND WAYS OF IDENTIFICATION | |
| KR101213217B1 (en) | SNP Markers Associated with Meat Quantity and Beef Quality in Hanwoo | |
| KR101929391B1 (en) | Novel SNP marker for discriminating increasedthe number of nipples of pigs and use thereof | |
| CN101970688A (en) | Methods of using genetic markers and related epistatic interactions | |
| KR101418402B1 (en) | Novel SNP marker for discriminating level of loinmuscle area of Pig and use thereof | |
| JP7007710B2 (en) | Bluefin tuna hereditary sex marker and hereditary sex discrimination method | |
| KR101595011B1 (en) | Novel SNP marker for discriminating number of nipple of Pig and use thereof | |
| KR101749823B1 (en) | Composition for identifying short hair spepcies in Sapsaree comprising single nucleotide polymorphism markers | |
| US20170283854A1 (en) | Multiplexed pcr assay for high throughput genotyping | |
| JP2008148612A (en) | Tool for identifying chicken variety and use thereof | |
| KR101450792B1 (en) | Novel SNP marker for discriminating Black Coat Colour of Pig and use thereof | |
| KR101741252B1 (en) | Gene composition for parentage testing in hanwoo | |
| KR101823372B1 (en) | SNP Makers for Identification of WooriHeukDon Porcine and Method for Identifying WooriHeukDon Porcine using the same | |
| KR101784163B1 (en) | Novel SNP marker for discriminating reduction of backfat thickness and use thereof | |
| US11884983B2 (en) | Method for predicting resistance | |
| JP2017163907A (en) | Method for discriminating high immunity pig and polymorphic marker therefor | |
| EP1660675B1 (en) | Polymorphism of the igf2 gene and improving production characteristics of cattle | |
| KR101520502B1 (en) | Single Nucleotide Polymorphism Markers in Swine and Method for Determination of Domestic Pork Origin by Using the Same | |
| JP2009219451A (en) | Method for individual identification and method for parentage test of cattle using single nucleotide polymorphism | |
| JP7362054B2 (en) | Genetic sex determination method for tuna using high resolution melting (HRM) analysis | |
| KR101696692B1 (en) | SNP Novel SNP marker for discriminating level of muscle fiber type within porcine muscle and use thereof | |
| CN111379032A (en) | Method and kit for constructing sequencing library for simultaneously realizing genome copy number variation detection and gene mutation detection | |
| KR101740634B1 (en) | Gene composition for parentage testing in wagyu | |
| JP2018110540A (en) | Method for selecting dog and determining their behavioral traits using genotype |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200813 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210824 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210910 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20211221 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211227 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7007710 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |