RU2721254C2 - Трансгенные мыши, экспрессирующие липопротеин (а) человека с отключенным геном витамина с, и их применение в качестве модели лечения заболеваний - Google Patents
Трансгенные мыши, экспрессирующие липопротеин (а) человека с отключенным геном витамина с, и их применение в качестве модели лечения заболеваний Download PDFInfo
- Publication number
- RU2721254C2 RU2721254C2 RU2015113820A RU2015113820A RU2721254C2 RU 2721254 C2 RU2721254 C2 RU 2721254C2 RU 2015113820 A RU2015113820 A RU 2015113820A RU 2015113820 A RU2015113820 A RU 2015113820A RU 2721254 C2 RU2721254 C2 RU 2721254C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- human
- mice
- gulo
- gene
- line
- Prior art date
Links
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 title claims abstract description 124
- 101000889990 Homo sapiens Apolipoprotein(a) Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title abstract description 11
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 title description 32
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 title description 30
- 102000045903 human LPA Human genes 0.000 title description 9
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 title description 3
- 102100040214 Apolipoprotein(a) Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 101710115418 Apolipoprotein(a) Proteins 0.000 claims abstract description 44
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 43
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 claims abstract description 43
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 claims abstract description 43
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 claims abstract description 43
- 101150079041 Gulo gene Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- 101150102415 Apob gene Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 208000010233 scurvy Diseases 0.000 claims abstract 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 96
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 30
- 241000230491 Gulo Species 0.000 claims description 17
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 34
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 27
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 17
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 17
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 16
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 9
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 8
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 8
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 8
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108010008150 Apolipoprotein B-100 Proteins 0.000 description 7
- 102000057248 Lipoprotein(a) Human genes 0.000 description 7
- 108010033266 Lipoprotein(a) Proteins 0.000 description 7
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 7
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 7
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 6
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 6
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 102100040202 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 description 5
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 5
- 108010012927 Apoprotein(a) Proteins 0.000 description 5
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 101000889953 Homo sapiens Apolipoprotein B-100 Proteins 0.000 description 4
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 4
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 102000006991 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 description 3
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 238000008214 LDL Cholesterol Methods 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000000923 atherogenic effect Effects 0.000 description 2
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 2
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 2
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 102000052249 human APOB Human genes 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010002329 Aneurysm Diseases 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000605403 Homo sapiens Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 101000966772 Homo sapiens Putative apolipoprotein(a)-like protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 1
- 208000036110 Neuroinflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000018262 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102100038124 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 241000288935 Platyrrhini Species 0.000 description 1
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102100040609 Putative apolipoprotein(a)-like protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 241000021375 Xenogenes Species 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000036523 atherogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- -1 but not limited to Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 238000011827 double-transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 108010022197 lipoprotein cholesterol Proteins 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000002314 neuroinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 235000021195 test diet Nutrition 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 210000004916 vomit Anatomy 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0375—Animal model for cardiovascular diseases
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к применению мыши, включающей нефункциональный ген GULO (GULO-/-), ген apoB-100 человека и ген apoB(a) человека, экспрессирующей ген apoB-100 человека (apoB-100+) и ген apo(a) человека (apo(a)+), а также не продуцирующей витамин С и продуцирующей Lp(a) человека, для определения возможности соединения лечить связанное с Lp(a) заболевание человека. Изобретение позволяет эффективно тестировать фармацевтические соединения на эффективность и применимость при профилактике и/или лечении заболеваний, связанных с Lp(a) человека. 7 з.п. ф-лы, 8 ил., 7 табл.
Description
Перекрестная ссылка на родственную заявку
Настоящая заявка претендует на приоритет от патентной заявки U.S. Utility Application 14506674, поданной 5 октября 2014 г. При этом находящаяся на рассмотрении и уже акцептованная заявка U.S. Utility Application 14506674 включена путем ссылки во всей полноте по всем пунктам.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение в общем касается трансгенных мышей, которые подверглись генетическим изменениям с тем, чтобы экспрессировать липопротеин (а) человека и отключить ген, экспрессирующий витамин С. В частности, два гена, определяющие два белка липопротеина (а) человека - аполипопротеин (а) и ало липопротеин В-100, могут экспрессироваться как индивидуально, так и в комбинации без экспрессии гена витамина С.Данная заявка содержит перечень последовательностей, сданный в виде ASCII-файла под названием RIPLLC018017US1sequence_ST25, дата создания 9/12/2013, а размер текстового ASCII-файла в байтах составляет 2 Кб. Эмбрионы двойных трансгенных мышей, обозначенные как Rath М Human Lipoprotein(a); Gulo(-/-), сданы на хранение под номером Jackson Stock# 912329 в Jackson Laboratory 8 апреля 2013 г.
Уровень техники
На сердечно-сосудистые заболевания приходится половина всех случаев смерти в промышленно развитых странах. За последние десятилетия появился новый фактор риска для этого заболевания - липопротеин (a) (Lp(a)). Было показано, что Lp(a) является независимым фактором риска для инфаркта миокарда (Rhoads GG et al., 1986; Clarke et al., 2009), цереброваскулярных заболеваний (Zenker G. et. al., 1986) и других форм сердечнососудистых заболеваний. Кроме того, установлено, что Lp(a) является важным компонентом атеросклеротических бляшек у человека (Rath М. et al., 1989). Помимо ниацина, в настоящее время нет общепринятого эффективного лечения, доступного в клинической кардиологии для снижения уровня Lp(a) в плазме или предотвращения его отложения внутри сосудистой стенки.
Lp(a) был открыт Kåre Berg в 1963 г. (Berg К. et al., 1963). Он состоит из молекулы липопротеина низкой плотности (LDL) и аполипопротеина (а) (аро(а)) - гликопротеина, прикрепленного к структурному белку LDL - аполипопротеину В-100 (ароВ) через дисульфидные связи. кДНК аро(а) проявляет сильную гомологию с плазминогеном, содержащим несколько повторов завитка, (kringle) IV плазминогена. Вследствие этой гомологии аро(а) связывается с фибриногеном/фибрином и ослабляет фибринолиз (McLean JW et al., 1987).
Lp(a) в основном встречается у человека и человекообразных обезьян, а появление гена аро(а) датируется около 40 миллионов лет назад, примерно во время дивергенции обезьян Старого Света и Нового Света (McLean et al., Nature, 1987). Это был также и тот момент времени в процессе эволюции, когда предки человека потеряли способность к эндогенному синтезу аскорбата из-за мутации в гене, кодирующем гулонолактоноксидазу (GULO), важнейший фермент для превращения глюкозы в аскорбат (витамин С) (Chatterjee IB, 1973; Nitoshimi M et al., 1991).
Значение дефицита аскорбата в инициировании процесса атерогенеза недавно было засвидетельствовано у мышей, неспособных экспрессировать ген L-гулонолактоноксидазы (GULO-/-) (Maeda N et al., 2000).
Roy et al. (2003, US 6512161) обсуждают несколько неудачных попыток создания модели на животных для экспрессии именно Lp(a) на таких моделях, как крысы, мыши и морские свинки и утверждают, что они не всегда представляют метаболизм человека и его заболевания. В своем исследовании они изобрели модель на кроликах, экспрессирующих гены аро(а) человека и ароВ-100 человека. Однако трансгенные кролики, разработанные Roy et al. (2003), тоже не воспроизводят физиологию человека в отношении другого ключевого аспекта метаболизма: в отличие от людей, кролики способны вырабатывать свой собственный витамин С.
Существует потребность в модели двойных трансгенных млекопитающих, проявляющих такие уникальные генетические признаки, с тем, чтобы разработать связанные с ними новые профилактические и терапевтические подходы.
Сущность изобретения
В настоящей заявке приведен способ получения и применения двойных трансгенных млекопитающих (мышей, крыс и других видов млекопитающих), обладающих генами аро(а) и/или ароВ-100 человека и вырабатывающих Lp(a) человека и в то же время не способных производить витамин С. В одном воплощении была получена третья линия трансгенных млекопитающих при скрещивании млекопитающего первой "нокаутной" линии и второй линии трансгенного млекопитающего (это могут быть мыши или другие животные), экспрессирующего набор генов, имеющих человеческую природу, причем первая линия - это "нокаутное" млекопитающее, обладающее нефункциональной L-гулонолактоноксидазой (GULO) (GULO-/-) и поэтому не вырабатывающее витамин С, а вторая линия мышей экспрессирует ген аро(а) человека (аро(а)+)) и вырабатывает аполипопротеин (а) (аро(а)), при этом третья линия трансгенных мышей обладает нефункциональным геном L-гулонолактоноксидазы (GULO-/-) и функциональным геном аро(а) человека (аро(а)+)). Таким образом, третья линия млекопитающих не будет вырабатывать витамин С, но будет вырабатывать аро(а) человека.
В другом воплощении была получена пятая линия трансгенных млекопитающих при скрещивании млекопитающего первой "нокаутной" линии, обладающего нефункциональным геном L-гулонолактоноксидазы (GULO) (GULO-/-), и четвертой линии, экспрессирующей ген ароВ-100 (ароВ100+) человека, причем пятая линия млекопитающих обладает нефункциональным геном L-гулонолактоноксидазы (GULO-/-) и функциональным геном ароВ-100 человека (ароВ100+). Таким образом, пятая линия трансгенных млекопитающих не будет вырабатывать витамин С, но будет вырабатывать аполипопротеин В-100 человека.
В другом воплощении скрещивали третью и пятую линию трансгенных млекопитающих, получая новое двойное трансгенное млекопитающее (это может быть, к примеру, мышь), которое имеет "нокаутный" ген GULO (GULO-/-), функциональный ген ароВ-100 человека (ароВ100+) и функциональный ген аро(а) человека (аро(а)+)). Поэтому новое двойное трансгенное млекопитающее будет вырабатывать аполипопротеин (а) (аро (а)) и/или аполипопротеин В-100 (ароВ-100), а также полные частицы липопротеина (а) (Lp(a)), но не будет вырабатывать витамин С. Эта новая модель двойных трансгенных млекопитающих похожа на человеческую систему по неспособности к эндогенному синтезу аскорбата наряду со способностью к экспрессии аро(а), ароВ-100, а также полных частиц липопротеина (a) (Lp(a)). В данном случае используется модель на мышах, но можно использовать и других млекопитающих и проводить скрещивание, введение генов или делецию генов, получая таких двойных трансгенных млекопитающих, чтобы экспрессировать или подавлять гены человека в любом сочетании.
В одном воплощении представлено млекопитающее - мышь, геном которой не обладает способностью к эндогенному синтезу аскорбата и в то же время экспрессирует аро(а) человека. В другом воплощении представлено двойной трансгенное млекопитающее - мышь, геном которой не обладает способностью к эндогенному синтезу аскорбата и в то же время экспрессирует ароВ-100 человека. В другом воплощении представлено трансгенное млекопитающее - мышь, геном которой не обладает способностью к эндогенному синтезу аскорбата и в то же время вырабатывает Lp(a) человека. Модель на животных может быть создана путем скрещивания, вставки генов или другими методами молекулярной биологии и/или генной инженерии.
В одном воплощении новые двойные трансгенные мыши применяются в качестве модели для исследования сердечно-сосудистых заболеваний (CVD). В другом воплощении двойные трансгенные мыши применяются в качестве модели для лечения заболеваний типа CVD. В другом воплощении двойные трансгенные мыши могут применяться в качестве модели для тестирования новых и старых препаратов для лечения заболеваний, связанных с синтезом Lp(a) и отсутствием продукции витамина С.
В одном воплощении модель двойной трансгенной мыши может применяться для тестирования эффекта различных препаратов, задействованных при ишемической болезни сердца, сердечно-сосудистых заболеваниях, включая заболевания коронарных артерий, цереброваскулярных заболеваниях (инсульт), сосудистых заболеваниях почек, заболеваниях периферических сосудов, аневризмах, тромботических заболеваниях, других формах сосудистых заболеваний, воспалительных заболеваниях, а также инфекционных заболеваниях, нейровоспалительных и нейродегенеративных заболеваниях.
В одном воплощении представлен способ получения двойных трансгенных млекопитающих, у которых отсутствует способность к эндогенному синтезу аскорбата и в то же время вырабатывается аполипопротеин (а) человека либо аполипопротеин В или Lp(a) человека, который включает скрещивание первого млекопитающего, у которого способность к синтезу аскорбата была подвергнута генетической делеции, со вторым млекопитающим, геном которого кодирует аро(а) человека или ароВ-100 человека или же оба этих аполипопротеина таким образом, чтобы они сочетались in vivo у данного трансгенного млекопитающего и вырабатывали полные частицы липопротеина (a) (Lp(a)) человека.
В другом воплощении представлен способ определения того, может ли соединение лечить атеросклероз или нежелательный профиль липидов в плазме, включающий: а) сравнение профиля липидов или степени атеросклероза у первого трансгенного млекопитающего, получавшего диету, которая широко известна как атерогенная, и обработанного данным соединением, с липидным профилем или степенью атеросклероза у второго трансгенного млекопитающего, получавшего такую же атерогенную диету, но не обработанного данным соединением; и b) определение потенциального терапевтического эффекта данного соединения на основании сравнительной оценки липидного профиля или степени атеросклероза у первого и второго трансгенного млекопитающего; причем и первое, и второе млекопитающее являются трансгенными млекопитающими.
В одном воплощении представлен способ лечения, в котором препарат для лечения эффекта высокого уровня Lp(a) в отсутствие или в присутствии таких микронутриентов, как витамин С, наблюдается на таких трансгенных мышах, которые не производят витамин С, но вырабатывают Lp(a) человека.
Композиция, способ и лечение, описанные здесь, могут быть реализованы любым способом для достижения различных аспектов и могут выполняться в подходящем для данного млекопитающего виде.
Краткое описание фигур
На фигурах из прилагаемых чертежей, на которых одинаковые обозначения означают одинаковые элементы, типичные воплощения представлены для примера, а не для ограничения изобретения.
На фиг. 1 представлена схема, использовавшаяся для создания двойных трансгенных мышей.
На фиг. 2 представлена экспрессия связанных через дисульфид аро(а) человека и ароВ-100 человека в виде собранного Lp(a) с липидной глобулой у самцов и самок трансгенных мышей с генами аро(а) человека и аро В-100 человека, но не у самцов и самок трансгенных мышей без обоих генов.
На фиг. 3 представлена экспрессия белка аро(а) человека у самок и самцов мышей.
На фиг. 4 представлена экспрессия белка ароВ-100 человека у самцов и самок трансгенных мышей в частицах LDL и частицах Lp(a).
На фиг. 5 представлен уровень аскорбата в сыворотке у самок и самцов трансгенных мышей (26-29 недель) при добавлении в корм витамина С или без добавления витамина С в мкмоль/л (мкМ).
На фиг. 6 представлен профиль холестерина методом электрофореза с иммунофиксацией белков сыворотки (SPIFE) у гипоаскорбемических или получавших с кормом аскорбат мышей Lp(a)+GULO(-/-).
На фиг. 7 представлен профиль частиц с аро(а) методом иммунофиксационного электрофореза (IFE) у гипоаскорбемических или получавших с кормом аскорбат мышей Lp(a)+GULO(-/-).
На фиг. 8 представлен профиль частиц с ароВ методом иммунофиксационного электрофореза (IFE) у гипоаскорбемических или получавших с кормом аскорбат мышей Lp(a)+GULO(-/-).
Другие особенности воплощений настоящего изобретения станут понятными из прилагаемых чертежей и из следующего подробного описания.
Раскрытие сущности изобретения
В настоящем изобретении представлены новые двойные трансгенные млекопитающие/мыши, способ скрещивания двойных трансгенных млекопитающих (это могут быть мыши или другие животные) и применение двойных трансгенных млекопитающих /мышей для оценки способов лечения сердечно-сосудистых и связанных с ними заболеваний. Двойные трансгенные мыши экспрессируют гены аполипопротеина (а) и аполипопротеина В-100 человека и вырабатывают ало липопротеин (а) и аполипопротеин В-100, а также полные частицы липопротеина (а) человека, при этом данные мыши не экспрессируют L-гулонолактоноксидазу (GULO-/-) и поэтому не вырабатывает витамин С. Эти новые двойные трансгенные мыши являются идеальной моделью для тестирования фармацевтических соединений на эффективность лечения и применимость для модуляции Lp(a) с помощью различных биологических и/или фармацевтических соединений, в том числе, но без ограничения, диеты, фармацевтических препаратов и способов лечения, влияющих на людей.
Хотя настоящие воплощения и описаны с привлечением конкретных типичных воплощений, однако должно быть ясно, что по этим воплощениям могут проводиться различные модификации и изменения, не отходящие от более широкой сущности и не выходящие за рамки данных воплощений.
Скрещивание млекопитающих/мышей
Модели на животных можно создавать посредством скрещивания, вставки генов или других методов молекулярной биологии и/или генной инженерии. В типичном примере приводится скрещивание "нокаутных" мышей и мышей, содержащих и экспрессирующих конкретный ген человека, получая двойных трансгенных мышей.
Мыши BALB/cBy-Gulo(-/-). Линия BALB/cBy-Gulosfx/J - это спонтанная мутация, картированная по локусу гулонолактоноксидазы, гена для синтеза витамина С. Линия мышей GULO(-/-) (первая "нокаутная" линия трансгенных мышей) была создана из гетерозиготных (гемизиготных) производителей Gulo(+/-), полученных из The Jackson Laboratory (табл. 1). Мышей разводили с добавлением в корм витамина С до тех пор, пока не получили достаточного количества гомозиготных производителей Gulo(-/-).
Содержание мышей Gulo(-/-). Мыши Gulo(-/-) не в состоянии синтезировать собственный витамин С, поэтому этот нутриент должен содержаться в рационе мышей. Витамин С содержался в бидистиллированной питьевой воде, содержащей 150 мг/л аскорбиновой кислоты (Sigma) и 0,01 мМ ЭДТА (Sigma) для стабилизации витамина С от разрушения при взаимодействии со следами металлов. Вода также содержала 10 г/л сахарозы с тем, чтобы замаскировать вкус, противный для мышей. Воду сменяли два раза в неделю. Кроме того, эти мыши получали корм, обогащенный 500 ррm L-аскорбил-полифосфата, стандартным ветеринарным пищевым источником стабильного витамина С, измельченным на фирме Test Diet в виде Modified Custom Lab Diet #5A38.
Мыши с apo(a) человека. Мышей с аро(а) человека (вторая линия трансгенных мышей) получали из регионального центра Mutant Mouse Regional Resource Centers (MMRRC) при поддержке NTH. Эта линия, FVB/N-Tg(LPA, LPAL2, PLG)1Hgc/Mmmh, была создана с помощью YAC в 270 kb, несущей человеческие гены аро(а) и apo(a)-like и плазминогена. Ее подарил Edward М. Rubin, M.D., Ph.D., Lawrence Berkeley National Laboratory. Родоначальных мышей разводили до тех пор, пока не получили достаточное количество мышей дикого типа аро(а)+Gulo для скрещивания. Проводили генотипирование на предмет переноса и наличия трансгена на фирме Transnetyx (Cordova, TN) на отрезанных из хвоста кусочках ткани и отбирали для скрещивания трансгенных мутантов, оказавшихся положительными по аро(а) в геноме.
Мыши с ароВ-100 человека. Мышей с ароВ-100 человека (четвертая линия трансгенных млекопитающих/мышей) получали из Taconic Farms, Inc. по соглашению о научных исследованиях. Эта линия, B6.SJL-Tg(APOB)1102Sgy N20+?, или мыши ароВ-100, была разработана MacRae F. Linton et al. из Gladstone Institute of Cardiovascular Disease путем микроинъекции гена аполипопротеина В-100 человека в зиготы C57BL/6J х SJL. Полученных мышей подвергали обратному скрещиванию с C57BL/6 на протяжении 4 поколений (N4). Taconic получила эту линию из Xenogen Biosciences в мае 1996 г. Мышей поддерживали путем обратного скрещивания гемизиготных мышей Аро(В-100) с инбредными мышами C57BL/6NTac. Гемизиготных мышей разводили так, чтобы получить гомозиготных мышей Аро(В-100). Проводили генотипирование на предмет переноса и наличия трансгена Аро(В-100) человека в геноме на фирме Transnetyx на отрезанных из хвоста кусочках ткани и отбирали трансгенных мутантов для скрещивания.
Стадии скрещивания, ведущие к получению линии мышей, вырабатывающих Lp(a) человека
На рис. 1 представлены различные стадии скрещивания нескольких линий мышей для получения двойных трансгенных мышей. Термины мышь и мыши используются взаимозаменяемо и все они означают мышей в данном описании. Проводили скрещивание (108) мышей с аро(а) человека (104) (вторая линия млекопитающих)+мышей GULO (-/-) (102) (первая "нокаутная" линия млекопитающих), получая третью линию трансгенных млекопитающих/мышей, которая экспрессирует ген аполипопротеина (а) человека (аро(а)+) и в то же время не содержит гена Gulo (GULO-/-) (112). Мышей GULO (-/-) (102) (первая "нокаутная" линия млекопитающих) и мышей с ароВ-100 человека, представленных как четвертая линия млекопитающих (106), скрещивали (108) для получения пятой линии мышей, то есть пятой линии млекопитающих, которая не содержит гена Gulo (GULO-/-), но экспрессирует ген аполипопротеина В-100 человека (ароВ-100+) (114). Таким образом, получили две родоначальные трансгенные линии для дальнейшего скрещивания:
- мыши типа аро(а) человека+ GULO (-/-) - третья линия трансгенных мышей,
- мыши типа ароВ-100 человека+ GULO (-/-) - пятая линия трансгенных мышей.
Скрещивание (108) родоначальных линий для получения линии мышей: Lp(a) человека+ GULO (-/-) (116). Новосозданных производителей линии аро(а) человека+ GULO(-/-) (112) и линии ароВ100 человека+ GULO(-/-) (114) впоследствии скрещивали (108) друг с другом для получения новой линии мышей: Lp(a) человека+ GULO(-/-) (116), то есть аро(а) человека+ароВ-100 человека+ GULO(-/-), которые именуются как линия "Rath M Human Lipoprotein(a); Gulo (-/-)" (116). Эмбрионы двойных трансгенных мышей, обозначенные как Rath M Human Lipoprotein(a); Gulo(-/-), сданы на хранение под номером Jackson Stock# 912329 в Jackson Laboratory 8 апреля 2013 г.
Генотипирование. Генотипирование на локус GULO и его гомозиготность проводили с помощью Taqman FAM Probe Real Time-PCR на фирме Transnetyx на отрезанных из хвоста кусочках ткани стандартными методами выделения ДНК и ПЦР. Наличие трансгена для ароВ-100 человека и аро(а) человека также проверяли на фирме Transnetyx.
Отрезанные из хвоста кусочки ткани брали у мышей под анестезией, а затем отправляли на фирму Transnetyx, где были разработаны следующие наборы зондов и использовались для выявления методом ПНР в реальном времени наличия или отсутствия геномной ДНК (используемые праймеры приведены ниже в табл. 2, 3 и 4). Проводили генотипирование пометов посредством Taqman PCR на кусочках ткани хвоста на фирме Transnetyx и тех, которые были положительны по геномным трансгенам аро(а) и ароВ-100 и в то же время гомозиготны по "нокаутной" мутации гена L-гулонолактоноксидазы, Gulo (-/-), что указывает на дефект синтеза витамина С, отбирали и отмечали как мышей-основателей "Rath М Human Lipoprotein(a); Gulo (-/-)". Из фиг. 2 видно, что у двойных трансгенных мышей образуется связанный через дисульфид липопротеин (а), который приведен как Lp(a) GULOKO F1, F2, M1 и М2. Точно так же видно отсутствие Lp(a) у мышей аро(а)+ без экспрессии ароВ-100 человека и мышей ароВ-100+ без экспрессии аро(а).
Интерпретация результатов генотипирования:
Gulo-1 КО+, Gulo-1 WT+=гемизиготные мыши, вырабатывающие витамин С;
Gulo-1 КО-, Gulo-1 WT+=гомозиготные мыши дикого типа, вырабатывающие витамин С;
Gulo-1 КО+, Gulo-1 WT-=гомозиготные мыши, дефектные по витамину С.
Для скрещивания отбирали мышей, гомозиготных по нокауту, GULO(-/-).
Интерпретация результатов генотипирования: +=положительные по гену аро(а) человека; -=отрицательные по гену аро(а) человека. Для скрещивания отбирали мышей, положительных по трансгену.
Интерпретация результатов генотипирования: +=положительные по гену ароВ-100 человека; -=отрицательные по гену ароВ-100 человека. Для скрещивания отбирали мышей, положительных по трансгену.
Мышей с генотипом Lp(a); GULO(-/-) обозначали как hApo(a)+; hApoB100+; GULO (-/-). Мышей нужно содержать с постоянным добавлением в корм витамина С, как описано выше.
Подтверждение получения трансгенных мышей на уровне белка. Наличие белков аро(а) человека и ароВ-100 человека в сыворотке мышей определяли методом ELISA в сыворотках, полученных от мышей GULO (-/-), мышей аро(а)+GULO (-/-), мышей ароВ+GULO (-/-), и мышей Lp(a)+GULO (-/-).
Белок аро(а) присутствовал в сыворотке как самцов, так и самок мышей до полового созревания. У самцов мышей после полового созревания значительно или полностью подавлялась экспрессия белка аро(а) в связи с повышенным уровнем тестостерона. Экспрессия аро(а) у самцов мышей может быть восстановлена посредством кастрации, непрерывной инфузии гормона роста через осмотический насос или путем биохимической модуляции с помощью диетических, химических или биологических индукторов.
Экспрессия белка ароВ-100 человека. Присутствие белка ароВ-100 человека в сыворотке определяли методом ELISA в сыворотках, полученных от мышей GULO (-/-), мышей аро(а)+GULO(-/-), мышей ароВ+GULO (-/-), и мышей Lp(a)+GULO (-/-).
Присутствие белка ароВ-100 в сыворотке мышей определяли методом иммуноферментного анализа на аполипопротеин человека с помощью Assaypro AssayMax (St. Charles, МО), который специфичен для ароВ-100 человека и не дает перекрестной реакции с ароВ-100 мыши и/или с любыми другими аполипопротеинами (Аро AI, АроС, АроЕ).
Белок ароВ-100 человека обнаруживался в сыворотке мышей hАроВ-100+GULO (-/-), мышей hApoB-100+аро(а)+GULO(-/-), но не мышей аро(а)+GULO (-/-) или мышей GULO (-/-) (табл. 5).
Белок аро(а) присутствовал в сыворотке содержащих ген аро(а) мышей GULO (-/-), содержащих гены аро(а) и ароВ-100 человека мышей GULO (-/-), но не у мышей GULO (-/-) без трансгена и не у мышей GULO (-/-), содержащих только ароВ-100 человека (табл. 6). Эти результаты подтверждают экспрессию и трансляцию трансгена аро(а) человека в сывороточный белок аро(а).
Экспрессия белка аро(а) человека. Наличие белка аро(а) в сыворотке определяли с помощью иммуноферментного анализа Lp(a) фирмы IBL International GmbH, который специфичен для аро(а) человека и не дает перекрестной реакции с плазминогеном или LDL. Выявляются все известные изоформы аро(а).
Экспрессия белков Lp(a) человека. Частицы Lp(a) состоят из белка аро(а) человека, связанного с ароВ-100 человека (основной белок частиц LDL) дисульфидной связью.
Профиль холестерина по методу SPIFE (фиг. 2). Наличие полных частиц липопротеина Lp(a) в сыворотке трансгенных мышей Lp(a)+ GULO(-/-) проверяли методом электрофореза с помощью набора SPIFE Cholesterol Profiling фирмы Helena (Beaumont, ТХ) и иммунофиксационного электрофореза (IFE).
Полоса Lр(а)-холестерин мигрирует на определенном расстоянии относительно LDL-холестерина и HDL-холестерина, причем она обнаруживается в сыворотке мышей Lp(a) человека+ GULO(-/-), но не в сыворотке мышей GULO (-/-), мышей аро(а) человека+ GULO (-/-) или мышей ароВ человека+ GULO (-/-), подтверждая, что для образования полных частиц Lp(a) в сыворотке необходимо присутствие и ароВ-100 человека, и аро(а) человека, и что присутствие одного лишь аро(а) человека недостаточно для получения Lp(a) и он не связывается с LDL мыши через дисульфидные связи. На фиг. 2 самая верхняя полоса в геле соответствует LDL-холестерину, а самая нижняя - HDL-холестерину. Плотные средние полосы, расположенные между полосами LDL и HDL, которые присутствуют на дорожках 16-18, представляют Ер(а)-холестерин из трех различных самок мышей Lp(a)+Gulo (-/-). Эти полосы отсутствуют у тех мышей Gulo (-/-), которые не экспрессируют одновременно трансгены как апо(а) человека, так и апоВ-100 человека. На дорожке 19 представлен сдвиг отношения заряда к массе в результате 24-часовой инкубации сыворотки образца #18 при комнатной температуре, который указывает на то, что небольшой сдвиг в миграции частиц может быть связан с окислением липопротеинов.
Иммунофиксационньш электрофорез (IFE) сыворотки мышей проводили отдельно на содержание аро(а) человека в частицах (фиг. 3) и содержание ароВ-100 человека в частицах (рис. 4), используя антитела, специфичные к аро(а) и к ароВ-100 человека, на Health Diagnostic Laboratory, Inc. (Richmond, VA). Полосы представляют белки apo(a) и ароВ-100, соответственно, у трансгенных мышей и их визуализацию в сыворотке, полученной от самок и самцов мышей.
Проверка отсутствия продукции витамина С у трансгенных линий мышей. Уровень аскорбата (витамина С) в сыворотке мышей GULO(-/-) и новосозданной линии Lp(a)+GULO (-/-) зависит от его поступления с кормом. У мышей, содержащихся на диете с дефицитом витамина С, постепенно уменьшается концентрация витамина С в сыворотке до тех пор, пока не достигнет нулевого уровня или не погибнет мышь. Уровень витамина С в сыворотке крови измеряли с помощью набора Ferric Reducing Ascorbate Assay (FRASC) фирмы Biovision (Mountain View, CA) (фиг. 5).
Модулирование липопротеин-холестерина. частиц с аро(а) и частиц с ароВ-100 (фиг. 6, фиг. 7, фиг. 8). Проводили анализ на сыворотках мышей Lp(a)+Gulo(-/-) при добавлении 30 мг/л, 60 мг/л или 150 мг/л аскорбиновой кислоты в питьевую воду, наряду с добавлением 500 ррm витамина С в корм (полное добавление). Было отмечено, что весь спектр холестерина в липопротеинах и/или частиц липопротеинов можно модулировать одним лишь аскорбатом в диете. Эти данные дополняют данные по количеству частиц и в сочетании с данными по нагрузке липопротеинов холестерином полностью подтверждают наличие белка аро(а), белка ароВ-100 человека и связанного через дисульфид Lp(a) в сыворотке этих мышей.
Порядок образцов на фиг. 6-8 соответствует следующему ключу, при этом 30vc означает группу с 30 мг/л витамина С, 60 vc означает группу с 60 мг/л витамина С, a sc означает контрольную группу с полным добавлением (150 мг/л витамина С+500 ррm витамина С в корме). Первые три лунки в каждом ряду не использовались.
Промышленное применение
Получение двойных трансгенных мышей, вьгоабатьтающих Lp(a) человека, но не вырабатывающих витамин С из-за отсутствия гена GULO (GULO-/-), путем скрещивания трансгенных мышей, то есть первой "нокаутной" линии и второй линии, получая третью линию, скрещивания первой "нокаутной" линии и четвертой линии, получая пятую линию, и скрещивания третьей линии и пятой линии, получая двойных трансгенных мышей. Обработка двойных трансгенных мышей модулирующими Lp(a) соединениями с целью выявления профилактических и/или терапевтических подходов для связанных с Lp(a) заболеваний человека. Связанные с Lp(a) заболевания по своей природе являются сердечно-сосудистыми, воспалительными, инфекционными или дегенеративными.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> CHA , JOHN CHANG-EUN
NIEDZWIECKI, ALEKSANDRA
RATH, MATTHIAS W
<120> TRANSGENIC MOUSE EXPRESSING HUMAN LIPOPROTEIN (A) WITH DISABLED
VITAMIN C GENE AND ITS USE AS A DISEASE TREATMENT MODEL
<130> RIPLLC018.017US1
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 1
ctagtgtagt ctaggtgata aggatcaact 30
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 2
cagctcagag agagaatgaa tcaca 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 3
ctgacatccc ttaggagttc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 4
agatgtgttc caggctgcaa 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 5
cacacactgc agggtgaca 19
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> Mouse
<400> 6
ctgcctgggt gttatc 16
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Human
<400> 7
cactacattt tgtgccagag atgga 25
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Human
<400> 8
ccctgtcctg aggctcctta 20
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> Human
<400> 9
tcagcagccc tcttcc 16
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Human
<400> 10
aggtttaact cctcctacct ccaa 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Human
<400> 11
tgagggagag ggttccatct t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Human
<400> 12
accagataac aggaagatat g 21
<---
Claims (8)
1. Применение мыши, которая включает нефункциональный ген GULO (GULO-/-), ген apoB-100 человека и ген apoB(a) человека, экспрессирует ген apoB-100 человека (apoB-100+) и ген apo(a) человека (apo(a)+), не продуцирует витамин С и продуцирует Lp(a) человека, для определения возможности соединения лечить связанное с Lp(a) заболевание человека, в частности включающее получение указанной мыши путем скрещивания первой “нокаутной” линии и второй линии с получением третьей линии, скрещивания первой “нокаутной” линии и четвертой линии с получением пятой линии, и скрещивания третьей линии и пятой линии с получением двойных мышей, и их обработку модулирующими Lp(a) соединениями, где первая “нокаутная” линия мышей включает нефункциональный ген GULO (GULO-/-), вторая линия мышей экспрессирует apo(a) человека (apo(a)+), третья линия мышей включает нефункциональный ген GULO (GULO-/-) и экспрессирует ген apo(a) человека (apo(a)+), четвертая линия мышей включает ген apoB-100 человека (apoB-100+) и пятая линия включает нефункциональный ген GULO (GULO-/-) и экспрессирует apoB-100 человека (apoB-100+).
2. Применение по п. 1, где первая “нокаутная” линия мышей не вырабатывает витамин C.
3. Применение по п. 1 или 2, где вторая линия мышей вырабатывает apo(a) человека.
4. Применение по любому из пп. 1-3, где третья линия мышей не вырабатывает витамин C и вырабатывает ap (a) человека.
5. Применение по любому из пп. 1-4, где пятая линия мышей не вырабатывает витамин C и вырабатывает apoB-100 человека.
6. Применение по любому из пп. 1-5, где двойная мышь включает нефункциональный ген GULO и не продуцирует витамин C и одновременно продуцирует Lp(a) человека.
7. Применение по любому из пп. 1-6, где связанное с Lp(a) заболевание человека является сердечно-сосудистым заболеванием.
8. Применение по любому из пп. 1-7, где связанное с Lp(a) заболевание человека является воспалительным, инфекционным или дегенеративным заболеванием.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14/506,674 US20150074835A1 (en) | 2013-09-12 | 2014-10-05 | Transgenic mouse expressing human lipoprotein (a) with disabled vitamin c gene and its use as a disease treatment model |
| US14/506,674 | 2014-10-05 | ||
| PCT/US2014/060195 WO2016057050A1 (en) | 2014-10-05 | 2014-10-11 | Transgenic mouse expressing human lipoprotein (a) with disabled vitamin c gene and its use as a disease treatment model |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015113820A RU2015113820A (ru) | 2016-11-10 |
| RU2015113820A3 RU2015113820A3 (ru) | 2018-06-15 |
| RU2721254C2 true RU2721254C2 (ru) | 2020-05-18 |
Family
ID=55660090
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015113820A RU2721254C2 (ru) | 2014-10-05 | 2014-10-11 | Трансгенные мыши, экспрессирующие липопротеин (а) человека с отключенным геном витамина с, и их применение в качестве модели лечения заболеваний |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3021663B1 (ru) |
| RU (1) | RU2721254C2 (ru) |
| WO (1) | WO2016057050A1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999035241A1 (en) * | 1998-01-08 | 1999-07-15 | Aventis Pharmaceuticals Products Inc. | Transgenic rabbit that expresses a functional human lipoprotein (a) |
| RU2425880C2 (ru) * | 2009-07-30 | 2011-08-10 | Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН | Способ получения трансгенных мышей |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9018437B2 (en) * | 2013-09-12 | 2015-04-28 | Matthias W. Rath | Transgenic mouse expressing human apo(a) and human apo(B-100) with disabled vitamin C gene produces human Lp(a) |
-
2014
- 2014-10-11 EP EP14830365.4A patent/EP3021663B1/en active Active
- 2014-10-11 RU RU2015113820A patent/RU2721254C2/ru active
- 2014-10-11 WO PCT/US2014/060195 patent/WO2016057050A1/en active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999035241A1 (en) * | 1998-01-08 | 1999-07-15 | Aventis Pharmaceuticals Products Inc. | Transgenic rabbit that expresses a functional human lipoprotein (a) |
| RU2425880C2 (ru) * | 2009-07-30 | 2011-08-10 | Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН | Способ получения трансгенных мышей |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| NAKATA Y et al. Vulnerable atherosclerotic plaque morphology inapolipoprotein E-deficient mice unable to make ascorbic Acid, Circulation, 2002, Vol.105,N.12, pp.1485-1490. * |
| RODGER EJ et al. Proteomic analysis of aortae from human lipoprotein(a) transgenic mice shows an early metabolic response independent of atherosclerosis, PLoS One, 2012, Vol.7, N.1, e30383. * |
| RODGER EJ et al. Proteomic analysis of aortae from human lipoprotein(a) transgenic mice shows an early metabolic response independent of atherosclerosis, PLoS One, 2012, Vol.7, N.1, e30383. NAKATA Y et al. Vulnerable atherosclerotic plaque morphology in apolipoprotein E-deficient mice unable to make ascorbic Acid, Circulation, 2002, Vol.105, N.12, pp.1485-1490. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3021663A1 (en) | 2016-05-25 |
| EP3021663A4 (en) | 2016-09-21 |
| EP3021663B1 (en) | 2023-01-18 |
| RU2015113820A (ru) | 2016-11-10 |
| WO2016057050A1 (en) | 2016-04-14 |
| RU2015113820A3 (ru) | 2018-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Peltzer et al. | LUBAC is essential for embryogenesis by preventing cell death and enabling haematopoiesis | |
| Castellano et al. | Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice | |
| Theurl et al. | On-demand erythrocyte disposal and iron recycling requires transient macrophages in the liver | |
| Herring et al. | Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury | |
| Zhang et al. | Haploinsufficiency of Klippel-Trenaunay syndrome gene Aggf1 inhibits developmental and pathological angiogenesis by inactivating PI3K and AKT and disrupts vascular integrity by activating VE-cadherin | |
| Romanelli et al. | Overexpression of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) in endothelial cells accelerates coronary artery disease in a mouse model of familial hypercholesterolemia | |
| Lillis et al. | LDL receptor-related protein-1 (LRP1) regulates cholesterol accumulation in macrophages | |
| Gregg et al. | Limb reduction defects in endothelial nitric oxide synthase-deficient mice | |
| Zhao et al. | TDP-43 facilitates milk lipid secretion by post-transcriptional regulation of Btn1a1 and Xdh | |
| O’Sullivan et al. | Frontline Science: Characterization of a novel mouse strain expressing human Siglec-8 only on eosinophils | |
| Ren et al. | Hematopoietic arginase 1 deficiency results in decreased leukocytosis and increased foam cell formation but does not affect atherosclerosis | |
| Kaiser et al. | MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus | |
| Palmieri et al. | Neutralization of oxidized phospholipids attenuates age‐associated bone loss in mice | |
| Zha et al. | CRISPR/Cas9-mediated knockout of APOC3 stabilizes plasma lipids and inhibits atherosclerosis in rabbits | |
| Nakagama et al. | Noonan syndrome‐associated biallelic LZTR1 mutations cause cardiac hypertrophy and vascular malformations in zebrafish | |
| Chrenek et al. | Expression of recombinant human factor VIII in milk of several generations of transgenic rabbits | |
| Choi et al. | BMP10 functions independently from BMP9 for the development of a proper arteriovenous network | |
| Yang et al. | CD73 regulates vascular smooth muscle cell functions and facilitates atherosclerotic plaque formation | |
| Gonzalo-Gobernado et al. | Liver growth factor “Lgf” as a therapeutic agent for alzheimer’s disease | |
| Qiao et al. | Trem2 H157Y increases soluble TREM2 production and reduces amyloid pathology | |
| Wang et al. | Trans-2-enoyl-CoA reductase Tecr-driven lipid metabolism in endothelial cells protects against transcytosis to maintain blood-brain barrier homeostasis | |
| Zorn et al. | Humanization of a strategic CD3 epitope enables evaluation of clinical T-cell engagers in a fully immunocompetent in vivo model | |
| Wang et al. | Endothelial cell‐anchored tissue factor pathway inhibitor regulates tumor metastasis to the lung in mice | |
| Song et al. | Genome editing with AAV-BR1-CRISPR in postnatal mouse brain endothelial cells | |
| RU2721254C2 (ru) | Трансгенные мыши, экспрессирующие липопротеин (а) человека с отключенным геном витамина с, и их применение в качестве модели лечения заболеваний |