RU2720475C2

RU2720475C2 - Test system for searching for drugs which reduce the risk of secondary leukemia, a method for preparing and using it

Info

Publication number: RU2720475C2
Application number: RU2018132409A
Authority: RU
Inventors: Николай Андреевич Ломов; Владимир Сергеевич Вьюшков; Егор Сергеевич Васецкий; Михаил Александрович Рубцов
Priority date: 2018-09-11
Filing date: 2018-09-11
Publication date: 2020-04-30
Also published as: RU2018132409A3; RU2018132409A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention refers to biotechnology, namely to techniques for searching for new therapeutic preparations or combinations of preparations (chemical compounds) which improve existing therapeutic approaches to treating cancer. Disclosed is a test system, to which the analyzed preparation (test substance) is added, and then the number of translocations formed compared to the control is concluded on the risk of secondary leukemia. Disclosed is a test system which enables to study the effect of different substances on the frequency of formation of rearrangements between loci AML and ETO, and hence their effect on the probability of secondary leukemia.

EFFECT: disclosed are a test system for searching for drugs which reduce the risk of secondary leukemia, a method for preparing and using it.

18 cl, 12 dwg, 6 tbl, 1 ex

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к медицинским технологиям, а именно, к технологиям поиска новых терапевтических препаратов или комбинаций препаратов (химических соединений), улучшающих существующие терапевтические подходы к лечению рака. В настоящее время в химиотерапии онкологических заболеваний используются ингибиторы топоизомераз. Пациенты, прошедшие лечение препаратами данной группы, рискуют в течение нескольких лет получить вторичный лейкоз. Данное заболевание развивается примерно у каждого двадцатого пациента. Развитие заболевания напрямую связано с возникновением определенных хромосомных перестроек (транслокаций). Проблема вторичных лейкозов может быть существенно снижена в случае обнаружения веществ, снижающих вероятность лейкозогенных хромосомных перестроек. Для обнаружения такого действия у различных веществ или комбинаций веществ предложена тест-система, к которой добавляется исследуемый препарат (тестируемое вещество), а затем по числу возникших транслокаций по сравнению с контролем делается вывод о риске возникновения вторичного лейкоза. Тест-система может быть адаптирована под высокопроизводительный скрининг молекул в поисках наиболее эффективной с точки зрения способности снижения числа транслокаций. Вещество или комбинация веществ, у которого(-ых) обнаруживается способность существенно снижать число транслокаций, может применяться (при условии прохождения всех необходимых клинических испытаний) в комбинированной терапии, то есть добавляться к уже существующим химиотерапевтическим препаратам, причем всем, которые могут приводить к возникновению заболеваний, вызванных хромосомными перестройками.The present invention relates to medical technologies, namely, to technologies for finding new therapeutic drugs or combinations of drugs (chemical compounds) that improve existing therapeutic approaches to the treatment of cancer. At present, topoisomerase inhibitors are used in cancer chemotherapy. Patients treated with this group of drugs are at risk for secondary leukemia for several years. This disease develops in approximately one in twenty patients. The development of the disease is directly related to the occurrence of certain chromosomal rearrangements (translocations). The problem of secondary leukemia can be significantly reduced if substances are found that reduce the likelihood of leukemic chromosomal rearrangements. To detect such an effect in various substances or combinations of substances, a test system is proposed, to which the studied drug (test substance) is added, and then the risk of secondary leukemia is concluded by the number of translocations compared with the control. The test system can be adapted for high-throughput screening of molecules in search of the most effective in terms of the ability to reduce the number of translocations. A substance or combination of substances for which the ability to significantly reduce the number of translocations is found can be used (provided all the necessary clinical trials have been completed) in combination therapy, that is, added to existing chemotherapeutic drugs, all of which may lead to diseases caused by chromosomal rearrangements.

Уровень техникиState of the art

На сегодня существует проблема вторичных лейкозов. Этот тип лейкоза развивается как побочный эффект химиотерапии с применением препаратов из класса ингибиторов топоизомераз (этопозид, доксирубицин). Данный вид терапии является одним из самых эффективных, и поэтому получил широкое распространение. Причиной вторичного лейкоза становятся определенные межхромосомные перестройки, происходящие при ошибочной репарации двуцепочечных разрывов ДНК, которые возникают вследствие применения ингибиторов топоизомераз. Снижение уровня подобных транслокаций означает снижение вероятности развития вторичных лейкозов. Для поиска веществ, которые способны снижать уровень таких транслокаций, предложена клеточная модель, представляющая культуру клеток, на которой возможно быстро и эффективно моделировать возникновение одной из хромосомных транслокаций, ассоциированных со вторичными лейкозами.Today, there is the problem of secondary leukemia. This type of leukemia develops as a side effect of chemotherapy using drugs from the class of topoisomerase inhibitors (etoposide, doxirubicin). This type of therapy is one of the most effective, and therefore has become widespread. The cause of secondary leukemia is certain interchromosomal rearrangements that occur during the error repair of double-stranded DNA breaks that occur as a result of the use of topoisomerase inhibitors. A decrease in the level of such translocations means a decrease in the likelihood of secondary leukemia. To search for substances that are able to reduce the level of such translocations, a cell model is proposed that represents a cell culture on which it is possible to quickly and efficiently model the occurrence of one of the chromosomal translocations associated with secondary leukemia.

Известно создание культуры клеток, в которых была воспроизведена с помощью системы CRISPR/Cas подобная транслокация AML-ETO (Torres R., Martin М.С., Garcia А., Cigudosa J.C, Ramirez J.С, Rodriguez-Perales S., 2014. Engineering human tumour-associated chromosomal translocations with the RNA-guided CRISPR-Cas9 system // Nat. Commun. V. 5. P. 1-8). Полученные клетки изучались на предмет наличия данной транслокации методом FISH и на предмет экспрессии химерного гена на месте транслокации. Авторы работы делают вывод о возможности создания с помощью системы CRISPR/Cas моделей для изучения онкологических заболеваний. Однако данная модель не ориентирована на изучение самого процесса возникновения хромосомной транслокации. Поэтому с ее помощью невозможно испытывать различные химические вещества на предмет снижения вероятности возникновения данной транслокации.It is known to create a culture of cells in which a similar AML-ETO translocation was reproduced using the CRISPR / Cas system (Torres R., Martin M.S., Garcia A., Cigudosa JC, Ramirez J.C., Rodriguez-Perales S., 2014 Engineering human tumor-associated chromosomal translocations with the RNA-guided CRISPR-Cas9 system // Nat. Commun. V. 5. P. 1-8). The obtained cells were examined for the presence of this translocation using the FISH method and for the expression of the chimeric gene at the site of translocation. The authors of the work conclude that it is possible to create models using the CRISPR / Cas system for the study of cancer. However, this model is not focused on the study of the process of the occurrence of chromosomal translocation. Therefore, with its help it is impossible to test various chemicals to reduce the likelihood of this translocation.

Отдаленными аналогами тест-системы могут быть клеточные линии, в которых в гены AML и ЕТО внесены мутации с применением технологии CRISPR/Cas: www.horizondiscovery.com/human-runx1-20bp-deletion-knockout-cell-line-hzghc004198c004 и www.horizondiscovery.com/human-rmix1t1-knockout-cell-line-hzghc862. Данные клеточные линии могут использоваться для изучения функций генов, но не для изучения процесса возникновения транслокаций.Remote analogs of the test system can be cell lines in which mutations were introduced into the AML and ETO genes using CRISPR / Cas technology: www.horizondiscovery.com/human-runx1-20bp-deletion-knockout-cell-line-hzghc004198c004 and www. horizondiscovery.com/human-rmix1t1-knockout-cell-line-hzghc862. These cell lines can be used to study the functions of genes, but not to study the process of occurrence of translocations.

Изогенные клеточные линии (т.е. имеющих одно происхождение), воспроизводящие ассоциированные с определенными видами рака мутациями (BRAF, KRAS, PIK3CA и EGFR), создают ученые из Италии (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19106301) и предлагают стратегию испытаний лекарств с помощью панели этих изогенных мутантных линий https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20016269. Авторы описывают пример обнаружения с помощью своего метода веществ - потенциальных терапевтических агентов, обладающих терапевтическим действием. При этом из уровня техники не выявлены тест-системы, с помощью которых было бы возможно определять процесс возникновения хромосомной транслокации, ассоциированной со вторичными лейкозами.Isogenic cell lines (i.e. having the same origin) that reproduce mutations associated with certain types of cancer (BRAF, KRAS, PIK3CA and EGFR) are created by scientists from Italy (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed / 19106301) and propose a drug testing strategy using the panel of these isogenic mutant lines https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20016269. The authors describe an example of the discovery using their method of substances - potential therapeutic agents with a therapeutic effect. At the same time, no test systems have been identified from the prior art with which it would be possible to determine the process of the occurrence of chromosomal translocation associated with secondary leukemia.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, является создание тест-системы для исследования терапевтического агента (активнодействующего вещества/компонента или комбинации веществ), используемого как компонент комбинированной химиотерапии, на предмет снижения риска возникновения заболеваний, вызванных межхромосомными перестройками, например, вторичного лейкоза, который проявляется как отдаленный побочный эффект при использовании препаратов из класса ингибиторов топоизомераз. Это одни из наиболее широко применяемых химиотерапевтических препаратов при лечении онкологических заболеваний.The technical problem solved by the present invention is the creation of a test system for the study of a therapeutic agent (active substance / component or combination of substances) used as a component of combination chemotherapy to reduce the risk of diseases caused by interchromosomal rearrangements, for example, secondary leukemia, which manifests itself as a long-term side effect when using drugs from the class of topoisomerase inhibitors. These are one of the most widely used chemotherapeutic drugs in the treatment of cancer.

Техническим результатом изобретения является выявление терапевтического агента (активнодействующего вещества/компонента/препарата или комбинации), использование которого при химиотерапии может привести к снижению риска возникновения вторичного лейкоза, при этом выявление агента осуществляют посредством детектирования и подсчета лейкозогенных хромосомных транслокаций заявлемой тест-системой после взаимодействия с исследуемым препаратом и сравнения с отрицательным контролем.The technical result of the invention is the identification of a therapeutic agent (active substance / component / preparation or combination), the use of which during chemotherapy can reduce the risk of secondary leukemia, while the identification of the agent is carried out by detecting and counting leukemogenic chromosomal translocations by the claimed test system after interacting with the study drug and comparisons with the negative control.

Тест-система предполагает поиск в первую очередь универсального терапевтического агента, который мог бы снизить риск заболеваний, вызванных образованием хромосомных транслокаций.The test system involves the search, first and foremost, for a universal therapeutic agent that could reduce the risk of diseases caused by the formation of chromosomal translocations.

Тест-система представляет из себя культуру генетически модифицированных клеток, в которых запускаются по сигналу извне искомые хромосомные транслокации. Моделируемыми транслокациями могут быть любые перестройки между разными хромосомами или участками одной хромосомы. Для повышения релевантности тест-системы предпочтительнее моделировать транслокации, вероятность возникновения которых необходимо снизить. Например, это могут быть вызывающие вторичный лейкоз транслокации - AML-ETO или другие. После добавления к системе тестируемых веществ и активации системы, искомые транслокации детектируются методом количественной ПЦР с использованием подобранных предварительно праймеров и параметров реакции. Базовый уровень формирования данных транслокаций при активации системы сравнивается с уровнем транслокаций, возникающих при добавлении в момент активации тестируемых веществ. Тест-система позволяет количественно оценивать влияние веществ на частоту транслокаций, а следовательно, достоверно сравнивать вещества между собой по этому параметру. Система адаптируется для процедуры высокопроизводительного скрининга, например, скрининга библиотек химических агентов в поисках наиболее эффективного вещества.The test system is a culture of genetically modified cells in which the desired chromosomal translocation is triggered by an external signal. Simulated translocations can be any rearrangements between different chromosomes or parts of the same chromosome. To increase the relevance of the test system, it is preferable to simulate translocations, the probability of occurrence of which must be reduced. For example, it can be translocations causing secondary leukemia - AML-ETO or others. After adding test substances to the system and activating the system, the desired translocations are detected by quantitative PCR using pre-selected primers and reaction parameters. The basic level of translocation data generation during system activation is compared with the level of translocations that occur when test substances are added at the time of activation. The test system allows you to quantify the effect of substances on the frequency of translocations, and therefore, reliably compare substances with each other by this parameter. The system is adapted for high-throughput screening procedures, for example, screening libraries of chemical agents in search of the most effective substance.

Поставленная проблема решается заявляемой тест-системой для исследования влияния препарата (вещества или комбинации веществ), используемого при химиотерапии, на вероятность возникновения вторичного лейкоза, представляющая собой линию клеток млекопитающего, геном которых содержит генетическую конструкцию, включающую гены систем направленного внесения двуцепочечных разрывов в хромосомы клетки в локусы, между которыми происходит лейкозогенная хромосомная перестройка, а также гены активатора транскрипции ТА и гены селективных маркеров, при этом гены направленного внесения двуцепочечных разрывов, находятся под контролем индуцируемого трансактиватором ТА промотора. При этом в качестве линии клеток млекопитающих используют клетки, скорость деления которых составляет не менее одного деления в 2-3 суток и геном которых изучен настолько, чтобы было возможным подобрать нуклеазы, узнающие локусы, между которыми формируются хромосомные перестройки, например, в качестве линии клеток млекопитающих могут быть использованы лимфобластоидные клетки человека (LCL) RPMI 8866. В качестве генов систем направленного внесения двуцепочечных разрывов используют эндонуклеазу Cas9 и гидовые РНК, при этом в качестве линии клеток млекопитающих, например клетки человека, мыши или любых других млекопитающих, используют клетки, скорость деления которых составляет не менее одного деления в 2-3 суток. В качестве системы, позволяющей вносить направленные двуцепочечные разрывы, используют систему CRISPR/Cas, то есть нуклеаза Cas9 и гидовые РНК, узнающие локусы внутри генов, между которыми возникает хромосомная перестройка, по изменению частоты которой оценивается эффективность вещества или комплекса веществ, в качестве которой выбрана перестройка между генами AML1 и ETO. В качестве системы контроля над экспрессией элементов системы, вносящей специфический разрыв, используют систему Tet-ON, включающую в себя индуцируемый промотор TRE, контролирующий экспрессию гена Cas9, индуцируемый белком трансактиватором, находящимся в комплексе с доксициклином, при этом в качестве селективных маркеров, позволяющих отличить клетки, несущие трансгенные конструкции, используют гены устойчивости к антибиотикам пуромицину и неомицину. Гены системы, позволяющей вносить направленные двуцепочечные разрывы, интегрированы в геном клеток исходной линии в локус, где они будут стабильно экспрессироваться, например, в области первого интрона гена PPP1R12C, расположенного на 19 хромосоме.This problem is solved by the claimed test system for studying the effect of a drug (substance or combination of substances) used in chemotherapy on the likelihood of secondary leukemia, which is a line of mammalian cells whose genome contains a genetic construct that includes genes for systems of directed double-stranded breaks in cell chromosomes to the loci between which leukemic chromosomal rearrangement occurs, as well as transcription activator genes for TA and selective marker genes s, while the genes for the directional introduction of double-stranded breaks are under the control of the transactivator-induced TA promoter. In this case, cells are used as a mammalian cell line, the division rate of which is at least one division in 2-3 days and whose genome has been studied so that it is possible to select nucleases that recognize loci between which chromosomal rearrangements are formed, for example, as a cell line mammalian cells, human lymphoblastoid cells (LCL) RPMI 8866 can be used. Cas9 endonuclease and guiding RNAs are used as genes for the double-stranded break gating systems, while the cell line mammalian cells such as human, mouse, or any other mammalian cells are used which fission rate of at least one division in 2-3 days. The CRISPR / Cas system, i.e., Cas9 nuclease and guiding RNAs that recognize loci within genes between which a chromosome rearrangement occurs, by changing the frequency of which evaluates the effectiveness of a substance or complex of substances, is used as a system that allows introducing directed double-stranded breaks. rearrangement between the genes AML1 and ETO. As a control system for the expression of elements of a system that introduces a specific gap, the Tet-ON system is used, which includes an inducible TRE promoter that controls the expression of the Cas9 gene, which is induced by a protein transactivator complexed with doxycycline, and as selective markers that distinguish cells carrying transgenic constructs use the genes for antibiotic resistance to puromycin and neomycin. The genes of the system that allows directed double-stranded breaks are integrated into the genome of the cells of the initial line at the locus where they will be stably expressed, for example, in the region of the first intron of the PPP1R12C gene located on chromosome 19.

Поставленная проблема также решается способом получения заявляемой тест-системы, который заключается в создании генетических конструкций, содержащих гены системы, позволяющей под действием внешнего воздействия вносить направленные двуцепочечные разрывы в нужные локусы, например, генетической конструкции (1), включающей элементы CRISPR/Cas: гены гидовых РНК gRNA_AML1 и gRNA_ETO, ген нуклеазы Cas9, находящийся под индуцируемом промотором TRE, и ген устойчивости к пуромицину, и генетической конструкции (2), включающей ген активатора транскрипции ТА и ген устойчивости к генетицину, с последующими трансфекцией полученных генетических конструкций в клетки исходной клеточной линии и отбором клеток, содержащих генетические конструкции. Способ заключается в выборе моделируемой хромосомной перестройки и участков, внесение разрывов в которые приведет к воспроизведению данной перестройки, затем конструирование системы под узнавание выбранной последовательности и внесение в нее разрыва, а именно конструирование нуклеазы ZFN - подбор аминокислотных последовательностей доменов «цинковых пальцев», распознающих нужную последовательность нуклеотидов ДНК, либо конструирование субъединиц нуклеазы TALEN - подбор доменов белка, распознающих нужную последовательность нуклеотидов ДНК, в случае системы CRISPR-Cas9 подбирается узнающий ДНК-мишень участок гидовой РНК, например, подбор участков в генах AML1 и ЕТО и гидовых РНК, которые их узнают. Конструирование плазмидных векторов, кодирующих отдельные элементы заявляемой тест-системы, например, в случае использования системы CRISPR/Cas - синтез олигонуклеотидов, представляющих из себя участки генов гидовых РНК, отвечающих за специфическое узнавание гидовой РНК разрезаемого локуса; клонирование полученных олигонуклеотидов в экспрессионный вектор, содержащий последовательность гена гидовых РНК, включающую участок для вставки этих олигонуклеотидов методом рестрикционного клонирования, а также промотор для экспрессии гена гидовой РНК эукариотической РНК-полимеразой III, с последующей проверкой работоспособности сконструированных нуклеаз, например методом ((Engineered Nuclease-induced Translocations» (ENIT) (Germini и др., 2017). Создание генетической конструкции (1) проводят амплификацией участков векторов, кодирующих отдельные элементы заявляемой тест-системы, например, в случае использования системы CRISPR/Cas, кодирующих гидовые РНК, содержащие промотор, кодирующую последовательность и терминатор, затем вставка данных последовательностей в плазмиду, содержащую ген Cas9 под индуцируемым промотором TRE и ген устойчивости к пуромицину, а также последовательностей, способствующие встраиванию трансгенов в геном трансфицируемых клеток, при этом в качестве последовательностей, способствующие встраиванию трансгенов в геном трансфицируемых клеток используют так называемые плечи гомологии, представляющие из себя участки, повторяющие последовательности длиной 100-1000 нуклеотидов с каждой стороны от точки разрыва в геноме, куда затем встраивается трансген. Получение генетической конструкции (2), содержащую ген трансактиватора системы Tet-ON, ген устойчивости к неомицину, а также последовательности, способствующие встраиванию трансгенов в геном трансфицируемых клеток (так называемые плечи гомологии). Трансфекцию полученных генетических конструкций в клетки исходной клеточной линии осуществляют посредством электропорации с подобранными заранее параметрами прибора и условиями электропорации. Отбор клеток, содержащих генетические конструкции, осуществляют благодаря наличию в составе генетических конструкций генов - селективных маркеров, при этом отбор клеток производят посредством выращивания клеток на селективных антибиотиках в течение двух недель при предварительно подобранных концентрациях антибиотиков, при которых погибают клетки, не несущие генов устойчивости к данным антибиотикам, но при которых выживают клетки, несущие селективные маркеры.The posed problem is also solved by the method of obtaining the inventive test system, which consists in creating genetic constructs containing the genes of the system, which, under the influence of external influences, can introduce directed double-stranded breaks at the desired loci, for example, the genetic construct (1), including CRISPR / Cas elements: genes guiding RNAs gRNA_AML1 and gRNA_ETO, the Cas9 nuclease gene located under the inducible TRE promoter, and the puromycin resistance gene, and the genetic construct (2), including the TA transcription activator gene and the gene stability with Geneticin, followed by transfection of genetic constructs derived cells in the original cell line and selection of cells containing the genetic construct. The method consists in choosing a simulated chromosome rearrangement and regions, introducing gaps in which will lead to the reproduction of this rearrangement, then designing the system for recognizing the selected sequence and introducing a gap in it, namely the construction of ZFN nuclease - selection of amino acid sequences of zinc finger domains that recognize the desired DNA nucleotide sequence, or construction of TALEN nuclease subunits - selection of protein domains that recognize the desired nucleotide sequence DNA in the case of CRISPR-Cas9 system selected finding out target DNA guides RNA portion, e.g., the selection of sites in genes AML1 and ETO and guides RNAs which recognize them. The construction of plasmid vectors encoding the individual elements of the claimed test system, for example, in the case of using the CRISPR / Cas system, the synthesis of oligonucleotides, which are portions of the genes of hydraulic RNAs responsible for the specific recognition of the hydraulic RNA of the cut locus; cloning the obtained oligonucleotides into an expression vector containing a sequence of gene RNA hydric RNA, including a site for insertion of these oligonucleotides by restriction cloning, as well as a promoter for expression of the gene RNA hydronucleotides with eukaryotic RNA polymerase III, followed by testing the operability of engineered nucleases, for example, ((Engineered Nuclease -induced Translocations ”(ENIT) (Germini et al., 2017). Creating a genetic construct (1) is carried out by amplification of sections of vectors encoding individual elements of the application test system, for example, in the case of using a CRISPR / Cas system encoding a guiding RNA containing a promoter, a coding sequence and a terminator, then inserting these sequences into a plasmid containing the Cas9 gene under the inducible TRE promoter and the puromycin resistance gene, as well as sequences that facilitate the incorporation of transgens into the genome of transfected cells, while the so-called shoulders are used as sequences that facilitate the incorporation of transgenes into the genome of transfected cells ogy, which represent the portions of repeating sequences of length 100-1000 nucleotides on each side of the discontinuity points in the genome, which is then incorporated transgene. Obtaining a genetic construct (2) containing the Tet-ON system transactivator gene, the neomycin resistance gene, and sequences that facilitate the incorporation of transgenes into the transfected cell genome (the so-called homology shoulders). Transfection of the obtained genetic constructs into cells of the original cell line is carried out by electroporation with pre-selected device parameters and electroporation conditions. Cells containing genetic constructs are selected due to the presence of genes - selective markers in the genetic constructs, and the cells are selected by growing cells on selective antibiotics for two weeks at pre-selected antibiotic concentrations, in which cells that do not carry resistance genes die given antibiotics, but in which cells carrying selective markers survive.

Также поставленная проблема решается способом проведения исследования влияния препарата (вещества или комбинации веществ), используемого при химиотерапии, на вероятность возникновения вторичного лейкоза, с помощью заявляемой тест-системы путем добавления к суспензии, содержащей не менее 2 млн. клеток, исследуемого препарата в концентрациях, не превышающих IC50 для данного препарата, и доксициклина в концентрации, достаточной для запуска экспрессии Cas9; инкубация полученной смеси; проведение количественной ПЦР и анализ результатов; вывод о снижении вероятности возникновения вторичного лейкоза делают по уменьшению количества полученных транслокаций по сравнению с количеством транслокаций в контроле. Предпочтительно концентрация доксициклина составляет от 0,1 до 1 мкг/мл. Образцы для ПЦР готовят любым известным из уровня техники способом или ДНК выделяют с помощью коммерческих наборов для выделения ДНК из клеток согласно инструкции к набору. Предпочтительно количественную ПЦР проводить с использованием предварительно подобранных праймеров ETO_f1-AML_f1 и MYC_f-MYC_r, дающих моноспецифический к участку транслокации продукт амплификации, а именно с последовательностями SEQ ID NO: 3-6. Предпочтительной программой (протоколом) для проведения количественной ПЦР с праймерами с последовательностями SEQ ID NO: 3-6 является: активация полимеразы 95°С 10 мин, денатурация ДНК 95°С 20 сек, отжиг праймеров 60°С 1 мин, стадия элонгации 72°С 30 сек, всего 42 цикла, затем кривая плавления 55-95°С шаг 0.5°С в 5 сек. Подсчет количества транслокаций, проводят следующим образом: полученные значения Ct (значения порогового цикла амплификации образца ДНК с соответствующей парой праймеров) подставляются в формулу (1):Also, the problem posed is solved by the method of studying the effect of the drug (substance or combination of substances) used in chemotherapy on the likelihood of secondary leukemia using the inventive test system by adding to the suspension containing at least 2 million cells of the studied drug in concentrations not exceeding the IC50 for this drug, and doxycycline in a concentration sufficient to trigger expression of Cas9; incubation of the resulting mixture; quantitative PCR and analysis of the results; the conclusion about the decrease in the likelihood of secondary leukemia is made by reducing the number of translocations obtained compared with the number of translocations in the control. Preferably, the doxycycline concentration is from 0.1 to 1 μg / ml. Samples for PCR are prepared by any method known in the art or DNA is isolated using commercial kits for the isolation of DNA from cells according to the instructions for the kit. Quantitative PCR is preferably carried out using the pre-selected primers ETO_f1-AML_f1 and MYC_f-MYC_r, giving the amplification product monospecific to the translocation site, namely with the sequences SEQ ID NO: 3-6. The preferred program (protocol) for quantitative PCR with primers with sequences of SEQ ID NO: 3-6 is: activation of polymerase 95 ° C for 10 min, denaturation of DNA 95 ° C for 20 sec, annealing of primers 60 ° C for 1 min, elongation step 72 ° From 30 sec, a total of 42 cycles, then a melting curve of 55-95 ° С, step 0.5 ° С in 5 sec. The number of translocations is calculated as follows: the obtained Ct values (values of the threshold cycle of amplification of the DNA sample with the corresponding pair of primers) are substituted into the formula (1):

где F - частота транслокаций AML/ETO, нормированная на количество ампликона праймеров Myc_f и Мус_r, E_Myc - эффективность амплификации ДНК с пары праймеров Myc_f и Мус_r, E_AML/ETO - эффективность амплификации ДНК с пары праймеров ETO_f1 и AML_f1, которая определяется один раз в предварительном эксперименте в условиях, максимально соответствующих условиям дальнейшей работы; <Ct>_i - среднее по трем повторностям значение порогового цикла амплификации образца ДНК с соответствующей парой праймеров, где i означает Мус или AML1/ЕТО. Для каждого значения F определяется стандартная ошибка на основании дисперсии Ct_Myc и Ct_AML/ETO по формуле (2):where F is the frequency of AML / ETO translocations, normalized to the number of amplicon of primers Myc_f and Мус_r, E _Myc is the efficiency of DNA amplification from a pair of primers Myc_f and Мус_r, E _{AML / ETO} is the amplification efficiency of DNA from a pair of primers ETO_f1 and AML_f1, which is determined once in a preliminary experiment under conditions that maximally correspond to the conditions for further work; <Ct> _i is the average of three replicates of the threshold cycle of amplification of a DNA sample with the corresponding pair of primers, where i means Myc or AML1 / ETO. For each value of F, the standard error is determined based on the variance Ct _Myc and Ct _{AML / ETO} according to the formula (2):

где F - частота транслокации, вычисленная на основании<Ct>_Myc и <Ct>_AML/ETO, Ем_ус и E_AML/ETO - значения эффективности амплификации с праймерами Myc_f и Мус_r и AML_f1/ETO_f1, соответственно. S_AML/ETO ² - дисперсия Ct_AML/ЕТО, SMyc² - дисперсия Заключение о вероятности возникновения вторичного лейкоза делают по наличию разницы между данными, полученными на обработанных клетках и на контрольных клетках, при этом разницу между данными, полученными на обработанных клетках и на контрольных клетках, делают на основании множественного сравнения экспериментальных выборок с контрольной с помощью непараметрического критерия Даннета.where F is the translocation frequency calculated on the basis of <Ct> _Myc and <Ct> _{AML / ETO} , _Emc and E _{AML / ETO} are the amplification efficiency values with primers Myc_f and Мус_r and AML_f1 / ETO_f1, respectively. S _{AML / ETO} ² - variance Ct _{AML / ETO} , SMyc ² - variance The conclusion about the likelihood of secondary leukemia is made by the difference between the data obtained on the treated cells and on the control cells, while the difference between the data obtained on the treated cells and on control cells are made on the basis of multiple comparisons of experimental samples with the control using the non-parametric Dunnet test.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

На фиг. 1 представлена схема конструкции, интегрированные в геном клеток описываемой тест-системы. Cas9 - ген нуклеазы Cas9, AML1-gRNA_- ген гидовой РНК, узнающей локус AML1, ETO-gRNA_- ген гидовой РНК, узнающей локус ETO, TRE - промотор гена Cas9, индуцируемый белком транс-активатором, Puro - ген устойчивости к пуромицину, Neo - ген устойчивости к неомицину, ТА - ген, кодирующий белок транс-активатор.In FIG. 1 shows a design diagram integrated into the genome of the cells of the described test system. Cas9 is the Cas9 nuclease gene, AML1-gRNA_ is the gene for guiding RNA recognizing the AML1 locus, ETO-gRNA_ is the gene for guiding RNA recognizing the ETO locus, TRE is the Cas9 gene promoter induced by the trans activator protein, Puro is the puromycin resistance gene, Neo - neomycin resistance gene, TA - a gene encoding a trans activator protein.

На фиг. 2 показана последовательность действий при анализе изучаемых веществ с помощью тест-системы.In FIG. 2 shows the sequence of actions in the analysis of the studied substances using a test system.

На фиг. 3 продемонстрировано влияние ингибиторов белков репарации RAD51 (В02) и MRE11 (Mirin) на частоту индуцируемых транслокаций AML1-ETO в линии LCL_iAML/ETO. А - Значение F умножено на 10000. Усы - SE_F. Круглыми точками отложены значения F для двух повторностей. Каждая точка амплифицировалась с каждой парой праймеров в трех повторностях. Ромбом отмечено среднее значение F для каждой выборки. «*» отмечены достоверные отличия от контроля (р<0.05 по критерию Даннета). Обозначения: NC - негативный контроль: экспрессия Cas9 не активировалась. К - положительный контроль: клетки + доксициклин, но без ингибиторов; В02 10 мкМ, В02 10 мкМ, Mirin 25 мкМ и Mirin 50 мкМ - одновременная активация экспрессии Cas9 и обработка клеток соответствующими ингибиторами в указанных концентрациях. Б - нормировка средних частот F в каждой выборке на среднее значение F в положительном контроле (К). В качестве меры разброса на гистограмме отложена стандартная ошибка (SE) для двух значений F в каждой выборке.In FIG. Figure 3 demonstrates the effect of RAD51 (B02) and MRE11 (Mirin) repair protein inhibitors on the frequency of induced translocations of AML1-ETO in the LCL_iAML / ETO line. A - The value of F is multiplied by 10000. The mustache is SE _F. The round dots indicate the values of F for two replicates. Each point was amplified with each pair of primers in triplicate. The diamond indicates the average value of F for each sample. "*" Marked significant differences from control (p <0.05 according to the Dunnet criterion). Designations: NC - negative control: Cas9 expression was not activated. K - positive control: cells + doxycycline, but without inhibitors; B02 10 μM, B02 10 μM, Mirin 25 μM and Mirin 50 μM - simultaneous activation of Cas9 expression and treatment of cells with appropriate inhibitors at the indicated concentrations. B - normalization of the average frequencies F in each sample to the average value of F in the positive control (K). As a measure of spread, the standard error (SE) for two F values in each sample is plotted on the histogram.

Фиг. 4. Электрофорез продуктов количественной ПЦР. На гель наносилось по одному образцу для каждой повторности. NC - негативный контроль: клетки без ингибиторов и доксициклина. K - положительный контроль: клетки + доксициклин без ингибиторов; В02 10 мкМ, В02 20 мкМ, Mirin 25 мкМ и Mirin 50 мкМ - одновременная активация экспрессии Cas9 и обработка клеток соответствующими ингибиторами в указанных концентрациях. Дорожка М - маркер молекулярных масс: набор из 10 фрагментов ДНК от 100 п.н. до 1000 п.н. с шагом в 100 п.н. Яркость полос на геле зависит от многих факторов, поэтому не используется для определения исходного количества матрицы.FIG. 4. Electrophoresis of quantitative PCR products. One sample was applied to the gel for each repetition. NC - negative control: cells without inhibitors and doxycycline. K - positive control: cells + doxycycline without inhibitors; B02 10 μM, B02 20 μM, Mirin 25 μM and Mirin 50 μM - simultaneous activation of Cas9 expression and cell treatment with appropriate inhibitors at the indicated concentrations. Lane M - molecular weight marker: a set of 10 DNA fragments from 100 bp up to 1000 bp in increments of 100 bp The brightness of the bands on the gel depends on many factors, therefore it is not used to determine the initial amount of the matrix.

На фиг. 5 представлена карта плазмиды phU6-gRNA. На карте отмечены элементы: KanR - ген устойчивости к канамицину под контролем бактериального промотора, Ori - ориджин репликации в клетках E. coli, M13f и M13r - праймеры для проверки вставки последовательности гидовой РНК в плазмиду, U6 - промотор РНК полимеразы III человека, gRNA_скаффолд - последовательность константной части гидовой РНК. Отмечены сайты узнавания рестриктазы BstV2I.In FIG. 5 shows a map of the plasmid phU6-gRNA. Elements marked on the map: KanR — kanamycin resistance gene under the control of a bacterial promoter, Ori — the origin of replication in E. coli, M13f and M13r cells — primers for checking the insertion of the guiding RNA sequence into the plasmid, U6 — human RNA polymerase III promoter, gRNA_scaffold — the sequence of the constant part of the guide RNA. Recognized restriction enzyme recognition sites of BstV2I.

На фиг. 6 показан участок плазмиды phU6-gRNA. Фрагмент, вырезаемый рестриктазой BstV2I, выделен цветом. На участке отмечены сайты узнавания рестриктазы BstV2I. Остальные обозначения как на фиг. 5.In FIG. 6 shows a plot of the plasmid phU6-gRNA. The fragment cut out by the restriction enzyme BstV2I is highlighted. Recognition sites of BstV2I restriction enzyme are marked on the site. Other designations as in FIG. 5.

На фиг. 7 представлена схема трансфекции клеток HeLa при проверке работы нуклеаз методом ENIT. Вместо плазмиды с достоверно работающей гидовой РНК («gRNA-X(+)») можно использовать пару плазмид, кодирующих достоверно работающую нуклеазу TALEN. gRNA_(?) - плазмида, содержащая проверяемый РНК-гид.In FIG. Figure 7 shows the HeLa cell transfection scheme for testing the operation of nucleases using the ENIT method. Instead of a plasmid with reliably working guiding RNA (“gRNA-X (+)”), a pair of plasmids encoding a reliably functioning TALEN nuclease can be used. gRNA_ (?) is a plasmid containing the checked RNA guide.

На фиг. 8 показано взаимное расположение праймеров на участках генов AML1, ЕТО и MYC. Овалом отмечены последовательности, узнаваемые гидовыми РНК в генах AML1 и ЕТО, квадратом - субъединицами TALEN в гене MYC.In FIG. Figure 8 shows the relative positions of the primers in the regions of the AML1, ETO, and MYC genes. The oval marks the sequences recognized by the guiding RNAs in the AML1 and ETO genes, the square - the TALEN subunits in the MYC gene.

На фиг. 9 представлен механизм активации экспрессии Cas9. Активатор транскрипции (ТА) экспрессируется конститутивно. ТА связывается с добавляемым к клеткам доксициклином (Dox) и активирует экспрессию Cas9. TRE - промотор, содержащий сайты посадки ТА.In FIG. Figure 9 shows the activation mechanism of Cas9 expression. A transcription activator (TA) is expressed constitutively. TA binds to doxycycline (Dox) added to cells and activates Cas9 expression. TRE is a promoter containing TA landing sites.

На фиг. 10 представлена схема интеграции кассеты в геном по механизму гомологичной рекомбинации.In FIG. 10 shows a diagram of the integration of the cassette into the genome by the mechanism of homologous recombination.

На фиг. 11 показана схема трансфекции клеток при получении линии LCL_iAML/ETO.In FIG. 11 shows a cell transfection scheme for the production of the LCL_iAML / ETO line.

На фиг. 12 отображено получение линии LCL_iAML/ETO. (А) - карта первого интрона гена PPP1R12C, с интегрированными кассетами генов. Цифрами 1 и 2 обозначены экзоны этого гена. HA-L и HA-R - плечи гомологии, использовавшиеся для интеграции кассет генов из плазмид. PuroR и GenR - гены устойчивости к пуромицину и генетицину, соответственно. TRE - индуцируемый промотор. CAG - конститутивный промотор. U6 - промотор для РНК-полимеразы III. ТА - ген активатора транскрипции M2rtTA. (Б) - временная шкала селекции клеток на антибиотиках. Селектирующие концентрации: генетицин - 800 мкг/мл, пуромицин - 0,3 мкг/мл. Поддерживающая концентрация - 300 мкг/мл генетицина и 0,1 мкг/мл пуромицина. Последовательная селекция трансфицированных клеток на генетицине и пуромицине позволяет отобрать клетки, у которых в одну хромосому встроены гены гидовых РНК gRNA_AML1 и gRNA_ETO, ген нуклеазы Cas9 и ген устойчивости к пуромицину, а в другую гомологичную хромосому встроены гены активатора транскрипции ТА и устойчивости к генетицину.In FIG. 12 shows the receipt of the LCL_iAML / ETO line. (A) - map of the first intron of the PPP1R12C gene, with integrated gene cassettes. Numbers 1 and 2 denote exons of this gene. HA-L and HA-R are the homology arms used to integrate gene cassettes from plasmids. PuroR and GenR are genes for resistance to puromycin and geneticin, respectively. TRE is an inducible promoter. CAG is a constitutive promoter. U6 is a promoter for RNA polymerase III. TA is the transcriptional activator gene of M2rtTA. (B) - timeline for cell selection on antibiotics. Selecting concentrations: geneticin - 800 μg / ml, puromycin - 0.3 μg / ml. The maintenance concentration is 300 μg / ml geneticin and 0.1 μg / ml puromycin. Sequential selection of transfected cells on geneticin and puromycin allows one to select cells that have the gRNA_AML1 and gRNA_ETO guiding RNA genes, the Cas9 nuclease gene and the puromycin resistance gene integrated in the same chromosome, and the TA transcription activator and geneticin resistance genes are integrated into the other homologous chromosome.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Заявляемая тест-система для определения частоты образования транслокаций представляет из себя культуру клеток млекопитающих с модифицированным геномом. Выбор исходной культуры клеток, на основе которой сделана тест-система, не является критичным для осуществления изобретения, но чем более близка исходная культура к клеткам, заболевание которых моделируется, тем более релевантными к реальному заболеванию будут полученные на этой культуре результаты.The inventive test system for determining the frequency of translocation formation is a culture of mammalian cells with a modified genome. The choice of the initial cell culture, on the basis of which the test system is made, is not critical for the implementation of the invention, but the closer the initial culture to the cells whose disease is modeled, the more relevant the results obtained on this culture will be relevant to the real disease.

В геном клеток интегрированы конструкции, представляющие из себя элементы нуклеаз, которые позволяют вносить точные разрывы в хромосомы клетки в локусы, между которыми происходит моделируемая перестройка, например в гены AML1 и ЕТО-транслокации между этими локусами характерны для вторичного лейкоза. В качестве таких нуклеаз в нашем примере используется нуклеаза Cas9 системы CRISPR/Cas, которая направляется в нужные локусы гидовыми РНК. Такими нуклеазами могут быть любые нуклеазы, вносящие направленный разрыв в геном клеток (например, ZFN, TALEN, Cpf1 и другие).Designs are integrated into the cell genome, which are nuclease elements that allow precise breaks in the chromosomes of the cells at the loci between which a simulated rearrangement takes place, for example, the AML1 and ETO translocations between these loci are characteristic of secondary leukemia. As such nucleases, in our example, the Cas9 nuclease of the CRISPR / Cas system is used, which is directed to the desired loci by the hydro gen RNAs. Such nucleases can be any nucleases that introduce a directed break in the genome of cells (for example, ZFN, TALEN, Cpf1 and others).

Чтобы нуклеазы вносили точный разрыв в необходимый локус, предварительно подбирается несколько вариантов нуклеаз, в случае системы CRISPR/Cas подбираются вариабельные участки этих РНК-гидов, отвечающих за узнавание. Работа РНК-гидов проверяется различными методами, например, мы проверяли наши гидовые РНК методом ((Engineered Nuclease-induced Translocations» (ENIT). Он предполагает котрансфекцию клеток (например, HeLa) плазмидами, кодирующими нуклеазу Cas9 и гидовые РНК. В случае, если нуклеаза эффективно вносит разрывы, то при репарации с некоторой вероятностью образуются хромосомные перестройки между точками разрывов. Спустя 48 часов после трансфекции с ДНК клеток ставится ПЦР на предмет наличия ожидаемых транслокаций, которые происходят между разрезаемыми локусами (Germini D., Saada Y.B., Tsfasman Т., Osina K., Robin С, Lomov K, Rubtsov М., Sjakste N., Lipinski M., Vassetzky Y., 2017. A one-step PCR-based assay to evaluate efficiency and precision of genomic DNA-editing tools // Mol. Ther. - Methods Clin. Dev. V. 5. № June. P. 43-50). Последовательности вариабельных участков используемых гидов в табл. 1.In order for nucleases to make an exact break at the required locus, several variants of nucleases are preliminarily selected; in the case of the CRISPR / Cas system, variable regions of these RNA guides responsible for recognition are selected. The work of RNA guides is checked by various methods, for example, we tested our guide RNAs using the ((Engineered Nuclease-induced Translocations »(ENIT) method). It involves cotransfection of cells (for example, HeLa) with plasmids encoding Cas9 nuclease and guide RNAs. In case Since nuclease efficiently introduces breaks, chromosomal rearrangements between breakpoints are formed with a certain probability during repair 48 hours after transfection with the DNA of the cells, PCR is performed to determine the expected translocations that occur between the cut loci (Germini D., Saad a YB, Tsfasman T., Osina K., Robin C, Lomov K, Rubtsov M., Sjakste N., Lipinski M., Vassetzky Y., 2017. A one-step PCR-based assay to evaluate efficiency and precision of genomic DNA-editing tools // Mol. Ther. - Methods Clin. Dev. V. 5. No. June. P. 43-50) The sequence of variable sections of the guides used in Table 1.

Заявляемая тест-система отличается тем, что запускается по сигналу извне. Для этого ключевой элемент системы - нуклеаза, вносящая разрыв в нужные локусы, - кодируется геном под контролем индуцируемого промотора. Например, может быть использована система Тет-ON. В этом случае для индукции экспрессии гена, находящегося под индуцируемым промотором, необходим белок транс-активатор, причем этот активатор работает только в присутствии доксициклина или других химических аналогов тетрациклина, которые способны связываться с белком транс-активатором системы Тет-ON. Поэтому ген транс-активатора также встраивается в геном клеток. Взаимное расположение генов относительно друг друга, а также точка в геноме, куда интегрируются эти конструкции, не важны, принципиальное значение имеет размещение гена Cas9 под контроль индуцируемого промотора.The inventive test system is different in that it is triggered by a signal from the outside. For this, a key element of the system — a nuclease that introduces a gap at the desired loci — is encoded by the gene under the control of an inducible promoter. For example, the Tet-ON system may be used. In this case, to induce the expression of a gene under the inducible promoter, a trans activator protein is required, and this activator works only in the presence of doxycycline or other tetracycline chemical analogues that are able to bind to the trans-activator protein of the Tet-ON system. Therefore, the trans activator gene is also integrated into the cell genome. The mutual arrangement of the genes relative to each other, as well as the point in the genome where these constructs are integrated, are not important, the placement of the Cas9 gene under the control of the induced promoter is of fundamental importance.

В результате добавления в среду к клеткам доксициклина происходит активация экспрессии нуклеазы Cas9, и она вносит в необходимых локусах разрывы, которые приводят к образованию транслокаций. Эти транслокации надежно детектируются методом ПЦР через 48 часов после добавления доксициклина. Также не так важно, гены какой именно нуклеазы будут закодированы в геноме, важно, чтобы они делали по сигналу двуцепочечные разрывы в требуемых локусах. Например, за основу культуры LCL_iAML/ETO, взята линия лимфобластоидных клеток (LCL) RPMI 8866 (из коллекции клеточных культур Health Protection Agency (HPA), Великобритания, поставляется Sigma-Aldrich, США), в геном которой были интегрированы элементы системы CRISPR/Cas и системы Tet-ON: гены гидовых РНК gRNA_AML1 и gRNA_ETO, ген нуклеазы Cas9 и ген устойчивости к пуромицину, ген активатора транскрипции ТА и ген устойчивости к генетицину. Для изготовления тест-системы может быть взята и другая линия иммортализированных клеток млекопитающих, чей геном расшифрован и опубликована его последовательность, чтобы была возможность подобрать нуклеазы под конкретные локусы в геноме. Выбор используемой культуры клеток определяется тем, насколько близки данные клетки к клеткам крови человека, заболевания в которых моделируются. Чем ближе - тем выше вероятность, что полученные на тест-системе результаты будут релевантны по отношению к настоящему заболеванию. Другим фактором является удобство работы с данными клетками - скорость деления клеток в культуре должна быть не слишком медленной - не менее одного деления в 2 суток.As a result of the addition of doxycycline to the medium to the cells, the expression of Cas9 nuclease is activated, and it introduces gaps at the necessary loci that lead to the formation of translocations. These translocations are reliably detected by PCR 48 hours after the addition of doxycycline. It is also not so important which genes of which particular nucleases will be encoded in the genome; it is important that they make double-stranded breaks at the required loci by signal. For example, based on the LCL_iAML / ETO culture, the lymphoblastoid cell line (LCL) RPMI 8866 (from the cell culture collection of the Health Protection Agency (HPA), UK, supplied by Sigma-Aldrich, USA) was taken, into the genome of which CRISPR / Cas system elements were integrated and Tet-ON systems: gRNA_AML1 and gRNA_ETO guiding RNA genes, Cas9 nuclease gene and puromycin resistance gene, TA transcription activator gene and geneticin resistance gene. For the production of the test system, another line of immortalized mammalian cells can be taken, whose genome has been deciphered and its sequence published so that it is possible to select nucleases for specific loci in the genome. The choice of cell culture used is determined by how close these cells are to human blood cells in which diseases are modeled. The closer - the higher the likelihood that the results obtained on the test system will be relevant to this disease. Another factor is the convenience of working with these cells - the cell division rate in the culture should not be too slow - at least one division in 2 days.

Интеграция необходимых элементов (фиг. 1) была осуществлена в участок в области первого интрона гена PPP1R12C, расположенного на 19 хромосоме. Интеграция может быть осуществлена в любые другие участки генома, в которых трансген будет стабильно экспрессироваться (так называемые Safe harbours (Sadelain М., Papapetrou Е.Р., Bushman F.D., 2011. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome // Nat. Rev. Cancer. V. 12. №1. P. 51-58). В одну хромосому интегрирована конструкция, содержащая ген нуклеазы Cas9 под промотором TRE (индуцируемый тетрациклином элемент), ген гидовой РНК, узнающей локус AML1 и ген гидовой РНК, узнающей локус ЕТО (таблица 1), а также ген селекивного маркера (элемента, позволяющего отобрать клетки, несущие трансгенную конструкцию), например, ген устойчивости к селективному антибиотику. В другую гомологичную хромосому 19 интегрирован ген белка-активатора и другой селективный маркер, например, ген устойчивости к антибиотику неомицину. Гены устойчивости к антибиотикам могут быть другими, с помощью которых можно осуществлять отбор клеток, несущих конструкции. Могут быть использованы также другие методы селекции клеток, несущих конструкцию, например, добавление гена флуоресцентного белка и последующий сортинг клеток. Исследования показывают, что уровень экспрессии гена белка-активатора постоянен, а экспрессия гена Cas9 запускается в ответ на добавление в среду к клеткам доксициклина в концентрации 1 мкг/мл и спустя сутки уровень экспрессии гена Cas9 выходит на плато. Транслокации между локусами AML1 и ЕТО при этом надежно детектируются спустя 48 часов после добавления доксициклина.Integration of the necessary elements (Fig. 1) was carried out in a region in the region of the first intron of the PPP1R12C gene located on chromosome 19. Integration can be carried out in any other parts of the genome in which the transgene will be stably expressed (the so-called Safe harbors (Sadelain M., Papapetrou E.R., Bushman FD, 2011. Safe harbors for the integration of new DNA in the human genome / / Nat. Rev. Cancer. V. 12. No. 1. P. 51-58) Integrated into a single chromosome is a construct containing the Cas9 nuclease gene under the TRE promoter (tetracycline-induced element), a gene for guiding RNA that recognizes the AML1 locus, and a gene for guiding RNA that recognizes the ETO locus (table 1), as well as the gene for the selective marker (an element that allows you to select cells carrying a transgenic construct cts), for example, a gene for resistance to a selective antibiotic.The gene of an activator protein and another selective marker, for example, a gene for resistance to an antibiotic neomycin, are integrated into another homologous chromosome 19. Antibiotic resistance genes may be different, with which cells can be selected, bearing constructs Other methods for selecting cells bearing the construct may also be used, for example, adding a fluorescent protein gene and then sorting the cells. Studies show that the level of expression of the activator protein gene is constant, and the expression of the Cas9 gene is triggered in response to the addition of doxycycline to the medium at a concentration of 1 μg / ml and after a day the level of expression of the Cas9 gene reaches a plateau. The translocations between the AML1 and ETO loci are reliably detected 48 hours after the addition of doxycycline.

Для работы с клеточной культурой - тест-системой и для измерения уровня (частоты) образования транслокаций применяется следующая последовательность действий. В качестве примера взята тест-система - клеточная линия LCL_iAML/ETO. Для тест-системы, созданной на основе другой исходной клеточной линии, протокол будет отличаться в методах культивирования этой линии, и будет соответствовать протоколу культивирования исходной линии. Подробно протокол создания клеточной линии LCL_iAML/ETO приведен ниже.To work with cell culture, the test system, and to measure the level (frequency) of translocation formation, the following sequence of actions is used. As an example, we took a test system - the cell line LCL_iAML / ETO. For a test system created on the basis of a different initial cell line, the protocol will differ in the cultivation methods of this line, and will correspond to the protocol for culturing the original line. The protocol for creating the LCL_iAML / ETO cell line is detailed below.

Клеточная линия LCL_iAML/ETO содержится согласно общепринятым методикам ведения суспензионных клеточных культур. Клетки культивируются в инкубаторе (например, «Binder», Германия) при 37°С во влажной атмосфере с содержанием 5% СО₂. Работа с культурами ведется с соблюдением техник асептики. Клетки LCL_культивируются в среде RPMI-1640 с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки «FBS certified)) («Gibco», США) до 10% объема, а также антибиотиков пенициллин в конечной концентрации 50 ед/мл («ПанЭко», Россия) и стрептомицин в конечной концентрации 50 мкг/мл («ПанЭко», Россия). Пассаж культуры LCL_проводится по достижению плотности 0,8-1 млн клеток/мл путем замены части объема культуры свежей полной средой.The cell line LCL_iAML / ETO is maintained according to generally accepted methods for managing suspension cell cultures. Cells are cultured in an incubator (eg, Binder, Germany) at 37 ° C in a humid atmosphere with a content of 5% CO ₂ . Work with cultures is carried out in accordance with aseptic techniques. LCL_ cells are cultured in RPMI-1640 medium supplemented with fetal calf serum (FBS certified)) (Gibco, USA) up to 10% of the volume, as well as penicillin antibiotics at a final concentration of 50 units / ml (PanEco, Russia) and streptomycin in final concentration of 50 μg / ml (PanEco, Russia). The culture passage LCL_ is carried out to achieve a density of 0.8-1 million cells / ml by replacing part of the culture volume with fresh complete medium.

Хранения клеток возможно в замороженном состоянии при -80°С или, что предпочтительнее, в хранилищах клеток в жидком азоте. Для работы следует разморозить ампулу с клетками при комнатной температуре. Затем перенести клетки в 10 мл среды, суспендировать и затем сменить эту среду на свежую, чтобы избавиться от DMSO в среде. Замораживание клеток производится в среде с добавлением 5-7% DMSO в специальных контейнерах для заморозки, например «Мг.Frosty® Cryo 1 С Freezing Containers». Все описанные процедуры культивирования клеток соответствуют общепринятым протоколам и рекомендациям по культивированию суспензионных клеток эукариот. The storage of cells is possible in a frozen state at -80 ° C or, preferably, in the storage of cells in liquid nitrogen. To work, you should defrost the ampoule with cells at room temperature. Then transfer the cells to 10 ml of medium, suspend and then change this medium to fresh to get rid of DMSO in the medium. Cells are frozen in a medium supplemented with 5-7% DMSO in special containers for freezing, for example, Mg Frosty® Cryo 1 With Freezing Containers. All described cell culture procedures are in accordance with generally accepted protocols and recommendations for the cultivation of eukaryotic suspension cells.

Для изучения влияния различных веществ на частоту образования транслокаций производится следующая последовательность действий. Линия клеток LCL_iAML/ETO (генетически модифицированные клетки со встроенными элементами систем CRISPR/Cas и TetON) размораживается, и клетки наращиваются до необходимого количества от 2 млн на экспериментальную точку (одна повторность эксперимента в определенных условиях, влияние которых изучается) при концентрации суспензии 0,3-0,8 млн клеток/мл. Общее количество клеток определяется удобством экспериментатора - чем меньше клеток, тем быстрее они нарастают до необходимого количества. С другой стороны, из меньшего количества клеток сложнее выделить геномную ДНК. Оптимальным является 3 млн клеток на экспериментальную точку. Перед началом эксперимента клетки разводятся до 0,3-0,4 млн клеток/мл. Затем клетки распределяются по 5 мл по лункам шестилуночного планшета: по одной лунке на каждую экспериментальную точку. Минимум одна из точек должна быть для контроля, остальные - для изучаемых веществ. В лунки добавляется доксициклин до концентрации 1 мкг/мл, а также (кроме лунки с контролем) изучаемые вещества в исследуемых концентрациях (можно в разных экспериментах брать одно и то же вещество, но в разных концентрациях). Концентрации подбираются исходя из влияния веществ на выживаемость клеток, что может быть взято из литературных данных или проведен соответствующий тест на выживаемость (например, МТТ или ХТТ тесты). В экспериментах были использованы концентрации, которые меньше, чем те, что приводят к гибели хотя бы половины из обработанных клеток. Осадок клеток ресуспендируется в необходимом объеме среды - 1 мл на 0,5 млн клеток или ином, согласно протоколу эксперимента), и суспензия перемещается в новый матрас для культивирования. Спустя 48 часов из клеток выделяется геномная ДНК, например, с помощью коммерческих наборов для выделения ДНК из клеток и согласно инструкции к набору. Затем с этой ДНК ставится количественная ПЦР, с ДНК каждой экспериментальной точки по 6 реакций: 3 реакции с предварительно подобранной парой праймеров ЕТО f1-AML_f1 и 3 реакции с парой MYC_f-MYC_r (последовательности праймеров в таблице 2). Праймеры подбираются исходя из того, какую транслокацию необходимо детектировать. Оптимальным является выбор праймеров с помощью сервиса Primer-blast (ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). Расстояние до точки разрыва - 30-100 нуклеотидов, чтобы использовать праймеры для количественной ПЦР. Лучше не допускать больше 2 GC в последних 5 нуклеотидах на 3'-конце праймера, всего длина 18-30 нуклеотидов. Программа количественной ПЦР: активация полимеразы 95°C - 10 мин, денатурация ДНК 95°C - 20 сек, отжиг праймеров 60°C - 1 мин, стадия элонгации 72°C - 30 сек, всего 42 цикла, затем кривая плавления 55-95°С шаг 0.5°С в 5 сек. Общая схема действий представлена на фиг. 2.To study the effect of various substances on the frequency of translocation formation, the following sequence of actions is performed. The LCL_iAML / ETO cell line (genetically modified cells with integrated elements of the CRISPR / Cas and TetON systems) is thawed, and the cells grow to the required amount from 2 million per experimental point (one repetition of the experiment under certain conditions, the effect of which is studied) at a suspension concentration of 0, 3-0.8 million cells / ml. The total number of cells is determined by the convenience of the experimenter - the smaller the cells, the faster they grow to the required number. From a smaller number of cells, on the other hand, it is more difficult to isolate genomic DNA. Optimal is 3 million cells per experimental point. Before the experiment, the cells are diluted to 0.3-0.4 million cells / ml. Then the cells are distributed in 5 ml per well of a six-well plate: one well for each experimental point. At least one of the points should be for control, the rest - for the studied substances. Doxycycline is added to the wells to a concentration of 1 μg / ml, and also (except for the control well) the studied substances in the studied concentrations (you can take the same substance in different experiments, but in different concentrations). Concentrations are selected based on the effect of substances on cell survival, which can be taken from the literature or an appropriate survival test can be performed (for example, MTT or XTT tests). In the experiments, concentrations were used that are less than those that lead to the death of at least half of the treated cells. The cell pellet is resuspended in the required volume of medium - 1 ml per 0.5 million cells or otherwise, according to the experimental protocol), and the suspension is transferred to a new mattress for cultivation. After 48 hours, genomic DNA is isolated from the cells, for example, using commercial kits for DNA extraction from cells and according to the instructions for the kit. Then, quantitative PCR is performed with this DNA, and 6 reactions are used for each experimental point DNA: 3 reactions with a pre-selected pair of ETO f1-AML_f1 primers and 3 reactions with a pair of MYC_f-MYC_r (sequence of primers in Table 2). Primers are selected based on which translocation needs to be detected. Optimal is the choice of primers using the Primer-blast service (ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). The distance to the break point is 30-100 nucleotides to use primers for quantitative PCR. It is better not to allow more than 2 GC in the last 5 nucleotides at the 3'-end of the primer, a total length of 18-30 nucleotides. Quantitative PCR program: activation of polymerase 95 ° C - 10 min, denaturation of DNA 95 ° C - 20 sec, annealing of primers 60 ° C - 1 min, elongation step 72 ° C - 30 sec, 42 cycles in total, then melting curve 55-95 ° С step 0.5 ° С in 5 sec. The general scheme of actions is presented in FIG. 2.

Результаты ПЦР анализируются следующим образом. Полученные значения Ct (значения порогового цикла амплификации образца ДНК с соответствующей парой праймеров) подставляются в формулу (1):PCR results are analyzed as follows. The obtained Ct values (values of the threshold cycle of amplification of a DNA sample with the corresponding pair of primers) are substituted into the formula (1):

где F - частота транслокаций AML/ETO, нормированная на количество ампликона праймеров Myc_f и Мус_r. Ем_ус - эффективность амплификации ДНК с пары праймеров Myc_f и Мус_r. E_AML/ETO - эффективность амплификации ДНК с пары праймеров ETO_f1 и AML_f1 (были определены согласно принятым методикам проведения количественной ПЦР; в качестве матрицы была взята геномная ДНК, и приготовлены разные разведения, затем поставлены реакции количественной ПЦР с соответствующими парами праймеров и строился график зависимости полученных значений Ct> от десятичного логарифма концентрации кДНК, значения эффективности определялись по формуле E=10^∧(-1/tg а), где а - угол наклона прямой на графике; значения в таблице 3). Эффективность праймеров определяется один раз в предварительном эксперименте в условиях, максимально соответствующих условиям дальнейшей работы: конкретный прибор, реагенты, протоколы выделения ДНК. В случае изменения этих условий, эффективность определяется заново. <Ct>_i - среднее по трем повторностям значение порогового цикла амплификации образца ДНК с соответствующей парой праймеров.where F is the frequency of AML / ETO translocations, normalized to the number of amplicon of primers Myc_f and Myc_r. I eat _us - the efficiency of amplification of DNA from a pair of primers Myc_f and Myc_r. E _{AML / ETO} - the efficiency of amplification of DNA from a pair of primers ETO_f1 and AML_f1 (they were determined according to the accepted methods of quantitative PCR; genomic DNA was taken as a matrix and various dilutions were prepared, then quantitative PCR reactions with the corresponding primer pairs were set up and a dependency graph was constructed obtained values Ct> from the decimal logarithm of the cDNA concentration, the efficiency values were determined by the formula E = 10 ^∧ (-1 / tg а), where a is the slope of the straight line in the graph; values in table 3). The effectiveness of the primers is determined once in a preliminary experiment under conditions that maximally correspond to the conditions for further work: a specific device, reagents, DNA isolation protocols. If these conditions change, the effectiveness is redefined. <Ct> _i is the average of three replicates of the threshold cycle of amplification of a DNA sample with the corresponding pair of primers.

Для каждого значения F определяется стандартная ошибка на основании дисперсии Ct_Myc и Ct_AML/ETO по формуле (2):For each value of F, the standard error is determined based on the variance Ct _Myc and Ct _{AML / ETO} according to the formula (2):

где F - частота транслокации, вычисленная на основании <Ct>_Myc и<Ct>_AML/ETO, Ем_ус и E_AML/ETO - значения эффективности амплификации с праймерами Myc_f и Мус_r и AML_f1/ETO_f1, соответственно. S_AML/ETO ² - дисперсия Ct_AML/ETO, S_Myc ² - дисперсия Множественное сравнение экспериментальных выборок с контрольной проводится с помощью непараметрического критерия Даннета (С. Гланц, 1999. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М.: Практика. Р. 1-459). Использование этого критерия оправдано, когда не известно, распределены ли значения нормально, а также проводится множественное попарное сравнение нескольких выборок с одной контрольной. Эти рассуждения применимы в случае 2-3 экспериментальных точек (повторностей) для обработки каждым из изучаемых веществ. В случае большого числа экспериментальных точек могут применяться другие инструменты статистической обработки результатов. Формула для расчета критерия Даннета (3):where F is the translocation frequency calculated on the basis of <Ct> _Myc and <Ct> _{AML / ETO,} _Emc and E _{AML / ETO} are the amplification efficiency values with primers Myc_f and Мус_r and AML_f1 / ETO_f1, respectively. S _{AML / ETO} ² - variance Ct _{AML / ETO,} S _Myc ² - variance Multiple comparison of experimental samples with the control is carried out using the non-parametric Dunnet test (S. Glants, 1999. Biomedical statistics. Transl. From English. M .: Practice R. 1-459). The use of this criterion is justified when it is not known whether the values are normally distributed, and a multiple pairwise comparison of several samples with one control is carried out. These considerations are applicable in the case of 2-3 experimental points (replicates) for processing by each of the studied substances. In the case of a large number of experimental points, other tools for statistical processing of the results can be used. The formula for calculating the Dunnet criterion (3):

где R_cont и R_i - суммарные ранги контрольной и опытной выборок, соответственно, n - число элементов в каждой выборке, 1 - число сравниваемых выборок. Ранги определяются на основании значений F для каждого тестируемого вещества (или контроля). Полученное значение q сравнивается с табличным (С. Гланц, 1999. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М.: Практика. Р. 1-459) для определения статистической значимости.where R _cont and R _i are the total ranks of the control and experimental samples, respectively, n is the number of elements in each sample, 1 is the number of compared samples. Ranks are determined based on the F values for each test substance (or control). The obtained q value is compared with the tabulated one (S. Glanz, 1999. Biomedical statistics. Transl. From English. M.: Practice. R. 1-459) to determine the statistical significance.

Для демонстрации того, что культура LCL_iAML/ETO может служить моделью ранних событий при возникновении лейкозогенных транслокаций, было исследовано влияние ингибирования белков репарации ДЦР на частоту транслокаций. Относительная частота транслокаций определялась с помощью количественной ПЦР. Для осуществления такой ПЦР в ходе предварительных экспериментов была подобрана пара праймеров (ETO_f1 и AML_f1), которая дает моноспецифический продукт при амплификации с геномной ДНК в одну стадию ПЦР.To demonstrate that the LCL_iAML / ETO culture can serve as a model of early events in the occurrence of leukemic translocations, the effect of inhibition of DCR repair proteins on the frequency of translocations was investigated. The relative frequency of translocations was determined using quantitative PCR. To carry out such PCR during the preliminary experiments, a pair of primers (ETO_f1 and AML_f1) was selected, which gives a monospecific product when amplified with genomic DNA in one PCR stage.

Было протестировано два ингибитора - Мирин (Mirin) и В02. Мирин (Mirin, Sigma-Aldrich, США) является ингибитором экзонуклеазной активности белка MRE11 (Dupre и др., 2008). Этот белок инициирует укорочение концов при гомологичной рекомбинации, а также сигнализирует о возникновении ДЦР путем активации киназы ATM (Stracker Т.Н., Petrini J.H.J., 2011. The MRE11 complex: starting from the ends // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. V. 12. №2. P. 90-103). Кроме того, MRE11 принимает участие и в негомологичном соединении концов, причем как в классическом, так и в альтернативном пути (Zha S., Boboila С, Alt F.W., 2009. Mrell: Roles in DNA repair beyond homologous recombination // Nat. Struct. Mol. Biol. T. 16. №8. C. 798-800). Второй используемый ингибитор - B02 (Sigma-Aldrich, США) - нарушает процесс гомологичной рекомбинации, препятствуя сборке филамента RAD51 на одноцепочечной ДНК {Huang F., Mazina О.М., Zentner I. J., Cocklin S., Mazin A. V., 2012. Inhibition of homologous recombination in human cells by targeting RAD51 recombinase // J. Med. Chem. V. 55. №7. P. 3011-3020). Используемые в работе концентрации ингибиторов приводили к возникновению физиологического эффекта в культурах клеток в описанных исследованиях (Dupre A., Boyer-Chatenet L., Sattler R.M., Modi А.Р., Lee J.-H., Nicolette M.L., Kopelovich L., Jasin M., Baer R., Paull T.T., Gautier J., 2008. A forward chemical genetic screen reveals an inhibitor of the Mrell-Rad50-Nbsl complex. // Nat. Chem. Biol. V. 4. №2. P. 119-125; Huang F., Mazina O.M., Zentner I.J., Cocklin S., Mazin A. V., 2012. Inhibition of homologous recombination in human cells by targeting RAD51 recombinase // J. Med. Chem. V. 55. №7. P. 3011-3020).Two inhibitors were tested - Mirin (Mirin) and B02. Mirin (Mirin, Sigma-Aldrich, USA) is an inhibitor of the exonuclease activity of the MRE11 protein (Dupre et al., 2008). This protein initiates shortening of the ends during homologous recombination, and also signals the occurrence of DSB by activation of the ATM kinase (Stracker, T. N., Petrini JHJ, 2011. The MRE11 complex: starting from the ends // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. V. 12. No. 2. P. 90-103). In addition, MRE11 is involved in non-homologous termination, both in the classical and alternative ways (Zha S., Boboila C, Alt FW, 2009. Mrell: Roles in DNA repair beyond homologous recombination // Nat. Struct. Mol. Biol. T. 16. No. 8. C. 798-800). The second inhibitor used - B02 (Sigma-Aldrich, USA) - disrupts the process of homologous recombination, preventing the assembly of the RAD51 filament on single-stranded DNA {Huang F., Mazina OM, Zentner IJ, Cocklin S., Mazin AV, 2012. Inhibition of homologous recombination in human cells by targeting RAD51 recombinase // J. Med. Chem. V. 55. No. 7. P. 3011-3020). The inhibitor concentrations used in this work led to the appearance of a physiological effect in cell cultures in the described studies (Dupre A., Boyer-Chatenet L., Sattler RM, Modi A.P., Lee J.-H., Nicolette ML, Kopelovich L., Jasin M., Baer R., Paull TT, Gautier J., 2008. A forward chemical genetic screen reveals an inhibitor of the Mrell-Rad50-Nbsl complex. // Nat. Chem. Biol. V. 4. No. 2. P 119-125; Huang F., Mazina OM, Zentner IJ, Cocklin S., Mazin AV, 2012. Inhibition of homologous recombination in human cells by targeting RAD51 recombinase // J. Med. Chem. V. 55. No. 7. P. 3011-3020).

Указанные ингибиторы добавлялись в концентрации 25 мкМ или 50 мкМ для мирина и 10 мкМ или 20 мкМ для В02 к культуре LCL_iAML/ETO (по 2 млн на каждую экспериментальную точку) параллельно с ее активацией доксициклином 1 мкг/мл. Спустя 48 часов из клеток выделялась геномная ДНК с помощью специальных коммерческих наборов, например «diaGene для выделения ДНК из культур клеток» («Диаэм», Россия), и ставилась количественная ПЦР на транслокации (фиг. 2). Отметим, что инкубация клеток с ингибиторами на протяжении указанного времени не приводила к гибели клеток, что проверялось окрашиванием трипановым синим. Эксперимент был проведен в двух биологических повторностях.These inhibitors were added at a concentration of 25 μM or 50 μM for myrin and 10 μM or 20 μM for B02 to the LCL_iAML / ETO culture (2 million per experimental point) in parallel with its activation with doxycycline 1 μg / ml. After 48 hours, genomic DNA was isolated from the cells using special commercial kits, for example, diaGene for DNA extraction from cell cultures (Diaem, Russia), and quantitative PCR for translocation was performed (Fig. 2). Note that the incubation of cells with inhibitors over the specified time did not lead to cell death, as was verified by trypan blue staining. The experiment was carried out in two biological replicates.

Для проведения количественной ПЦР использовался набор реактивов «Maxima SYBR Green qPCR Master mix» («Thermo Fisher Scientific)), США), позволяющий проводить реакцию с использованием «горячего старта». Объем одной реакции - 25 мкл. Концентрация праймеров составляла 250 нМ. Последовательности праймеров приведены в таблице 2. Параметры циклов ПЦР указаны выше. Для работы использовался прибор «CFX96» («Bio-Rad Laboratories», США). Анализ результатов количественной ПЦР проводился с помощью программы «Bio-Rad CFX Manager» версии 3.1 («Bio-Rad Laboratories», США). Пороговое значение флуоресценции и значение порогового цикла (Ct) определялось автоматически. По окончании циклов ПЦР прибор снимал кривую плавления для подтверждения специфичности амплификации.To carry out quantitative PCR, the Maxima SYBR Green qPCR Master mix reagent kit (Thermo Fisher Scientific), USA) was used, which allowed the reaction to be carried out using a “hot start”. The volume of one reaction is 25 μl. The concentration of primers was 250 nM. The primer sequences are shown in table 2. The parameters of the PCR cycles are indicated above. For operation, the CFX96 instrument (Bio-Rad Laboratories, USA) was used. Analysis of the results of quantitative PCR was carried out using the program “Bio-Rad CFX Manager” version 3.1 (“Bio-Rad Laboratories”, USA). The fluorescence threshold value and the threshold cycle value (Ct) were determined automatically. At the end of the PCR cycles, the instrument took a melting curve to confirm the specificity of amplification.

Для дополнительного подтверждения специфичности амплификации ПЦР-продукты амплификации в каждой повторности были проанализированы с помощью электрофореза (фиг. 3). Во всех случаях, кроме негативного контроля (клетки без ингибиторов и доксициклина) размер ПЦР-продуктов соответствовал ожидаемым. В негативном контроле обнаруживаются продукты неспецифической амплификации, поэтому частота «транслокаций» в этом случае несколько больше нуля (фиг. 3).To further confirm the specificity of amplification, the PCR amplification products in each replicate were analyzed by electrophoresis (Fig. 3). In all cases, except for the negative control (cells without inhibitors and doxycycline), the size of the PCR products was as expected. In the negative control, nonspecific amplification products are detected, therefore the frequency of “translocations” in this case is slightly greater than zero (Fig. 3).

В результате были получены данные Ct (таблица 4), которые подставлялись в формулу (1). Значения эффективностей для праймеров (E_AML/ETO) брали из табл 3. Стандартная ошибка вычислялась на основании дисперсии Ct_Myc и Ct_AML/ETO по формуле (2). Полученные данные (табл. 5) наносились на график. Множественное сравнение экспериментальных выборок с контрольной проводилось с помощью непараметрического критерия Даннета (3).As a result, Ct data were obtained (Table 4), which were substituted into formula (1). The efficacy values for the primers (E _{AML / ETO} ) were taken from Table 3. The standard error was calculated based on the variance Ct _Myc and Ct _{AML / ETO} according to formula (2). The data obtained (table. 5) were plotted on a graph. Multiple comparison of experimental samples with the control was carried out using the non-parametric Dunnet test (3).

Таблица 4. Данные Ct из результатов обработки клеточной линии ингибиторами одновременно с индукцией Cas9. NC - отрицательный контроль, К - индукция транслокаций без ингибиторов, В10 и В20 - кообработка ингибитором В02 в концентрациях 10 и 20 мкМ соответственно, М25 и М50 - кообработка ингибитором Мирин в концентрациях 25 и 50 мкМ, соответственно.Table 4. Ct data from the results of processing the cell line with inhibitors simultaneously with Cas9 induction. NC - negative control, K - induction of translocations without inhibitors, B10 and B20 - co-treatment with a B02 inhibitor at concentrations of 10 and 20 μM, respectively, M25 and M50 - co-treatment with a Mirin inhibitor at concentrations of 25 and 50 μM, respectively.

Измеряемая частота транслокаций в данном эксперименте не является абсолютной, поскольку мы не знаем доли клеток в популяции, которые несут хромосомную перестройку. Фактически, мы измеряем долю молекул транслокации по отношению к ДНК гена MYC, по которому проводилась нормировка. Тем не менее, этого вполне достаточно для сравнения частот транслокации в различных экспериментальных условиях.The measured frequency of translocations in this experiment is not absolute, since we do not know the proportion of cells in the population that carry chromosomal rearrangement. In fact, we measure the proportion of translocation molecules relative to the DNA of the MYC gene, which was normalized. Nevertheless, this is quite sufficient for comparing translocation frequencies under various experimental conditions.

Можно видеть, что ингибирование Rad51 с помощью В02 не снижает частоту транслокаций (фиг. 3). Это согласуется с предположением о том, что ошибочная репарация ДЦР, приводящая к возникновению перестроек, осуществляется путем негомологичного соединения концов. В то же время, при ингибировании MRE11 с помощью Mirin наблюдается снижение частоты транслокаций на 39% и 44% для 25 мкМ и 50 мкМ ингибитора, соответственно. Для определения статистической достоверности различий был использован непараметрический критерий Даннета (С. Гланц, 1999. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М.: Практика. Р. 1-459). Этот критерий позволяет проводить попарное сравнение нескольких выборок с одной контрольной. Использование именно непараметрической версии критерия объясняется малым объемом выборки и отсутствием уверенности в том, что случайная величина F распределена нормально. Значение частот транслокаций были заменены рангами, как того требует используемый критерий. При этом для составления выборки использовались именно биологические повторности - по два значения F для каждой выборки.It can be seen that inhibition of Rad51 with B02 does not reduce the frequency of translocations (Fig. 3). This is consistent with the assumption that the erroneous repair of DCR, leading to the occurrence of rearrangements, is carried out by non-homologous connection of the ends. At the same time, upon inhibition of MRE11 by Mirin, a translocation frequency decrease of 39% and 44% was observed for 25 μM and 50 μM inhibitor, respectively. To determine the statistical significance of differences, the non-parametric Dunnet test was used (S. Glants, 1999. Biomedical statistics. Transl. From English. M .: Practice. R. 1-459). This criterion allows pairwise comparison of several samples with one control. The use of a nonparametric version of the criterion is explained by the small sample size and the lack of confidence that the random variable F is distributed normally. The values of translocation frequencies were replaced by ranks, as required by the criterion used. At the same time, biological replications were used to compile the sample — two F values for each sample.

Таким образом, как показали проведенные эксперименты:Thus, as shown by the experiments:

- заявляемая тест-система позволяет изучать влияние различных веществ на частоту образования перестроек между локусами AML и ЕТО, а значит, их влияние на вероятность возникновения вторичных лейкозов.- the claimed test system allows you to study the effect of various substances on the frequency of the formation of rearrangements between the AML and ETO loci, and hence their influence on the likelihood of secondary leukemia.

- в заявляемой тест-системе Mirin в концентрации 25 мкМ и 50 мкМ на 39% и 44% снижает частоту образования транслокаций между AML и ЕТО. Эта транслокация приводит ко вторичным лейкозам, и поэтому имеет смысл провести следующий этап испытаний данного вещества на предмет снижения частоты лейкозогенных перестроек при использовании химиотерапевтических препаратов из класса ингибиторов топоизомераз.- in the inventive test system Mirin at a concentration of 25 μm and 50 μm by 39% and 44% reduces the frequency of translocation formation between AML and ETO. This translocation leads to secondary leukemia, and therefore it makes sense to carry out the next stage of testing this substance to reduce the frequency of leukemic rearrangements when using chemotherapeutic drugs from the class of topoisomerase inhibitors.

Разница в уровне транслокаций напрямую связана с разницей в уровне риска возникновения вторичных лейкозов.The difference in translocation level is directly related to the difference in the level of risk of secondary leukemia.

Протокол создания клеточной линии LCL_iAML/ETO.Protocol for the creation of the cell line LCL_iAML / ETO.

Для выполнения этой задачи сначала были подобраны гидовые РНК (гиды) и собраны плазмиды на основе плазмиды phU6-gRNA_(номер в Addgene #53188). Каждая такая плазмида содержала ген одной из гидовых РНК. Эти плазмиды затем использовали для проверки работоспособности гидов. Потом участок, содержащий ген гидовой РНК (вместе с промотором и терминатором), амплифицировали с помощью ПЦР, чтобы затем вставить его в плазмиду Puro_Cas9 donor (номер #58409 в Addgene). Сборка осуществлялась методом Gibson Assembly. Полученная плазмида Puro_Cas9+gRNA_AML1_ETO использовалась при трансфекции клеток.To accomplish this task, guiding RNAs (guides) were first selected and plasmids based on the phU6-gRNA_ plasmid (number in Addgene # 53188) were assembled. Each such plasmid contained the gene of one of the guiding RNAs. These plasmids were then used to test the performance of the guides. Subsequently, the region containing the gene for guiding RNA (together with the promoter and terminator) was amplified by PCR to then insert it into the plasmid Puro_Cas9 donor (number # 58409 in Addgene). Assembly was carried out by the Gibson Assembly method. The obtained plasmid Puro_Cas9 + gRNA_AML1_ETO was used for cell transfection.

Подбор гидовGuides selection

В качестве гидов использовали последовательности узнающих участков гидовых РНК, узнающих последовательности внутри пятого интрона гена AML1 и второго интрона гена ЕТО. Последовательности, узнаваемые гидовыми РНК, располагаются в указанных интронах вблизи кластеров точек разрыва. В качестве исходного материала для выбора узнающих участков гидовых РНК в онлайн-сервис crispr.mit.edu загружали последовательность размером 250 нуклеотидов, включавшая в себя максимальное число точек разрыва, обнаруженных у пациентов (Smith et al., 2014). Для каждого локуса были отобраны по три гидовые РНК, имеющих температуру отжига около 60°С с учетом добавленных нуклеотидов САСС, необходимых для дальнейшего встраивания в плазмиду phU6-gRNA, и начинающихся с G, в противном случае добавляли G на 5'-конец.As guides, sequences of recognizing regions of the guiding RNAs recognizing sequences within the fifth intron of the AML1 gene and the second intron of the ETO gene were used. The sequences recognized by guiding RNAs are located in these introns near clusters of break points. A sequence of 250 nucleotides in size, including the maximum number of break points detected in patients, was uploaded to the crispr.mit.edu online service as a starting material for selecting recognizing guiding RNA sites (Smith et al., 2014). Three guiding RNAs were selected for each locus, having an annealing temperature of about 60 ° С, taking into account the added CACC nucleotides necessary for further insertion into the phU6-gRNA plasmid and starting with G; otherwise, G was added to the 5'-end.

Подбор праймеровPrimer Selection

Вместе с гидами подбирались и праймеры для ПЦР, с помощью сервиса Primer-blast (ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). Расстояние до точки разрыва выбирали 30-100 нуклеотидов, чтобы использовать праймеры впоследствии и для ПЦР в реальном времени. В отобранных праймерах старались допускать не больше 2 GC в последних 5 нуклеотидах на 3'-конце праймера, всего длина 18-30 нуклеотидов. Синтез праймеров осуществлен на заказ в компании ООО «ДНК-синтез» (Москва, Россия) или в Eurofins Genomics (Германия).Together with the guides, primers for PCR were also selected using the Primer-blast service (ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). The distance to the break point was chosen 30-100 nucleotides to use the primers subsequently for real-time PCR. In the selected primers, they tried to allow no more than 2 GC in the last 5 nucleotides at the 3'-end of the primer, a total length of 18-30 nucleotides. Primer synthesis was custom-made at DNA Synthesis LLC (Moscow, Russia) or at Eurofins Genomics (Germany).

Сборка плазмид с генами гидовых РНКAssembly of plasmids with gene guides RNA

Сборка экспрессионных векторов, несущих гены гидовых РНК, осуществляли на основе плазмиды phU6-gRNA_(номер #53188, «Addgene», США). Этот вектор содержит промотор гена мяРНК U6, последовательность конститутивной части гидовой РНК (скаффолд), и небольшой спейсер между ними (фиг. 5). Спейсер содержит сайты рестрикции для эндонуклеазы BstV21, вырезающей этот фрагмент из плазмиды. На его место встраивали олигонуклеотид, представляющий из себя последовательность узнающего участка гидовой РНК (фиг. 6). Таким образом плазмида phU6-gRNA_использовалась для создания целого семейства плазмид, несущих гены разных гидовых РНК.The assembly of expression vectors carrying the guiding RNA genes was carried out on the basis of the plasmid phU6-gRNA_ (number # 53188, Addgene, USA). This vector contains the promoter of the U6 snRNA gene, the sequence of the constitutive part of the guiding RNA (scaffold), and a small spacer between them (Fig. 5). The spacer contains restriction sites for the BstV21 endonuclease that cuts this fragment from the plasmid. In its place, an oligonucleotide was inserted, which is a sequence of a recognizing region of a guiding RNA (Fig. 6). Thus, the phU6-gRNA_ plasmid was used to create a whole family of plasmids carrying genes of different guiding RNAs.

Получение олигонуклеотидов. Последовательность узнающего участка гидовой РНК далее называется «прямым» гидом, а комплементарная ей - «обратным». К «прямому» гиду добавлялся на 5'-конец САСС, к обратному - АААС. Заказывали получившиеся олигонуклеотиды сразу 5'-фосфорелированными.Obtaining oligonucleotides. The sequence of the recognizing region of the guiding RNA is hereinafter called the “direct” guide, and the complementary sequence to it is called the “reverse” one. To the “direct” guide was added to the 5'-end of CASS, to the opposite - AAAAS. The resulting oligonucleotides were immediately ordered 5'-phosphorylated.

Отжиг олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды разводили до 10 мМ, брали 31 пмоль прямого и столько же соответствующего ему обратного (3,1 мкл), смешивали, нагревали до 95°С и инкубировали 5 мин, затем давали остыть 1 час до комнатной температуры.Annealing of oligonucleotides. Oligonucleotides were diluted to 10 mM, 31 pmol of direct and the same corresponding reverse (3.1 μl) were taken, mixed, heated to 95 ° C and incubated for 5 min, then allowed to cool for 1 hour to room temperature.

Рестрикция плазмиды phU6-gRNA. К 1 мкг плазмиды phU6-gRNA_добавляли 10 единиц активности рестриктазы BstV2I («СибЭнзим», Россия) в поставляемом с ферментом буфере. Рестрикцию проводили при 55°С в течение двух часов. Дефосфорилировали плазмиду с помощью 1 единицы активности щелочной фосфатазы «FastAP» («Thermo Fisher Scientific)), США) 1 час при 37°С, затем инактивировали фермент 15 мин при 75°С. Проводили очистку с помощью набора для очистки ПЦР-продукта NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (MACHEREY-NAGEL, Германия) или по протоколу производителя, элюцию проводили в 40 мкл воды, получали концентрацию около 20 нг/мкл.Restriction of the plasmid phU6-gRNA. 10 units of BstV2I restriction enzyme activity (SibEnzyme, Russia) were added to 1 μg of phU6-gRNA_ plasmid in the buffer supplied with the enzyme. Restriction was carried out at 55 ° C for two hours. The plasmid was dephosphorylated using 1 FastAP alkaline phosphatase activity unit (Thermo Fisher Scientific), USA) for 1 hour at 37 ° C, then the enzyme was inactivated for 15 min at 75 ° C. Purification was performed using the NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up PCR product purification kit (MACHEREY-NAGEL, Germany) or according to the manufacturer's protocol, elution was performed in 40 μl of water, and a concentration of about 20 ng / μl was obtained.

Лигирование и трансформация бактерий. Реакцию лигирования проводили в 15 мкл: 2 мкл (5 пмоль) олигонуклеотидов, 4 мкл плазмиды (100 нг), 0,5 мкл лигазы Т4 ДНК-лигазы («Thermo Fisher Scientific», США), 1,5 мкл соответствующего лигазного буфера, 7 мкл воды. Негативный контроль - аналогичная реакция, но вместо олигонуклеотидов брали 2 мкл воды. Положительный контроль: 33 нг чистой плазмиды, 0,5 мкл лиг. буфера, 3 мкл воды. Лигирование проводили 20 минут при комнатной температуре.Ligation and transformation of bacteria. The ligation reaction was carried out in 15 μl: 2 μl (5 pmol) of oligonucleotides, 4 μl of plasmid (100 ng), 0.5 μl of T4 DNA ligase ligase (Thermo Fisher Scientific, USA), 1.5 μl of the corresponding ligase buffer, 7 μl of water. A negative control is a similar reaction, but instead of oligonucleotides, 2 μl of water was taken. Positive control: 33 ng of pure plasmid, 0.5 μl of lig. buffer, 3 μl of water. Ligation was carried out for 20 minutes at room temperature.

Затем проводили трансформацию: 3-5 мкл лигазной смеси добавляли к 50 мкл компетентных клеток, подвергали клетки тепловому шоку 40 с при 42°С. Охлаждали 2 мин на льду, добавляли 750 мкл среды SOC, которая представляет собой среду SOB с добавлением глюкозы до 20 мМ. Инкубировали 1 час при 37°С в термомиксере. По 200 мкл размазывали на чашку с агаризованной средой LB (1% w/v триптона, 0,5% w/v дрожжевого экстракта, 170 мМ NaCl, 1,5% агара) с добавлением в качестве селектирующего антибиотика канамицина («Панэко», Россия) 25 мкг/мл. Колонии бактерий выращивались в течение ночи в инкубаторе при 37°С.Then the transformation was carried out: 3-5 μl of the ligase mixture was added to 50 μl of competent cells, the cells were heat shocked for 40 s at 42 ° C. Cooled for 2 min on ice, 750 μl of SOC medium, which is SOB medium with the addition of glucose up to 20 mM, was added. Incubated for 1 hour at 37 ° C in a thermomixer. 200 μl were spread per cup with LB agar medium (1% w / v tryptone, 0.5% w / v yeast extract, 170 mM NaCl, 1.5% agar) with kanamycin added as a selection antibiotic (Paneko, Russia) 25 mcg / ml. Bacteria colonies were grown overnight in an incubator at 37 ° C.

Скрининг клонов. На следующий день после трансформации оценивали число колоний в опыте и контролях. Если в опыте выросло колоний значительно больше, чем в негативном контроле, то ставили ПЦР-скрининг: скалывали по несколько колоний в 200 мкл воды, брали этой суспензии 1 мкл и замешивали ПЦР с использованием обратного праймера М13 г и прямого олигонуклеотида (тот, который с добавлением САСС) в качестве прямого праймера. Результаты ПЦР визуализировали на электрофорезе. Так определялись колонии, несущие плазмиду с необходимой вставкой. Из таких колоний затем наращивали ночную культуру (в 5-10 мл среды LB с соответствующим антибиотиком) и выделяли плазмиду с помощью набора «NucleoSpin® Plasmid» (MACHEREY-NAGEL, Германия) или «GeneJET Plasmid Miniprep Kit» («Thermo Fisher Scientific», США) по протоколу производителя. Плазмиду затем секвенировали на предмет корректности вставки, используя праймер М13 г. Метод ENIT для проверки гидовых РНКClone screening. The day after the transformation, the number of colonies in the experiment and controls was estimated. If in the experiment there were significantly more colonies than in the negative control, then PCR screening was performed: several colonies were chopped off in 200 μl of water, 1 μl was taken of this suspension and PCR was mixed using reverse primer M13 g and direct oligonucleotide (the one with by adding CASS) as a direct primer. PCR results were visualized by electrophoresis. In this way, colonies carrying the plasmid with the necessary insert were determined. An overnight culture was then grown from such colonies (in 5-10 ml LB medium with the appropriate antibiotic) and the plasmid was isolated using the NucleoSpin® Plasmid kit (MACHEREY-NAGEL, Germany) or the GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific) , USA) according to the manufacturer's protocol. The plasmid was then sequenced for insert correctness using an M13 primer. ENIT method for checking guiding RNAs

Метод «Engineered Nuclease-induced Translocations» (ENIT) предполагает котрансфекцию клеток (например, HeLa) плазмидами, кодирующими нуклеазы и гидовые РНК (в случае проверки работы элементов системы CRISPR/Cas) (фиг. 7). В случае, если нуклеазы эффективно вносят разрывы, то при репарации с некоторой вероятностью образуются хромосомные перестройки между точками разрывов. Спустя 48 часов после трансфекции с ДНК клеток ставится ПЦР на предмет наличия ожидаемых транслокаций, которые происходят между разрезаемыми локусами.The Engineered Nuclease-induced Translocations (ENIT) method involves the co-transfection of cells (eg, HeLa) with plasmids encoding nucleases and guiding RNAs (when checking the operation of elements of the CRISPR / Cas system) (Fig. 7). In the event that nucleases efficiently introduce breaks, then during repair, with some probability, chromosome rearrangements between break points are formed. 48 hours after transfection with cell DNA, PCR is performed to determine the expected translocations that occur between the cut loci.

Трансфекция HeLaTransfection HeLa

За день до трансфекции засеивали в шестилуночный планшет клетки культуры HeLa на 30% конфлюентности. На следующий день трансфицировали клетки: меняли клеткам среду на OptiMEM, затем смешивали плазмиды в равном соотношении, 3-4 мкг суммарно из расчета на одну лунку в 300 мкл среды«Орй-МЕМ» («Gibco», США). Затем добавляли реагент «TurboFect» («Thermo Fisher Scientific)), США) согласно инструкции производителя - 6-8 мкл. Оставляли на 15-20 мин на столе. Затем весь объем добавляли по каплям к клеткам. На следующий день меняли среду на свежую полную DMEM.The day before transfection, HeLa culture cells were seeded in a six-well plate at 30% confluency. The next day, the cells were transfected: the medium was changed to OptiMEM, then the plasmids were mixed in equal proportions, 3-4 μg in total per one well in 300 μl of Ory-MEM medium (Gibco, USA). Then added TurboFect reagent (Thermo Fisher Scientific), USA) according to the manufacturer's instructions - 6-8 μl. Left for 15-20 minutes on the table. Then the entire volume was added dropwise to the cells. The next day, the medium was changed to a fresh full DMEM.

Direct-Nested PCRDirect-Nested PCR

Транслокации лучше всего детектируются, если в методе ENIT использовать стратегию вложенной (nested) ПЦР. Также вложенная ПЦР менее требовательна к подготовке образцов, поэтому возможно использование «прямой» ПЦР (Direct PCR) без выделения ДНК с помощью специальных наборов.Translocations are best detected by using the nested PCR strategy in the ENIT method. Nested PCR is also less demanding on sample preparation, so it is possible to use “direct” PCR (Direct PCR) without DNA isolation using special kits.

Спустя 48 часов после трансфекции клетки снимали с чашки с помощью раствора 0,05% трипсина - 0,53 мМ ЭДТА («ПанЭко», Россия) - 300 мкл на лунку, затем добавляли 2,7 мл PBS.48 hours after transfection, cells were removed from the plate using a solution of 0.05% trypsin — 0.53 mM EDTA (PanEco, Russia) —300 μl per well, then 2.7 ml PBS was added.

На одну реакцию ПЦР брали 5-100 тысяч клеток. Осаждали 3 мин 5000 rpm на настольной центрифуге. К осадку клеток добавляли 2Х премикс для ПЦР (буфер, нуклеотиды, ионы магния - согласно инструкции производителя к ДНК-полимеразе) и протеиназу К до 0,1 мг/мл так, чтобы получилось по 10 мкл на каждую предстоящую реакцию. Распределяли по 10 мкл в ПЦР-пробирки. Ставили в амплификатор, программа: 10 мин 60° и 3 мин 95°.For one PCR reaction, 5-100 thousand cells were taken. Precipitated 3 min. 5000 rpm in a benchtop centrifuge. To the cell pellet was added 2X premix for PCR (buffer, nucleotides, magnesium ions — according to the manufacturer’s instructions for DNA polymerase) and proteinase K up to 0.1 mg / ml so that 10 μl for each forthcoming reaction was obtained. Distributed 10 μl in PCR tubes. They put it in an amplifier, program: 10 min 60 ° and 3 min 95 °.

После в пробирки добавляли HotStart Taq-полимеразу, праймеры для первой стадии вложенной ПЦР и воду до 20 мкл. Ставился ПЦР1 с внешними праймерами с программой: 95°С 5 мин, 20×(95°С 20 сек, 60°С 1 мин, 72°С 45 сек), 72°С 5 мин.After that HotStart Taq polymerase, primers for the first stage of the inserted PCR and water up to 20 μl were added to the tubes. PCR1 with external primers was set with the program: 95 ° С for 5 min, 20 × (95 ° С for 20 sec, 60 ° С for 1 min, 72 ° С for 45 sec), 72 ° С for 5 min.

Затем 1 мкл из реакции разбавлялся в 100 мкл воды и 1 мкл этого разбавленного раствора использовался для ПЦР2 (в 20 мкл) с внутренними праймерами: 95°С 5 мин, 25×(95°С 20 сек, 60°С 1 мин, 72°С 30 сек), 72°С 5 мин. Результаты ПЦР2 анализировались с помощью электрофореза, длины полос сравнивались с теоретически ожидаемыми. Последовательности праймеров даны в таблице 6, а их взаимное расположение на фиг. 8.Then, 1 μl from the reaction was diluted in 100 μl of water, and 1 μl of this diluted solution was used for PCR2 (in 20 μl) with internal primers: 95 ° C for 5 min, 25 × (95 ° C for 20 sec, 60 ° C for 1 min, 72 ° C 30 s), 72 ° C 5 min. The results of PCR2 were analyzed by electrophoresis, the lengths of the bands were compared with the theoretically expected. The primer sequences are given in table 6, and their relative position in FIG. 8.

Вставка генов гидовых РНК в плазмиду Puro_Cas9 donorInsertion of gene guides RNA into the plasmid Puro_Cas9 donor

Метод Gibson Assembly. Метод позволяет вставлять в одной реакции сразу несколько фрагментов, причем в любое место плазмиды, где возможно внести разрыв. Для встраивания 2 фрагментов, в качестве места встраивания выбрали сайт узнавания рестриктазой Sail. Использовался набор «Gibson Assembly Master Mix» (NEB, Великобритания), выполняемый протокол основан на протоколе производителя набора.Gibson Assembly Method. The method allows you to insert several fragments in one reaction at once, and at any place in the plasmid where it is possible to introduce a gap. To embed 2 fragments, the recognition site was restricted to Sail by the restriction enzyme recognition site. The Gibson Assembly Master Mix set (NEB, Great Britain) was used; the protocol being executed is based on the protocol of the kit manufacturer.

Подбор праймеров для Gibson AssemblyPrimer selection for Gibson Assembly

Праймеры со «свешивающимися» 5'-концами подбирались согласно протоколу Gibson Assembly от NEB, исходя из последовательности плазмиды вокруг точки, куда вставляются фрагменты, в нашем случае вокруг сайта узнавания рестриктазой Sail.Primers with "hanging" 5'-ends were selected according to the NEB Gibson Assembly protocol, based on the sequence of the plasmid around the point where the fragments are inserted, in our case, around the Sail restriction enzyme recognition site.

Наработка фрагментов для вставкиMaking fragments to insert

В плазмиду Puro_Cas9 donor вставляли гены гидовых РНК, наработанных с помощью ПЦР и с использованием праймеров со свешивающимися 5'-концами, в качестве матрицы использовались проверенные плазмиды phU6-gRNA со вставкой узнающего участка гРНК. Сначала ставили оптимизацию условий ПЦР: ставили градиент по температурам отжига праймеров. В качестве точки отсчета брали температуру отжига, рассчитанную в онлайн-сервисах «NEB Tm Calculator» или «Thermo Fisher Scientific Tm Calculator)). Оценивали качество ПЦР и концентрацию фрагментов по яркости полос на электрофорезе с помощью программы ImageJ. Затем ставили препаративный ПЦР в 50 мкл. Очистили ПЦР-продукт специальным набором для очистки ПЦР NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (MACHEREY-NAGEL, Германия), элюировали с колонки в 12 мкл воды (концентрация получалась около 300 нг/мкл).The genes of guiding RNAs generated by PCR and using primers with 5 ′ ends were inserted into the Puro_Cas9 donor plasmid; verified phU6-gRNA plasmids with an insert of the recognizing gRNA region were used as a matrix. First, optimization of PCR conditions was set: a gradient was set for the primer annealing temperatures. The annealing temperature calculated in the online services “NEB Tm Calculator” or “Thermo Fisher Scientific Tm Calculator)) was taken as a reference point. The quality of PCR and the concentration of fragments were evaluated by the brightness of the bands on electrophoresis using the ImageJ program. Then put preparative PCR in 50 μl. The PCR product was purified with a special NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up PCR kit (MACHEREY-NAGEL, Germany), was eluted from the column in 12 μl of water (the concentration was about 300 ng / μl).

Подготовка вектораVector preparation

Ставили рестрикцию 1-2 мкг плазмиды Puro_Cas9 donor (номер #58409, «Addgene», США) рестриктазой SalIl на 3 часа при 37°С. Очищали продукт рестрикции с помощью набора для очистки ПЦР-продукта NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up (MACHEREY-NAGEL, Германия), элюировали в 10-20 мкл воды.Restriction was performed on 1-2 μg of the plasmid Puro_Cas9 donor (number # 58409, Addgene, USA) with the restriction enzyme SalIl for 3 hours at 37 ° C. The restriction product was purified using a NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up PCR product purification kit (MACHEREY-NAGEL, Germany), eluting with 10-20 μl of water.

Gibson AssemblyGibson assembly

Каждую реакцию ставили в 4-8 мкл. Ставили контроли: с положительным контролем из набора и отрицательным контролем (вектор без вставок). Предварительно готовили смесь фрагментов для вставки, содержащую по 10 нг каждого фрагмента. В каждую реакцию брали плазмиды 110 нг, 1 мкл олигонуклеотидов (или воды для контроля) и воды до 4 мкл, добавляли 4 мкл Gibson Assembly Master Mix. Помещали в амплификатор на 30 мин на 50°С, затем оставляли на 4°С.Each reaction was set at 4-8 μl. The controls were set: with a positive control from the set and a negative control (vector without inserts). Previously prepared a mixture of fragments for insert containing 10 ng of each fragment. Plasmids 110 ng, 1 μl of oligonucleotides (or control water) and water up to 4 μl were taken in each reaction, 4 μl of Gibson Assembly Master Mix was added. It was placed in a thermocycler for 30 min at 50 ° С, then left at 4 ° С.

Брали по 2 мкл этой смеси к 50 мкл компетентных клеток, затем проводили трансформацию по обычному протоколу. Высевали клетки на агаровые чашки с ампициллином в качестве селективного антибиотика.2 μl of this mixture was taken to 50 μl of competent cells, then transformation was carried out according to the usual protocol. Cells were seeded on agar plates with ampicillin as a selective antibiotic.

Скрининг колонийColony Screening

После трансформации на чашках вырастало от нескольких десятков колоний в положительном контроле; в опыте вырастало на порядок больше колоний, чем в негативном контроле. В этом случае ставили ПЦР-скрининг колоний - скалывали штук 20 колоний в 200 мкл воды, брали 1 мкл этой суспензии и замешивали ПЦР с праймерами PuroCas9_F_Sal и PuroCas9_R_Sal, 30 циклов, 60°С отжиг. На электрофорезе выявляются полоски: 200 п. н. - если вставки нет, 500 п.н. - если вставился только один фрагмент, 800 п.н. - если вставились оба фрагмента. В последнем случае такую колонию скалывали, наращивали ночную культуру, выделяли плазмиду с помощью набора «NucleoSpin® Plasmid» и отправляли на секвенирование. Для секвенирования использовали те же праймеры: PuroCas9_F_Sal и PuroCas9_R_Sal. Если секвенирование показывало корректность вставки, то наращивали большой объем культуры (150 мл) с этой плазмид ой и выделяли плазмиду с помощью набора «NucleoBond® Xtra Midi» (MACHEREY-NAGEL, Германия) для дальнейшей трансфекции плазмидой клеток.After transformation, the plates grew from several tens of colonies in the positive control; in the experiment, an order of magnitude more colonies grew than in the negative control. In this case, colony PCR screening was performed — 20 colonies were chopped off in 200 μl of water, 1 μl of this suspension was taken and PCR was mixed with PuroCas9_F_Sal and PuroCas9_R_Sal primers, 30 cycles, 60 ° С annealing. On electrophoresis, strips are detected: 200 bp. - if there is no insert, 500 bp - if only one fragment is inserted, 800 bp - if both fragments are inserted. In the latter case, such a colony was cleaved, an overnight culture was expanded, the plasmid was isolated using the NucleoSpin® Plasmid kit and sent for sequencing. For sequencing, the same primers were used: PuroCas9_F_Sal and PuroCas9_R_Sal. If sequencing showed the correct insertion, a large culture volume (150 ml) was expanded with this plasmid and the plasmid was isolated using the NucleoBond® Xtra Midi kit (MACHEREY-NAGEL, Germany) for further transfection with the cell plasmid.

Получение линии LCL_iAML/ETOGetting the LCL_iAML / ETO line

Чтобы двуцепочечные разрывы не вносились в ДНК еще до начала экспериментов, ген Cas9 находится под индуцируемым промотором системы Tet-On, которая позволяет регулировать экспрессию гена. Система основана на бактериальной системе регуляции экспрессии Tet-оперона, отвечающего за устойчивость бактерии к антибиотикам тетрациклинового ряда. Система состоит двух компонентов: промотора перед регулируемым геном и белка транс-активатора. В состав промотора входит минимальный CMV-промотор и несколько операторных последовательностей (TRE - tetracycline response element), а транс-активатор содержит домен, связывающий эти операторные последовательности только в присутствии тетрациклина или его аналогов, например доксициклина. Также в состав транс-активатора входит сильный трансактивирующий домен вирусного белка VP 16, который запускает сборку инициаторного комплекса РНК-полимеразы II. Принцип работы системы - на фиг. 9To prevent double-stranded breaks from being introduced into DNA even before the start of experiments, the Cas9 gene is located under the inducible promoter of the Tet-On system, which allows one to regulate gene expression. The system is based on the bacterial system for regulating the expression of the Tet operon, which is responsible for the bacterial resistance to tetracycline antibiotics. The system consists of two components: a promoter in front of the regulated gene and a trans activator protein. The promoter includes a minimal CMV promoter and several operator sequences (TRE - tetracycline response element), and the trans activator contains a domain that binds these operator sequences only in the presence of tetracycline or its analogues, for example, doxycycline. The trans activator also includes a strong transactivating domain of the viral protein VP 16, which starts the assembly of the RNA polymerase II initiator complex. The principle of operation of the system is shown in FIG. 9

Для интеграции элементов системы CRISPR/Cas и системы Tet-On в геном клеток собрали все элементы в две кассеты в составе двух плазмид. В состав одной кассеты входили ген Cas9 под промотором TRE, гены двух гидовых РНК и ген устойчивости к селективному антибиотику пуромицину. В состав второй кассеты входил ген транс-активатора под конститутивным промотором и ген устойчивости к антибиотику неомицину (генитицину). Чтобы повысить вероятность встраивания этих кассет в геном, мы выбрали стратегию интеграции трансгенов по механизму гомологичной рекомбинации. Встраиваемые кассеты находились в составе плазмидных векторов и были окружены плечами гомологии к определенному участку генома. В качестве такого места в геноме использовался локус AAVS1, который находится внутри первого интрона гена PPP1R12C на 19 хромосоме. Назвали этот локус так, потому что в него in vitro интегрировался вирус AAV, хотя in vivo это и не является местом предпочтительной интеграции этого вируса. Так или иначе, было показано, что трансгены, встроенные в этот локус, демонстрируют стабильную экспрессию, отчего его часто используют, как место для интеграции в геном трансгенов («Safe harbour») (Sadelain, 2011). Одновременно с плазмидами, несущими интегрируемые кассеты, LCL_трансфицировались плазмидами, кодирующими субъединицы TALEN-нуклеазы, которая вносит разрыв в этот локус. Выбор TALEN-нуклеаз вместо более простой системы CRISPR/Cas в данном случае обуславливался тем, что гены гидовых РНК к генам AML1 и ЕТО, находящиеся в состав интегрируемых кассет, находятся под конститутивным промотором hU6 (промотор мяРНК для РНК-полимеразы III). И появление в клетке плазмид, конститутивно экспрессирующих Cas9, привело бы к преждевременным разрывам в локусах AML1 и ЕТО и к нежелательным хромосомным перестройкам еще на стадии получения линии клеток. Схема интеграции кассеты в геном по механизму гомологичной рекомбинации отражена на фиг. 10. Выбор стратегии создания линии также был обусловлен тем, что уже существовали плазмидные векторы, содержащие почти все необходимые элементы системы. Нам оставалось лишь встроить в вектор Puro_Cas9 donor гены гидовых РНК, которые мы подобрали, вставили в плазмиды phU6-gRNA_и проверили методом ENIT. Получение итогового вектора Puro_Cas9+gRNA_AML1_ETO описано в разделе «Вставка генов гидовых РНК в плазмиду Puro_Cas9 donor». Для получения нашей клеточной модели мы использовали культуру LCL, поскольку она является удобной в работе линией лейкоцитов человека. Итак, мы трансфицировали клетки этой культуры одновременно четырьмя плазмидами: Puro_Cas9+gRNA_AML1_ETO, AAVS1-M2rtTA (#60843 «Addgene», США) и двумя плазмидами, содержащими гены субъединиц нуклеазы TALEN, которая вносит разрыв по сайту AAVS1: TALENL (#59025, «Addgene», США) и TALENR (#59026, «Addgene», США) (фиг. 11). Трансфекцию всех плазмид осуществляли путем электропорации по протоколу «Jurkat» с помощью прибора «Gene Pulser Xcell» («Bio-Rad Laboratories», США). Для электропорации использовалось по 2,5 мкг плазмид TALEN_L и TALEN_R, и по 2,3 мкг плазмид AAVS1-M2rtTA и Cas9+gRNA_AML1_ЕТО. После попадания в клетку плазмид начинается транзиентная экспрессия, и начинает нарабатываться TALEN-нуклеаза, которая вносит разрыв в локусы AAVS1 на обеих гомологичных хромосомах. В результате репарации по механизму гомологичной рекомбинации в место разрывов будут встраиваться кассеты, окруженные плечами гомологии. В ряде случаев в одну гомологичную хромосому клетки встроится кассета из плазмиды Puro_Cas9+gRNA_AML1_ETO, содержащая гены гидовых РНК gRNA_AML1 и gRNA_ETO, ген нуклеазы Cas9 и ген устойчивости к пуромицину, а в другую гомологичную хромосому встроится кассета из плазмиды AAVS1-M2rtTA, содержащая ген активатора транскрипции ТА и ген устойчивости к генетицину. Селекция трансфицированных клеток на генетицине и пуромицине позволяет отобрать клетки, содержащие в геноме обе конструкции (фиг. 12), для краткости полученную линию назвали линией LCL_iAML/ETO.To integrate elements of the CRISPR / Cas system and the Tet-On system into the cell genome, all elements were assembled into two cassettes comprising two plasmids. One cassette contained the Cas9 gene under the TRE promoter, the genes of two guiding RNAs, and the puromycin selective antibiotic resistance gene. The second cassette included the trans activator gene under the constitutive promoter and the antibiotic resistance gene neomycin (geniticin). To increase the likelihood of these cassettes being inserted into the genome, we chose a strategy for integrating transgenes by the mechanism of homologous recombination. The inserted cassettes were part of plasmid vectors and were surrounded by shoulders of homology to a specific part of the genome. The AAVS1 locus, which is located inside the first intron of the PPP1R12C gene on chromosome 19, was used as such a place in the genome. This locus was called so because the AAV virus was integrated into it in vitro, although in vivo this is not the site of the preferred integration of this virus. One way or another, it was shown that transgenes inserted at this locus exhibit stable expression, which is why it is often used as a place for integration into transgenic genomes (“Safe harbor”) (Sadelain, 2011). Simultaneously with plasmids carrying integrable cassettes, LCL_ was transfected with plasmids encoding the subunits of TALEN nuclease, which introduced a gap at this locus. The choice of TALEN nucleases instead of the simpler CRISPR / Cas system in this case was determined by the fact that the genes of the guiding RNAs to the AML1 and ETO genes, which are part of integrable cassettes, are located under the constitutive hU6 promoter (snRNA promoter for RNA polymerase III). And the appearance in the cell of plasmids constitutively expressing Cas9 would lead to premature ruptures at the AML1 and ETO loci and to undesirable chromosome rearrangements even at the stage of obtaining the cell line. The scheme of integration of the cassette into the genome by the mechanism of homologous recombination is shown in FIG. 10. The choice of the strategy for creating the line was also due to the fact that there already existed plasmid vectors containing almost all the necessary elements of the system. All we had to do was insert the genes of the guiding RNAs that we selected into the Puro_Cas9 donor vector, insert them into the phU6-gRNA_ plasmids, and verify them using the ENIT method. Obtaining the final vector Puro_Cas9 + gRNA_AML1_ETO is described in the section "Insertion of gene RNA guides in the plasmid Puro_Cas9 donor". To obtain our cell model, we used the LCL culture, since it is a convenient line of human leukocytes in work. So, we transfected the cells of this culture simultaneously with four plasmids: Puro_Cas9 + gRNA_AML1_ETO, AAVS1-M2rtTA (# 60843 Addgene, USA) and two plasmids containing the TALEN nuclease subunit genes, which introduces a gap at the AAVS1: TALENL site (# 59025 Addgene ", USA) and TALENR (# 59026," Addgene ", USA) (Fig. 11). All plasmids were transfected by electroporation according to the Jurkat protocol using a Gene Pulser Xcell device (Bio-Rad Laboratories, USA). For electroporation, 2.5 μg of TALEN_L and TALEN_R plasmids were used, and 2.3 μg of AAVS1-M2rtTA and Cas9 + gRNA_AML1_ETO plasmids were used. After plasmids enter the cell, transient expression begins, and TALEN nuclease begins to accumulate, which introduces a gap in the AAVS1 loci on both homologous chromosomes. As a result of repair by the mechanism of homologous recombination, cassettes surrounded by homology shoulders will be built into the gap. In some cases, a cassette from the Puro_Cas9 + gRNA_AML1_ETO plasmid containing the guiding RNA genes gRNA_AML1 and gRNA_ETO, a Cas9 nuclease gene and a puromycin resistance gene, and a cassette from the A-AVTA1 transcriptid plasmid gene is inserted into one homologous chromosome of the cell TA and the gene for resistance to geneticin. Selection of transfected cells on geneticin and puromycin allows selection of cells containing both constructs in the genome (Fig. 12); for brevity, the resulting line was called the LCL_iAML / ETO line.

--->--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙLIST OF SEQUENCES

<110> Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" (МГУ)<110> Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education "Moscow State University named after MV Lomonosov" (Moscow State University)

<120> ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ПОИСКА ПРЕПАРАТОВ, СНИЖАЮЩИХ РИСК ВОЗНИКНОВЕНИЯ ВТОРИЧНЫХ ЛЕЙКОЗОВ, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ<120> TEST SYSTEM FOR SEARCHING FOR DRUGS REDUCING THE RISK OF SECONDARY LEUKOSIS, METHOD OF ITS PRODUCTION AND APPLICATION

<160> SEQ ID NО:1<160> SEQ ID NO: 1

<210> 1<210> 1

<211> 20<211> 20

<212> AML<212> AML

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<400> 1<400> 1

1 GACTCCCCCA TGTACCCCTA1 GACTCCCCCA TGTACCCCTA

<160> SEQ ID NО:2<160> SEQ ID NO: 2

<210> 2<210> 2

<211> 20<211> 20

<212> ETO<212> ETO

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<400> 2<400> 2

1 GATGTAAGAG GAAGCAGCTT1 GATGTAAGAG GAAGCAGCTT

<160> SEQ ID NО:3<160> SEQ ID NO: 3

<210> 3<210> 3

<211> 20<211> 20

<212> AML_f1<212> AML_f1

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<400> 3<400> 3

1 TGGGGAAGCT CACCAGATAG1 TGGGGAAGCT CACCAGATAG

<160> SEQ ID NО:4<160> SEQ ID NO: 4

<210> 4<210> 4

<211> 20<211> 20

<212> ETO_f1<212> ETO_f1

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<400> 4<400> 4

1 TTGGGACACC TAGGAGTGGT1 TTGGGACACC TAGGAGTGGT

<160> SEQ ID NО:5<160> SEQ ID NO: 5

<210> 5<210> 5

<211> 24<211> 24

<212> Myc_f <212> myc_f

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<400> 5<400> 5

1 CCAGTAACTC CTCTTTCTTC GGAC1 CCAGTAACTC CTCTTTCTTC GGAC

<160> SEQ ID NО:6<160> SEQ ID NO: 6

<210> 6<210> 6

<211> 22<211> 22

<212> Myc_r<212> Myc_r

<213> Artificial sequence<213> Artificial sequence

<400> 6<400> 6

1 CGCTATGCTG GATTTTGCTG CA1 CGCTATGCTG GATTTTGCTG CA

<---<---

Claims

1. A test system for studying the effect of a drug used in chemotherapy on the likelihood of secondary leukemia, which is human lymphoblastoid cells (LCL) RPMI 8866, the genome of which contains a genetic construct that includes genes for systems that make double-stranded breaks in cell chromosomes at loci, which are used as Cas9 endonuclease and guiding RNAs between which there is a leukogenic chromosomal rearrangement, as well as TA transcription activator genes and selective marker genes While introducing genes directed double-stranded breaks are under the control of an inducible promoter transactivator TA, and as the locus, which occurs between leykozogennaya chromosomal rearrangement, rearrangement between genes used AML1 and ETO.

2. The test system according to claim 1, characterized in that as a mammalian cell line, cells are used whose division rate is at least one division in 2-3 days and whose genome has been studied so that it is possible to select nucleases recognizing loci, between which chromosomal rearrangements are formed.

3. The test system according to claim 1, characterized in that the genes for antibiotic resistance to puromycin and neomycin are used as selective markers.

4. The test system according to claim 1, characterized in that the genes of the system for the directed introduction of double-stranded breaks are integrated into the genome of the cells of the initial line at the locus, ensuring their stable expression.

5. The test system according to claim 1, characterized in that the genes of the system of directed insertion of double-stranded breaks are integrated in the region of the first intron of the PPP1R12C gene located on chromosome 19.

6. A method of obtaining a test system according to claim 1, characterized in that the genetic construct (1) is created, including the genes of the guiding RNAs, the Cas9 nuclease gene located under the inducible TRE promoter, and the puromycin resistance gene; and a genetic construct (2), including the TA transcription activator gene and the geneticin resistance gene, then the resulting genetic constructs are transfected into cells of the original cell line, followed by selection of cells containing the genetic constructs.

7. The method according to p. 6, characterized in that the use of hydraulic RNA gRNA _AML1 and gRNA_ETO.

8. The method according to p. 6, characterized in that the creation of the genetic construct (1) is carried out by amplification of sections of vectors encoding hydraulic RNAs and sequences that facilitate their integration into the genome of transfected cells, by embedding the obtained sections in a plasmid containing the Cas9 gene under the inducible promoter TRE and puromycin resistance gene.

9. The method according to p. 8, characterized in that as sequences that facilitate embedding, using sections that repeat sequences of length from 100 to 1000 nucleotides on each side of the break point in the genome.

10. The method according to p. 6, characterized in that the transfection of the obtained genetic constructs in the cells of the original cell line is carried out by electroporation.

11. The method according to p. 6, characterized in that the selection of cells is carried out by growing cells in media with selective antibiotics at concentrations at which cells that do not carry resistance genes for these antibiotics die, but at which cells that carry selective markers survive.

12. The method of studying the effect of the drug used in chemotherapy on the likelihood of secondary leukemia using the test system according to claim 1, characterized in that the test drug is added to a suspension containing at least 2 million cells of the test system a concentration not exceeding the IC50 for this drug, and doxycycline in a concentration sufficient to trigger Cas9 expression, incubate the resulting mixture, followed by quantitative PCR and analysis of the results, and conclude that and the likelihood of secondary leukemia is made by reducing the number of translocations obtained compared to the number of translocations in the control sample.

13. The method according to p. 12, characterized in that the concentration of doxycycline is from 0.1 to 1 μg / ml

14. The method according to p. 12, characterized in that the quantitative PCR is carried out using primers ETO_f1-AML_f1 and MYC_f-MYC_r.

15. The method according to p. 14, characterized in that the use of primers with sequences of SEQ ID NO: 3-6.

16. The method according to p. 14, characterized in that the quantitative PCR is carried out according to the program: polymerase activation: 95 ° C, 10 min; DNA denaturation: 95 ° C, 20 sec; primer annealing: 60 ° C, 1 min; elongation stage: 72 ° С, 30 sec, 42 cycles in total, then melting curve: 55-95 ° С, step 0.5 ° С in 5 sec.

17. The method according to p. 14, characterized in that the analysis of the PCR results is carried out by counting the number of translocations, the obtained values of the threshold cycle of amplification of the DNA sample with the corresponding pair of primers (Ct) are substituted into the formula (1):

where F is the frequency of AML / ETO translocations, normalized to the number of amplicon of primers Myc_f and Myc_r, Emus is the efficiency of DNA amplification from a pair of primers Myc_f and Myc_r, Eaml / eto is the efficiency of DNA amplification from a pair of primers ETO_f1 and AML_f1, which is determined once in a preliminary an experiment under conditions that maximally correspond to the conditions for further work; <Ct> _i is the average of three replicates of the threshold cycle of amplification of a DNA sample with the corresponding pair of primers, where i means Myc or AML1 / ETO.

18. The method according to p. 14, characterized in that the comparison of the data obtained by the studied samples and the control is done on the basis of multiple comparisons of experimental samples with the control using the non-parametric Dunnet test.