RU2718274C1

RU2718274C1 - Method for creating an experimental model of colonic hypoganglis disease

Info

Publication number: RU2718274C1
Application number: RU2019115281A
Authority: RU
Inventors: Евгения Сергеевна Пименова; Наталья Сергеевна Корчагина; Дарья Дмитриевна Зюзько; Маргарита Степановна Саакян; Григорий Алексеевич Королев
Priority date: 2019-05-20
Filing date: 2019-05-20
Publication date: 2020-04-01

Abstract

FIELD: medicine.SUBSTANCE: invention refers to medicine, namely pediatric surgery. Abdominal cavity is opened. Descending colonic segment is separated from mesentery blood vessels. Then a segment of a descending colon of length 2 cm is separated with marginal vessels of the left colonic artery, blood supplying the given intestinal segment, with their subsequent ligation for exclusion of mesenteric blood supply on the given segment with preservation of an intramural blood supply. Abdominal cavity is closed. In period from 9 to 62 days after ligation, a hypogangloid model is obtained in a segment of a descending colon.EFFECT: method enables reproducing a model of colonic hypoglyphosis for further study of anatomical and physiological features of the intestine and developing methods of treating the given condition.1 cl, 2 ex, 1 dwg

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к области медицины, а именно детской хирургии, и может быть использовано для фундаментальных исследований, диагностики и лечения гипоганлиоза толстой кишки.The invention relates to medicine, namely to pediatric surgery, and can be used for basic research, diagnosis and treatment of colon hypoganliosis.

Уровень техникиState of the art

Гипоганглиоз кишечника до настоящего времени не до конца изученное состояние [Martucciello, G., Prato, А. P., Puri, P., Holschneider, А. М, Meier-Ruge, W., Jasonni, V., Grosfeld, J. L. (2005). Controversies concerning diagnostic guidelines for anomalies of the enteric nervous system: a report from the fourth International Symposium on Hirschsprung's disease and related neurocristopathies. Journal of pediatric surgery, 4#(10), 1527-1531]. Считается, что гипоганглиоз может быть как врожденным, так и приобретенным заболеванием, которое может осложняться частичной кишечной непроходимостью [Taguchi, Т., Masumoto, K., Ieiri, S., Nakatsuji, Т., & Akiyoshi, J. (2006). New classification of hypoganglionosis: congenital and acquired hypoganglionosis. Journal of pediatric surgery, 41(12), 2046-2051].Intestinal hypogangliosis has not yet been fully studied [Martucciello, G., Prato, A. P., Puri, P., Holschneider, A. M, Meier-Ruge, W., Jasonni, V., Grosfeld, JL ( 2005). Controversies concerning diagnostic guidelines for anomalies of the enteric nervous system: a report from the fourth International Symposium on Hirschsprung's disease and related neurocristopathies. Journal of pediatric surgery, 4 # (10), 1527-1531]. It is believed that hypogangliosis can be both congenital and acquired disease, which can be complicated by partial intestinal obstruction [Taguchi, T., Masumoto, K., Ieiri, S., Nakatsuji, T., & Akiyoshi, J. (2006). New classification of hypoganglionosis: congenital and acquired hypoganglionosis. Journal of pediatric surgery, 41 (12), 2046-2051].

Создание экспериментальной модели гипоганглиоза толстой кишки является актуальной задачей, которая позволит изучать анатомические и функциональные особенности кишечника при гипоганглиозе, и будет способствовать разработке возможных способов лечения данного заболевания.The creation of an experimental model of colon hypogangliosis is an urgent task that will allow us to study the anatomical and functional features of the intestine with hypogangliosis, and will contribute to the development of possible ways to treat this disease.

Проведение исследования уровня техники по энтеральной нервной системе и хронической мезентериальной ишемии позволило выявить следующие источники информации, описывающие методы создания моделей аганглиоза и гипоганглиоза.Conducting a study of the prior art on the enteric nervous system and chronic mesenteric ischemia revealed the following sources of information that describe methods for creating models of agangliosis and hypogangliosis.

Из уровня техники известен способ экспериментального воспроизведения аганглиоза толстой кишки (Sato, A., Yamamoto, М., Imamura, K., Kashiki, Y., Kunieda, Т., & Sakata, K. (1978). Pathophysiology of aganglionic colon and anorectum: an experimental study on aganglionosis produced by a new method in the rat. Journal of pediatric surgery, 13(4), 399-405.) посредством аппликации препарата бензалкония хлорида на стенку кишки.The prior art method for experimental reproduction of colon agangliosis (Sato, A., Yamamoto, M., Imamura, K., Kashiki, Y., Kunieda, T., & Sakata, K. (1978). Pathophysiology of aganglionic colon and anorectum: an experimental study on aganglionosis produced by a new method in the rat. Journal of pediatric surgery, 13 (4), 399-405.) by applying benzalkonium chloride to the intestinal wall.

Однако химическое воздействие препаратом бензалкония хлорида на стенку кишки приводит к тотальной гибели всех энтеральных ганглиев, а не к снижению их количества, как при гипоганглиозе.However, the chemical effect of benzalkonium chloride on the intestinal wall leads to the total death of all enteral ganglia, and not to a decrease in their number, as in hypogangliosis.

Из уровня техники известен также способ экспериментального воспроизведения гипоганглиоза с помощью аппликации раствором бензалкония хлорида определенной концентрации (0,1%) в течение определенного времени (30 минут) (Yu, Н., Pan, W., Wang, Н., & Gao, Y. (2016). A Time-Limited and Partially Reversible Model of Hypoganglionosis Induced by Benzalkonium Chloride Treatment. Neurochemical research, 41(5), 1138-1144)The prior art also knows a method for experimentally reproducing hypogangliosis by applying a solution of benzalkonium chloride of a certain concentration (0.1%) for a certain time (30 minutes) (Yu, N., Pan, W., Wang, N., & Gao, Y. (2016). A Time-Limited and Partially Reversible Model of Hypoganglionosis Induced by Benzalkonium Chloride Treatment. Neurochemical research, 41 (5), 1138-1144)

Однако, известный способ представляет собой воздействие поверхностно-активного вещества на кишку, что не может наблюдаться в природных условиях, в то время как нарушение кровоснабжения кишечника - патологический процесс, который сопровождает ряд заболеваний и может считаться более биологически обоснованным для создания модели гипоганглиоза.However, the known method is the effect of a surfactant on the intestine, which cannot be observed under natural conditions, while the violation of the blood supply to the intestine is a pathological process that accompanies a number of diseases and can be considered more biologically justified to create a model of hypogangliosis.

При этом из уровня техники известен способ создания модели хронической ишемии толстой кишки 1, 2 и 3 степени (В.И. Нефедов, И.С. Евлахова, патент на изобретение №2291496) (прототип), который воспроизводят следующим образом. Проводят премедикацию биологических моделей, дают интубационный наркоз, вскрывают брюшную полость и производят выделение краевого сосуда толстой кишки на протяжении 5 см. Последовательно, полипропиленовой нитью, перевязывают 2 через 2 прямые ветви краевого сосуда толстой кишки на протяжении 5 см, при этом объемный кровоток уменьшается на 20-30% от исходного и соответствует 1-й степени ишемии. Для создания 2-й степени ишемии полипропиленовой нитью перевязывают 2 через 1 прямые ветви краевого сосуда толстой кишки на протяжении 5 см. Для создания 3-й степени ишемии последовательно, полипропиленовой нитью, перевязывают 4 через 2 прямые ветви краевого сосуда толстой кишки на протяжении 5 см. После чего кишку укладывают на место и производят послойное ушивание раны.Moreover, from the prior art, a method is known for creating a model of chronic colon ischemia of the 1st, 2nd and 3rd degree (V.I. Nefedov, I.S. Yevlakhova, invention patent No. 2291496) (prototype), which is reproduced as follows. Biological models are sedated, intubation anesthesia is given, the abdominal cavity is opened and the marginal vessel of the colon is excreted for 5 cm. Consistently, with polypropylene suture, 2 are ligated through 2 straight branches of the rectal colon vessel for 5 cm, while the volumetric blood flow decreases 20-30% of the original and corresponds to the 1st degree of ischemia. To create the 2nd degree of ischemia, 2 straight strands are ligated with polypropylene filament through 5 cm through 5 cm. To create the 3rd degree of ischemia, 4 straight strands of rectal colon are ligated through polypropylene filament 4 over 2 cm through 5 straight strands After which the intestine is laid in place and layered wound closure is performed.

Однако известный способ направлен на воспроизведение мезентериальной ишемии различной степени тяжести путем лигирования различных сосудов брыжейки и не отражает состояние энтеральной нервной системы стенки кишки, лишенной кровоснабжения, не дает информацию о состоянии ганглиев толстой кишки.However, the known method is aimed at reproducing mesenteric ischemia of varying severity by ligation of various vessels of the mesentery and does not reflect the state of the enteric nervous system of the intestinal wall, lacking blood supply, does not provide information about the condition of the ganglia of the colon.

Раскрытие изобретенияDisclosure of Invention

Технической проблемой, решаемой изобретением, является создание модели экспериментального гипоганглиоза толстой кишки.The technical problem solved by the invention is the creation of a model of experimental hypogangliosis of the colon.

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является возможность воспроизведения модели гипоганглиоза толстой кишки для дальнейшего изучения анатомо-физиологических особенностей кишечника и разработки методов лечения данного состояния.The technical result to which the claimed invention is directed is the ability to reproduce a model of colon hypogangliosis for further study of the anatomical and physiological characteristics of the intestine and the development of treatment methods for this condition.

Технический результат достигается за счет разработки способа создания экспериментальной модели гипоганглиоза толстой кишки у лабораторного животного, включающего вскрытие брюшной полости, выделение участка нисходящей ободочной кишки с кровоснабжающими сосудами брыжейки, выделение сегмента нисходящей ободочной кишки длиной 2 см с краевыми сосудами левой ободочной артерии, кровоснабжающими данный сегмент кишки с последующим их лигированием для исключения мезентериального кровоснабжения на данном сегменте с сохранением интрамурального кровоснабжения, ушивание полости с последующим получением в период от 9 до 62 дней после лигирования модели гипоганглиоза в сегменте нисходящей ободочной кишки.The technical result is achieved by developing a method for creating an experimental model of colon hypogangliosis in a laboratory animal, including opening the abdominal cavity, isolating a section of the descending colon with blood supply vessels of the mesentery, isolating a segment of the descending colon 2 cm long with marginal vessels of the left colon artery supplying this segment intestines with their subsequent ligation to exclude mesenteric blood supply in this segment while maintaining intramural Nogo perfusion, suturing cavity followed by obtaining a period of 9 to 62 days after ligation model gipoganglioza segment descending colon.

Ранее известный способ создания ишемии толстой кишки был направлен на создание ишемии различной степени тяжести. Перевязка сосудов с чередованием позволяла сохранять мезентериальный кровоток кишки за счет нелигированных сосудов. Проведенные морфологические исследования свидетельствовали о различной степени выраженности деструктивных процессов, развивающихся в ишемизированном участке, при этом морфологическое исследование энтеральных ганглиев не было проведено. В предлагаемом способе создания гипоганлиоза доказано, что перевязка двух соседних конечных ветвей (краевых сосудов) левой ободочной артерии, т.е. полная блокада магистрального кровотока в участке нисходящей ободочной кишки длиной 2 см, ведет не к деструкции и некрозу ишемизированного сегмента, а к уменьшению количества ганглиев данного участка (гипоганглиозу в определенные сроки после операции). При увеличении площади лигирования более 2 см отмечены некротические изменения в слизистой оболочке толстой кишки, что может привести к перфорации и перитониту.A previously known method for creating colon ischemia was aimed at creating ischemia of varying severity. Bandaging of vessels with alternation allowed mesenteric blood flow of the intestine to be preserved due to non-ligated vessels. Conducted morphological studies showed varying degrees of severity of destructive processes developing in the ischemic site, while a morphological study of the enteric ganglia was not conducted. In the proposed method for creating hypoganliosis, it is proved that the ligation of two adjacent terminal branches (marginal vessels) of the left colon artery, i.e. complete blockage of the main blood flow in the section of the descending colon 2 cm long does not lead to destruction and necrosis of the ischemic segment, but to a decrease in the number of ganglia of this section (hypogangliosis at certain times after the operation). With an increase in the ligation area of more than 2 cm, necrotic changes in the mucous membrane of the colon are noted, which can lead to perforation and peritonitis.

Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings

Изобретение поясняется иллюстрацией (фиг.), на которой представлен основной этап операции. Позициями на фиг.обозначены: 1 - нисходящая ободочная кишка, 2 - левая ободочная артерия и ее ветви (краевые сосуды), 3 - места лигирования краевых сосудов.The invention is illustrated by illustration (Fig.), Which presents the main stage of the operation. The positions in Fig. Indicate: 1 - the descending colon, 2 - the left colon artery and its branches (marginal vessels), 3 - places of ligation of the marginal vessels.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Для воспроизведения экспериментальной модели гипоганглиоза используют опытное животное (например, беспородного половозрелого самца крысы) массой 400-700 граммов. Содержание животных необходимо осуществлять в соответствующих условиях, основываясь на документах «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» и законодательстве Российской Федерации, в свободном доступе к воде и пищи. За 6 часов до операции соблюдают голодный и безводный промежутки.To reproduce the experimental model of hypogangliosis, an experimental animal (for example, a purebred sexually mature male rat) weighing 400-700 grams is used. Keeping animals must be carried out in appropriate conditions, based on the documents of the "European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes" and the legislation of the Russian Federation, in free access to water and food. 6 hours before surgery, keep hungry and anhydrous intervals.

Общий наркоз проводят комбинированным препаратом (тилетамин + золаземап) в дозе 15 мг/кг внутримышечно. После введения животного в наркоз проводят лапаротомию, выделяют участок нисходящей ободочной кишки с кровоснабжающими сосудами брыжейки. На данном участке выделяют сегмент длиной 2 см с краевыми сосудами левой ободочной артерии, кровоснабжающими данный сегмент кишки, и проводят лигирование (перевязку) краевых сосудов в непосредственной близости к стенке нисходящей ободочной кишки, например, посредством перевязки синтетической сополимерной нитью (фиг.), таким образом, лишая сегмент толстой кишки длиной 2 см магистрального (мезентериального) кровоснабжения. При этом данный сегмент, лишенный магистрального кровотока, продолжает кровоснабжаться интрамуральными сосудами. Затем брюшную полость ушивают. После операции в сроки от 9 до 62 суток развивается гипоганглиоз сегмента нисходящей ободочной кишки.General anesthesia is carried out with a combined drug (tiletamine + zolazemap) at a dose of 15 mg / kg intramuscularly. After the animal is anesthetized, a laparotomy is performed, a section of the descending colon with blood vessels of the mesentery is isolated. In this area, a 2 cm long segment with marginal vessels of the left colon artery supplying this segment of the intestine is isolated, and ligation (ligation) of the marginal vessels is carried out in close proximity to the wall of the descending colon, for example, by ligation with a synthetic copolymer thread (Fig.), Such thus, depriving a segment of the colon 2 cm long of the main (mesenteric) blood supply. At the same time, this segment, deprived of the main blood flow, continues to be supplied with intramural vessels. Then the abdominal cavity is sutured. After surgery, from 9 to 62 days later, hypogangliosis of the descending colon segment develops.

Предлагаемый способ прошел апробацию на лабораторных животных.The proposed method has been tested on laboratory animals.

Операции по лигированию краевых сосудов левой ободочной артерии выполнены 10 крысам в условиях вивария Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. В дальнейшем животные находились под наблюдением. У всех крыс отмечено нарушение работы кишечника после операции - задержка стула или разжиженный стул. В различные сроки после первой операции (7, 9, 12, 14, 21, 42, 53, 62 сутки) выполнена повторная лапаротомия, на которой было выявлено, что большинство крыс имели признаки частичной кишечной непроходимости (отсутствие кишечного содержимого в зоне ишемии и скопление его в вышележащих отделах, чаще с их дилатацией). Выполнена биопсия двух участков толстой кишки длиной 2 см. Первый участок - сегмент кишки, ранее лишенный кровоснабжения, второй участок - сегмент поперечно-ободочной кишки выше зоны ишемии. Все препараты отмыты и фиксированы в 40% растворе формальдегида, в дальнейшем рутинно окрашены гематоксилин-эозином. При микроскопии рассчитано количество ганглиев на 5 мм в двух участках толстой кишки. Выявлено, что в зоне ишемии имеет место гипоганглиоз - снижено количество энтеральных ганглиев по сравнению с участком здоровой кишки (различия статистически значимы).Ligation operations of the marginal vessels of the left colon artery were performed in 10 rats under vivarium conditions of the First MGMU named after THEM. Sechenov. Subsequently, the animals were under observation. All rats showed disruption of the intestines after surgery - stool retention or liquefied stools. At various times after the first operation (7, 9, 12, 14, 21, 42, 53, 62 days), a repeated laparotomy was performed, on which it was revealed that most rats had signs of partial intestinal obstruction (lack of intestinal contents in the ischemic zone and accumulation it in the overlying departments, often with their dilatation). A biopsy of two sections of the colon 2 cm long was performed. The first section was a segment of the intestine previously deprived of blood supply, the second section was a segment of the transverse colon above the ischemic zone. All preparations were washed and fixed in a 40% formaldehyde solution, subsequently routinely stained with hematoxylin-eosin. Microscopy calculated the number of ganglia per 5 mm in two sections of the colon. It was revealed that hypogangliosis takes place in the ischemic zone - the number of enteral ganglia is reduced in comparison with the area of a healthy intestine (differences are statistically significant).

Таким образом, проведенные исследования показали, что при осуществлении заявляемого решения в сроки от 9 до 62 дней после лигирования концевых ветвей левой ободочной артерии у крыс развился гипоганглиоз в сегменте нисходящей ободочной кишки, лишенном мезентериального кровоснабжения.Thus, the studies showed that in the implementation of the proposed solution from 9 to 62 days after ligation of the terminal branches of the left colon artery, rats developed hypogangliosis in the segment of the descending colon, devoid of mesenteric blood supply.

Изобретение иллюстрировано следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1.Example 1

Крысе весом 560 граммов провели общий наркоз комбинированным препаратом (тилетамин + золазепам), выполнили лапаротомию, выделили и лигировали синтетической сополимерной нитью (со сроком биодеградации не менее 30 дней) краевые сосуды левой ободочной артерии, кровоснабжающие нисходящую ободочную кишку на протяжении 2 см, таким образом, лишив участок толстой кишки длиной 2 см магистрального кровоснабжения, сохраняя при этом интрамуральный кровоток. Провели глухое ушивание брюшной полости. Через 9 дней с применением аналогичного наркоза выполнили повторную лапаротомию, на которой отмечены признаки частичной непроходимости кишечника - дилатация кишечных петель выше зоны ишемии и скопление в них кишечного содержимого. Выполнили биопсию двух участков толстой кишки - в зоне ишемии и вышележащих отделов поперечно-ободочной кишки. Микроскопическое исследование показало, что количество ганглиев на 5 мм составило 18,5, в вышележащих отделах - 21.A rat weighing 560 grams underwent general anesthesia with a combined preparation (tiletamine + zolazepam), performed a laparotomy, isolated and ligated with synthetic copolymer thread (with a biodegradation period of at least 30 days), the marginal vessels of the left colon artery supplying the descending colon for 2 cm, thus , depriving a section of the colon 2 cm long of the main blood supply, while maintaining intramural blood flow. We performed deaf abdominal suturing. After 9 days with the use of similar anesthesia, a repeated laparotomy was performed, which showed signs of partial intestinal obstruction - dilatation of intestinal loops above the ischemic zone and accumulation of intestinal contents in them. A biopsy of two sections of the colon was performed - in the area of ischemia and overlying sections of the transverse colon. Microscopic examination showed that the number of ganglia per 5 mm was 18.5, in the overlying departments - 21.

Пример 2.Example 2

Крысе весом 530 граммов провели общий наркоз комбинированным препаратом (тилетамин + золазепам), выполнили лапаротомию, выделили и лигировали краевые сосуды левой ободочной артерии, кровоснабжающие нисходящую ободочную кишку на протяжении 2 см. Провели глухое ушивание брюшной полости. Через 56 дней с применением аналогичного наркоза выполнили повторную лапаротомию, на которой отмечены признаки частичной непроходимости кишечника - дилатация кишечных петель выше зоны ишемии и скопление в них кишечного содержимого. Выполняли биопсию двух участков толстой кишки - в зоне ишемии и вышележащих отделов поперечно-ободочной кишки. Микроскопическое исследование показало, что количество ганглиев на 5 мм составило 10,5, в вышележащих отделах - 27.A rat weighing 530 grams underwent general anesthesia with a combined drug (tiletamine + zolazepam), performed a laparotomy, isolated and ligated the marginal vessels of the left colon artery, supplying the descending colon through the bloodstream for 2 cm. Deaf abdominal suturing was performed. After 56 days, with the use of similar anesthesia, a repeated laparotomy was performed, which showed signs of partial intestinal obstruction - dilatation of intestinal loops above the ischemic zone and accumulation of intestinal contents in them. A biopsy of two sections of the colon was performed - in the area of ischemia and overlying sections of the transverse colon. Microscopic examination showed that the number of ganglia per 5 mm was 10.5, in the overlying departments - 27.

При сравнении количества ганглиев в зоне ишемии и в здоровой кишке у 10 опытных животных выявлено, что различия статистически значимы.When comparing the number of ganglia in the ischemic zone and in a healthy gut in 10 experimental animals, it was found that the differences are statistically significant.

Применение описанной экспериментальной модели гипоганглиоза толстой кишки позволяет изучать особенности анатомических и функциональных изменения кишечника при гипоганглиозе, а также разрабатывать возможные варианты лечения заболевания.The use of the described experimental model of colon hypogangliosis allows you to study the features of the anatomical and functional changes in the intestine with hypogangliosis, as well as develop possible treatment options for the disease.

Claims

A method for creating an experimental model of colon hypogangliosis in a laboratory animal, including opening the abdominal cavity, isolating a section of the descending colon with blood vessels of the mesentery, isolating a segment of the descending colon of 2 cm in length with marginal vessels of the left colon artery supplying this segment of the intestine, followed by to exclude mesenteric blood supply in this segment while maintaining intramural blood supply, cavity suturing with subsequent Scientists in the period between 9 and 62 days after ligation gipoganglioza models in the segment of the descending colon.