RU2716999C1 - Способ получения рекомбинантных аденоассоциированных вирусов для использования в генной терапии - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. С целью экспрессии трансгена исключительно в клетках мышечной ткани для создания аденоассоциированного вируса используют экспрессирующий вектор, содержащий мышцеспецифический промотор С5-12, повторяющиеся последовательности ДНК, комплементарные последовательностям плечей микроРНК mir-142 и mir-499, и упаковочную плазмиду, которая содержит для экспрессии белка VP3 вируса промотор C5-tataless и ген вирусного белка VP3 субтипа 2 человека, который содержит дополнительную аминокислотную последовательность TGASSLNIAGLS. Изобретение обеспечивает получение вирусов для узконаправленной и безопасной экспрессии целевых белков в мышечной ткани. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 пр.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и генной терапии, в частности, к получению рекомбинантных аденоассоциированных вирусов для экспрессии генов в мышечной ткани млекопитающих.

Последние годы характеризуются развитием исследований в области генной терапии. В результате уже созданы и разрешены к применению в медицине четыре геннотерапевтических препарата на основе вирусов и плазмидных ДНК, в том числе Glybera, генотерапевтический препарат против редкого наследственного заболевания - семейного дефицита фермента липопротеинлипазы, созданный на основе аденоассоциированного вируса 1 типа и разрешенный к применению в Евросоюзе.

Аденоассоциированные вирусы (ААВ) являются безоболочечными вирусами, содержащими одноцепочечную ДНК. ААВ могут реплицироваться только в присутствии других вирусов, называемых вирусами-помощниками (аденовируса или герпесвирусов). Для производства рекомбинантного человеческого ААВ без использования вируса-помощника широко применяется так называемая трехплазмидная система, в которой культивируемые клетки одновременно трансфецируются тремя плазмидами: плазмидой-помощницей, упаковывающей плазмидой и экспрессирующим вектором. Большинство аденовирусных генов (Е2А, Е4 и VA-PHK), необходимых для создания рекомбинантных частиц ААВ, закодировано в плазмиде-помощнице. Белок Rep, необходимый для репликации вирусной ДНК, и три белка оболочки аденоассоциированного вируса кодируются областью Rep-Cap расположенной в упаковывающей плазмиде. Экспрессирующий вектор содержит ген, кодирующий целевой белок контролем соответствующего промотора, а также инвертированные концевые повторы, необходимые для упаковки данного вектора в вирусные капсиды. После трансфекции клеток тремя одновременно плазмидой-помощницей, упаковывающей плазмидой и экспрессионным вектором, в клетках происходит продукция рекомбинантного аденоассоциированного вируса, который содержит ДНК экспрессионного вектора. Рекомбинантный аденоассоциированный вирус очищают, концентрируют и используют, в частности, для генной терапии млекопитающих (Mingozzi Fl, High КА.: Therapeutic in vivo gene transfer to genetic disease using AAV: progress and challenges, Nature Reviews Genetics, 2011, 12 (5), стр.: 341-355).

Введенный в организм рекомбинантный ААВ проникает в клетки-мишени, в которых он может сохраняться в течение длительного времени - до 10 лет (Buchlis G., Podsakoff G.M., Radu A., Hawk S.M., Flake A.W., Mingozzi F., High K.A.: Factor IX expression in skeletal muscle of a severe hemophilia В patient 10 years after AAV-mediated gene transfer, Blood., 2012 Mar 29, 119 (13); стр: 3038-3041, doi: 10.1182/blood-2011-09-382317). Ряд авторов считают, что аденоассоциированный вирус не вызывает ни симптомов заболеваний, ни каких-либо паталогических процессов у лабораторных животных и человека (Lisowski L., Тау S.S., Alexander Y.E.: Adeno-associated virus serotypes for gene therapeutics Current Opinion in Pharmacology, 2015, 24 (1): стр. 59-67).

Однако, несмотря на наличие первых разрешенных к применению препаратов, в генной терапии имеется ряд проблем. В частности, серьезной проблемой является неконтролируемая экспрессия трансгена в нецелевых тканях, которая может привести к серьезным побочным эффектам. Так, в животной модели мышечной дистрофии, связанной с дефицитом внутриклеточной протеазы кальпаин-3, неконтролируемая экспрессия трансгена в сердечной мышце привела к развитию серьезного фиброза сердца и смерти животных (Roudaut С, Le Roy F., Suel L., Poupiot J., Charton K., Bartoli M., Richard I.: Restriction of calpain 3 expression to the skeletal muscle prevents cardiac toxicity and corrects pathology in a murine model of limb-girdle muscular dystrophy, Circulation, 2013, 128 (10), стр.: 1094-1104). При конститутивном синтезе эритропоэтина в организме мышей в течение 10 недель после введения генотерапевтического препарата наблюдалась смерть 70% животных (Johnston J., Tazelaar J., Rivera V.M., Clackson Т., Gao G.P., Wilson J.M.: Regulated expression of erythropoietin from an AAV vector safely improves the anemia of beta-thalassemia in a mouse model, Mol Ther., 2003 Apr, 7(4), стр. :493-497).

Перспективной тканью для экспрессии трансгенов является мышечная ткань, значительная по массе среди других тканей и органов и обладающая высоким потенциалом в отношении синтеза и секреции белков. Вместе с тем, необходимо репрессировать возможную даже незначительную экспрессию трансгенов в других органах и тканях, в частности, в клетках миокарда и в антигенпрезентирующих клетках иммунной системы.

Для направления рекомбинантного ААВ преимущественно в мышечные клетки было предложено использовать капсидные белки субтипов 1, 6, 7, 8, 9, обладающих тропностью к миоцитам. Однако, данные субтипы ААВ, помимо заражения мышечных клеток, способны к трансфекции клеток других органов и тканей (Wang D, Zhong Li, Nahid A.M., Gao G.: The potential of adeno-associated viral vectors for gene delivery to muscle tissue, Expert Opin DrugDeliv., 2014, 11(3), стр.: 345-364, doi:10.1517/17425247.2014.871258).

Для подавления экспрессии трансгенов в тех органах и тканях, где она нежелательна, можно использовать тканеспецифические микроРНК (миРНК) - малые некодирующие молекулы РНК длиной 18-25 нуклеотидов (в среднем 22), участвующие в подавлении активности генов. Являясь комплементарными к целевым матричным РНК, миРНК связываются с ними и образуют участки двуцепочечной РНК, что, посредством различных механизмов, приводит к разрушению матричных РНК и прекращению синтеза кодируемого белка. В частности, известно, что Mir-142 активна в клетках иммунной системы, a Mir-499 - в кардиомиоцитах (Majowicz А, Maczuga P, Kwikkers KL, van der Marel S, van Logtenstein R, Petry H, van Deventer SJ, Konstantinova P, Ferreira V.: Mir-142-3р target sequences reduce transgene-directed immunogenicity following intramuscular adeno-associated virus 1 vector-mediated gene delivery, J Gene Med., 2013 Jun-Jul; 15(6-7), стр. :219-232. doi: 10.1002/jgm.2712; Matkovich S.J., Hu Y., Dorn G.W.: Regulation of cardiac microRNAs by cardiac microRNAs, Circ Res., 2013; 113(1), стр.: 62-71).

Из уровня техники известна заявка США US 20160032319 А1, из которой известен рекомбинантный ААВ связанный с экспрессионными кассетами длиной до 4,7-5,0 тысяч пар нуклеотидов, применение которого уменьшает остаточные примеси плазмидной ДНК.

Известна заявка США US 20160068821 А1, относящаяся к выделенному химерному вирусу, содержащему белок бокавируса капсида и геном рекомбинантного адено-ассоциированного вируса (ААВ), изолированный rBoV, содержащий человеческий белок бокавируса капсида и рекомбинантный BoV геном.

Наиболее близким техническим решением к настоящему изобретению является решение, предложенное в международной заявке WO 2002063025 A3. Из заявки известно, что повышенная трансфекция рекомбинантными аденоассоциированными вирусами мышечных клеток достигается путем использования вирионов ААВ-1 и ААВ-6 субтипов, обладающих свойством предпочтительно трансфецировать мышечные клетки по сравнению с другими субтипами вируса. При введении с помощью таких векторов генов, кодирующих факторы VIII и IX свертываемости крови, наблюдался синтез данных факторов преимущественно мышечными клетками с дальнейшим их поступлением в кровоток. При этом, факторы свертываемости крови VIII и IX синтезировались в количествах, достаточных для демонстрации терапевтического эффекта на моделях экспериментальной гемофилии у животных. Однако, учитывая высокую вероятность трансфекции ААВ-1 и ААВ-6 миокарда и других органов, в которых экспрессия трансгенов может оказаться токсичной, для применения в медицинских целях необходимо создать вектора на основе аденоассоциированного вируса, обеспечивающие более высокую специфичность экспрессии трансгенов в мышечной ткани.

Целью настоящего изобретения является создание рекомбинантных аденоассоциированных вирусов для узконаправленной и безопасной экспрессии целевых белков в мышечной ткани.

Указанная цель достигается за счет того, что для продукции рекомбинантного аденоассоциированного вируса применяют упаковочный вектор и экспрессирующую плазмиду, содержащие следующий набор элементов:

- сильные мышеспецифические промоторы C5-tataless и С5-12 для обеспечения высокого уровня экспрессии, предпочтительно в мышечной ткани;

- последовательности, комплементарные плечам микроРНК, специфичные для антиген-презентирующих клеток, сердечной ткани, печени и некоторых других тканей, для подавления экспрессии трансгена в данных органах и тканях;

- последовательность, кодирующую измененный капсидный белок, обеспечивающий адресную доставку терапевтического аденоассоциированного вируса в клетки мышечной ткани (миоциты).

Экспрессионный вектор и упаковочный вектор по настоящему изобретению, после трансфекции культивируемых клеток совместно с плазмидой-помощницей, производят рекомбинантный

аденоассоциированный вирус с высокой тропностью к мышечной ткани, способный доставлять в клетки скелетной мускулатуры и экспрессировать в них трансгены. При этом обеспечивается подавление экспрессии трансгенов в других органах и тканях.

Изобретение иллюстрируется фигурами 1, 2, 3 и перечнем использованных последовательностей.

Ниже приведено краткое описание графических материалов:

На фиг. 1 представлена карта экспрессионной кассеты экспрессирующего вектора pER.

ITR - последовательность левого и правого инвертированного терминального повторов (ITR) ААВ;

С5-12 - последовательность мышцеспецифичного промотора С5-12;

PROTEIN - последовательность трансгена;

miR-142 5р и miR-142 3р - антисмысловые последовательности, комплементарные плечам микроРНК-142;

miR-499 3р и miR-499 3р - антисмысловые последовательности, комплементарные плечам микроРНК-499;

polyA - сигнал полиаденилирования и терминатор гена бета-глобина мыши.

На фиг. 2 представлена карта экспрессионной кассеты упаковочной плазмиды pRC.

С5 - последовательность мышцеспецифичного промотора C5-tataless;

REP - последовательность, кодирующая белок REP аденоассоциированного вируса;

САР - последовательность, кодирующая область САР аденоассоциированного вируса;

TGASSLNIAGLS - последовательность, кодирующая мышцеспеци-фический пептид TGASSLNIAGLS;

polyA - сигнал полиаденилирования и терминатор гена бета-глобина мыши.

На фиг. 3 представлен результат электрофореза к ДНК из различных органов крыс, трансфецированных рекомбинантным аденоассоциированным вирусом:

1, 2 - скелетные мышцы;

3 - сердце;

4 - мозг;

5 - легкие;

6 - селезенка;

7 - кишечник;

9, 10 - тимус;

11, 12 - скелетные мышцы;

8, 13 - маркеры ДНК.

Ниже приведены примеры осуществления изобретения.

Пример 1. Конструирование и синтез векторов.

1.1. Конструирование экспрессионного вектора pER.

При конструировании вектора для экспрессии целевых белков была создана экспрессионная кассета, содержащая сильный мышцеспецифический промотор С5-12, терминатор транскрипции и сигнал полиаденилирования.

Перед сигналом полиаденилирования расположены следующие участки:

- участок, комплементарный 5р плечам микроРНК-142 повторенный 2 раза и участок, комплементарный 3р плечам микроРНК-499, повторенный 2 раза,

- участок, комплементарный 5р плечам микроРНК-499 и 3р плечам микроРНК-142, повторенный 2 раза. Участки, комплементарные плечам микроРНК, обеспечивают блокирование экспрессии трансгена в клетках сердечной мускулатуры (МикроРНК-499) и в антигенпрезентирующих клетках (микроРНК-142);

- концевые повторы аденоассоциированного вируса, необходимые для упаковки вектора в вирусный капсид.

Трансген помещается в данную экспрессионную кассету между промотором и последовательностями, комплементарными микро-РНК.

Транскрипция трансгена терминируется сигналом полиаденилирования и терминации гена бета-глобина мыши. (фиг. 1).

1.2. Конструирование упаковочной плазмиды pRC.

Упаковочная плазмида pRC содержит экспрессионную кассету, содержащую промотор C5-tataless и терминатор транскрипции и полиаденилирования гормона роста человека, которые обуславливает эффективную транскрипцию и трансляцию мРНК в мышечных клетках. Между ними помещаются последовательность ДНК, кодирующая белок Rep, необходимый для репликации аденоассоциированного вируса и последовательность ДНК, кодирующая область САР субтипа 2 ААВ, в результате экспрессии которой синтезируются три белка вирусной оболочки: VP1, VP2 и VP3, необходимые для сборки вирусного капсида. В участок последовательности, кодирующей VP3, вставлена последовательность, кодирующая пептид TGASSLNIAGLS с целью усиления связывания аденоассоциированного вируса с мышечными клетками (см. Фиг. 2).

Экспрессионный вектор и упаковочная плазмида также содержат элементы, необходимые для их селекции и репликации в бактериальных клетках:

- ген устойчивости к ампициллину AmpR для селекции бактериальных клеток при наработке плазмиды;

- репликатор для репликации плазмиды в клетках бактерий.

Таким образом, имеется возможность нарабатывать предложенные по настоящему изобретению экспрессионный вектор и упаковочную плазмиду в клетках бактерий, а затем использовать их для трансфекции культивируемых клеток человека и животных с последующей наработкой и очисткой аденоассоциированного вируса. Очищенный и сконцентрированный вирус можно применять для генной терапии.

Пример 2. Наработка и очистка рекомбинантного аденоассоциированного вируса.

Экспрессионные кассеты по настоящему изобретению: Ер, содержащая в качестве трансгена кДНК эритропоэтина человека, и RC, были получены методом автоматизированного химического синтеза и вставлены в плазмиду pUC18, содержащую репликатор и ген устойчивости к ампициллину с получением экспрессионного вектора pER-Ep и упаковочной плазмиды pRC.

Вектор pER-Ep, упаковочную плазмиду pRC, а также плазмиду-помощницу pHelper нарабатывали в бактериальных клетках и очищали в соответствии с известными стандартными методиками. Культивируемые клетки AAV293 рассевали в количестве 12,64x10⁶ на клеточную фабрику типа CF2 (Nunc, США) в стандартной ростовой среде. Трансфекцию клеток осуществляли наработанными векторами и плазмидой-помощницей

Для трансфекции использовали реагент «РЕ1рго» и плазмиды, в количестве:

- pER-Ep (концентрация 840 мг/мл) - 300 мкл,

- pRC (1060 мг/мл) - 238 мкл, и

- pHelper (500 мг/мл) - 500 мкл.

Далее клетки AAV293 инкубировали в течение 72 часов, после чего выделяли аденоассоциированные вирусы. Клетки промывали от клеточной среды раствором PBS и снимали с помощью 0,25% раствора трипсина-ЭДТА. Клетки растворяли в 50 мл раствора 150 мМ NaCl, 20 мМ Tris, рН=8.0 и лизировали методом замораживания-оттаивания. Затем инкубировали осветленные лизаты клеток в течение часа при +37°С, в присутствии 0,05 ед/мкл бензоназы (Sigma Aldrich, США). Далее дважды центрифугировали при 3000g, 15 мин и полученный супернатант очищали на аффинной колонке «Hi-Trap Column» (GE Healthcare, Швеция) по протоколу производителя. Элюцию проводили 5 мл элюирующего раствора с низким рН (рН=2), который незамедлительно, после промывки колонки, доводили до нейтрального с помощью 1М Tris-HCl рН=8.0. Титр вируса определяли с помощью ПНР в реальном времени с праймерами на кДНК эритропоэтина человека.

В результате нескольких наработок получили 1 мл очищенного раствора рекомбинантного аденоассоциированного вируса с титром 10¹⁰.

Пример 3. Экспрессия целевой последовательности in vivo.

Трем крысам линии Вистар (самцам, весом 175 граммов) вводили по 0,3 мл физиологического раствора, содержащего 10¹⁰ рекомбинантного аденоассоциированного вируса внутримышечно, распределив данный объем поровну между правой и левой бедренными мышцами. Через 5 суток из скелетных мышц, сердца, мозга, почек, селезенки и кишечника животных выделяли РНК, на матрице которой синтезировали кДНК, которую в свою очередь, использовали в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции с праймерами на ген эритропоэтина человека: прямой праймер 5'-AGGCCG AGA АТАТС ACGACG-3' и обратный праймер 5'-CCTCCCCTGTGTACAGCTTC-3'. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 2% агарозе, после чего гель красили 0,1% раствором бромистого этидия и фотографировали под УФ-освещением. Результаты, представленные на Фиг. 3, показывают, что РНК, специфичная к целевому гену, синтезировалась только в скелетных мышцах и не синтезировалась в сердце, мозге, легких, селезенке, кишечнике животных.

--->

Перечень последовательностей

<110>Al-ShehadatR.I., KlimovN.A., KondrashkinaA.V., MalakhovI.S., KadirovaR.A., UhnevaM.A., GalochkinaA.S.

<120>A method for producing adenoassociated viruses for use in gene therapy

<130>

<160> 1

<210> SEQ ID No:1

<211> 1465

<212> DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Expressing cassette of the pER-Ep vector expressing human erythropoietin

<400> 1

gcggccgccc cgggaggtac cgagctccac cgcggtggcg gccgtccgcc ctcggcacca 60

ttcctcacga cacccaaata tggcgacggg tgaggaatgg tggggagtta tttttagagc 120

ggtgaggaat ggtgggcagg cagcaggtgt tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta 180

tttttagagc ggtgaggaat ggtggacacc caaatatggc gacggcacca ttcctcaccc 240

gtcgccatat ttgggtgtcc cgtccgcccc ggccggggcc gcattcctgg gggccgggcg 300

gtgctcccgc ccgcctcgat aaaaggctcc ggggccggcg gcggcccacg agctacccgg 360

aggagcggga ggaagcttgc atgcctgcag gtcgactcta gaggatcccc gggtaccgag 420

ctcgaattcg atatcaagct tggcattccg gtactgttgg taaaccacca tgggggtgca 480

cgaatgtcct gcctggctgt ggcttctcct gtccctgctg tcgctccctc tgggcctccc 540

agtcctgggc gccccaccac gcctcatctg tgacagccga gtcctggaga ggtacctctt 600

ggaggccaag gaggccgaga atatcacgac gggctgtgct gaacactgca gcttgaatga 660

gaatatcact gtcccagaca ccaaagttaa tttctatgcc tggaagagga tggaggtcgg 720

gcagcaggcc gtagaagtct ggcagggcct ggccctgctg tcggaagctg tcctgcgggg 780

ccaggccctg ttggtcaact cttcccagcc gtgggagccc ctgcagctgc atgtggataa 840

agccgtcagt ggccttcgca gcctcaccac tctgcttcgg gctctgggag cccagaagga 900

agccatctcc cctccagatg cggcctcagc tgctccactc cgaacaatca ctgctgacac 960

tttccgcaaa ctcttccgag tctactccaa tttcctccgg ggaaagctga agctgtacac 1020

aggggaggcc tgcaggacag gggacagagt ttaaacagca cagacttgct gtgatgttaa 1080

acatcactgc aagtcttaat ccataaagta ggaaacacta caagtagtgc tttctacttt 1140

atggaagcac agacttgctg tgatgttaaa catcactgca agtcttaatc cataaagtag 1200

gaaacactac aagtagtgct ttctacttta tgctgtgcct tctagttgcc agccatctgt 1260

tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 1320

ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 1380

tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga 1440

tgcggtgggc tctatgggcg gccgc 1465

<110>Al-Shehadat R.I., Klimov N.A., Kondrashkina A.V., Malakhov I.S., Kadirova R.A., Uhneva M.A., Galochkina A.S.

<120> A method for producing adenoassociated viruses for use in gene therapy

<130>

<160> 1

<210> SEQ ID No:2

<211>4489

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223>Expressing cassette of the packing vector pER

<400>2

gggaggggtg gagtcgtgac gtgaattacg tcatagggtt agggaggtcc tgtattagag 60

gtcacgtgag tgttttgcga cattttgcga caccatgtgg tcacgctggg tatttaagcc 120

cgagtgagca cgcagggtct ccattttgaa gcgggaggtt tgaactatgc cggggtttta 180

cgagattgtg attaaggtcc ccagcgacct tgacgggcat ctgcccggca tttctgacag 240

ctttgtgaac tgggtggccg agaaggaatg ggagttgccg ccagattctg acatggatct 300

gaatctgatt gagcaggcac ccctgaccgt ggccgagaag ctccagcgcg actttctgac 360

ggaatggcgc cgtgtgagta aggccccgga ggcccttttc tttgtgcaat ttgagaaggg 420

agagagctac ttccacatgc acgtgctcgt ggaaaccacc ggggtgaaat ccatggtttt 480

gggacgtttc ctgagtcaga ttcgcgaaaa actgattcag agaatttacc gcgggatcga 540

gccgactttg ccaaactggt tcgcggtcac aaagaccaga aatggcgccg gaggcgggaa 600

caaggtggtg gatgagtgct acatccccaa ttacttgctc cccaaaaccc agcctgagct 660

ccagtgggcg tggactaata tggaacagta tttaagcgcc tgtttgaatc tcacggagcg 720

taaacggttg gtggcgcagc atctgacgca cgtgtcgcag acgcaggagc agaacaaaga 780

gaatcagaat cccaattctg atgcgccggt gatcagatca aaaacttcag ccaggtacat 840

ggagctggtc gggtggctcg tggacaaggg gattacctcg gagaagcagt ggattcagga 900

ggaccaggcc tcatacatct ccttcaatgc ggcctccaac tcgcggtccc aaatcaaggc 960

tgccttggac aatgcgggaa agattatgag cctgactaaa accgcccccg actacctggt 1020

gggccagcag cccgtggagg acatttccag caatcggatt tataaaattt tggaactaaa 1080

cgggtacgat ccccaatatg cggcttccgt ctttctggga tgggccacga aaaagttcgg 1140

caagaggaac accatctggc tgtttgggcc tgcaactacc gggaagacca acatcgcgga 1200

ggccatagcc cacactgtgc ccttctacgg gtgcgtaaac tggaccaatg agaactttcc 1260

cttcaacgac tgtgtggaca agatggtgat ctggtgggag gaggggaaga tgaccgccaa 1320

ggtcgtggag tcggccaaag ccattctcgg aggaagcaag gtgcgcgtgg accagaaatg 1380

caagtcctcg gcccagatag acccgactcc cgtgatcgtc acctccaaca ccaacatgtg 1440

cgccgtgatt gacgggaact caacgacctt cgaacaccag cagccgttgc aagaccggat 1500

gttcaaattt gaactcaccc gccgtctgga tcatgacttt gggaaggtca ccaagcagga 1560

agtcaaagac tttttccggt gggcaaagga tcacgtggtt gaggtggagc atgagttcta 1620

cgtcaaaaag ggtggagcca agaaaagacc cgcccccagt gacgcagata taagtgagcc 1680

caaacgggtg cgcgagtcag ttgcgcagcc atcgacgtca gacgcggaag cttcgatcaa 1740

ctacgcagac aggtaccaaa acaaatgttc tcgtcacgtg ggcatgaatc tgatgctgtt 1800

tccctgtaga caatgcgaga gaatgaatca gaactcaaat atctgcttca ctcacggaca 1860

gaaagactgt ttagagtgct ttcccgtgtc agaatctcaa cccgtttctg tcgtcaaaaa 1920

ggcgtatcag aaactgtgct acattcatca tatcatggga aaggtgccag acgcttgcac 1980

tgcctgcgat ctggtcaatg tggatttgga tgactgcatc tttgaacaat aaatgattta 2040

aatcaggtat ggctgccgat ggttatcttc cagattggct cgaggacact ctctctgaag 2100

gaataagaca gtggtggaag ctcaaacctg gcccaccacc accaaagccc gcagagcggc 2160

ataaggacga cagcaggggt cttgtgcttc ctgggtacaa gtacctcgga cccttcaacg 2220

gactcgacaa gggagagccg gtcaacgagg cagacgccgc ggccctcgag cacgacaaag 2280

cctacgaccg gcagctcgac agcggagaca acccgtacct caagtacaac cacgccgacg 2340

cggagtttca ggagcgcctt aaagaagata cgtcttttgg gggcaacctc ggacgagcag 2400

tcttccaggc gaaaaagagg gttcttgaac ctctgggcct ggttgaggaa cctgttaaga 2460

cggctccggg aaaaaagagg ccggtagagc actctcctgt ggagccagac tcctcctcgg 2520

gaaccggaaa ggcgggccag cagcctgcaa gaaaaagatt gaattttggt cagactggag 2580

acgcagactc agtacctgac ccccagcctc tcggacagcc accagcagcc ccctctggtc 2640

tgggaactaa tacgatggct acaggcagtg gcgcaccaat ggcagacaat aacgagggcg 2700

ccgacggagt gggtaattcc tcgggaaatt ggcattgcga ttccacatgg atgggcgaca 2760

gagtcatcac caccagcacc cgaacctggg ccctgcccac ctacaacaac cacctctaca 2820

aacaaatttc cagccaatca ggagcctcga acgacaatca ctactttggc tacagcaccc 2880

cttgggggta ttttgacttc aacagattcc actgccactt ttcaccacgt gactggcaaa 2940

gactcatcaa caacaactgg ggattccgac ccaagagact caacttcaag ctctttaaca 3000

ttcaagtcaa agaggtcacg cagaatgacg gtacgacgac gattgccaat aaccttacca 3060

gcacggttca ggtgtttact gactcggagt accagctccc gtacgtcctc ggctcggcgc 3120

atcaaggatg cctcccgccg ttcccagcag acgtcttcat ggtgccacag tatggatacc 3180

tcaccctgaa caacgggagt caggcagtag gacgctcttc attttactgc ctggagtact 3240

ttccttctca gatgctgcgt accggaaaca actttacctt cagctacact tttgaggacg 3300

ttcctttcca cagcagctac gctcacagcc agagtctgga ccgtctcatg aatcctctca 3360

tcgaccagta cctgtatttt ttgagcagaa caaacactcc aagtggaacc accacgcagt 3420

caaggcttca gttttctcag gccggagcga gtgacattcg ggaccagtct aggaactggc 3480

ttcctggacc ctgttaccgc cagcagcgag tatcaaagac atctgcggat aacaacaaca 3540

gtgaattttc gtggactgga gctaccaagt accacctcaa tggcagagac tctctggtga 3600

atccgggccc ggccatggca agccacaagg acgatgaaga aaagtttttt cctcagagcg 3660

gggttctcat ctttgggaag caaggctcag agaaaacaaa tgtggacatt gaaaaggtca 3720

tgattacaga cgaagaggaa atcaggacaa ccaatcccgt ggctacggag cagtatggtt 3780

ctgtatctac caacctccag gccggcaaca ctggagcgag cagcctgaat atcgcgggac 3840

tgagtgccca agcagctacc gcagatgtca acacacaagg cgttcttcca ggcatggtct 3900

ggcaggacag agatgtgtac cttcaggggc ccatctgggc aaagattcca cacacggacg 3960

gacattttca cccctctccc ctcatgggtg gattcggact taaacaccct cctccacaga 4020

ttctcatcaa gaacaccccg gtacctgcga atccttcgac caccttcagt gcggcaaagt 4080

ttgcttcctt catcacacag tactccacgg gacaggtcag cgtggagatc gagtgggagc 4140

tgcaaaagga aaacagcaaa cgctggaatc ccgaaattca gtacacttcc aactacaaca 4200

agtctgttaa tgtggacttt actgtggaca ctaatggcgt gtattcagag cctcgcccca 4260

ttggcaccag atttctgact cgtaatctgt aattacgtgt taatcaataa accggttaat 4320

tcgtgtcagt tgaactttgg tctcatgtcg ttattatctt atctggtcac cagatacgta 4380

gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacagcccgg gcgtttaaac agcgggcgga 4440

ggggtggagt cgtgacgtga attacgtcat agggttaggg aggtcctgt 4489

<---

Claims (2)

1. Способ получения рекомбинантных аденоассоциированных вирусов, отличающийся тем, что с целью экспрессии трансгена исключительно в клетках мышечной ткани для создания аденоассоциированного вируса используют экспрессирующий вектор, содержащий мышцеспецифический промотор С5-12, повторяющиеся последовательности ДНК, комплементарные последовательностям плечей микроРНК mir-142 и mir-499, и упаковочную плазмиду, которая содержит для экспрессии белка VP3 вируса промотор C5-tataless и ген вирусного белка VP3 субтипа 2 человека, который содержит дополнительную аминокислотную последовательность TGASSLNIAGLS.

2. Способ получения рекомбинантных аденоассоциированных вирусов по п. 1, отличающийся тем, что экспрессионный вектор и упаковочная плазмида содержат ген устойчивости к ампициллину AmpR для селекции бактериальных клеток при наработке плазмиды и репликатор для репликации плазмиды в клетках бактерий.

Images