RU2715900C1 - Способ индикации радиотоксинов в облученных пищевых продуктах и кормах - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к радиационной биологии, а именно к индикации радиотоксинов в облученных пищевых и кормовых продуктах для оценки их биологической безопасности. Для этого готовят исследуемый материал, гомогенизируют пробы в присутствии экстрагента. Проводят концентрирование методом выпаривания на вакуумном испарителе осадка этанолового экстракта, подвергнутого после разведения физиологическим раствором серологическому анализу. Изготавливают антительный бентонитовый диагностикум на основе антирадиотоксической сыворотки с получением наночастиц бентонита путем диспергирования бентпорошка в ультразвуковой установке. Метят полученный комплекс метиленовой синью и визуально оценивают реакции бентонитовой флокуляции в крестах. Серологический анализ проводят в реакции бентонитовой флокуляции (РБФ) с антирадиотоксическим бентонитовым диагностикумом (АТБД). В качестве носителя специфических антител используют сенсибилизированные антирадиотоксической сывороткой наночастицы бентонита размером 75-85 нм, для сенсибилизации которых используют гипериммунные сыворотки кроликов. По феномену флокуляции сенсибилизированных наночастиц бентонита в РБФ судят о наличии радиотоксинов в исследуемой пробе. В качестве иммунизирующего агента-антигена используют растительный радиотоксин. Определяют концентрации радиотоксинов по максимальному разведению исследуемого материала - 1:8 и ниже, свидетельствующие об экологической безопасности пищевых и кормовых продуктов. Изобретение позволяет повысить чувствительность реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) тест-системы в 2 раза и РБФ тест-системы в 1,66 раза по сравнению с прототипом. 5 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 пр.

Description

Изобретение относится к радиационной биологии, в частности, к оценке экологической (радиационной) безопасности продуктов животноводства и растениеводства.

Согласно рекомендациям МАГАТЭ, для продления сроков хранении пищевых продуктов растительного и животного происхождения: картофель, зернофураж, лук, ягоды, фрукты, соки, мясо и мясопродукты, рыба и морепродукты подвергаются радиационной обработке (облучению) в высоких дозах от 1⋅10² до 6⋅10³ Гр. Хотя по данным одних авторов облученные продукты считаются безопасными, а по данным других - такие продукты обладают мутагенным эффектом из-за содержания в них радиомиметиков - радиотоксинов. Поэтому встает вопрос о допуске таких продуктов в пищу человека и корм животных, наличие или отсутствие в них радиотоксинов, определение их концентрации, сроков появления и распада в зависимости от сроков после облучения.

Известен полярографический способ индикации (обнаружения) радиотоксинов в облученных растительных объектах путем исследования супернатантов водных гомогенатов в присутствии 0,15 М фосфатного буфера и вытеснения О₂ из исследуемых проб путем пропускания очищенного азота и снятия полярограмм на полярографе с ртутным электродом с последующим расчетом содержания радиотоксина графическим методом по высоте полярографической волны (см. статью A.M. Кузина и Н. Норбаева «Количественные закономерности образования хинонов в гамма-облученной растительной ткани. // Докл. АН СССР. - 1965. - Т. 164. - Вып. 6. - С. 1409-1412»).

Недостатком способа является неспецифичность метода, поскольку в параллельных пробах на полярограммах из облученных и необлученных объектов обнаруживаются совершенно идентичные полярографические волны, которые по высоте волн не имеют достоверных отличий. Во-вторых, низкая разрешающая способность способа не позволяет выявлять малые количества радиотоксина и по этим данным не представляется возможным судить о степени безопасности облученных продуктов. В-третьих, необходимость ртутных электродов для полярографов создает определенные технические трудности для выполнения известного способа. Кроме того, необходимость исследования больших количеств проб в экстренных случаях резко ограничивает возможности проведения этого способа.

Вместе с тем из области радиационной иммунологии известно, что радиотоксины образуются в клетках облученных микроорганизмов и растений (кукуруза, рожь, овес, пшеница, горох, чечевица, лук, чеснок, грибы, фрукты, картофель и т.д.) и что биохимический состав растительных антигенов - радиотоксинов не зависит от вида перечисленных объектов, поэтому растительный антиген - радиотоксин является специфичным для всех перечисленных объектов, а антисыворотки, полученные путем гипериммунизации животных одним из этих агентов, будут реагировать с радиотоксинами, образующимися в перечисленных облученных растительных объектах. Поэтому обнаружение радиотоксинов в пищевых и кормовых продуктах (овес, кукуруза, пшеница, рожь, соя, горох, лук, чеснок, грибы, фрукты) требует разработки специфичного диагностикума и адекватных методов подготовки проб к исследованию путем перевода твердой фазы в жидкую и исследования супернатантов или осадков на наличие искомого агента с использованием высокочувствительных тест-систем.

Известен способ обнаружения антигенов или антител в организме животных в реакции бентонитовой флокуляции (РБФ) путем адсорбции антигена или антител на частицах бентонита при инкубировании смеси с последующей отмывкой целевого продукта (см. статью R. Wallace et al. "The bentonite Flocculation test in the assay of Neisseria arifihody". J. Immunol. - 1970. - №8 - P. 655-659).

Недостатком способа является использование нативного бентонита с размерами частиц 0,002 мм, что снижает чувствительность реакции.

Для повышения чувствительности реакции был предложен способ использовать в качестве иммуносорбента микрочастиц бентонита размером 0,0006-0,0009 мм (А.с. СССР А61К 39/00 от 23.08.1982. Бюл. №31).

Недостатком способа является сложная технология изолирования микрочастиц бентонита с использованием концентрированных растворов соляной кислоты (1н HCL) и многократное отмывание микрочастиц бентонита. Кроме того, предлагаемый диагностикум предназначен для индикации микробных антигенов возбудителей инфекционных болезней, например, шигелл Флекснера.

Известен способ индикации радиоиндуцированных токсических соединений (радиотоксинов) в реакции бентонитовой флокуляции (см. Автореферат P.P. Гайнуллина «Разработка бентонитового диагностикума для индикации радиоиндуцированных токсических соединений». - Казань. 2009. 23 с.), включающий извлечение из облученных в дозе 350-400 Гр клубней картофеля - радиотоксина, гипериммунизация кроликов путем внутримышечного 4-х кратного с интервалом в 14 дней введения антигена в дозе 1,0-2,0 см, получение диагностических сывороток, сенсибилизация последними частиц иммуносорбента.

Недостатком способа является сложная технология очистки бентонита и низкая чувствительность диагностикума, поскольку в качестве иммуносорбента используются микрочастицы бентонита размером 0,0006 - 0,0009 мм (60-90 мкм), которые обладают недостаточной сорбционной активностью и вследствие низкой дисперсности, быстро выпадают в осадок, изменяя ход реакции и снижая чувствительность РБФ тест-системы при иммунохимическом анализе исследуемого материала.

Между тем из области нанотехнологии известно, что переход материи в наноразмерное состояние сопровождается изменением фундаментальных свойств вещества, поэтому применение терминов с приставкой «нано-» указывает на новую среду деятельности, изучающую объекты наномира с очень специфическими свойствами и обладающую вследствие этого гигантским научно-технологическим и социально-экономическим потенциалом (см. статью А.С. Радилова, В.Р. Ремовского «Нанотехнологии и нанотоксикология - взгляд на проблему» // Токсикологический вестник. 2007. - №6. - С. 4-8).

Поэтому одним из перспективных направлений использования природных минералов является создание на их основе наноразмерных лекарственных и диагностических препаратов с более выраженными положительными свойствами и, в связи с этим, возникает постоянная необходимость биологического тестирования наноразмерных частиц, полученных из минеральных сырьевых ресурсов.

Известен способ получения противолучевого антительного бентонитового препарата (АТБП) для диагностики радиационных поражений организма, включающий извлечение из облученных в дозе 350-400 Гр клубней картофеля радиотоксина, гипериммунизацию кроликов путем внутримышечного 4-кратного с интервалом в 14 дней введения антигена в дозе 1,0-2,0 см³, конъюгированного с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ) в соотношении 1:1, получение диагностических сывороток, сенсибилизацию последними наночастиц бентонита размером 75-85 нм, полученных путем обработки термоактивной бентонитовой глины на ультразвуковой установке, сенсибилизацию наночастиц осуществляют путем смешивания 0,19-0,20%-ной водной суспензии наночастиц бентонита с гипериммунной сывороткой в соотношении 3:7 с последующим термостатированием при температуре 30°С в течение 30 мин, центрифугирование смеси при 3000 об/мин в течение 7 мин, отмывание дистиллированной водой при 3000 об/мин в течение 10 мин, декантирование супернатанта, ресуспендирование осадка в дистиллированной воде до концентрации 0,19-0,20% и внесение в полученный иммунохимический комплекс индикаторного компонента - 0,1% - ной метиленовой сини, из расчета 0,7 см³ на 100 см³ (заявка N 2019110695/020592 приоритет от 10.04.2019 г., поданная нами).

Полученный противолучевой антительный бентонитовый препарат (АТБД) использовали только для диагностики радиационных поражений организма.

Наиболее близким к предлагаемому является способ обнаружения радиотоксинов в облученных пищевых продуктах для оценки их биологической безопасности, включающий приготовление исследуемого материала гомогенизацией пробы в присутствии экстрагента, концентрирование методом выпаривания на вакуумном испарителе осадка этанолового экстракта, подвергнутого после разведения физиологическим раствором серологическому анализу в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с антирадиотоксическим антительным эритроцитарным диагностикумом (АТЭД), использование в качестве специфических антител сенсибилизированных антирадиотоксической сывороткой формалинизированных и танизированных эритроцитов барана, использование гипериммунной сыворотки кроликов для сенсибилизации эритроцитов, использование в качестве иммунизирующего агента - антигена - растительного радиотоксина, полученного путем этанолового экстрагирования пророщенного и облученного зерна и по феномену гемагглютинации сенсибилизированных эритроцитов в РНГА судят о наличии радиотоксинов в исследуемой пробе, и определение концентрации радиотоксинов по максимальному разведению исследуемого материала, при котором наблюдают феномен гемагглютинации, а максимальное разведение 1:8 и ниже свидетельствует об экологической безопасности пищевого продукта. (Патент RU N2324176, МПК G01N 33/02 опубл. 10.05.2008, БИ N 13).

Недостатком способа является использование в качестве иммуносорбента эритроцитов барана, которые характеризуются высокой чувствительностью к колебаниям факторов внешней среды (рН, температура, присутствие химических веществ), ведущих к инактивации эритроцитарного диагностикума.

При создании изобретения ставилась задача разработать эффективный, высокочувствительный и точный способ индикации радиотоксина в подвергнутых лучевой обработке пищевых и кормовых продуктах.

Эта задача решается в способе индикации радиотоксинов в облученных пищевых и кормовых продуктах для оценки их биологической безопасности, предусматривающим приготовление исследуемого материала, гомогенизацию пробы в присутствии экстрагента, концентрирование методом выпаривания на вакуумном испарителе осадка этанолового экстракта, подвергнутого после разведения физиологическим раствором серологическому анализу, использование в качестве иммунизирующего агента - антигена - растительный радиотоксин, полученного путем этанолового экстрагирования пророщенного и облученного зерна, и определение концентрации радиотоксинов по максимальному разведению исследуемого материала 1:8 и ниже, свидетельствующие об экологической безопасности пищевых и кормовых продуктов, согласно изобретения, серологический анализ проводят в реакции бентонитовой флокуляции (РБФ) с антирадиотоксическим бентонитовым диагностику-мом (АТБД), а в качестве носителя специфических антител используют сенсибилизированные антирадиотоксической сывороткой наночастицы бентонита размером 75-85 нм, для сенсибилизации которых используют гипериммунные сыворотки кроликов, и по феномену флокуляции сенсибилизированных наночастиц бентонита в РБФ судят о наличии радиотоксинов в исследуемой пробе, а по титру антигена (максимальное разведение осадков этаноловых экстрактов) определяют концентрацию радиотоксина и устанавливают степень экологической (радиационной) безопасности облученных продуктов.

В качестве исследуемого материала используют концентрированные осадки этаноловых экстрактов, полученные путем гомогенизации зерна (овощей, фруктов и т.д.) в присутствии 96%-ного этанола, взятого в соотношении 1:3, экстрагирования в течение 50-60 мин при постоянном перемешивании и удалении экстрагента на вакуумном испарителе при температуре 28-33°С, полученный после упаривания осадок (концентрированный радиотоксинсодержащий экстракт) подвергают серологическому анализу в РБФ.

В качестве иммунизирующего антигена для гипериммунизации животных при получении специфической антирадиотоксической сыворотки используют извлеченный путем этанолового экстрагирования из пророщенного зерна (кукурузы, пшеницы, ржи, сои гороха) белково-хиноидный радиотоксин, содержащий 45-50 мг/мл растительного белка; для увеличения выхода иммунизирующей субстанции - белково-радиотоксинного комплекса из технологического сырья - зерна, последний перед облучением подвергают проращиванию в течение 6,5 - 7,5 сут с последующим облучением в дозе 300 - 310 Гр, затем выдерживают при температуре 18 - 22°С в течение 23 - 29 часов и продукт подвергают гомогенизации в присутствии 96%-ного этанола в соотношении 1:3, экстрагируют в течение 50 - 60 мин при температуре 0°С, смесь центрифугируют при 8000 об/мин, экстрагент удаляют на вакуумном испарителе и полученный продукт стандартизируют по белку 4,5-5,5 мг/мл и используют в качестве иммунизирующего антигена при получении антирадиотоксической гипериммунной сыворотки.

Гипериммунную антирадиотоксическую сыворотку получают путем 4-кратного с интервалом в 14 дней внутримышечного в дозе 1,0-2 см³ введения кроликам радиотоксина, извлеченного из пророщенного и облученного зерна (например, кукурузы).

Сенсибилизацию наночастиц бентонита осуществляют путем смешивания 0,19 - 0,20%-ной водной суспензии наночастиц бентонита с гипериммунной сывороткой в соотношении 3:7 с последующим термостатированием смеси при температуре 30°С в течение 30 мин, затем смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 7 мин, полученный осадок отмывают дистиллированной водой при 3000 об/мин в течение 10 мин, супернатант декантируют, осадок ресуспендируют в дистиллированной воде до концентрации 0,19-0,20%, затем вносят в полученный иммунохимический комплекс индикаторный компонент - 0,1%-ную метиленовую синь из расчета 0,7 см³ на 100 см³ смеси. Полученный указанным способом продукт - антительный бентонитовый диагностикум (АТБД) хранят в холодильнике при температуре 2 - 6°С и используют для обнаружения радиотоксинов в облученных пищевых и кормовых продуктах.

Использование в качестве антирадиотоксического бентонитового диагностикума (АТБД) наночастиц бентонита размером 75-85 нм, полученных путем обработки термоактивированной бентонитовой глины на ультразвуковой установке УЗУ-0,25 при 18,5 кГр, выходной мощности 80 ВТ, амплитуде колебаний волновода 5 мкм, ускоряет сроки индикации радиотоксина в 3 раза, повышает чувствительность диагностикума в 1,66 - 2,0 раза по сравнению с прототипом и аналогом соответственно.

Способ индикации радиотоксина в объектах ветеринарного надзора осуществляется следующим образом.

Начальным этапом исследования является изготовление индикаторного компонента - антительного бентонитового диагностикума - (АТБД) на основе антирадиотоксической сыворотки, которая служит источником специфических антирадиотоксических антител (сенситином) для сенсибилизации (нагружения наночастиц бентонита), служащих минеральным иммуносорбентом (носителем) специфических антирадиотоксических антител.

Антирадиотоксическую сыворотку получают путем гипериммунизации кроликов антигеном - специфическим радиомиметиком - радиотоксином, в качестве которого используют этаноловый экстракт пророщенной и облученной растительной ткани. Для получения радиотоксина используют зерно (кукурузу, овес, рожь, пшеницу, горох, сою), которое смачивают в течение 24 ч и проращивают в течение 7 сут. Семидневные проростки зерна (например, кукурузы сорта «Стерлинг»), облучают гамма-лучами в дозе 300-310 Гр и выдерживают их при температуре 18-22°С в течение 24 часов. Через 24 часа после облучения берут по 50-60 г пророщенного зерна, растирают с 140-150 мл 96%-ного этанола и центрифугируют при 8000 об/мин; из полученного супернатанта экстрагент (этанол) удаляют на вакуумном испарителе при 28-33°С, полученный после упаривания этанола осадок представляет собой концентрированный радиотоксин, содержащий антигенный материал. Все процедуры по изолированию радиотоксина проводят при температуре 0°С.

В полученном этаноловом экстракте определяют белок по Лоури, содержание которого составляет, в зависимости от сорта зерна 5,7 - 7,8 мг/мл. Полученный этаноловый экстракт, содержащий белково-хиноидный радиотоксический комплекс (лучевые растительные антигены), стандартизируют путем разведения стерильным физиологическим раствором рН 7,2-7,4 до концентрации 5 мг/мл для гипериммунизации лабораторных животных (например, кроликов).

Гипериммунизацию кроликов живой массой 2,0-2,5 кг проводят по следующей схеме. Приготовленный по вышеописанной методике антиген - радиотоксин вводят кроликам 4-кратно внутримышечно в область внутренней поверхности бедра с интервалом в 14 дней между введениями по 1,0-2,0 мм³ на каждое введение. На восьмой день после последней инъекции антигена у кроликов берут кровь из ушной вены для определения антирадиотоксических антител, которое проводят в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) по К. Мальборгу (Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987, с. 211-218). В качестве положительного антигена в реакции используют этаноловый экстракт облученного зерна, в качестве отрицательного - экстракт необлученного зерна.

Кролики, в сыворотке которых обнаруживают антитела в титрах не ниже 1:300, обескровливают. Полученные иммунные сыворотки в дальнейшем используют в качестве сенситина - источника специфических антител для сенсибилизации (нагружения) наночастиц бентонита с целью изготовления антирадиотоксического антительного бентонитового диагностикума (АТБД).

На втором этапе получают иммуносорбент - наночастицы бентонита путем диспергирования бентпорошка (термоактивированной бентонитовой глины любого происхождения) в ультразвуковой установке УЗУ-0,25 при частоте 18,8 кГц, выходной мощности установки 80 Вт и амплитуде колебаний ультразвукового волновода 5 мкм. Результаты микроскопирования обработанного ультразвуком бентонита показали, что размеры наночастиц составляют от 75 до 85 нм.

Полученный наноразмерный бентпорошок суспендируют из расчета 190-200 мг на 100 см³ дистиллированной воды и получают 0,19 - 0,20%-ную водную суспензию.

На следующем этапе проводят сенсибилизацию (нагружение специфическими противорадиационными антителами) наночастиц бентонита следующим образом: 0,19 - 0,20%-ную бентонитовую суспензию смешивают с гипериммунной противолучевой сывороткой в соотношении 3:7 (30 см³ бентонитовой суспензии + 70 см³ гипериммунной сыворотки).

Полученную смесь тщательно перемешивают и помещают в термостат при 30°С на 30 мин для стабилизации наночастиц бентонита. По истечению указанной экспозиции смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 7 мин. Надосадочную жидкость (супернатант) декантируют, а осадок дважды отмывают в 100 см³ дистиллированной воды при 3000 об/мин в течение 10 мин. Полученный центрифугат (осадок) ресуспензируют в дистиллированной воде в концентрации 0,19 - 0,20%.

Для визуальной индикации комплекса антиген (радиотоксин) - антитело, в РБФ тест-системе, полученный комплекс (бентонитовая суспензия + противолучевая сыворотка) метят специальным индикаторным красителем - метиленовой синью, количественное соотношение и концентрацию которого определяют экспериментальным путем. Устанавливают, что оптимальная концентрация метиленовой сини составляет 0,1%, а количество вносимого индикатора в комплексе иммуносорбент - сенситин составляет 0,7 см³ на 100 см³ диагностикума.

Полученный вышеописанным способом антирадиотоксический антительный бентонитовый диагностикум (АТБД) хранят в холодильнике при температуре 2-6°С и используют в качестве источника антирадиотоксических антител в реакции бентонитовой флокуляции (РБФ) для обнаружения радиотоксинов в исследуемых пробах из облученных продуктов растениеводства и животноводства.

Обнаружение (индикация) радиотоксина в пищевых и кормовых продуктах осуществляют следующим образом. Пробы зерна (кукурузы, сои, гороха, пшеницы, ржи, чечевицы, ячменя и т.д.) смачивают в течение 24 ч при температуре 18-22°С, затем растирают с 35-45 мл 96%-ного этанола и центрифугируют при 8000 об/мин. Все процедуры по гомогенизации и экстракции проводят при температуре 0°С. Концентрирование радиотоксина в полученном супернатанте и удаление экстрагента осуществляют на вакуумном испарителе при 22-33°С и полученный при этом осадок подвергают серологическому исследованию в РБФ на предмет индикации (обнаружения) радиотоксинов. Пробы овощей (картофеля, свеклы, моркови, фруктов и т.д.) не смачивают, а размельчают, растирают и обрабатывают как изложено выше.

Серологический анализ полученных экстрактов проводят путем постановки реакции бентонитовой флокуляции (РБФ) с антирадиотоксическим (антительным) бентонитовым диагностикумом, изготовленным согласно вышеописанной технологии. Для этого из этаноловых экстрактов (осадков) готовят последовательные двукратные (1:2, 1:4, 1:8 и т.д.) разведения антигена на физиологическом растворе и добавляют к каждому разведению по 1 капле (330 мкл) сенсибилизированных антирадиотоксической сывороткой наночастицы бентонита (АТБД). Смесь испытуемых антигенов и диагностикума тщательно перемешивают до гомогенной взвеси и оставляют на 2-2,5 часа при комнатной температуре или в термостате при 37°С.

Результаты реакции бентонитовой флокуляции оценивают визуально в крестах по следующей схеме:

- реакция считается положительной, когда на дне лунок иммунологических планшетов в рядах с положительным и испытуемым антигенами образуется «зонтик» сенсибилизированных наночастиц бентонита интенсивностью в 4 креста (4+), когда наночастицы занимают 1/2 поверхности дна лунок и (3+), когда наночастицы занимают 1/3 поверхности дна лунок при отсутствии таковых в лунках с отрицательным и гетерологичным (ожоговым) антигенами;

- реакция считается сомнительной, когда на дне лунки образуется «зонтик» сенсибилизированных наночастиц, занимающих

дна лунок с оценкой в 2+;

- реакция считается отрицательной, когда флокуляция осевших наночастиц занимает 1/5 дна лунок или когда наночастицы осели на дно лунок в виде плотной пуговицы или кольца.

Реакцию сопровождают соответствующими контролями. В качестве положительного антигена в РБФ используют этаноловый экстракт от облученных объектов (зерна), а в качестве отрицательного контроля - аналогичные экстракты от необлученных объектов.

Количественную оценку реакции выражают в титрах (1:2, 1:4, 1:8 и т.д.) или в логарифмах с основанием 2 (1:2=1 log₂; 1:4=2 log₂ и т.д.).

Оседание сенсибилизированных наночастиц (АТБД) на дно лунок иммунологических планшет в виде «зонтика» с оценкой в 3+ и 4+ в ряду с испытуемыми пробами и положительным антигеном и отсутствие такового в лунках с отрицательными антигенами в РБФ свидетельствуют о наличие в исследуемых пробах искомых антигенов (радиотоксинов).

Обнаружение в исследуемых пробах из объектов ветеринарно-медицинского надзора антигенов с титрами 1:8 и ниже свидетельствует о том, что исследуемый объект подвергался воздействию ионизирующих излучений в относительно невысоких дозах. Поэтому эти облученные объекты радиационной опасности не представляют.

Превышение диагностических титров в 2-3 раза свидетельствует об облучении объектов в высоких дозах ионизирующих излучений и время, прошедшее после облучения, недостаточно, чтобы радиоиндуцированные токсические продукты успели деградировать, поэтому исследуемые объекты, прежде чем допускать в пищу, должны быть выдержаны по срокам до полной деградации радиотоксинов или подвергаться термической обработке (проварке).

Реализация способа индикации радиотоксина в объектах ветеринарно-медицинского надзора иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение антительного противолучевого бентонитового диагностикума (АТБД) для проведения реакции бентонитовой флокуляции (РБФ) с целью обнаружения радиотоксина в объектах ветеринарно-медицинского надзора. Для получения АТБД в качестве иммуносорбента используют наночастицы бентонита с размером 75-85 нм, получаемые путем диспергирования термоактивированного бентонита, в ультразвуковой установке «УЗУ-0,25» при частоте 15,5; 16,5; 17,5; 18,5; 19,5; 20,5 кГр, приготовления 0,11; 0,13; 0,15; 0,17; 0,19; 0,20; 0,21; 0,22%-ной водной суспензии, смешивании ее с гипериммунной противолучевой сывороткой в соотношениях 1:1; 2:2; 2:3; 2:5; 2:7; 3:1; 3:2; 3:3; 3:4; 3:5; 3:6; 3:7; 3:8; 3:10; 4:1; 4:2; 4:3; 4:4; 4:6; 4:7; 4:8; 4:9 и термостатирование при 30°С в течение 15; 20; 25; 30; 35; 40 минут, центрифугируют при 1000; 1500; 2000; 2500; 3000; 3500; 4000 об/мин, в течение 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10 минут, осадок 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-кратно отмывают дистиллированной водой, осадок ресуспедируют в дистиллированной воде до 0,15 - 0,22% - ных концентраций и вносят индикаторный компонент - метиленовую синь в концентрациях 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,1; 0,11; 0,12; 0,13; 0,14% из расчета 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 см³ на 100 см³ суспензии сенсибилизированных гипериммунной противолучевой сывороткой наночастиц бентонита. С использованием указанных значений компонентов, получают различные варианты АТБД. Оптимальные условия получения диагностикума определяют путем постановки реакции бентонитовой флокуляции (РБФ) со стандартным - радиотоксином.

Установлено, что максимальные (1:2250-1:2500) титры стандартного антигена (радиотоксина) обнаруживают в РБФ тест-системе с диагностикумом, полученным путем смешивания 0,19-0,20%-ной суспензии наночастиц бентонита, содержащей 0,1% метиленовой сини, с гипериммунной противорадиационной сывороткой в соотношении 3:7, термостатирования в течение 30 минут при 30°С, центрифугирования смеси при 3000 об/мин в течение 7 мин с последующим 2-кратным отмыванием осадка центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут, ресуспендированием осадка в дистиллированной воде до 0,19-0,20%-ной концентрации и внесением в иммунохимический комплекс индикаторного компонента (метки) 0,1%-ной метиленовой сини из расчета 0,7 см³ на 100 см³ суспензии сенсибилизированных гипериммунов противолучевой сыворотки наночастиц бентонита.

Любые изменения параметров получения диагностикума: соотношений компонентов (иммуносорбентхыворотка), условий сенсибилизации (время, температура), центрифугирования, концентрации наночастиц в суспензии, концентрации и объема индикаторного компонента, приводят к снижению титров антигенов (радиотоксина) в реакции бентонитовой флокуляции (РБФ).

Пример 2. Проверка чувствительности РНГА и РБФ с известным и предлагаемым диагностикумами. Для индикации радиотоксина в РНГА и РБФ моделировали искусственную контаминацию проб воды, овощей, зерна стандартным радиотоксином (хиноидным радиотоксином - ХРТ) в разведениях 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512; 1:1024; 1:2048; 1:4096.

При пересчете разведений на абсолютные значения, т.е. на микрограммы, мы исходили из того, что концентрация радиотоксина в стандартном препарате составляла 20 мкг/мл. Следовательно, при разведении 1:2 содержание радиотоксина составляло 10 мкг/мл, 1:4-5 мг/мл, 1:8 - 2,5 мкг/мл, 1:16 - 1,25 мкг/мл; 1:32 - 0,65 мкг/мл; 1:64 - 0,32 мкг/мл; 1:128- 0,19 мкг/мл; 1:256 - 0,095 мкг/мл; 1:512 - 0,047 мкг/мл; 1:1024 - 0,023 мкг/мл; 1:2048 -0,011; 1:4096 - 0,005 мкг/мл; 1:8192 - 0,002 мкг/мл.

Результаты индикации радиотоксина в искусственно контаминированных пробах с использованием известного и предложенного диагностикумов показали, что максимальные титры радиотоксина в РНГА и РБФ в пробах с использованием известных диагностикумов (микровариант АТЭД и АТБД) составляли 1:256 (АТЭД) - 1:512 (АТБД), т.е. 0,95 мкг/мл, в то время как при параллельном использовании предлагаемого диагностикума (нановариант АТБД) - 1:4096-1:8192, что соответствует абсолютном значению 0,005-0,002 мкг/мл. Указанные значения превышают значения прототипа в 16 раз и аналога в 8 раз соответственно.

Следовательно, использование нановарианта диагностикума обеспечивает повышение чувствительности диагностикума в 8-16 раз, т.е. он обнаруживает в облученных продуктах радиотоксин при содержании его в концентрациях 0,005-0,002/ (2-5)⋅10^-6 г радиотоксина, против 0,08⋅10^-6 и 0,04⋅10^-6 г в прототипе и аналоге соответственно.

Пример 3. Проверку эффективности предлагаемого способа обнаружения радиотоксина в облученных пищевых продуктах и кормах проводили на облученных в дозах 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 кГр клубнях картофеля с использованием известного (РБФ с микродиагностикумом) и предлагаемого (РБФ с нанодиагностикумом).

Пробы из облученных в вышеуказанных дозах и необлученных объектов подвергали этаноловому экстрагированию и удалению экстрагента на вакуумном испарителе, подвергали иммунохимическому анализу путем постановки РНГА с АТЭД и РБФ с использованием известных (АТБД на основе макрочастиц бентонита) и предлагаемого (АТБД с наночастицами бентонита).

Результаты индикации радиотоксина в облученном различными дозами γ-лучей картофелем с использованием известных и предлагаемого диагностикумов представлены в таблице.

Из данных таблицы видно, что использованные диагностикумы обладают различной активностью: через 24 часа после облучения эритроцитарный (АТЭД) и бентонитовый (микроаналог - АТБД) диагностикумы не выявляют искомый агент (радиотоксин) в облученных объектах, в то время как предлагаемый диагностикум (нановариант АТБД) выявляет радиотоксин в дозах, превышающих диагностические титры в 2 раза (4 log₂). Известные диагностикумы (АТЭД и АТБД - микроаналог) только на 3-й сутки после облучения выявляет радиотоксин в диагностических титрах (3 log₂), в то время как нановариант АТБД к этому сроку обнаруживает высокие концентрации радиотоксина (5-6 log₂), что превышает показатели прототипа и аналога в 1,66 и 2,0 раза соответственно. На период максимального накопления радиотоксина в облученном продукте (на 10 сут после облучения) титры в РНГА с АТЭД составили 5,0 log₂, в РБФ с микровариантом АТБД - 6,0 log₂, в то время как в РБФ с нановариантом АТБД - 9 log₂, что превышает показатели прототипа (АТЭД) в 1,8 раза и микроаналога (АТБД) - в 1,5 раза. В отдаленные сроки исследования (20-е, 30-е сут) известные диагностикумы прототипа (АТЭД) и аналога (микровариант АТБД) теряют эффективность - ни в одной пробе из исследованных облученных объектов радиотоксины не обнаруживаются. В отличие от прототипа и аналога, использование предлагаемого нановарианта диагностикума (нано-АТБД) позволяет выявлять искомый радиотоксин в весьма высоких концентрациях (7,0 log₂ - на 20-е сут, 6,0 log₂, - на 25-е сут и 5,0 log₂ - на 30-е сут после облучения), что превышает значения прототипа и аналога в 5-7 раз (Р<0,001).

Пример 4. Оценка экологической безопасности подвергнутых радиационной обработке пищевых продуктов.

Исследования проводили на 96 белых мышах, разделенных на 12 групп по 8 животных на каждый вариант опыта (5 различных доз облучения и 6 экспозиций, 1 контроль). Животным соответствующих групп в течение 30 сут скармливали пробы картофеля, облученного в дозах 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 кГр и выдержанного 5, 10, 15, 20 и 30 сут после облучения. В качестве критерия оценки экологической безопасности облученных объектов использовали частоту хромосомных аберраций (ЧХА) соматических клеток периферической крови подопытных животных и зависимость этого показателя от титров антигенов - радиотоксинов в облученных вышеуказанных дозах ионизирующих излучений и времени отбора проб после облучения объектов.

Результаты изучения мутагенного эффекта облученных продуктов на лабораторных животных показали, что скармливание животным облученных продуктов в течение 30 сут вызывало существенное увеличение частоты хромосомных аббераций соматических клеток периферической крови белых мышей и величина этого показателя (ЧХА) имела прямую корреляционную зависимость от дозы лучевого воздействия, сроков после облучения и величины титров радиотоксина, обнаруженных в РБФ-тесте. Установлено, что у животных, получавших необлученный (контрольный) пищевой продукт, частота хромосомных аббераций составляла 0,34±0,05. У животных, получавших облученный пищевой продукт, через 5 сут после облучения, титры которого составляли от 1:512 до 1:32, частота хромосомных аббераций (ЧХА) соматических клеток периферической крови колебалась в пределах 1,20-1,02, что превышало контрольные значения в 3,0-3,8 раза (Р<0,01). Эти значения цитогенетических показателей сохранялись на таком высоком уровне у мышей, которые получали пробы, взятые на 5-16 сут после облучения. Частота хромосомных аббераций клеток крови приближалась к контрольным значениям только к 28-30 суткам, когда титры радиотоксина в исследуемых объектах составляли 1:4-1:8.

Следовательно, обнаружение в облученных пищевых продуктах радиотоксина в титрах 1:4-1:8 свидетельствует о низкой мутагенной активности облученных продуктов и их экологической безопасности, а превышение титров радиотоксина в исследуемых пробах в 2,5-3,8 раза - о высокой мутагенной активности облученных продуктов, т.е. об их экологической опасности, и эти продукты, прежде чем их допускать в пищу, должны быть выдержаны по срокам до полной деградации радиотоксинов (30 и белее суток) или использованы в пищу людям или корм животным только после тщательной проварки. Это положение распространяется и на другие продукты (морковь, лук, свекла, все зернопродукты и т.д.).

Таким образом, предлагаемый способ индикации радиотоксина в облученных продуктах позволяет повысить чувствительность РНГА тест-системы в 2 раза и РБФ тест-системы - в 1,66 раза по сравнению с прототипом и микроаналогом соответственно. Установлено также, что известные диагностикумы в начальные (1-3 сут) и отдаленные сроки не выявляют радиотоксины, что не позволяет дать объективную оценку об экологической безопасности облученных продуктов.

Claims (6)

1. Способ индикации радиотоксинов в облученных пищевых и кормовых продуктах для оценки их биологической безопасности, включающей приготовление исследуемого материала, гомогенизацию пробы в присутствии экстрагента, концентрирование методом выпаривания на вакуумном испарителе осадка этанолового экстракта, подвергнутого после разведения физиологическим раствором серологическому анализу, заключающийся в том, что происходит изготовление антительного бентонитового диагностикума на основе антирадиотоксической сыворотки с получением наночастиц бентонита путем диспергирования бентпорошка в ультразвуковой установке, мечение полученного комплекса метиленовой синью и визуальная оценка реакции бентонитовой флокуляции в крестах; серологический анализ проводят в реакции бентонитовой флокуляции (РБФ) с антирадиотоксическим бентонитовым диагностикумом (АТБД), а в качестве носителя специфических антител используют сенсибилизированные антирадиотоксической сывороткой наночастицы бентонита размером 75-85 нм, для сенсибилизации которых используют гипериммунные сыворотки кроликов, и по феномену флокуляции сенсибилизированных наночастиц бентонита в РБФ судят о наличии радиотоксинов в исследуемой пробе, также используют в качестве иммунизирующего агента-антигена - растительный радиотоксин, полученный путем этанолового экстрагирования пророщенного и облученного зерна и определяют концентрации радиотоксинов по максимальному разведению исследуемого материала - 1:8 и ниже, свидетельствующие об экологической безопасности пищевых и кормовых продуктов.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала используют концентрированные осадки этаноловых экстрактов, полученные путем гомогенизации пробы в присутствии 96%-ного этанола, взятого в соотношении 1:3, и экстрагирования в течение 50-60 мин при постоянном перемешивании и удалении экстрагента на вакуумном испарителе при t=28-30°C.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве иммунизирующего агента используют белково-хиноидный радиотоксин, содержащий 45-50 мл растительного белка, полученный из предварительно пророщенного в течение 6,5-7,5 суток и облученного в дозе 300-310 Гр зерна, которое выдерживают в течение 23-29 часов при 18-22°С, гомогенизируют в присутствии 96%-ного этанола в соотношении 1:3, экстрагируют при температуре 0°С, центрифугируют при 8000 об/мин, экстрагент удаляют на вакуумном испарителе и полученный продукт стандартизируют по белку до 4,5-5,5 мл.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что гипериммунную антирадиотоксическую сыворотку получают путем 4-кратного с интервалом в 14 дней внутримышечного введения радиотоксина в дозе 1,0-2,0 см³ кроликам.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сенсибилизацию наночастиц бентонита размером 75-85 нм осуществляют путем смешивания 0,19-0,20%-ной водной суспензии наночастиц бентонита с гипериммунной сывороткой в соотношении 3:7 с последующим термостатированием смеси при температуре 30°С в течение 30 мин, затем смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 7 мин, полученный осадок дважды отмывают дистиллированной водой при 3000 об/мин, супернатант декантируют, осадок ресуспендируют в дистиллированной воде до концентрации 0,19-0,20%, вносят в полученный иммунохимический комплекс индикаторный компонент - 0,1%-ную метиленовую синь из расчета 0,7 см³ на 100 см³, полученный АТБД используют для обнаружения радиотоксинов в облученных пищевых и кормовых продуктах.

6. Способ по пп. 1 и 5, отличающийся тем, что в качестве антирадиотоксического бентонитового диагностикума (АТБД) используют наночастицы бентонита размерами 75-85 нм, полученные путем обработки термоактивированной бентонитовой глины на ультразвуковой установке «УЗУ - 0,25» при 18,5 кГц, выходной мощности 80 Вт, амплитуде колебания волновода 5 мкм, которые сенсибилизируют антирадиотоксической гипериммунной сывороткой, метят индикаторным комплексом - 0,01%-ной - метиленовой синью и полученный продукт - АТБД используют в реакции бентонитовой флокуляции (РБФ) для индикации радиотоксина в облученных пищевых и кормовых продуктах.