RU2704998C1 - Method of reversible inhibition in tumor cells of hepatocellular carcinoma of gene expression coding synthesis of apolipoprotein b - Google Patents
Method of reversible inhibition in tumor cells of hepatocellular carcinoma of gene expression coding synthesis of apolipoprotein b Download PDFInfo
- Publication number
- RU2704998C1 RU2704998C1 RU2018146825A RU2018146825A RU2704998C1 RU 2704998 C1 RU2704998 C1 RU 2704998C1 RU 2018146825 A RU2018146825 A RU 2018146825A RU 2018146825 A RU2018146825 A RU 2018146825A RU 2704998 C1 RU2704998 C1 RU 2704998C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dispersion
- tumor cells
- hepatocellular carcinoma
- magnetite
- pts
- Prior art date
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа обратимого ингибирования в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека экспрессии гена, кодирующего синтез аполипопротеина В (апоВ). Обратимое ингибирование экспрессии гена, кодирующего синтез апоВ, и находящегося не только в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы, но и в гепатоцитах печени, необходимо для контроля над биохимическими процессами в живых организмах. Данное изобретение может быть использовано для снижения уровня липопротеинов низкой плотности, одним из которых является апоВ, и их метаболитов в сыворотке крови, повышенный уровень которых приводит к возникновению атеросклеротических бляшек и связан с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний.The invention relates to the field of biotechnology and relates to a method of reversible inhibition in tumor cells of human hepatocellular carcinoma of the expression of a gene encoding the synthesis of apolipoprotein B (apoB). Reversible inhibition of the expression of a gene encoding apoB synthesis, and located not only in tumor cells of hepatocellular carcinoma, but also in liver hepatocytes, is necessary to control biochemical processes in living organisms. This invention can be used to reduce the level of low density lipoproteins, one of which is apoB, and their metabolites in serum, an increased level of which leads to the appearance of atherosclerotic plaques and is associated with the risk of developing cardiovascular diseases.
Известен способ обратимого ингибирования в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы экспрессии гена, кодирующего синтез апоВ, путем введения дисперсии липидных наночастиц, содержащих связанную с ними малую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту (миРНК), комплементарную к матричной рибонуклеиновой кислоте (мРНК), кодирующей синтез апоВ в опухолевой клетке, а также доставки миРНК с использованием липида на основе полиэтиленгликоля-2000 (Hattori Y, Machida Y, Honda M, Takeuchi N, Ohno H, Onishi H. Small interfering RNA delivery into the liver by cationic cholesterol derivative-based liposomes Journal of Liposome Research 2016; 2104. doi: 10.1080/08982104.2016.1205599).There is a method of reversible inhibition of hepatocellular carcinoma tumor cells in the expression of a gene encoding apoB synthesis by introducing a dispersion of lipid nanoparticles containing the small interfering ribonucleic acid (siRNA) associated with them, complementary to a matrix ribonucleic acid (mRNA) encoding a tumor synthesis as well as siRNA delivery using a polyethylene glycol-2000 lipid (Hattori Y, Machida Y, Honda M, Takeuchi N, Ohno H, Onishi H. Small interfering RNA delivery into the liver by cationic cholesterol derivative-based liposomes Journal of Lipos ome Research 2016; 2104. doi: 10.1080 / 08982104.2016.1205599).
Данный способ имеет такие признаки, совпадающие с существенными признаками предложенного технического решения, как введение дисперсии липидных наночастиц, содержащей связанную с ними миРНК, комплементарную к мРНК, кодирующей апоВ, в биологический объект.This method has such features that coincide with the essential features of the proposed technical solution, such as the introduction of a dispersion of lipid nanoparticles containing the associated siRNA, complementary to the mRNA encoding apoB, in a biological object.
Известен способ обратимого ингибирования в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы экспрессии гена, кодирующего синтез апоВ, путем введения в биологический объект дисперсии липидных наночастиц, содержащих связанную с ними миРНК, комплементарную к мРНК, кодирующей синтез апоВ в опухолевой клетке (Hattori Y, Takeuchi N, Nakamura M, Yoshiike Y, Taguchi M, Ohno H, et al. Effect of cationic lipid type in cationic liposomes for siRNA delivery into the liver by sequential injection of chondroitin sulfate and cationic lipoplex. J Drug Deliv Sci Technol 2018; 48: 235-44. doi: 10.1016/j.jddst.2018.09.022).There is a method of reversible inhibition of hepatocellular carcinoma tumor cells in the expression of a gene encoding apoB synthesis by introducing into a biological object a dispersion of lipid nanoparticles containing their siRNA complementary to mRNA encoding apoB synthesis in a tumor cell (Hattori Y, Takeuchi N, Nakamura, Nakamura , Yoshiike Y, Taguchi M, Ohno H, et al. Effect of cationic lipid type in cationic liposomes for siRNA delivery into the liver by sequential injection of chondroitin sulfate and cationic lipoplex. J Drug Deliv Sci Technol 2018; 48: 235-44. doi: 10.1016 / j.jddst.2018.09.022).
Данный способ имеет такие признаки, совпадающие с существенными признаками предложенного технического решения, как введение дисперсии липидных наночастиц, содержащей связанную с ними миРНК, комплементарную к мРНК, кодирующую в том числе и синтез апоВ, в биологический объект, в том числе и в опухолевые клетки.This method has such features that coincide with the essential features of the proposed technical solution, such as the introduction of a dispersion of lipid nanoparticles containing siRNA associated with them, complementary to mRNA, encoding, including apoB synthesis, in a biological object, including tumor cells.
Наиболее близким к заявляемому является известный способ обратимого ингибирования в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы экспрессии гена, кодирующего синтез апоВ, путем введения дисперсии липидных наночастиц, содержащих связанную с ними миРНК, комплементарную к мРНК, кодирующей синтез апоВ в опухолевой клетке, в среду с опухолевыми клетками (Tadin-strapps М, Peterson LB, Cumiskey A, Rosa RL, Mendoza VH, Castro-perez J, et al. siRNA-induced liver ApoB knockdown lowers serum LDL-cholesterol in a mouse model with human-like serum lipids Journal of Lipid Research, 2011; 52. doi: 10.1194/jlr.M012872 - прототип). В данном способе в качестве опухолевых клеток гепатоцеллюлярной карциномы используют опухолевые клетки Нера1-6 мыши, которые культивируют в среде DMEM (Corning, №10-013-CV), содержащей 4,5 г/л глюкозы, 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1,5 г/л бикарбоната натрия, 4 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 ед./мл пенициллина. В качестве дисперсии липидных наночастиц используют липосомы, содержащие связанную с ними миРНК, комплементарную к мРНК, кодирующую синтез апоВ.Closest to the claimed is a known method of reversible inhibition of hepatocellular carcinoma in tumor cells of the expression of a gene encoding apoB synthesis by introducing a dispersion of lipid nanoparticles containing their siRNA complementary to mRNA encoding apoB synthesis in a tumor cell in an environment with tumor cells ( Tadin-strapps M, Peterson LB, Cumiskey A, Rosa RL, Mendoza VH, Castro-perez J, et al. SiRNA-induced liver ApoB knockdown lowers serum LDL-cholesterol in a mouse model with human-like serum lipids Journal of Lipid Research , 2011; 52. doi: 10.1194 / jlr.M012872 - prototype). In this method, mouse Hepa-6 tumor cells are used as hepatocellular carcinoma tumor cells, which are cultured in DMEM medium (Corning, No. 10-013-CV) containing 4.5 g / l glucose, 10% fetal bovine serum, 1, 5 g / l sodium bicarbonate, 4 mM L-glutamine, 100 μg / ml streptomycin and 100 units / ml penicillin. As a dispersion of lipid nanoparticles, liposomes containing siRNA associated with them, complementary to mRNA, encoding apoB synthesis, are used.
Данный способ содержит такие признаки, совпадающие с существенными признаками предложенного технического решения, как введение дисперсии липидных наночастиц, содержащих связанную с ними миРНК, комплементарную к мРНК, кодирующей синтез апоВ в опухолевой клетке, в среду с опухолевыми клетками.This method contains such features that coincide with the essential features of the proposed technical solution, such as the introduction of a dispersion of lipid nanoparticles containing siRNA associated with them, complementary to mRNA encoding the synthesis of apoB in the tumor cell, in the medium with tumor cells.
Недостатком известного способа является то, что он не позволяет добиться высокого уровня обратимого ингибирования в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы экспрессии гена, кодирующего синтез апоВ, для клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека Huh7 (см. контрольный пример 4).The disadvantage of this method is that it does not allow to achieve a high level of reversible inhibition in tumor cells of hepatocellular carcinoma of the expression of the gene encoding apoB synthesis for the Huh7 human hepatocellular carcinoma cell line (see control example 4).
Техническая проблема изобретения заключается в разработке способа обратимого ингибирования в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы экспрессии гена, кодирующего синтез апоВ, лишенного вышеуказанного недостатка.The technical problem of the invention lies in the development of a method of reversible inhibition in tumor cells of hepatocellular carcinoma of the expression of a gene encoding apoB synthesis, devoid of the above drawback.
Технический результат изобретения состоит в повышении степени обратимого ингибирования в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы экспрессии гена, кодирующего синтез апоВ.The technical result of the invention is to increase the degree of reversible inhibition in tumor cells of hepatocellular carcinoma of the expression of a gene encoding apoB synthesis.
Технический результат достигается следующим образом, когда в способе обратимого ингибирования в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы экспрессии гена, кодирующего синтез аполипопротеина В, включающем введение дисперсии липидных наночастиц, содержащих связанную с ними миРНК, комплементарную к мРНК, кодирующей последовательность апоВ в опухолевой клетке, в среду с опухолевыми клетками, в качестве липидных наночастиц используют наночастицы модифицированных кристаллов магнетита, смешение 1 мас. ч. полученной дисперсии модифицированных кристаллов магнетита выполняют с раствором миРНК в водном растворе ацетата натрия, содержащем 0,05-0,20 мас. ч. миРНК, очищают полученную дисперсию повторным диализом против воды, добавляют в очищенную дисперсию натрий-фосфатного буфера до получения дисперсии с ионной силой 0,15 М, в качестве среды с опухолевыми клетками используют среду с опухолевыми клетками Huh7 гепатоцеллюлярной карциномы человека, причем после введения дисперсии липидных наночастиц в среду с опухолевыми клетками полученную смесь обрабатывают в течение 1-3 ч переменным магнитным полем с индуктивностью 50-100 миллитесла.The technical result is achieved as follows when, in a method of reversible inhibition in hepatocellular carcinoma tumor cells, expression of a gene encoding apolipoprotein B synthesis, comprising introducing a dispersion of lipid nanoparticles containing their siRNA complementary to mRNA encoding the sequence of apoB in the tumor cell into tumor cells, as the lipid nanoparticles use nanoparticles of modified magnetite crystals, a mixture of 1 wt. including the obtained dispersion of modified crystals of magnetite is performed with a solution of siRNA in an aqueous solution of sodium acetate containing 0.05-0.20 wt. including siRNAs, the resulting dispersion is purified by repeated dialysis against water, added to the purified dispersion of sodium phosphate buffer to obtain a dispersion with an ionic strength of 0.15 M; medium with tumor cells using human Huh7 tumor cell hepatocellular carcinoma is used, and after administration dispersion of lipid nanoparticles into a medium with tumor cells, the resulting mixture is treated for 1-3 hours with an alternating magnetic field with an inductance of 50-100 millitesla.
Следует отметить, что уровень обратимого ингибирования экспрессии гена, кодирующего синтез апоВ, в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы зависит от типа клеточной линии. При этом наличие высокого уровня ингибирования для одной клеточной линии никоем образом не гарантирует высокого уровня ингибирования для другой линии. Так, например, высокий уровень обратимого ингибирования для опухолевых клеток Нера1-6 мыши не гарантирует аналогичного эффекта для клеточных линий человека.It should be noted that the level of reversible inhibition of gene expression encoding apoB synthesis in tumor cells of hepatocellular carcinoma depends on the type of cell line. However, the presence of a high level of inhibition for one cell line in no way guarantees a high level of inhibition for another line. For example, a high level of reversible inhibition for mouse Hera1-6 tumor cells does not guarantee a similar effect for human cell lines.
Предлагаемый способ является новым и не описан в патентной и научно-технической литературе.The proposed method is new and is not described in the patent and scientific literature.
В предложенном техническом решении липидные наночастицы обязательно должны содержать связанную с ними миРНК, комплементарную к мРНК, кодирующей синтез апоВ. При этом если в предлагаемом способе в качестве миРНК использовать миРНК с другой последовательностью нуклеотидов, то предлагаемый способ становится неработоспособным.In the proposed technical solution, lipid nanoparticles must necessarily contain the associated siRNA complementary to the mRNA encoding apoB synthesis. Moreover, if in the proposed method, siRNA with a different nucleotide sequence is used as siRNA, the proposed method becomes inoperative.
Если использованную в предлагаемом техническом решении линию опухолевых клеток гепатоцеллюлярной карциномы заменить на любую другую линию опухолевых клеток, где не экспрессируется ген, кодирующий синтез апоВ, то предложенный способ также становится неработоспособным.If the tumor cell line of the hepatocellular carcinoma used in the proposed technical solution is replaced by any other tumor cell line where the gene encoding apoB synthesis is not expressed, the proposed method also becomes inoperative.
В предлагаемом способе используют исходные наночастицы кристаллов магнетита с размером 23-27 нм. Метод получения частиц магнетита с указанными размерами раннее описан в патенте RU №2668440, МПК С30В 29/16 (2006.01), 2017. Методом просвечивающей электронной микроскопии было показано, что полученные кристаллы имеют кубическую форму с размером (со стороной) 23-27±1 нм. С помощью дифрактометра Rigaku Smartlab было выявлено, что положение рентгеновских рефлексов полученных кристаллов соответствует справочным значениям рефлексов магнетита.In the proposed method, the original nanoparticles of magnetite crystals with a size of 23-27 nm are used. The method for producing magnetite particles with the indicated sizes was previously described in patent RU No. 2668440, IPC С30В 29/16 (2006.01), 2017. Using transmission electron microscopy, it was shown that the obtained crystals have a cubic shape with a size (side) of 23-27 ± 1 nm Using a Rigaku Smartlab diffractometer, it was found that the position of the X-ray reflections of the obtained crystals corresponds to reference values of magnetite reflections.
Получение наночастиц магнетита, покрытых указанным в предложенном техническом решении липидным слоем, также описано в патенте №2656667, МПК С30В 29/16 (2006.01), 2017, в котором модифицированные кристаллы магнетита получают путем смешения 138 мас. ч. кристаллов магнетита и 1 мас. ч. смеси холестерина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ола и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоля)-2000, взятых в массовом соотношении 15:7:75:3, соответственно, вначале с 60000 мас. ч. хлороформа, затем 82240 мас. ч. N-метил-2-пирролидона, обработки смеси ультразвуком, удаления хлороформа и добавления в нее воды с последующим диализом полученной дисперсии модифицированных кристаллов магнетита против воды. После дополнительной модификации флуоресцентным красителем полученные частицы ранее были использованы для визуализации введенных в биологический объект наночастиц. Использование вышеуказанных модифицированных липидами наночастиц магнетита для связывания с миРНК, ингибирующего экспрессию гена, кодирующего синтез апоВ, в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы, в литературе не описано.The preparation of magnetite nanoparticles coated with the lipid layer indicated in the proposed technical solution is also described in patent No. 2656667, IPC С30В 29/16 (2006.01), 2017, in which modified magnetite crystals are obtained by mixing 138 wt. including crystals of magnetite and 1 wt. including a mixture of cholesterol, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1,1 '- (2- (4- (2 - ((2- (bis (2-hydroxy-dodecyl) amino) ethyl) (2 -hydroxydecyl) amino) ethyl) piperazin-1-yl) ethylazanediyl) didodecan-2-ol and 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-methoxy (polyethylene glycol) -2000, taken in a mass ratio of 15: 7: 75: 3, respectively, initially with 60,000 wt. including chloroform, then 82240 wt. including N-methyl-2-pyrrolidone, sonicating the mixture, removing chloroform and adding water to it, followed by dialysis of the resulting dispersion of modified magnetite crystals against water. After additional modification with a fluorescent dye, the obtained particles were previously used to visualize nanoparticles introduced into a biological object. The use of the above lipid-modified magnetite nanoparticles to bind to siRNA that inhibits the expression of the gene encoding apoB synthesis in tumor cells of hepatocellular carcinoma is not described in the literature.
Используемые в предложенном техническом решении оптимальный размер наночастиц исходного магнетита 23-27 нм, а также оптимальный качественный и количественный состав смеси липидов, используемой для модификации поверхности кристаллов магнетита, оптимальные массовые соотношения исходных кристаллов магнетита, смеси липидов, хлороформа, N-метил-2-пирролидона, воды, в том числе оптимальное соотношение между содержанием магнетита в дисперсии и концентрацией миРНК в водном растворе ацетата натрия, а также оптимальные продолжительности обработки смеси ультразвуком, диализа полученной дисперсии против воды, обработки магнитным полем опухолевых клеток гепатоцеллюлярной карциномы Huh7, смешанных с дисперсией модифицированных частиц, содержащих миРНК, оптимальная мощность ультразвука, оптимальный размер пор в используемом диализном мешке, а также оптимальные частота переменного магнитного поля и его индуктивность были установлены экспериментально.Used in the proposed technical solution, the optimal nanoparticle size of the initial magnetite is 23-27 nm, as well as the optimal qualitative and quantitative composition of the lipid mixture used to modify the surface of magnetite crystals, the optimal mass ratios of the initial magnetite crystals, a mixture of lipids, chloroform, N-methyl-2- pyrrolidone, water, including the optimal ratio between the magnetite content in the dispersion and the concentration of siRNA in an aqueous solution of sodium acetate, as well as the optimal duration of processing mixtures of ultrasound, dialysis of the obtained dispersion against water, magnetic field treatment of tumor cells of Huh7 hepatocellular carcinoma mixed with dispersion of modified particles containing siRNA, optimal ultrasound power, optimal pore size in the used dialysis bag, as well as optimal frequency of the alternating magnetic field and its inductance were installed experimentally.
При осуществлении данного способа смешения дисперсии модифицированных кристаллов магнетита с раствором миРНК в водном растворе ацетата натрия, водный раствор ацетата натрия должен содержать не менее 0,05 мас. ч. миРНК, поскольку при меньшем ее содержании происходит агрегация частиц магнетита. Верхний предел массового содержания миРНК в водном растворе ацетата натрия в принципе не лимитирован, однако, во избежание лишнего расхода миРНК целесообразно использовать интервал 0,05-0,20 мас. ч. миРНК. Следует отметить, что повторный диализ дисперсии против воды можно проводить в течение различного времени, например, в течение 24-48 ч При этом целесообразно использовать диализные мешки с размером пор не менее 25 кДа, поскольку при меньшем размере пор затруднена диффузия несвязанной миРНК через поры мембраны. Перед смешением очищенной дисперсии липидных наночастиц, содержащей миРНК, с опухолевыми клетками преимущественно следует проводить очистку дисперсии от контаминирующих ее микроорганизмов путем шприцевой фильтрации через фильтр с размером пор не более 0,45 мкм, поскольку при большем размере пор появляется возможность проникновения микроорганизмов через поры. Однако, необходимость вышеуказанной стадии дополнительной фильтрации дисперсии зависит от уровня стерильности в рабочем помещении и в стерильных условиях не является обязательной.When implementing this method of mixing a dispersion of modified magnetite crystals with a solution of siRNA in an aqueous solution of sodium acetate, the aqueous solution of sodium acetate should contain at least 0.05 wt. including siRNA, since at a lower content there is an aggregation of magnetite particles. The upper limit of the mass content of siRNA in an aqueous solution of sodium acetate is in principle not limited, however, in order to avoid excessive consumption of siRNA, it is advisable to use the interval 0.05-0.20 wt. including siRNA. It should be noted that re-dialysis of the dispersion against water can be carried out for different times, for example, within 24-48 hours. It is advisable to use dialysis bags with a pore size of at least 25 kDa, since with a smaller pore size diffusion of unbound siRNA through the pores of the membrane is difficult . Before mixing the purified dispersion of lipid nanoparticles containing siRNA with tumor cells, it is preferable to purify the dispersion from microorganisms contaminating it by syringe filtration through a filter with a pore size of not more than 0.45 μm, since with a larger pore size, microorganisms can penetrate through the pores. However, the need for the above stage of additional filtration of the dispersion depends on the level of sterility in the working room and under sterile conditions is not mandatory.
В предлагаемом техническом решении смесь обрабатывают переменным магнитным полем, т.е. полем с переменным вектором намагниченности, при этом частота переменного магнитного поля может быть различна и составлять, например, 37-45 герц. Если вместо переменного магнитного поля использовать постоянное магнитное поле, то технический результат не достигается. Оптимальные значения индуктивности магнитного поля 50-100 миллитесла были установлены экспериментально.In the proposed technical solution, the mixture is treated with an alternating magnetic field, i.e. field with a variable magnetization vector, while the frequency of the alternating magnetic field can be different and make, for example, 37-45 hertz. If instead of an alternating magnetic field a constant magnetic field is used, then the technical result is not achieved. The optimal values of the magnetic field inductance of 50-100 millitesla were established experimentally.
Перед введением полученных дисперсий в среду с опухолевыми клетками проводят стандартные процедуры определения содержания железа в дисперсии с последующим его пересчетом на магнетит и определения содержания в ней миРНК.Before introducing the obtained dispersions into the medium with tumor cells, standard procedures are carried out to determine the iron content in the dispersion, followed by its conversion to magnetite and determine the content of siRNA in it.
Во всех примерах измерение концентрации железа осуществляют посредством феррозинового теста. При этом 20 мкл дисперсии смешивают с 80 мкл концентрированной соляной кислоты, после чего в раствор добавляют 900 мкл дистиллированной воды, из полученного раствора отбирают 100 мкл и разбавляют 900 мкл дистиллированной воды, после чего 400 мкл этого раствора смешивают с 200 мкл дистиллированной воды и 40 мкл заранее приготовленного феррозинового теста. Концентрацию определяют фотометрически по заранее приготовленной калибровочной кривой.In all examples, the measurement of iron concentration is carried out by means of a ferrosin test. In this case, 20 μl of the dispersion is mixed with 80 μl of concentrated hydrochloric acid, after which 900 μl of distilled water is added to the solution, 100 μl is taken from the resulting solution and 900 μl of distilled water is diluted, after which 400 μl of this solution is mixed with 200 μl of distilled water and 40 μl of a pre-prepared ferrosin test. The concentration is determined photometrically from a pre-prepared calibration curve.
Во всех примерах измерение концентрации миРНК проводят методом спектрофлуориметрии (Spectramax М5) с использованием теста Quant-iT RiboGreen RNA. Кривые строят непосредственно перед измерением с учетом фона. Равные концентрации липидоподобных наночастиц в буфере инкубируют с флуоресцентным красителем RiboGreen и измеряют флуоресценцию. Эффективность инкапсулирования рассчитывают как отношение концентрации связанной миРНК к изначально добавляемой концентрации миРНК к частицам.In all examples, the measurement of siRNA concentration is carried out by spectrofluorimetry (Spectramax M5) using the Quant-iT RiboGreen RNA test. Curves are plotted immediately before the measurement, taking into account the background. Equal concentrations of lipid-like nanoparticles in the buffer are incubated with RiboGreen fluorescent dye and fluorescence is measured. Encapsulation efficiency is calculated as the ratio of the concentration of bound siRNA to the initially added concentration of siRNA to particles.
В предлагаемом способе степень обратимого ингибирования экспрессии вышеуказанного гена определяют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией путем последовательного выделения РНК согласно рекомендациям производителя Trizol реагента, оценки концентрации полученной РНК с использованием спектрофотометра NanoDrop™ One/OneC Microvolume UV-Vis. Комплементарную ДНК (кДНК) получают в реакции обратной транскрипции с помощью фермента обратной транскриптазы (набор для синтеза кДНК Maxima First Strand для RT-qPCR). Полученную кДНК используют для количественной ПЦР.In the proposed method, the degree of reversible inhibition of the expression of the above gene is determined by reverse transcription polymerase chain reaction (PCR) by sequential isolation of RNA according to the recommendations of the manufacturer Trizol reagent, assessing the concentration of RNA obtained using a NanoDrop ™ One / OneC Microvolume UV-Vis spectrophotometer. Complementary DNA (cDNA) is obtained in the reverse transcription reaction using the reverse transcriptase enzyme (Maxima First Strand cDNA synthesis kit for RT-qPCR). The resulting cDNA is used for quantitative PCR.
Следует отметить, что ингибирование экспрессии гена является обратимым из-за последующего восстановления экспрессии гена, вызванного процессом транскрипции мРНК (Summerton JE. Morpholino, siRNA, and S-DNA Compared: Impact of Structure and Mechanism of Action on Off-Target Effects and Sequence Specificity 2007: 651-60).It should be noted that inhibition of gene expression is reversible due to subsequent restoration of gene expression caused by the mRNA transcription process (Summerton JE. Morpholino, siRNA, and S-DNA Compared: Impact of Structure and Mechanism of Action on Off-Target Effects and Sequence Specificity 2007: 651-60).
Экспериментально было показано, что в предлагаемом способе использование переменного магнитного поля с определенной продолжительностью и индуктивностью позволяет повысить степень обратимого ингибирования в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы экспрессии гена, кодирующего синтез апоВ, в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека.It was experimentally shown that in the proposed method, the use of an alternating magnetic field with a certain duration and inductance can increase the degree of reversible inhibition of the expression of the gene encoding apoB synthesis in tumor cells of human hepatocellular carcinoma in tumor cells of hepatocellular carcinoma.
Преимущества предлагаемого способа иллюстрируют следующие примеры.The advantages of the proposed method are illustrated by the following examples.
Пример 1Example 1
В трехгорлую колбу, помещенную в масляную баню и снабженную обратным холодильником, высокотемпературным термометром и системой подачи инертного газа, при комнатной температуре вводят 20,0 мл октадецена, 1,800 г олеата железа(III), 0,570 г олеиновой кислоты и 1,220 г олеата натрия. Затем включают нагрев масляной бани, содержимое колбы нагревают до 70°С со скоростью 6°С/мин и выдерживают при этой температуре в течение 30 мин. В колбу подают ток азота, после дегазации содержимого колбы ее нагревают с 70°С до 320°С со скоростью 2°С/мин с постепенным увеличением мощности плитки. Колбу выдерживают при 320°С в течение 25 мин, затем извлекают из масляной бани и содержимое колбы оставляют остывать до комнатной температуры, проводя эти стадии синтеза в атмосфере азота. Через 30 мин содержимое колбы выливают в химический стакан, содержащий 80,0 мл осадителя изопропанола, после чего содержимое стакана перемешивают. Выпавший в осадок кристаллы магнетита отделяют магнитной декантацией, затем их переносят в химический стакан, содержащий 10,0 мл триоктиламина, 0,284 г олеиновой кислоты и 0,912 г олеата натрия, и диспергируют путем перемешивания. Полученную дисперсию переносят в ранее использованную трехгорлую колбу. Содержимое колбы продувают азотом, колбу помещают в масляную баню и нагревают до 350°С со скоростью 2°С/мин, после чего туда в атмосфере азота по каплям вводят раствор 18,000 г олеата железа(III) в 22,0 мл триоктиламина в течение 10 ч. Затем колбу извлекают из масляной бани и охлаждают до комнатной температуры, проводя эти стадии синтеза в атмосфере азота. После чего содержимое колбы переносят в химический стакан, содержащий 200,0 мл осадителя изопропанола. Выпавший магнетит отделяют от остальных компонентов реакционной смеси методом магнитной декантации, затем сушат до постоянной массы. Получают 1,701 г кристаллов магнетита с размером 25 нм.20.0 ml of octadecene, 1.800 g of iron (III) oleate, 0.570 g of oleic acid and 1.220 g of sodium oleate are introduced into a three-necked flask, placed in an oil bath and equipped with a reflux condenser, high-temperature thermometer and inert gas supply system. Then include heating the oil bath, the contents of the flask are heated to 70 ° C at a rate of 6 ° C / min and kept at this temperature for 30 minutes A nitrogen stream is supplied to the flask; after degassing the contents of the flask, it is heated from 70 ° C to 320 ° C at a rate of 2 ° C / min with a gradual increase in tile power. The flask was kept at 320 ° C for 25 min, then removed from the oil bath and the contents of the flask were allowed to cool to room temperature, conducting these synthesis steps in a nitrogen atmosphere. After 30 minutes, the contents of the flask were poured into a beaker containing 80.0 ml of isopropanol precipitant, after which the contents of the beaker were mixed. The precipitated magnetite crystals are separated by magnetic decantation, then they are transferred into a beaker containing 10.0 ml of trioctylamine, 0.284 g of oleic acid and 0.912 g of sodium oleate, and dispersed by stirring. The resulting dispersion is transferred to a previously used three-necked flask. The contents of the flask were purged with nitrogen, the flask was placed in an oil bath and heated to 350 ° C at a rate of 2 ° C / min, after which a solution of 18,000 g of iron (III) oleate in 22.0 ml of trioctylamine was dropwise added thereto over 10 h. Then the flask is removed from the oil bath and cooled to room temperature, carrying out these stages of synthesis in a nitrogen atmosphere. After that, the contents of the flask are transferred into a beaker containing 200.0 ml of isopropanol precipitant. The precipitated magnetite is separated from the remaining components of the reaction mixture by magnetic decantation, then dried to constant weight. Obtain 1.701 g of magnetite crystals with a size of 25 nm.
345 мг (138 мас. ч.) полученных кристаллов магнетита и 2,5 мг (1 мас. ч.) смеси холестерина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ола и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоля)-2000, взятых в массовом соотношении 15:7:75:3, соответственно, смешивают вначале с 100 мл (60000 мас. ч.) хлороформа, затем с 200 мл (82240 мас. ч.) N-метил-2-пирролидона, после чего полученную смесь обрабатывают в течение 6 ч ультразвуком мощностью 580 Вт с использованием ультразвуковой бани. После этого смесь переносят в круглодонную колбу и хлороформ удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме при температуре 40°С. Затем в колбу добавляют 1000 мл воды, содержимое колбы переносят в мешок для диализа с размером пор 25 кДа и проводят диализ дисперсии против воды продолжительностью 24 ч. Получают разбавленную водную дисперсию модифицированных кристаллов магнетита, которую концентрируют до 250 мл с концентрацией 1,38 мг/мл путем удаления части воды с использованием роторного испарителя.345 mg (138 parts by weight) of the obtained magnetite crystals and 2.5 mg (1 parts by weight) of a mixture of cholesterol, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1,1 '- (2- ( 4- (2 - ((2- (bis (2-hydroxydedecyl) amino) ethyl) (2-hydroxydecyl) amino) ethyl) piperazin-1-yl) ethylazanediyl) didodecan-2-ol and 1,2-dimyristoyl-sn -glycero-methoxy (polyethylene glycol) -2000, taken in a mass ratio of 15: 7: 75: 3, respectively, is first mixed with 100 ml (60,000 parts by weight) of chloroform, then with 200 ml (82240 parts by weight) N -methyl-2-pyrrolidone, after which the resulting mixture was treated for 6 hours with ultrasound power of 580 W using ultra ƃ bath. After that, the mixture was transferred to a round bottom flask and chloroform was removed using a rotary evaporator in vacuum at a temperature of 40 ° C. Then 1000 ml of water was added to the flask, the contents of the flask were transferred to a dialysis bag with a pore size of 25 kDa and the dispersion was dialyzed against water for 24 hours. A diluted aqueous dispersion of modified magnetite crystals was obtained, which was concentrated to 250 ml with a concentration of 1.38 mg / ml by removing part of the water using a rotary evaporator.
50 мл полученной дисперсии, содержащей 116 мг (1 мас. ч.) модифицированных липидами кристаллов магнетита, смешивают с 10 мл водного раствора ацетата натрия с концентрацией 25 мМ, содержащего 23,20 мг (0,20 мас. ч.) миРНК. Затем полученную дисперсию помещают в диализный мешок с размером пор 25 кДа и проводят очистку полученной дисперсии диализом против воды в течение 48 ч. Очищенную дисперсию переносят в шприц и в стерильных условиях проводят ее стерилизацию путем фильтрации через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм. В стерильной дисперсии вышеописанным способом определяют содержание железа с последующим его пересчетом на магнетит, а также определяют содержание в ней миРНК.50 ml of the obtained dispersion containing 116 mg (1 part by weight) of lipid-modified magnetite crystals are mixed with 10 ml of an aqueous solution of sodium acetate with a concentration of 25 mM containing 23.20 mg (0.20 parts by weight) of siRNA. Then, the resulting dispersion is placed in a dialysis bag with a pore size of 25 kDa and the resulting dispersion is purified by dialysis against water for 48 hours. The purified dispersion is transferred to a syringe and sterilized under sterile conditions by filtration through a 0.22 μm syringe filter. In a sterile dispersion, in the manner described above, the iron content is determined, followed by its conversion to magnetite, and the content of siRNA in it is also determined.
Одну таблетку стандартного натрий-фосфатного таблетированного буфера марки Gibco® PBS Tablet растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Далее 5 мл буфера добавляют к 45 мл стерилизованной дисперсии с получением дисперсии с ионной силой 0,15 М.One tablet of Gibco® PBS Tablet standard sodium phosphate tablet buffer is dissolved in 10 ml of distilled water. Next, 5 ml of the buffer is added to 45 ml of the sterilized dispersion to obtain a dispersion with an ionic strength of 0.15 M.
Клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека Huh7 высевают в 12-луночный планшет в количестве 2×105 клеток в лунке в среде DMEM (Corning, №10-013-CV), содержащей 4,5 г/л глюкозы, 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 4 мМ L-глутамина. Затем в каждую из лунок вводят аликвоты ранее полученной стерильной дисперсии с конечной концентрацией миРНК в клеточной среде равной 20 наномоль/л и общим конечным объемом смеси по 1 мл в каждой лунке. Культуральный планшет после 2 ч инкубации при 37°С в атмосфере воздуха, содержащего 5% CO2, помещают в генератор переменного магнитного поля марки Tor 03/15 НТ и включают магнитное поле с частотой 45 герц и индуктивностью 50 миллитесла. Общее время нахождения в магнитном поле - 1 ч. Далее культуральный планшет помещают в инкубатор, где оставляют при 37°С в атмосфере воздуха, содержащего 5% CO2, на 48 ч. Степень обратимого ингибирования в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы экспрессии гена, кодирующего синтез апоВ, составляет 92%.Huh7 human hepatocellular carcinoma cells are seeded in a 2-well plate in an amount of 2 × 10 5 cells per well in DMEM medium (Corning, No. 10-013-CV) containing 4.5 g / l glucose, 10% fetal bovine serum and 4 mM L-Glutamine. Then, aliquots of the previously obtained sterile dispersion with a final concentration of siRNA in the cell medium equal to 20 nanomol / L and a total final volume of the mixture of 1 ml in each well are introduced into each well. The culture plate, after 2 hours of incubation at 37 ° C in an atmosphere of air containing 5% CO 2 , is placed in a Tor 03/15 NT alternating magnetic field generator and a magnetic field with a frequency of 45 hertz and an inductance of 50 millitesla is turned on. The total residence time in a magnetic field is 1 hour. Next, the culture plate is placed in an incubator, where it is left at 37 ° C in an atmosphere of air containing 5% CO 2 for 48 hours. The degree of reversible inhibition of the expression of a gene encoding synthesis in tumor cells of hepatocellular carcinoma apoV is 92%.
Пример 2.Example 2
В трехгорлую колбу, помещенную в масляную баню и снабженную обратным холодильником, высокотемпературным термометром и системой подачи инертного газа, при комнатной температуре вводят 15,0 мл октадецена, 0,900 г олеата железа(III), 0,280 г олеиновой кислоты и 0,610 г олеата натрия. Затем включают нагрев масляной бани, содержимое колбы нагревают до 70°С со скоростью 5°С/мин и выдерживают при этой температуре в течение 30 мин. В колбу подают ток аргона и после дегазации содержимого колбы ее нагревают с 70°С до 320°С со скоростью 5°С/мин, затем содержимое колбы выдерживают при 320°С в течение 30 мин, после чего колбу извлекают из масляной бани и оставляют остывать до комнатной температуры в атмосфере аргона. Через 60 мин содержимое колбы выливают в химический стакан, содержащий 30 мл осадителя изопропанола, после чего содержимое стакана перемешивают. Выпавшие в осадок кристаллы магнетита отделяют магнитной декантацией, затем их переносят в химический стакан, содержащий 8,0 мл октадецена, 0,057 г олеиновой кислоты и 0,180 г олеата натрия, и диспергируют путем перемешивания. Полученную дисперсию переносят в ранее использованную трехгорлую колбу. Содержимое колбы продувают аргоном, колбу помещают в масляную баню и нагревают со скоростью 5°С/мин до 318°С, после чего туда в атмосфере аргона по каплям вводят раствор 9,00 г олеата железа(III) в 18 мл октадецена в течение 5 ч. Затем колбу извлекают из масляной бани и охлаждают до комнатной температуры, проводя эти стадии синтеза в атмосфере аргона. После этого содержимое колбы переносят в химический стакан, содержащий 110 мл осадителя изопропанола. Выпавший магнетит отделяют от остальных компонентов реакционной смеси методом магнитной декантации, затем сушат до постоянной массы. Получают 0,851 г кристаллов магнетита с размером 23 нм.15.0 ml of octadecene, 0.900 g of iron (III) oleate, 0.280 g of oleic acid and 0.610 g of sodium oleate are introduced into a three-necked flask, placed in an oil bath and equipped with a reflux condenser, high-temperature thermometer and inert gas supply system. Then include heating the oil bath, the contents of the flask are heated to 70 ° C at a speed of 5 ° C / min and kept at this temperature for 30 minutes An argon current is introduced into the flask and after degassing the contents of the flask, it is heated from 70 ° C to 320 ° C at a speed of 5 ° C / min, then the contents of the flask are kept at 320 ° C for 30 minutes, after which the flask is removed from the oil bath and left cool to room temperature in argon atmosphere. After 60 minutes, the contents of the flask were poured into a beaker containing 30 ml of the precipitant isopropanol, after which the contents of the beaker were mixed. The precipitated crystals of magnetite are separated by magnetic decantation, then they are transferred into a beaker containing 8.0 ml of octadecene, 0.057 g of oleic acid and 0.180 g of sodium oleate, and dispersed by stirring. The resulting dispersion is transferred to a previously used three-necked flask. The contents of the flask are purged with argon, the flask is placed in an oil bath and heated at a rate of 5 ° C / min to 318 ° C, after which a solution of 9.00 g of iron (III) oleate in 18 ml of octadecene is added dropwise thereto over 5 h. Then the flask is removed from the oil bath and cooled to room temperature, carrying out these stages of synthesis in an argon atmosphere. After that, the contents of the flask are transferred into a beaker containing 110 ml of isopropanol precipitant. The precipitated magnetite is separated from the remaining components of the reaction mixture by magnetic decantation, then dried to constant weight. Obtain 0.851 g of magnetite crystals with a size of 23 nm.
691 мг (138 мас. ч.) полученных кристаллов магнетита и 5 мг (1 мас. ч.) смеси холестерина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ола и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоля)-2000, взятых в массовом соотношении 15:7:75:3, соответственно, смешивают вначале с 200 мл (60000 мас. ч.) хлороформа, затем с 400 мл (82240 мас. ч.) N-метил-2-пирролидона, после чего полученную смесь обрабатывают в течение 7 ч ультразвуком мощностью 290 Вт с использованием ультразвуковой бани. После этого смесь переносят в круглодонную колбу и хлороформ удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме при температуре 43°С. Затем в колбу добавляют 1600 мл воды, содержимое колбы переносят в мешок для диализа с размером пор 50 кДа и проводят диализ дисперсии против воды продолжительностью 48 ч. Получают разбавленную водную дисперсию модифицированных кристаллов магнетита, которую концентрируют до 246 мл путем удаления части воды с использованием роторного испарителя.691 mg (138 parts by weight) of the obtained magnetite crystals and 5 mg (1 parts by weight) of a mixture of cholesterol, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1,1 '- (2- (4- (2 - ((2- (bis (2-hydroxydedecyl) amino) ethyl) (2-hydroxydecyl) amino) ethyl) piperazin-1-yl) ethylazanediyl) didodecan-2-ol and 1,2-dimyristoyl-sn-glycero -methoxy (polyethylene glycol) -2000, taken in a mass ratio of 15: 7: 75: 3, respectively, is first mixed with 200 ml (60,000 parts by weight) of chloroform, then with 400 ml (82240 parts by weight) of N-methyl -2-pyrrolidone, after which the resulting mixture is treated for 7 hours with ultrasound power of 290 W using ultrasound ukovoy bath. After that, the mixture was transferred to a round bottom flask and chloroform was removed using a rotary evaporator in vacuum at a temperature of 43 ° C. Then 1600 ml of water was added to the flask, the contents of the flask were transferred to a dialysis bag with a pore size of 50 kDa and the dispersion was dialyzed against water for 48 hours. A diluted aqueous dispersion of modified magnetite crystals was obtained, which was concentrated to 246 ml by removing part of the water using rotary evaporator.
100 мл полученной дисперсии, содержащей 309 мг (1 мас. ч.) модифицированных липидами кристаллов магнетита, смешивают с 10 мл водного раствора ацетата натрия с концентрацией 25 мМ, содержащего 15,45 мг (0,05 мас. ч.) миРНК. Затем полученную дисперсию помещают в диализный мешок с размером пор 50 кДа и проводят очистку полученной дисперсии диализом против воды в течение 36 ч. Очищенную дисперсию переносят в шприц и в стерильных условиях проводят ее стерилизацию путем фильтрации через шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм. В стерильной дисперсии вышеописанным способом определяют содержание железа с последующим его пересчетом на магнетит, а также определяют содержание в ней миРНК.100 ml of the obtained dispersion containing 309 mg (1 parts by weight) of lipid-modified magnetite crystals are mixed with 10 ml of an aqueous solution of sodium acetate with a concentration of 25 mM containing 15.45 mg (0.05 parts by weight) of siRNA. Then, the resulting dispersion is placed in a dialysis bag with a pore size of 50 kDa and the resulting dispersion is purified by dialysis against water for 36 hours. The purified dispersion is transferred to a syringe and sterilized under sterile conditions by filtration through a 0.22 μm syringe filter. In a sterile dispersion, in the manner described above, the iron content is determined, followed by its conversion to magnetite, and the content of siRNA in it is also determined.
Одну таблетку стандартного натрий-фосфатного таблетированного буфера марки Gibco® PBS Tablet растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Далее 5 мл буфера добавляют к 45 мл стерилизованной дисперсии с получением дисперсии с ионной силой 0,15 М.One tablet of Gibco® PBS Tablet standard sodium phosphate tablet buffer is dissolved in 10 ml of distilled water. Next, 5 ml of the buffer is added to 45 ml of the sterilized dispersion to obtain a dispersion with an ionic strength of 0.15 M.
Клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека Huh7 высевают в 12-луночный планшет в количестве 2×105 клеток в лунке в среде DMEM (Corning, №10-013-CV), содержащей 4,5 г/л глюкозы, 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 4 мМ L-глутамина. Затем в каждую из лунок вводят аликвоты ранее полученной стерильной дисперсии с конечной концентрацией миРНК в клеточной среде равной 20 наномоль/л и общим конечным объемом смеси по 1 мл в каждой лунке. Культуральный планшет после 2 ч инкубации при 37°С в атмосфере воздуха, содержащего 5% CO2, помещают в генератор переменного магнитного поля и включают магнитное поле с частотой 45 герц и индуктивностью 80 миллитесла. Общее время нахождения в магнитном поле - 2 ч. Далее культуральный планшет помещают в инкубатор, где оставляют при 37°С в атмосфере воздуха, содержащего 5% CO2, на 48 ч. Степень обратимого ингибирования в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы экспрессии гена, кодирующего синтез апоВ, составляет 88%.Huh7 human hepatocellular carcinoma cells are seeded in a 2-well plate in an amount of 2 × 10 5 cells per well in DMEM medium (Corning, No. 10-013-CV) containing 4.5 g / l glucose, 10% fetal bovine serum and 4 mM L-Glutamine. Then, aliquots of the previously obtained sterile dispersion with a final concentration of siRNA in the cell medium equal to 20 nanomol / L and a total final volume of the mixture of 1 ml in each well are introduced into each well. A culture plate after 2 hours of incubation at 37 ° C in an atmosphere of air containing 5% CO 2 is placed in an alternating magnetic field generator and a magnetic field with a frequency of 45 hertz and an inductance of 80 millitesla is turned on. The total time spent in a magnetic field is 2 hours. Next, the culture plate is placed in an incubator, where it is left at 37 ° C in an atmosphere of air containing 5% CO 2 for 48 hours. The degree of reversible inhibition of the expression of a gene encoding synthesis in tumor cells of hepatocellular carcinoma apoV is 88%.
Пример 3.Example 3
В трехгорлую колбу, помещенную в масляную баню и снабженную обратным холодильником, высокотемпературным термометром и системой подачи инертного газа, при комнатной температуре вводят 25,0 мл октадецена, 0,177 г ацетилацетоната железа(III), 0,142 г олеиновой кислоты и 0,456 г олеата натрия. Затем включают нагрев масляной бани, содержимое колбы нагревают до 70°С со скоростью 2°С/мин и выдерживают при этой температуре в течение 30 мин. В колбу подают ток аргона и после дегазации содержимого колбы ее нагревают с 70°С до 320°С со скоростью 4°С/мин, затем колбу выдерживают при 320°С в течение 60 мин, после чего колбу извлекают из масляной бани и содержимое колбы оставляют остывать до комнатной температуры, проводя эти стадии синтеза в атмосфере аргона. Через 120 мин содержимое колбы выливают в химический стакан, содержащий 75,0 мл осадителя изопропанола, после чего содержимое стакана перемешивают. Выпавшие в осадок кристаллов магнетита отделяют магнитной декантацией, затем их переносят в химический стакан, содержащий 12,0 мл дибензилового эфира, 0,068 г олеиновой кислоты и 0,219 г олеата натрия, и диспергируют путем перемешивания. Полученную дисперсию переносят в ранее использованную трехгорлую колбу. Содержимое колбы продувают аргоном, колбу помещают в масляную баню и нагревают до 290°С со скоростью 6°С/мин. После чего туда в атмосфере аргона по каплям подают раствор 1,368 г олеата железа(III) в 38,0 мл дибензилового эфира в течение 1 ч, затем колбу извлекают из масляной бани и охлаждают до комнатной температуры, проводя эти стадии синтеза в атмосфере аргона, и содержимое колбы переносят в химический стакан, содержащий 100,0 мл осадителя изопропанола. Выпавший магнетит отделяют от остальных компонентов реакционной смеси методом магнитной декантации, затем сушат до постоянной массы. Получают 0,155 г кристаллов магнетита с размером 27 нм.25.0 ml of octadecene, 0.177 g of iron (III) acetylacetonate, 0.142 g of oleic acid and 0.456 g of sodium oleate are introduced into a three-necked flask, placed in an oil bath and equipped with a reflux condenser, a high-temperature thermometer and an inert gas supply system. Then include heating the oil bath, the contents of the flask are heated to 70 ° C at a rate of 2 ° C / min and kept at this temperature for 30 minutes An argon current is introduced into the flask and after degassing the contents of the flask, it is heated from 70 ° C to 320 ° C at a speed of 4 ° C / min, then the flask is kept at 320 ° C for 60 minutes, after which the flask is removed from the oil bath and the contents of the flask allowed to cool to room temperature, carrying out these stages of synthesis in an argon atmosphere. After 120 minutes, the contents of the flask are poured into a beaker containing 75.0 ml of the precipitant isopropanol, after which the contents of the beaker are mixed. The precipitated crystals of magnetite are separated by magnetic decantation, then they are transferred to a beaker containing 12.0 ml of dibenzyl ether, 0.068 g of oleic acid and 0.219 g of sodium oleate, and dispersed by stirring. The resulting dispersion is transferred to a previously used three-necked flask. The contents of the flask are purged with argon, the flask is placed in an oil bath and heated to 290 ° C at a rate of 6 ° C / min. After that, a solution of 1.388 g of iron (III) oleate in 38.0 ml of dibenzyl ether is added dropwise thereto in an argon atmosphere for 1 h, then the flask is removed from the oil bath and cooled to room temperature by performing these synthesis steps in an argon atmosphere, and the contents of the flask are transferred to a beaker containing 100.0 ml of isopropanol precipitant. The precipitated magnetite is separated from the remaining components of the reaction mixture by magnetic decantation, then dried to constant weight. Obtain 0.155 g of magnetite crystals with a size of 27 nm.
138 мг (138 мас. ч.) полученных кристаллов магнетита и 1 мг (1 мас. ч.) смеси холестерина, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина, 1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ола и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоля)-2000, взятых в массовом соотношении 15:7:75:3, соответственно, смешивают вначале с 40 мл (60000 мас. ч.) хлороформа, затем с 80 мл (82240 мас. ч.) N-метил-2-пирролидона, после чего полученную смесь обрабатывают в течение 0,5 ч ультразвуком мощностью 580 Вт с использованием ультразвуковой бани. После этого смесь переносят в круглодонную колбу и хлороформ удаляют с помощью роторного испарителя в вакууме при температуре 35°С. Затем в колбу добавляют 480 мл воды, содержимое колбы переносят в мешок для диализа с размером пор 50 кДа и проводят диализ дисперсии против воды продолжительностью 36 ч. Получают разбавленную водную дисперсию модифицированных кристаллов магнетита, которую концентрируют до 197 мл путем удаления части воды с использованием роторного испарителя.138 mg (138 parts by weight) of the obtained magnetite crystals and 1 mg (1 parts by weight) of a mixture of cholesterol, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1,1 '- (2- (4- (2 - ((2- (bis (2-hydroxydedecyl) amino) ethyl) (2-hydroxydecyl) amino) ethyl) piperazin-1-yl) ethylazanediyl) didodecan-2-ol and 1,2-dimyristoyl-sn-glycero -methoxy (polyethylene glycol) -2000, taken in a mass ratio of 15: 7: 75: 3, respectively, is first mixed with 40 ml (60,000 parts by weight) of chloroform, then with 80 ml (82,240 parts by weight) of N-methyl -2-pyrrolidone, after which the resulting mixture is treated for 0.5 h with 580 W ultrasound using ultrasound ukovoy bath. After that, the mixture was transferred to a round bottom flask and chloroform was removed using a rotary evaporator in vacuum at a temperature of 35 ° C. Then, 480 ml of water is added to the flask, the contents of the flask are transferred to a dialysis bag with a pore size of 50 kDa and the dispersion is dialyzed against water for 36 hours. A diluted aqueous dispersion of modified magnetite crystals is obtained, which is concentrated to 197 ml by removing part of the water using rotary evaporator.
70 мл полученной дисперсии, содержащей 32,4 мг (1 мас. ч.) модифицированных липидами кристаллов магнетита, смешивают с 10 мл водного раствора ацетата натрия с концентрацией 25 мМ, содержащего 3,24 мг (0,10 мас. ч.) миРНК. Затем полученную дисперсию помещают в диализный мешок с размером пор 50 кДа и проводят очистку полученной дисперсии диализом против воды в течение 48 ч. Очищенную дисперсию переносят в шприц и в стерильных условиях проводят ее стерилизацию путем фильтрации через шприцевой фильтр с размером пор 0,45 мкм. В стерильной дисперсии вышеописанным способом определяют содержание железа с последующим его пересчетом на магнетит, а также определяют содержание в ней миРНК.70 ml of the obtained dispersion containing 32.4 mg (1 parts by weight) of lipid-modified magnetite crystals are mixed with 10 ml of an aqueous solution of sodium acetate with a concentration of 25 mM containing 3.24 mg (0.10 parts by weight) of siRNA . Then, the resulting dispersion is placed in a dialysis bag with a pore size of 50 kDa and the dispersion is purified by dialysis against water for 48 hours. The purified dispersion is transferred to a syringe and sterilized under sterile conditions by filtration through a syringe filter with a pore size of 0.45 μm. In a sterile dispersion, in the manner described above, the iron content is determined, followed by its conversion to magnetite, and the content of siRNA in it is also determined.
Одну таблетку стандартного натрий-фосфатного таблетированного буфера марки Gibco® PBS Tablet растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Далее 5 мл буфера добавляют к 45 мл стерилизованной дисперсии с получением дисперсии с ионной силой 0,15 М.One tablet of Gibco® PBS Tablet standard sodium phosphate tablet buffer is dissolved in 10 ml of distilled water. Next, 5 ml of the buffer is added to 45 ml of the sterilized dispersion to obtain a dispersion with an ionic strength of 0.15 M.
Клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека Huh7 высевают в 12-луночный планшет в количестве 2×105 клеток в лунке в среде DMEM (Corning, №10-013-CV), содержащей 4,5 г/л глюкозы, 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 4 мМ L-глутамина. Затем в каждую из лунок вводят аликвоты ранее полученной стерильной дисперсии с конечной концентрацией миРНК в клеточной среде равной 20 наномоль/л и общим конечным объемом смеси по 1 мл в каждой лунке. Культуральный планшет после 2 ч инкубации при 37°С в атмосфере воздуха, содержащего 5% CO2, помещают в генератор переменного магнитного поля и включают магнитное поле с частотой 37 герц и индуктивностью 100 миллитесла. Общее время нахождения в магнитном поле - 3 ч. Далее культуральный планшет помещают в инкубатор, где оставляют при 37°С в атмосфере воздуха, содержащего 5% CO2, на 48 ч. Степень обратимого ингибирования в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы экспрессии гена, кодирующего синтез апоВ, составляет 91%.Huh7 human hepatocellular carcinoma cells are seeded in a 2-well plate in an amount of 2 × 10 5 cells per well in DMEM medium (Corning, No. 10-013-CV) containing 4.5 g / l glucose, 10% fetal bovine serum and 4 mM L-Glutamine. Then, aliquots of the previously obtained sterile dispersion with a final concentration of siRNA in the cell medium equal to 20 nanomol / L and a total final volume of the mixture of 1 ml in each well are introduced into each well. The culture plate after 2 hours of incubation at 37 ° C in an atmosphere of air containing 5% CO 2 is placed in an alternating magnetic field generator and a magnetic field with a frequency of 37 hertz and an inductance of 100 millitesla is turned on. The total time spent in a magnetic field is 3 hours. Next, the culture plate is placed in an incubator, where it is left at 37 ° C in an atmosphere of air containing 5% CO 2 for 48 hours. The degree of reversible inhibition of hepatocellular carcinoma tumor cells expressing the gene encoding the synthesis apoV is 91%.
Пример 4 (контрольный, без воздействия на смесь магнитного поля)Example 4 (control, without affecting the magnetic field mixture)
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако после введения липидных наночастиц в среду с опухолевыми клетками наложения магнитного поля не проводят. Степень обратимого ингибирования в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы экспрессии гена, кодирующего синтез апоВ, составляет 45%.The experiment is carried out analogously to example 1, however, after the introduction of lipid nanoparticles into the medium with tumor cells, the application of a magnetic field is not carried out. The degree of reversible inhibition in tumor cells of hepatocellular carcinoma of the expression of the gene encoding apoB synthesis is 45%.
Пример 5 (контрольный, по прототипу)Example 5 (control, prototype)
Опыт проводят аналогично прототипу, однако оценку степени обратимого ингибирования экспрессии проводят на линии клеток Huh7 гепатоцеллюлярной карциномы человека, а не Нера1-6 мыши.The experiment is carried out similarly to the prototype, however, the degree of reversible inhibition of expression is assessed on a Huh7 cell line of a human hepatocellular carcinoma, rather than mouse Hera1-6.
20 мг 2-{4-[(3b)-холест-5-ен-3-илокси]бутокси}-N,N-диметил-3-[(9Z,12Z)-октадека-9,12-диен-1-илокси]пропан-1-амина, 8,62 мг холестерина и 6,83 мг 1,2-димиристоил-sn-глицеро-метокси(полиэтиленгликоля)-2000 смешивают сначала с 1 мл этанола, а затем с 1 мл раствора цитратного буфера с рН 4, содержащего 2,73 мг миРНК, комплементарной к мРНК, кодирующей апоВ. Полученную смесь очищают от этанола путем многократной диафильтрации с использованием мембраны с размером пор 25 кДа. Очищенную дисперсию переносят в шприц и проводят ее стерилизацию путем фильтрации через шприцевой фильтр с размером пор 0,45 мкм в стерильных условиях. В стерильной дисперсии вышеописанным способом определяют содержание в ней миРНК.20 mg 2- {4 - [(3b) -cholest-5-en-3-yloxy] butoxy} -N, N-dimethyl-3 - [(9Z, 12Z)-octadec-9,12-diene-1- yloxy] propan-1-amine, 8.62 mg of cholesterol and 6.83 mg of 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-methoxy (polyethylene glycol) -2000 are mixed first with 1 ml of ethanol and then with 1 ml of citrate buffer solution with pH 4, containing 2.73 mg of siRNA complementary to mRNA encoding apoB. The resulting mixture was purified from ethanol by repeated diafiltration using a membrane with a pore size of 25 kDa. The purified dispersion is transferred to a syringe and sterilized by filtration through a syringe filter with a pore size of 0.45 μm under sterile conditions. In a sterile dispersion as described above, the content of siRNA in it is determined.
Одну таблетку стандартного натрий-фосфатного таблетированного буфера марки Gibco® PBS Tablet растворяют в 10 мл дистиллированной воды. Далее 5 мл буфера добавляют к 45 мл стерилизованной дисперсии с получением дисперсии с ионной силой 0,15 М.One tablet of Gibco® PBS Tablet standard sodium phosphate tablet buffer is dissolved in 10 ml of distilled water. Next, 5 ml of the buffer is added to 45 ml of the sterilized dispersion to obtain a dispersion with an ionic strength of 0.15 M.
Клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека Huh7 высевают в 12-луночный планшет в количестве 2×105 клеток в лунке в среде DMEM (Corning, №10-013-CV), содержащей 4,5 г/л глюкозы, 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 4 мМ L-глутамина. Затем в каждую из лунок вводят аликвоты ранее полученной стерильной дисперсии с конечной концентрацией миРНК в клеточной среде равной 20 наномоль/л и общим конечным объемом смеси по 1 мл в каждой лунке. Далее культуральный планшет помещают в инкубатор, где оставляют при 37°С в атмосфере 5% CO2 в течение еще 48 ч. Степень обратимого ингибирования в опухолевых клетках гепатоцеллюлярной карциномы экспрессии гена, кодирующего синтез апоВ, составляет 35%.Huh7 human hepatocellular carcinoma cells are seeded in a 2-well plate in an amount of 2 × 10 5 cells per well in DMEM medium (Corning, No. 10-013-CV) containing 4.5 g / l glucose, 10% fetal bovine serum and 4 mM L-Glutamine. Then, aliquots of the previously obtained sterile dispersion with a final concentration of siRNA in the cell medium equal to 20 nanomol / L and a total final volume of the mixture of 1 ml in each well are introduced into each well. The culture plate is then placed in an incubator, where it is left at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 for an additional 48 hours. The degree of reversible inhibition of the gene encoding apoB synthesis in tumor cells of hepatocellular carcinoma is 35%.
Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенный способ действительно повышает степень обратимого ингибирования в опухолевых клетках Huh7 гепатоцеллюлярной карциномы человека экспрессии гена, кодирующего синтез апоВ, с 35% (прототип) до 88-92%, т.е. в 2,5-2,7 раза.Thus, it can be seen from the above examples that the proposed method really increases the degree of reversible inhibition in human Huh7 tumor cells of hepatocellular carcinoma of the human expression of the gene encoding apoB synthesis from 35% (prototype) to 88-92%, i.e. 2.5-2.7 times.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018146825A RU2704998C1 (en) | 2018-12-27 | 2018-12-27 | Method of reversible inhibition in tumor cells of hepatocellular carcinoma of gene expression coding synthesis of apolipoprotein b |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018146825A RU2704998C1 (en) | 2018-12-27 | 2018-12-27 | Method of reversible inhibition in tumor cells of hepatocellular carcinoma of gene expression coding synthesis of apolipoprotein b |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2704998C1 true RU2704998C1 (en) | 2019-11-01 |
Family
ID=68500954
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018146825A RU2704998C1 (en) | 2018-12-27 | 2018-12-27 | Method of reversible inhibition in tumor cells of hepatocellular carcinoma of gene expression coding synthesis of apolipoprotein b |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2704998C1 (en) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US1998840A (en) * | 1934-03-13 | 1935-04-23 | Bell Telephone Labor Inc | Magnetic material and method of treatment thereof |
| RU2656667C1 (en) * | 2017-12-27 | 2018-06-06 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский технологический университет "МИСиС" | Method for producing modified crystals of magnetite |
| RU2689392C1 (en) * | 2018-12-27 | 2019-05-28 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский технологический университет "МИСиС" | Method of producing modified magnetite crystals |
-
2018
- 2018-12-27 RU RU2018146825A patent/RU2704998C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US1998840A (en) * | 1934-03-13 | 1935-04-23 | Bell Telephone Labor Inc | Magnetic material and method of treatment thereof |
| RU2656667C1 (en) * | 2017-12-27 | 2018-06-06 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский технологический университет "МИСиС" | Method for producing modified crystals of magnetite |
| RU2689392C1 (en) * | 2018-12-27 | 2019-05-28 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский технологический университет "МИСиС" | Method of producing modified magnetite crystals |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| MEEX S.J.R. et al. "Huh-7 or HepG2 cell: which is better model for studying human apolipoprotein-B100 assembly and secretion?", J Lipid Res. 2011; 52(1):152-158; стр.152-154, 156; DOI: 10.1194/jlr.D008888. * |
| РУДАКОВСКАЯ П.Г. Новые бифункциональные органические лиганды для модификации наночастиц золота и магнетита и гибридные материалы на их основе: синтез, свойства, возможности применения, дис. канд. хим. наук, 2015. - 185 стр. * |
| РУДАКОВСКАЯ П.Г. Новые бифункциональные органические лиганды для модификации наночастиц золота и магнетита и гибридные материалы на их основе: синтез, свойства, возможности применения, дис. канд. хим. наук, 2015. - 185 стр. САЛИХОВ С.В. Закономерности формирования структуры и магнитных свойств наноразмерных и наноструктурированных порошков на основе оксидов железа, дис. канд. физ-мат. наук, 2016. - 205 с. MEEX S.J.R. et al. "Huh-7 or HepG2 cell: which is better model for studying human apolipoprotein-B100 assembly and secretion?", J Lipid Res. 2011; 52(1):152-158; стр.152-154, 156; DOI: 10.1194/jlr.D008888. * |
| САЛИХОВ С.В. Закономерности формирования структуры и магнитных свойств наноразмерных и наноструктурированных порошков на основе оксидов железа, дис. канд. физ-мат. наук, 2016. - 205 с. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tu et al. | Mimicking the cell: bio-inspired functions of supramolecular assemblies | |
| Chen et al. | Reversible pore‐structure evolution in hollow silica nanocapsules: large pores for siRNA delivery and nanoparticle collecting | |
| CN107753464B (en) | Hollow silica nanoparticles encapsulating bioactive components, methods of making and uses thereof | |
| Walde | Surfactant assemblies and their various possible roles for the origin (s) of life | |
| JP2024507482A (en) | Ionizable lipid molecules, their production methods and applications in the production of lipid nanoparticles | |
| CN101338322B (en) | Novel gene vector constructed by high molecular polymer and preparation method | |
| CA2657013A1 (en) | Temperature-responsive microcarrier | |
| CN110638759A (en) | A preparation for in vitro transfection and in vivo mRNA delivery | |
| Wang et al. | Cellular shellization: Surface engineering gives cells an exterior | |
| CN112011513B (en) | Method for capturing high-purity circulating tumor cells based on bioorthogonal chemical method | |
| CN109576210A (en) | A kind of method of quick separating excretion body | |
| RU2704998C1 (en) | Method of reversible inhibition in tumor cells of hepatocellular carcinoma of gene expression coding synthesis of apolipoprotein b | |
| CN104974343B (en) | Modified polyethyleneimine and its application in Gene transfer vector reagent is prepared | |
| WO2021170034A1 (en) | Amino lipid compound, preparation method therefor, and application thereof | |
| RU2699172C1 (en) | Method of reversible inhibition in tumor cells of hepatocellular carcinoma of gene expression coding synthesis of apolipoprotein b | |
| CN117105271B (en) | Manganese carbonate nano STING agonist and preparation method and application thereof | |
| CN113968968B (en) | Amino lipid compound, preparation method and application thereof | |
| CN106188537A (en) | A kind of PEI compounds of modification and its preparation method and application | |
| CN101787375A (en) | Reverse non-viral vector gene transfection method | |
| CN109364264A (en) | Gene and chemicals corotation carrier and its application method | |
| AU2014324102A1 (en) | Improved methods of genetically modifying animal cells | |
| CN103484426A (en) | Non-animal source low-protein culture medium | |
| KR20160105112A (en) | Method of delivering therapeutic agents into cells with magnetic circulating-nano particles | |
| Cui et al. | Effects of dendrimer-functionalized multi-walled carbon nanotubes on murine embryonic stem cells | |
| Baczynska et al. | Surface charge and the association of liposomes with colon carcinoma cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20200724 Effective date: 20200724 |