RU2704969C1

RU2704969C1 - Method for morphological evaluation of erythrocyte aggregation induced by high-molecular polymers

Info

Publication number: RU2704969C1
Application number: RU2018125117A
Authority: RU
Inventors: Юрий Александрович Шереметьев; Метхун Мадибронович Рогозин; Александра Николаевна Поповичева; Александр Николаевич Успенский
Priority date: 2018-07-09
Filing date: 2018-07-09
Publication date: 2019-11-01

Abstract

FIELD: medicine.SUBSTANCE: invention refers to medicine and can be used for morphological evaluation of erythrocyte aggregation induced by high-molecular polymers. That is ensured by washing off red blood cells from the blood. Then they are mixed in ratio 2:1 with solution of high-molecular polymer (dextran or polyvinylpyrrolidone), which contains 0.1 % albumin. After that, said mixture is placed on a slide, mixed, lens ×100 is lowered into a drop of mixture. Performing erythrocytes microphotography.EFFECT: invention enables evaluating erythrocyte aggregation by light microscopy.1 cl, 2 dwg

Description

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к исследованию реологических свойств крови и может быть использовано для оценки агрегатного состояния эритроцитов.The invention relates to medicine and biology, namely to the study of the rheological properties of blood and can be used to assess the state of aggregation of red blood cells.

Известен фотометрический способ оценки агрегации эритроцитов (Schmid-Schonbein et al., Microvasc. Res. 1973. Vol. 6. P. 366- 376), включающий выделение эритроцитов из крови, смешивание с аутоплазмой или с высокомолекулярным декстраном, помещение в кювету реоскопа и регистрацию записи агрегатограммы.A known photometric method for assessing red blood cell aggregation (Schmid-Schonbein et al., Microvasc. Res. 1973. Vol. 6. P. 366-376), including the isolation of red blood cells from blood, mixing with autoplasma or with high molecular weight dextran, placing a rheoscope in a cuvette and registration of the aggregatogram record.

С помощью фотометрического метода можно определить степень агрегации эритроцитов в виде «монетных столбиков». Однако практически не изученной остается прижизненная морфология агрегатного состояния эритроцитов при большом увеличении светового микроскопа.Using the photometric method, you can determine the degree of aggregation of red blood cells in the form of “coin columns”. However, the intravital morphology of the aggregate state of erythrocytes with a large increase in the light microscope remains practically unstudied.

Известны методы изучения морфологии агрегатов эритроцитов в аутологичной плазме и сыворотке крови при большом увеличении светового микроскопа (Шереметьев Ю.А., Успенский А.Н. Способ микроскопической оценки агрегатного состояния эритроцитов в аутоплазме. Патент RU 2605843, 2016; Шереметьев Ю.А., Успенский А.Н. Способ оценки агрегатного состояния эритроцитов в аутологичной сыворотке крови. Патент RU 2590985, 2016). В связи с тем, что высокомолекулярные полимеры (декстран, поливинилпирролидон) нашли широкое применение в качестве агрегирующих агентов как для изучения механизмов взаимодействия эритроцитов, так и оценки их агрегационной способности при патологиях различного генеза, представляется важным разработать способ морфологической оценки агрегации эритроцитов, индуцированной высокомолекулярными полимерами, при большом увеличении светового микроскопа.Known methods for studying the morphology of red blood cell aggregates in autologous plasma and blood serum with a large increase in light microscope (Sheremetyev Yu.A., Uspensky AN Method for microscopic evaluation of the state of aggregation of red blood cells in autoplasma. Patent RU 2605843, 2016; Sheremetyev Yu.A., Uspensky AN A method for assessing the state of aggregation of red blood cells in autologous blood serum. Patent RU 2590985, 2016). Due to the fact that high molecular weight polymers (dextran, polyvinylpyrrolidone) are widely used as aggregating agents both for studying the mechanisms of interaction of red blood cells and for assessing their aggregation ability in pathologies of various origins, it seems important to develop a method for morphological assessment of red blood cell aggregation induced by high molecular weight polymers , with a large increase in the light microscope.

За прототип взят способ микроскопической оценки агрегатного состояния эритроцитов в аутоплазме (Шереметьев Ю.А., Успенский А.Н. Способ микроскопической оценки агрегатного состояния эритроцитов в аутоплазме. Патент RU 2605843, 2016), включающий забор крови, выделение эритроцитов, смешивание плазмы крови с эритроцитами в соотношении 2:1, помещение смеси на предметное стекло, перемешивание, опускание в каплю смеси объектива ×100, осуществление микрофотосъемки.The prototype is a method of microscopic assessment of the state of aggregation of red blood cells in an autoplasma (Sheremetyev Yu.A., Uspensky A.N. Method of microscopic assessment of the state of aggregation of red blood cells in an autoplasma. Patent RU 2605843, 2016), including blood sampling, isolation of red blood cells, mixing blood plasma with erythrocytes in a ratio of 2: 1, placing the mixture on a glass slide, mixing, lowering the lens mixture × 100 into a drop, microphotography.

Известно, что нормальные эритроциты трансформируются в эхиноциты при контакте двух стеклянных поверхностей (Wong P. A basis of echinocytosis and stomatocytosis in disc-sphere transformation of the erythrocyte. J. Theor. Biol. 1999. V. 196. P. 343-361). Это называется «эффектом стекла». Эффект стекла, в частности, происходит, когда в суспензию эритроцитов, помещенных на предметное стекло, опускают объектив 100^х (Шереметьев Ю.А., Поповичева А.Н., Успенский А.Н., Александров А.А., Успенская О.А. Способ прижизненной оценки действия реагентов на образование стоматоцитов. Патент RU 2629609, 2017). В способе, взятом за прототип, эффект стекла устраняется за счет того, что плазма содержит белок альбумин, предотвращающий трансформацию клеток в эхиноциты (Wong P. A basis of echinocytosis and stomatocytosis in disc-sphere transformation of the erythrocyte. J. Theor. Biol. 1999. V.196. P. 343-361). Растворы полимеров не содержат белков плазмы, поэтому при контакте двух стеклянных поверхностей в их присутствии эритроциты трансформируются в эхиноциты.Normal red blood cells are known to transform into echinocytes when two glass surfaces come in contact (Wong P. A basis of echinocytosis and stomatocytosis in disc-sphere transformation of the erythrocyte. J. Theor. Biol. 1999. V. 196. P. 343-361) . This is called the “glass effect." The glass effect, in particular, occurs when a 100 ^x lens is lowered into a suspension of red blood cells placed on a slide (Sheremetyev Yu.A., Popovicheva A.N., Uspensky A.N., Aleksandrov A.A., Uspenskaya O. A. Method for intravital assessment of the action of reagents on the formation of stomatocytes. Patent RU 2629609, 2017). In the prototype method, the glass effect is eliminated due to the fact that the plasma contains albumin protein that prevents the transformation of cells into echinocytes (Wong P. A basis of echinocytosis and stomatocytosis in disc-sphere transformation of the erythrocyte. J. Theor. Biol. 1999. V.196. P. 343-361). Polymer solutions do not contain plasma proteins; therefore, upon contact of two glass surfaces in their presence, red blood cells are transformed into echinocytes.

Задачей предполагаемого изобретения является создание несложного, быстро реализуемого способа микроскопической оценки агрегатного состояния эритроцитов в присутствии высокомолекулярных полимеров.The objective of the proposed invention is the creation of a simple, quickly implemented method of microscopic assessment of the state of aggregation of red blood cells in the presence of high molecular weight polymers.

Поставленная задача решается за счет того, что раствор высокомолекулярного полимера в присутствии 0.1% альбумина смешивают с отмытыми эритроцитами в соотношении 2:1, смесь помещают на предметное стекло, перемешивают, опускают в нее объектив (×100) светового микроскопа и после достижения фокуса (×1000) наблюдают через окуляр микроскопа. Для микроскопической оценки агрегатного состояния эритроцитов производят микрофотосъемку.The problem is solved due to the fact that a solution of high molecular weight polymer in the presence of 0.1% albumin is mixed with washed red blood cells in a 2: 1 ratio, the mixture is placed on a glass slide, mixed, the lens (× 100) of the light microscope is lowered into it and after reaching the focus (× 1000) is observed through the eyepiece of the microscope. For microscopic assessment of the state of aggregation of red blood cells, microphotography is performed.

Способ осуществляется следующим образом. Кровь забирают в вакуумные пробирки, содержащие 3.8% цитрат натрия (соотношение 9:1). Пробирки центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Плазму и клетки белой крови убирают, после чего эритроциты трижды промывают физиологическим раствором. В качестве высокомолекулярных полимеров используют 3% раствор декстрана 70 (м. в. 70 кДа, Sigma, США) или 0.5% раствор поливинилпирролидона (м. в. 360 кДа, Sigma, США). Декстран или поливинилпирролидон приготавливают на забуференном физиологическом растворе (10 мМ Трис - HCl, 150 мМ NaCl, рН 7.4), содержащем 0.1% альбумин. Раствор декстрана или поливинилпирролидона, содержащий 0.1% альбумин, смешивают с эритроцитами в соотношении 2:1, каплю смеси помещают на предметное стекло, перемешивают, опускают в нее объектив (×100) светового микроскопа и после достижения фокуса (×1000), производят микрофотосъемку.The method is as follows. Blood is collected in vacuum tubes containing 3.8% sodium citrate (9: 1 ratio). The tubes are centrifuged at 3000 rpm for 20 minutes Plasma and white blood cells are removed, after which the red blood cells are washed three times with physiological saline. As high molecular weight polymers, a 3% solution of dextran 70 (m.v. 70 kDa, Sigma, USA) or a 0.5% solution of polyvinylpyrrolidone (m.v. 360 kDa, Sigma, USA) are used. Dextran or polyvinylpyrrolidone is prepared in buffered saline (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4) containing 0.1% albumin. A solution of dextran or polyvinylpyrrolidone containing 0.1% albumin is mixed with red blood cells in a 2: 1 ratio, a drop of the mixture is placed on a glass slide, mixed, the lens (× 100) of the light microscope is lowered into it and after reaching the focus (× 1000), microphotography is performed.

На рисунке 1 видно образование «монетных столбиков» из эритроцитов здоровых доноров после добавления к ним 3% раствора декстрана, содержащего 0.1% альбумина. Наблюдается отсутствие эхиноцитов.Figure 1 shows the formation of “coin columns” from the erythrocytes of healthy donors after adding 3% dextran solution containing 0.1% albumin to them. There is a lack of echinocytes.

На рисунке 2 видно образование «монетных столбиков» из эритроцитов здоровых доноров после добавления к ним 0.5% раствор поливинилпирролидона, содержащего 0.1% альбумина. Наблюдается отсутствие эхиноцитов.Figure 2 shows the formation of “coin columns” from red blood cells from healthy donors after adding 0.5% solution of polyvinylpyrrolidone containing 0.1% albumin to them. There is a lack of echinocytes.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет проводить морфологическую оценку агрегации эритроцитов при большом увеличении светового микроскопа не только в аутологичной плазме и сыворотке крови, но и в растворе высокомолекулярного полимера.Thus, the proposed method allows morphological assessment of red blood cell aggregation with a large increase in the light microscope, not only in autologous plasma and blood serum, but also in a solution of high molecular weight polymer.

Claims

A method for morphologically evaluating red blood cell aggregation induced by high molecular weight polymers, including blood sampling and microscopic examination of red blood cell aggregation, characterized in that the high molecular weight polymer solution selected from dextran or polyvinylpyrrolidone, which contains 0.1% albumin, is mixed with washed red blood cells: 1 in a ratio of 2: 1 in a ratio of 2: , placed on a glass slide, mixed, immersed in a drop of a mixture of lens × 100, produce microphotography.