RU2704274C2

RU2704274C2 - Strawberry propagation method in vitro

Info

Publication number: RU2704274C2
Application number: RU2017146180A
Authority: RU
Inventors: Михаил Сергеевич Аркаев; Мария Александровна Дремова; Вадим Георгиевич Лебедев; Иван Александрович Поздняков; Наталья Михайловна Субботина; Константин Александрович Шестибратов
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2019-10-25
Also published as: RU2017146180A; RU2017146180A3

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to the field of biotechnology. Invention is a method for increasing efficiency of in vitro cultivation of wild strawberries on a liquid medium. Method includes propagation of strawberry micro-races for three weeks on a Murashige and Skoog liquid nutrient medium with addition of a key component of sorbitol.

EFFECT: proposed method allows to achieve high ratio of wild strawberry multiplication in liquid medium in vitro with low duration of cultivation, and almost completely exclude vitrification.

1 cl, 1 tbl

Description

Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ повышения эффективности размножения in vitro земляники садовой на жидкой среде. Результаты данного изобретения могут быть использованы при получении посадочного материала земляники садовой.The invention relates to the field of plant biotechnology. The invention is a method of increasing the efficiency of in vitro propagation of garden strawberries in a liquid medium. The results of this invention can be used to obtain planting material of strawberries.

Уровень техникиState of the art

Большинство биотехнологических лабораторий, работающих с культурами in vitro, используют в качестве питательной среды агаризованные среды. В основном среды содержат порядка 6-8 г/л агара. Следует отметить, что стоимость хорошего, подходящего для сред in vitro агара в настоящее время довольно высока и его применение при культивировании растений резко увеличивает себестоимость получаемого посадочного материала и снижает рентабельность производства.Most biotechnology laboratories working with in vitro cultures use agarized media as culture medium. Basically, the medium contains about 6-8 g / l agar. It should be noted that the cost of a good agar suitable for in vitro media is currently quite high and its use in plant cultivation dramatically increases the cost of the resulting planting material and reduces the profitability of production.

В качестве достойной альтернативы способов размножения на агаризованных средах разрабатываются способы размножения растений на жидких питательных средах. Жидкие среды способствуют хорошей аэрации и поглощению поверхностного кислорода. Кроме того, в них более равномерно идет распределение всех питательных веществ и растворение токсических метаболитов. Применение жидких сред увеличивает площадь поверхности контакта ткани и питательной среды, обеспечивая, тем самым, активизацию процесса дыхания, а также благоприятствует процессу синтеза белка и поглощению солей. Среди ключевых недостатков использования жидких сред можно отметить возможное изменение значения рН в течение культивирования, а также витрификацию, которая очень сильно снижает качество микропобегов и может вызывать гибель растений (Preil, W. 2005. General introduction: a personal reflection on the use of liquid media for in vitro culture. Pages 1-18 in А.К. Hvoslef-Eide and W. Preil, eds. Liquid culture system for in vitro plant propagation. Spriger Verlag, Berlin, Germany). Поэтому разработка состава жидких сред для культур с одновременным сокращением продолжительности культивирования позволит повысить эффективность размножения растений.As a worthy alternative to methods of propagation on agarized media, methods of plant propagation on liquid nutrient media are being developed. Liquid media contribute to good aeration and absorption of surface oxygen. In addition, they more evenly distribute all nutrients and dissolve toxic metabolites. The use of liquid media increases the surface area of contact between tissue and the nutrient medium, thereby ensuring the activation of the respiration process, and also favors the process of protein synthesis and the absorption of salts. Among the key disadvantages of using liquid media are possible changes in pH during cultivation, as well as vitrification, which greatly reduces the quality of microprobe and can cause plant death (Preil, W. 2005. General introduction: a personal reflection on the use of liquid media for in vitro culture. Pages 1-18 in A.K. Hvoslef-Eide and W. Preil, eds. Liquid culture system for in vitro plant propagation. Spriger Verlag, Berlin, Germany). Therefore, the development of the composition of liquid media for crops while reducing the duration of cultivation will increase the efficiency of plant propagation.

Земляника является одной из наиболее значимых культур в ягодоводстве и в настоящее время она культивируется практически во всем мире. Земляника может расти в различных почвенно-климатических условиях, плодоносит в год посадки или на следующий год, созревает раньше большинства других плодовых и ягодных культур, дает высокие урожаи крупных, привлекательных, вкусных и ароматных ягод. Биохимический состав ягод определяет их пищевую и лечебную ценность. Таким образом, содержание в ягодах полезных для здоровья людей веществ и отличный вкус предопределяют востребованность земляники на рынке в свежем, замороженном и переработанном виде. Одним из способов получения посадочного материала земляники является ее размножение в условиях in vitro.Strawberries are one of the most significant crops in berry growing and are currently cultivated almost all over the world. Strawberries can grow in different soil and climatic conditions, bear fruit in the year of planting or the next year, ripen earlier than most other fruit and berry crops, yield high yields of large, attractive, tasty and fragrant berries. The biochemical composition of berries determines their nutritional and medicinal value. Thus, the content in the berries of substances that are useful for human health and excellent taste predetermine the demand for strawberries in the market in fresh, frozen and processed form. One of the ways to obtain strawberry planting material is its propagation in vitro.

Известен способ размножения земляники садовой в биореакторе в течение 8 недель с использованием жидкой среды следующего состава: среда ВМ с добавлением 0,05 или 0,1 мМ тидиазурона (S.С. Debnath. Developing a scale-up system for the in vitro multiplication of thidiazuron-induced strawberry shoots using a bioreactor. Canadian Journal of Plant Science, 2008, 88(4): 737-746).A known method of propagation of garden strawberries in a bioreactor for 8 weeks using a liquid medium of the following composition: VM medium with the addition of 0.05 or 0.1 mm thidiazuron (S. C. Debnath. Developing a scale-up system for the in vitro multiplication of thidiazuron-induced strawberry shoots using a bioreactor. Canadian Journal of Plant Science, 2008, 88 (4): 737-746).

Недостатками использования данного способа являются длительный период культивирования (8 недель), высокая витрифицированность растений (до 30%), а также высокая стоимость цитокинина тидиазурона, который к тому же усиливает появление сомаклональных изменений.The disadvantages of using this method are the long cultivation period (8 weeks), the high vitrification of plants (up to 30%), and the high cost of thidiazuron cytokinin, which also enhances the appearance of somaclonal changes.

Наиболее близким известным прототипом является способ культивирования земляники садовой в биореакторе с использованием жидкой среды следующего состава: среда Мурасиге-Скуга с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП, 0,05 мг/л индолилмасляной кислоты, 0,03 мг/л гиббереловой кислоты и 30 г/л сахарозы (L. Georgieva, I. Tsvetkov, М. Georgieva and V. Kondakova. New protocol for in vitro propagation of berry plants by tis bioreactor, Bulgarian Journal of Agricultural Science, 22 (5) 2016, 745-751).The closest known prototype is a method of cultivating garden strawberries in a bioreactor using a liquid medium of the following composition: Murashige-Skoog medium with the addition of 0.5 mg / l 6-BAP, 0.05 mg / l indolylbutyric acid, 0.03 mg / l gibberelic acid and 30 g / l sucrose (L. Georgieva, I. Tsvetkov, M. Georgieva and V. Kondakova. New protocol for in vitro propagation of berry plants by tis bioreactor, Bulgarian Journal of Agricultural Science, 22 (5) 2016, 745 -751).

К недостаткам ближайшего прототипа следует отнести умеренный коэффициент мультипликации (4,0) и время культивирования, не отличающее от использования агаризованных питательных сред (4 недели).The disadvantages of the closest prototype include a moderate coefficient of multiplication (4.0) and the cultivation time, not different from the use of agarized culture media (4 weeks).

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Целью предлагаемого изобретения является повышение эффективности размножения земляники садовой на жидкой среде с одновременным сокращением продолжительности культивирования и сохранением качественных характеристик растений.The aim of the invention is to increase the efficiency of propagation of garden strawberries in a liquid medium while reducing the duration of cultivation and maintaining the qualitative characteristics of plants.

Поставленная цель достигается за счет использования жидкой среды Мурасиге-Скуга (Murashige Т. & Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497) с добавлением 0,2 г/л 6-БАП, 20 г/л сахарозы и 10 г/л сорбитола, оказывающего в данной концентрации защиту от витрификации.This goal is achieved through the use of liquid medium Murashige-Skoog (Murashige T. & Skoog F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. // Physiol. Plant, 15 (1962) 473-497) with the addition of 0 , 2 g / l 6-BAP, 20 g / l sucrose and 10 g / l sorbitol, which in this concentration protects against vitrification.

Суть изобретения состоит в том, что растения земляники садовой культивируются в колбах Эрленмейера на шейкере, с качающимся типом платформы, на жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга для мультипликации, а именно с добавлением 0,2 г/л 6-БАП, 20 г/л сахарозы и 10 г/л сорбитола и переносятся на свежую питательную среду через 3 недели.The essence of the invention lies in the fact that garden strawberry plants are cultivated in Erlenmeyer flasks on a shaker, with a swinging type of platform, on a Murasige-Skoog liquid nutrient medium for animation, namely with the addition of 0.2 g / l 6-BAP, 20 g / l sucrose and 10 g / l sorbitol and are transferred to fresh culture medium after 3 weeks.

Осуществление изобретенияThe implementation of the invention

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.The proposed method is implemented as follows.

1. В нестерильных условиях готовится жидкая питательная среда Мурасиге-Скуга. В нее добавляются необходимые количества макро- и микроэлементов, 10 г/л сорбитола, 20 г/л сахарозы, объем доводится дистиллированной водой с подведением значения рН до 5,6-5,8. Среда разливается по 30 мл в колбы Эрленмейера объемом 250 мл, запечатывается фольгой и бумагой, завязывается резинкой. Автоклавирование проводится при 1 атм и 120°С в течение 20 минут. В остывшую среду стерильно вносятся раствор витаминов Мурасиге-Скуга и регулятор роста 6-БАП в концентрации 0,2 г/л. Все манипуляции с растительным материалом производятся в стерильных условиях ламинара. В колбу со средой вносятся 5 эксплантов длиной не менее 1 см каждый. У каждого экспланта предварительно убираются нижние листья (2-3 листа).1. In non-sterile conditions, a liquid nutrient medium Murashige-Skoog is prepared. The necessary amounts of macro- and microelements, 10 g / l of sorbitol, 20 g / l of sucrose are added to it, the volume is adjusted with distilled water with a pH value of 5.6-5.8. The medium is poured into 30 ml into Erlenmeyer flasks with a volume of 250 ml, sealed with foil and paper, tied with an elastic band. Autoclaving is carried out at 1 atm and 120 ° C for 20 minutes. A solution of Murashige-Skoog vitamins and a 6-BAP growth regulator at a concentration of 0.2 g / l are sterilized into the cooling medium. All manipulations with plant material are performed under sterile conditions of the laminar. 5 explants with a length of at least 1 cm each are introduced into the flask with the medium. Each explant previously removed the lower leaves (2-3 sheets).

2. В течение трех недель проводится культивирование растений на жидкой среде в колбах Эрленмейера на шейкере с качающимся типом платформы со скоростью 100 оборотов в минуту, при освещении 1000 лк в течение 14 часов.2. For three weeks, plants are cultivated on a liquid medium in Erlenmeyer flasks on a shaker with a swinging type of platform at a speed of 100 revolutions per minute, with illumination of 1000 lux for 14 hours.

2. Через 3 недели производится срезка побегов для последующего укоренения, а оставшиеся нижние части растений пересаживаются на свежую питательную среду.2. After 3 weeks, the shoots are cut for subsequent rooting, and the remaining lower parts of the plants are transplanted to fresh nutrient medium.

Техническим результатом предлагаемого способа является достижение высокого коэффициента мультипликации земляники садовой, равного 5,0, при коротком, трехнедельном периоде культивирования, а также низкий уровень витрификации растений (Таблица 1).The technical result of the proposed method is to achieve a high coefficient of multiplication of garden strawberries, equal to 5.0, with a short, three-week cultivation period, as well as a low level of vitrification of plants (Table 1).

Изобретение может быть использовано для быстрого получения качественного и здорового посадочного материала, при этом действие изобретения распространяется на широкий спектр сортов земляники садовой, предлагаемых биотехнологическими лабораториями и предприятиями на российский рынок, в том числе на популярные, но медленно размножающиеся, в силу своих сортовых особенностей, сорта, такие как: Гигантелла Максим (Gigantella Maxim), Редгонтлет (Red Gauntlet), Роман (Roman).The invention can be used to quickly obtain high-quality and healthy planting material, while the invention extends to a wide range of varieties of garden strawberries offered by biotechnological laboratories and enterprises on the Russian market, including popular but slowly reproducing ones, due to their variety characteristics, varieties such as: Gigantella Maxim (Gigantella Maxim), Redgontlet (Red Gauntlet), Roman (Roman).

Полученные результаты свидетельствуют о достижении значительного технического эффекта в сравнении с известными способами. Предложенный способ обеспечивает повышение эффективности размножения земляники садовой с коэффициентом мультипликации до 5,0 при одновременном снижении длительности культивирования и уровня витрификации микропобегов (таблица 1).The results obtained indicate the achievement of a significant technical effect in comparison with known methods. The proposed method provides an increase in the efficiency of propagation of strawberry garden with a multiplier of up to 5.0, while reducing the duration of cultivation and the level of vitrification of microprobe (table 1).

Claims

The method of propagation of strawberry garden in vitro, including the cultivation of strawberry explants in a liquid nutrient medium, characterized in that the nutrient medium contains macronutrients, trace elements and vitamins according to Murashige-Skoog, 0.2 mg / l 6-BAP, 20 g / l sucrose, 10 g / l sorbitol, shoots of at least 1 cm long with 2-3 lower leaves removed and cultivation duration of three weeks are used as explants