RU2701817C1 - Strain stagonospora cirsii g-51 vizr - producer of herbarumine i and stagonolide a - Google Patents

Strain stagonospora cirsii g-51 vizr - producer of herbarumine i and stagonolide a Download PDF

Info

Publication number
RU2701817C1
RU2701817C1 RU2018147582A RU2018147582A RU2701817C1 RU 2701817 C1 RU2701817 C1 RU 2701817C1 RU 2018147582 A RU2018147582 A RU 2018147582A RU 2018147582 A RU2018147582 A RU 2018147582A RU 2701817 C1 RU2701817 C1 RU 2701817C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cirsii
vizr
stagonolide
strain
gerbarumin
Prior art date
Application number
RU2018147582A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Александр Олегович Берестецкий
Анна Александровна Далинова
Всеволод Романович Дубовик
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений" filed Critical Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений"
Priority to RU2018147582A priority Critical patent/RU2701817C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2701817C1 publication Critical patent/RU2701817C1/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14Fungi; Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145Fungal isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62Carboxylic acid esters
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645Fungi ; Processes using fungi

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnologies.
SUBSTANCE: invention relates to the biotechnology. Disclosed is strain of fungus Stagonospora cirsii, which is a producer of herbarumine I and stagonolide A. Strain of fungus is deposited in State collection of microorganisms VIZR numbered G-51 VIZR.
EFFECT: invention provides high production of herbarumine I and stagonolide A.
1 cl, 4 tbl, 4 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению биологически активных веществ и может быть использовано для получения природных фитотоксических соединений: гербарумина I и стагонолида А.The invention relates to biotechnology, in particular to the production of biologically active substances and can be used to produce natural phytotoxic compounds: Gerbarumin I and Stagonol A.

Многие фитопатогенные грибы способны образовывать фитотоксические соединения, которые являются факторами их вирулентности. Фитотоксины, которые обладают минимальным эффектом в отношении нецелевых организмов (теплокровных, насекомых, микроорганизмов и проч.), могут рассматриваться как природные гербициды или прототипы синтетических гербицидов (Берестецкий, 2008 [1], 2017 [2]).Many phytopathogenic fungi are able to form phytotoxic compounds, which are factors of their virulence. Phytotoxins, which have a minimal effect on non-target organisms (warm-blooded, insects, microorganisms, etc.), can be considered as natural herbicides or prototypes of synthetic herbicides (Berestetskiy, 2008 [1], 2017 [2]).

Среди грибных фитотоксинов особо можно выделить гербарумин I и стагонолид А из группы 10-членных лактонов (рисунок 1). Гербарумин I проявил более сильное токсическое действие (ЛД50 в отношении проростков щирицы печальной около 0 05 mM), чем гербицид 2,4-Д (Rivero-Cruz et al., 2000 [3]) Стагонолид А достоверно ингибировал рост корней проростков бодяка полевого с ЛД50 около 0.005 mM. Было показано также, что стагонолид А фитотоксичен и для листьев ряда сорных растений (Yuzikhin et al., 2007 [4]). Среди других фитотоксинов из группы 10-членных лактонов он проявил наиболее высокую токсичность в отношении листьев бодяка полевого и осота полевого (Berestetskiy et al., 2008 [5]). Эти вещества рекомендовались как гербицидные соединения природного происхождения (Rivero-Cruz et al., 2000 [3]; Yuzikhin et al., 2007 [4]).Among fungal phytotoxins, one can especially distinguish gerbarumin I and stagonolide A from the group of 10-membered lactones (Figure 1). Gerbarumin I showed a stronger toxic effect (LD 50 in relation to seedlings of sad shiritsa about 0 05 mM) than the herbicide 2,4-D (Rivero-Cruz et al., 2000 [3]) Stagonolide A significantly inhibited the growth of roots of seedlings with an LD of 50 about 0.005 mM. It was also shown that stagonolide A is phytotoxic for the leaves of a number of weeds as well (Yuzikhin et al., 2007 [4]). Among other phytotoxins from the group of 10-membered lactones, he showed the highest toxicity to the leaves of the Cirsium arvensis and Sow thistle (Berestetskiy et al., 2008 [5]). These substances were recommended as herbicidal compounds of natural origin (Rivero-Cruz et al., 2000 [3]; Yuzikhin et al., 2007 [4]).

Figure 00000001
Figure 00000001

Известный из литературы продуцент гербарумина I гриб Phoma herbarum ТОХ-01020 был выделен из пораженных листьев кукурузы (Zea mays) в 1998 году. Гриб культивировали на модифицированной среде М-D-I на орбитальных качалках при температуре 28°С и скорости вращения орбитальной качалки 120 об/мин в течение 15 дней Метаболиты гриба извлекали из культуральной жидкости и мицелия этилацетатом. Объединенный экстракт (4 г) фракционировали при помощи колоночной хроматографии на силикагеле в системе дихлорметан-изопропанол при градиентном режиме элюирования с содержанием изопропанола от 0 до 100%. Из фракции FIV-3 при помощи препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) был выделен гербарумин I с выходом 0.320 мг/л (Rivero-Cruz et al., 2000 [3])The well-known literature producer Gerbarumin I fungus Phoma herbarum TOX-01020 was isolated from the affected leaves of corn (Zea mays) in 1998. The fungus was cultivated on modified M-D-I medium on orbital shakers at a temperature of 28 ° C and an orbital rocking speed of 120 rpm for 15 days. The fungal metabolites were extracted from the culture fluid and mycelium with ethyl acetate. The combined extract (4 g) was fractionated by silica gel column chromatography in a dichloromethane-isopropanol system under an elution gradient mode with an isopropanol content of 0 to 100%. Herbarumin I was isolated from FIV-3 using preparative high performance liquid chromatography (HPLC) with a yield of 0.320 mg / L (Rivero-Cruz et al., 2000 [3])

Продуцентом стагонолида А является гриб Stagonospora cirsii С-163 (депонирован в коллекции ВИЗР как штамм VIZR 1.41). Гриб культивировали 2 недели на модифицированной среде Чапека без перемешивания, экстракцию метаболитов производили этилацетатом. Стагонолид А был выявлен в среднеполярной фракции при фракционировании экстракта на силикагеле системой растворителей гексан-диэтиловый эфир с выходом 40 мг/л среды (Yuzikhin et al., 2007 [4]).Stagonol A is produced by the fungus Stagonospora cirsii C-163 (deposited in the VIZR collection as strain VIZR 1.41). The fungus was cultivated for 2 weeks on a modified Chapek medium without stirring, the metabolites were extracted with ethyl acetate. Stagonolide A was detected in the mid-polar fraction when the extract was fractionated on silica gel with a solvent system of hexane-diethyl ether with a yield of 40 mg / l of medium (Yuzikhin et al., 2007 [4]).

Для практического применения, углубленного изучения гербарумина I и стагонолида А (например, изучения механизмов действия, синтеза производных, определения селективности) необходимо получение этих биологически активных соединений в достаточных (от нескольких сот миллиграммов до нескольких граммов) количествах. Недостатком штамма-прототипа P. herbarum ТОХ-01020 является крайне низкий выход гербарумина I. Продуктивность штамма гриба Stagonospora cirsii VIZR 1.41 по стагонолиду А также невысока. Поэтому перспективы использования этих штаммов как продуцентов стагонолида А и гербарумина I были ограничены.For practical use, an in-depth study of gerbarumine I and stagonolide A (for example, studying the mechanisms of action, synthesis of derivatives, determining selectivity), it is necessary to obtain these biologically active compounds in sufficient quantities (from several hundred milligrams to several grams). The disadvantage of the prototype strain P. herbarum TOX-01020 is the extremely low yield of gerbarumin I. The productivity of the strain of the fungus Stagonospora cirsii VIZR 1.41 for stagonolide A is also low. Therefore, the prospects for using these strains as producers of stagonolide A and gerbarumin I were limited.

Задачей изобретения является получение универсального штамма-продуцента, способного образовывать гербарумин I и стагонолид А с высокой продуктивностью, превосходящей прототипы P. herbarum ТОХ-01020 и Stagonspora cirsii VIZR 1.41, соответственно.The objective of the invention is to obtain a universal producer strain capable of forming gerbarumin I and stagonolide A with high productivity exceeding the prototypes of P. herbarum TOX-01020 and Stagonspora cirsii VIZR 1.41, respectively.

Поставленная задача была решена получением высокопродуктивного штамма гриба S. cirsii Г-51 ВИЗР, способного продуцировать как гербарумин I, так и стагонолид А.The problem was solved by obtaining a highly productive strain of the fungus S. cirsii G-51 VIZR, capable of producing both gerbarumin I and stagonolide A.

Штамм Г-51 ВИЗР был отобран в результате сравнения фитотоксической активности экстрактов различных штаммов S. cirsii, различного географического происхождения и выделенных с разных растений-хозяев, включая один из прототипов - штамм С-163 (таблица 1). Идентификация грибов была проведена по данным J.J. Davis (Davis, 1919 [6]).Strain G-51 VIZR was selected by comparing the phytotoxic activity of extracts of various strains of S. cirsii of different geographical origin and isolated from different host plants, including one of the prototypes, strain C-163 (table 1). Identification of fungi was carried out according to J.J. Davis (Davis, 1919 [6]).

Для получения экстрактов различные штаммы S. cirsii культивировали на модифицированной среде Чапека следующего состава: 45 г/л сахарозы, 3г/л NaNO3, 1 г/л KH2PO4, 0.5 г/л MgSO4, 0.5 г/л KCl, витамины тиамин - (100 мкг) и биотин (5 мкг), рН=6 Инокуляцию сред осуществляли агаровым блоком, вырезанным из края недельной колонии гриба на стандартном картофельно-глюкозном агаре (Благовещенская, 2017 [7]). Выращивание культур S. cirsii проводили в 500-мл конических колбах с 100 мл среды в 4-х повторностях. Инкубацию культур вели в течение 14 суток при температуре 24°С без встряхивания.To obtain extracts, various strains of S. cirsii were cultivated on a modified Chapek medium of the following composition: 45 g / l sucrose, 3 g / l NaNO 3 , 1 g / l KH 2 PO 4 , 0.5 g / l MgSO4, 0.5 g / l KCl, vitamins thiamine - (100 μg) and biotin (5 μg), pH = 6 Media were inoculated with an agar block cut from the edge of a weekly fungal colony on standard potato-glucose agar (Blagoveshchenskaya, 2017 [7]). Cultivation of S. cirsii cultures was carried out in 500 ml conical flasks with 100 ml of medium in 4 replicates. The cultures were incubated for 14 days at a temperature of 24 ° C without shaking.

Жидкостную экстракцию метаболитов грибов проводили этилацетатом в 500-мл делительных воронках. В воронку заливали 100 мл культурального фильтрата и 100 мл органического растворителя и энергично встряхивали в течение 1 минуты Нижнюю водную фазу отбрасывали, верхнюю органическую фазу фильтровали через безводный сульфат натрия Na2SO4 и упаривали на роторном испарителе при 40°С досуха.The liquid extraction of fungal metabolites was carried out with ethyl acetate in 500 ml separatory funnels. 100 ml of culture filtrate and 100 ml of organic solvent were poured into the funnel and vigorously shaken for 1 minute. The lower aqueous phase was discarded, the upper organic phase was filtered through anhydrous sodium sulfate Na 2 SO 4 and evaporated to dryness on a rotary evaporator at 40 ° С.

Для оценки фитотоксического действия экстрактов использовали метод листовых дисков (Берестецкий и др., 2010 [8]). Исследуемые фракции растворяли сначала в небольшом количестве этанола, затем доводили водой до заданной концентрации (5 мг/мл для экстрактов). Конечная концентрация этанола в растворе составляла 5% (по объему), что является нетоксичным для растений. Из листьев среднего яруса 3-5-недельных растений осота пробочным сверлом вырезали диски 1 см в диаметре. Высечки помещали во влажную камеру. Каждую высечку в центре надкалывали препаровальной иглой и наносили в область надкола 10 мкл исследуемого раствора. Учет симптомов (площадь некроза) проводили через 48 ч инкубации при температуре 24°С и переменном искусственном освещении (12 ч в день).To assess the phytotoxic effect of the extracts, the leaf disc method was used (Berestetskii et al., 2010 [8]). The studied fractions were first dissolved in a small amount of ethanol, then adjusted with water to a predetermined concentration (5 mg / ml for extracts). The final concentration of ethanol in the solution was 5% (by volume), which is non-toxic to plants. From leaves of the middle tier of 3-5-week-old sow thistles, disks 1 cm in diameter were cut with a cork drill. Die cuts were placed in a wet chamber. Each die cut in the center was punctured with a dissecting needle and 10 μl of the test solution was applied to the puncture region. Symptoms (necrosis area) were taken into account after 48 h of incubation at a temperature of 24 ° C and variable artificial lighting (12 h per day).

Максимальную фитотоксическую активность в отношении листовых дисков осота продемонстрировал экстракт из жидкой культуры штамма Г-51 ВИЗР. При концентрации экстракта 2 мг/мл площадь некрозов листовых дисков осота превышала 90% при использовании экстракта из культуральной жидкости штамма Г-51 ВИЗР, что было в 1.5 раза выше, чем при использовании экстракта из культуральной жидкости штамма-прототипа С-163 (таблица 2)The maximum phytotoxic activity against leaf disks was demonstrated by the extract from the liquid culture of strain G-51 VIZR. When the extract concentration was 2 mg / ml, the area of necrosis of leaf disks of sow thistle exceeded 90% when using the extract from the culture fluid of strain G-51 VIZR, which was 1.5 times higher than when using the extract from the culture fluid of strain C-163 prototype (table 2 )

Figure 00000002
Figure 00000002

Figure 00000003
Figure 00000003

1 доля пораженной площади по отношению к общей площади листового диска, %; концентрация экстракта 2 мг/мл 1 share of the affected area in relation to the total area of the leaf disk,%; extract concentration 2 mg / ml

Характеристика продуцентаProducer Characteristic

Систематическое положение. Вид Stagonospora cirsii J.J. Davis относится к отделу Ascomycota, подотделу Pezizomycotina, классу Dothideomycetes, подклассу Pleosporomycetidae, порядку Pleosporales, семейству MassarinaceaeSystematic position. View Stagonospora cirsii J.J. Davis belongs to the Ascomycota division, the Pezizomycotina subdivision, the Dothideomycetes class, the Pleosporomycetidae subclass, the Pleosporales order, the Massarinaceae family

По морфологии спороношения штамм S. cirsii Г-51 ВИЗР был практически идентичен изоляту S. cirsii VIZR 1.41 (С-163) - продуценту стагонолида A (Yuzikhin et al., 2007 [4]), выделенному из больных листьев бодяка полевого (Cirsium arvense). Штамм S. cirsii Г-51 обладает быстрым ростом на стандартных агаризованных питательных средах (картофельно-глюкозном агаре (КГА), овсяном агаре (OA), мальтозном агаре (МА) и агаре Чапека с витаминами (ЧА)) в темноте при 24°С. Диаметр двухнедельных колоний S. cirsii Г-51 на всех агаризованных средах составлял свыше 90 мм. Гриб образует на КГА колонии темно-серого цвета, с клочковато-войлочной текстурой. Цвет реверса темно-серый. На среде OA гриб образует темно-серые колонии с мелкими белыми ватообразными мицелиальными скоплениями. На среде МА колонии S. cirsii Г-51 ВИЗР светло-серые, войлочно-бархатистые. Цвет реверса от светло-бурого до темно-бурого. На среде ЧА гриб образует бархатистые колонии дымчато-серого цвета Край колоний на всех агаризованных средах неровный, древовидно-лопастнойAccording to the morphology of sporulation, the strain S. cirsii G-51 VIZR was almost identical to the isolate S. cirsii VIZR 1.41 (C-163), the producer of stagonolide A (Yuzikhin et al., 2007 [4]), isolated from diseased leaves of the arthropod (Cirsium arvense ) The strain S. cirsii G-51 has rapid growth on standard agarized nutrient media (potato glucose agar (OCA), oat agar (OA), maltose agar (MA) and Capeca agar with vitamins (NA)) in the dark at 24 ° C . The diameter of the two-week colonies of S. cirsii G-51 on all agar media was over 90 mm. The fungus forms on the KGA colonies of a dark gray color, with a ragged-felt texture. The reverse color is dark gray. On the OA medium, the fungus forms dark gray colonies with small white cotton-like mycelial clusters. On the MA medium, colonies of S. cirsii G-51 VIZR are light gray, felt-velvety. The color of the reverse is from light brown to dark brown. On ChA medium, the fungus forms velvety smoky-gray colonies. The edge of the colonies on all agarized media is uneven, tree-lobed.

Хранение штамма S. cirsii Г-51 ВИЗР осуществляется в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре в бытовом холодильнике при температуре 5°С, а также при -80°С в 10%-ном стерильном растворе глицерина.The S. cirsii G-51 VIZR strain is stored in test tubes on mowed potato-glucose agar in a domestic refrigerator at a temperature of 5 ° C, as well as at -80 ° C in a 10% sterile glycerol solution.

Пример 1. Глубинное культивирование штамма S. cirsii Г-51 ВИЗРExample 1. Deep cultivation of a strain of S. cirsii G-51 VIZR

Для глубинного культивирования S. cirsii Г-51 ВИЗР использовали модифицированную жидкую питательную среду Чапека с витаминами (ЧАВ) в следующей модификации: глюкоза - 45 г, NaNO3 - 3 г, К2НРО4 - 1 г, MgSO4×7H2O - 0,5 г, KCl - 0.5 г, FeSO4×7H2O - 0.01 г, тиамин - 100 мкг, биотин - 5 мкг, 10 г подсолнечного рафинированного масла в качестве пеногасителя, вода дистиллированная до 1 л, рН 6 Культивирование гриба проводили в биореакторе с рабочим объемом 1.5 л фирмы Applikon Biotechnology (Голландия) с системой управления процессами ez-Control и программным обеспечением BioXpert. Система была оснащена сенсорами рН, температуры, концентрации растворенного кислорода и пены Ферментационную среду (1.4 л) инокулировали 100 мл 7-суточной культуры, полученной на среде ЧАВ без масла по вышеописанной методике Параметры ферментации: скорость подачи воздуха 1.5 л/мин, температура 24°С, скорость перемешивания 200 об/мин в течение 2 суток и 400 об/мин - до завершения процесса ферментации, уровень рН не поддерживали. Пеногаситель - растительное масло (1% от объема среды) вводили в среду до посева гриба. Культивировали 7 дней, ежедневно отбирая пробы по 30 мл. До проведения анализа образцы культуральной жидкости хранили в морозильной камере при -20°С.For deep cultivation of S. cirsii G-51 VIZR, Chapek’s modified liquid nutrient medium with vitamins (CAV) was used in the following modification: glucose - 45 g, NaNO 3 - 3 g, K 2 NRA 4 - 1 g, MgSO 4 × 7H 2 O - 0.5 g, KCl - 0.5 g, FeSO 4 × 7H 2 O - 0.01 g, thiamine - 100 μg, biotin - 5 μg, 10 g of sunflower refined oil as an antifoam, distilled water to 1 l, pH 6 Mushroom cultivation was carried out in a bioreactor with a working volume of 1.5 l from Applikon Biotechnology (Holland) with an ez-Control process control system and BioXpert software. The system was equipped with sensors for pH, temperature, concentration of dissolved oxygen and foam. Fermentation medium (1.4 L) was inoculated with 100 ml of a 7-day-old culture obtained on a surfactant-free medium without oil according to the method described above. Fermentation parameters: air feed rate 1.5 l / min, temperature 24 ° C, the stirring speed of 200 rpm for 2 days and 400 rpm - until the completion of the fermentation process, the pH level was not maintained. Antifoam - vegetable oil (1% of the volume of the medium) was introduced into the medium before sowing the fungus. Cultivated for 7 days, daily taking samples of 30 ml. Prior to analysis, culture fluid samples were stored in a freezer at -20 ° C.

Количественный анализ токсинов проводили следующим образом. Твердофазную экстракцию фитотоксинов из фильтрата культуральной жидкости гриба S. cirsii Г-51 ВИЗР и их очистку проводили при помощи вакуумной установки (манифолда) и колонок с 0.5 г обращенно-фазового сорбента Chromabond С 18ес (объем резервуара 3 мл, Macherey-Nagel, Германия). Сорбент кондиционировали последовательным внесением в колонку 3 мл метанола и 3 мл воды (не допуская пересыхания). В колонку вносили 200 мкл фильтрата культуральной жидкости. Сорбент промывали 3 мл воды и 3 мл 25%-ного метанола, затем подсушивали воздухом в течение 1 минуты. Аналиты элюировали из колонки метанолом (2 мл), элюат тщательно перемешивали и хранили в морозильной камере при -20°С. Для количественного анализа фитотоксинов из полученных проб отбирали 200 мкл элюата, добавляли к нему 300 мкл воды и тщательно перемешивали. Анализ фитотоксинов проводили с использованием колонки Acquity UPLC ВЕН С 18 50×2.1 мм. В качестве подвижной фазы использовали систему метанол-вода в соотношении 50:50 (по объему), скорость подачи подвижной фазы 250 мкл/мин, температура термостата колонки 40°С. Объем вводимого образца 5 мкл. Время удерживания (tR) стагонолида А составляло 1.4 мин, гербарумина I - 1.9 мин. Погрешность tR не превышала 2%. Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площадей пиков от концентрации стагонолида А и гербарумина I в пробах, установили методом абсолютной калибровки по пяти концентрациям веществ в диапазоне от 0.125 до 20 нг в анализируемой пробе, соответствующих содержанию фитотоксинов от 0.625 до 100 мг/л. Эксперимент повторяли трижды, приведены данные типичного из них.Quantitative analysis of toxins was carried out as follows. Solid-phase extraction of phytotoxins from the filtrate of the culture fluid of the fungus S. cirsii G-51 VIZR and their purification was carried out using a vacuum unit (manifold) and columns with 0.5 g of reversed-phase sorbent Chromabond C 18c (tank volume 3 ml, Macherey-Nagel, Germany) . The sorbent was conditioned by sequentially adding 3 ml of methanol and 3 ml of water to the column (without drying out). 200 μl of culture fluid filtrate was added to the column. The sorbent was washed with 3 ml of water and 3 ml of 25% methanol, then dried with air for 1 minute. Analytes were eluted from the column with methanol (2 ml), the eluate was thoroughly mixed and stored in a freezer at -20 ° C. For the quantitative analysis of phytotoxins, 200 μl of the eluate were taken from the obtained samples, 300 μl of water was added to it and thoroughly mixed. Phytotoxin analysis was performed using an Acquity UPLC BEN C 18 × 50 × 2.1 mm column. The methanol-water system was used as the mobile phase in a ratio of 50:50 (by volume), the flow rate of the mobile phase was 250 μl / min, and the column thermostat temperature was 40 ° С. The volume of the injected sample is 5 μl. The retention time (t R ) of stagonolide A was 1.4 min, and gerbarumin I was 1.9 min. The error t R did not exceed 2%. Calibration characteristics expressing the dependence of peak areas on the concentration of stagonolide A and gerbarumin I in the samples were established by absolute calibration for five concentrations of substances in the range from 0.125 to 20 ng in the analyzed sample, corresponding to phytotoxins from 0.625 to 100 mg / l. The experiment was repeated three times, the data are typical of them.

Стагонолид А был обнаружен в культуральной жидкости на 4 сутки ферментации. Максимальная его концентрация (116.7 мг/л) выявлена на 5-е сутки культивирования, затем его содержание в культуральной жидкости быстро снизилось до 24 мг/мл. На 7-е сутки ферментации стагонолид А в культуральной жидкости не обнаружили. Гербарумин выявлен в 6-суточной и 7-суточной культуральной жидкости (38 мг/л и 116.5 мг/л соответственно) (таблица 3).Stagonolide A was detected in the culture fluid on the 4th day of fermentation. Its maximum concentration (116.7 mg / l) was detected on the 5th day of cultivation, then its content in the culture fluid quickly decreased to 24 mg / ml. On the 7th day of fermentation, stagonolide A was not found in the culture fluid. Gerbarumin was detected in 6-day and 7-day culture fluids (38 mg / l and 116.5 mg / l, respectively) (table 3).

Figure 00000004
Figure 00000004

Максимальное содержание стагонолида А (116.7 мг/л) в 5-суточной культуре штамма S. cirsii Г-51 ВИЗР более чем в 2 раза превышает выход фитотоксина из культуры прототипа S. cirsii VIZR 1.41 (С-163). Максимальное содержание гербарумина I (116.5 мг/л) в 7-суточной культуре штамма S. cirsii Г-51 ВИЗР более чем в 350 раз превышает продуктивность прототипа P. herbarum ТОХ-01020.The maximum content of stagonolide A (116.7 mg / l) in a 5-day-old culture of the strain S. cirsii G-51 VIZR is more than 2 times higher than the yield of phytotoxin from the culture of the prototype S. cirsii VIZR 1.41 (C-163). The maximum content of gerbarumin I (116.5 mg / l) in a 7-day-old culture of S. cirsii strain G-51 VIZR is more than 350 times higher than the productivity of the prototype P. herbarum TOX-01020.

Пример 2. Получение стагонолида А и гербарумина I при помощи глубинного культивирования S. cirsii Г-51 ВИЗРExample 2. Obtaining stagonolide A and gerbarumin I using deep cultivation of S. cirsii G-51 VIZR

Для верификации данных о содержании фитотоксинов в культуральном фильтрате S. cirsii Г-51 ВИЗР, полученных методом количественного анализа с применением ВЭЖХ (таблица 3), было проведено препаративное выделение стагонолида А и гербарумина I из культурального фильтрата стандартными методами жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии (Sterner, 2012 [9]).To verify the data on the phytotoxin content in the S. cirsii G-51 VIZR culture filtrate obtained by quantitative analysis using HPLC (Table 3), a preparative isolation of stagonolide A and Gerbarumin I from the culture filtrate was carried out using standard liquid-liquid extraction and column chromatography methods (Sterner, 2012 [9]).

Культивирование S. cirsii Г-51 ВИЗР в биореакторе останавливали на 6-е сутки ферментации при описанных в Примере 1 условиях. После отделения биомассы экстракцию метаболитов из фильтрата культуральной жидкости проводили хлористым метиленом. Грубое разделение экстракта (масса около 500 мг) проводили в стеклянной колонке (длина 40 см, диаметр 2.5 см) на силикагеле (50 г, диаметр частиц 70-200 мкм, Merck, Германия) в ступенчатом градиенте: гексан (элюент 1), гексан-этилацетат (8:2 по объему, элюент 2), гексан-этилацетат (6:4, элюент 3), гексан-этилацетат (4:6, элюент 4), этилацетат (элюент 5), этилацетат-метанол (8:2, элюент 6), все по 200 мл (4 порции по 50 мл) Предварительный контроль состава фракций осуществляли при помощи ТСХ (пластины Silica gel 60 F254, Merck, Германия) в системе гексан-этилацетат 8:2. Вещества визуализировали в УФ-свете (254 нм) и обработкой пластин реактивом на основе серной кислоты и анисового альдегида с последующим нагревом при температуре 105°С. Стагонолид А хорошо визуализируется при 254 нм и окрашивается реактивом в коричневый цвет (Rf 0.35). Гербарумин I при 254 нм не выявляется, реактивом окрашивается в синий цвет (Rf 0.15). По данным ТСХ и СВЭЖХ/ДМД фракция 3 (50 мг) содержала преимущественно стагонолид А, фракция 5 (150 мг) - гербарумин I с примесями.The cultivation of S. cirsii G-51 VIZR in the bioreactor was stopped on the 6th day of fermentation under the conditions described in Example 1. After separation of the biomass, the extraction of metabolites from the filtrate of the culture fluid was carried out with methylene chloride. Coarse separation of the extract (weight about 500 mg) was carried out in a glass column (length 40 cm, diameter 2.5 cm) on silica gel (50 g, particle diameter 70-200 μm, Merck, Germany) in a stepwise gradient: hexane (eluent 1), hexane ethyl acetate (8: 2 by volume, eluent 2), hexane-ethyl acetate (6: 4, eluent 3), hexane-ethyl acetate (4: 6, eluent 4), ethyl acetate (eluent 5), ethyl acetate-methanol (8: 2 , eluent 6), all 200 ml each (4 portions 50 ml each). The preliminary composition of the fractions was carried out using TLC (Silica gel plates 60 F 254 , Merck, Germany) in an 8: 2 hexane-ethyl acetate system. The substances were visualized in UV light (254 nm) and the plates were treated with a reagent based on sulfuric acid and anisaldehyde, followed by heating at 105 ° C. Stagonolide A is well visualized at 254 nm and stained with a brown reagent (R f 0.35). Gerbarumin I at 254 nm is not detected, the reagent is colored blue (R f 0.15). According to TLC and HPLC / DMD, fraction 3 (50 mg) contained predominantly stagonolide A, fraction 5 (150 mg) contained gerbarumin I with impurities.

Дальнейшую очистку гербарумина I проводили на обращенно-фазовой (ОФ) колонке Puriflash PF-15C18HP/20G (20 г, диаметр частиц сорбента 15 мкм, Interchim, Франция) при помощи системы препаративной хроматографии среднего давления Sepacore (

Figure 00000005
, Швейцария) с УФ/ВИД-детектором Образец фракции 5 адсорбировали на 2 г ОФ сорбента (Silica gel 60 silanazied, диаметр частиц 63-200 мкм, Merck, Германия) и вносили в предколонку для сухой загрузки объемом 6 мл. Элюирование метаболитов осуществляли при комнатной температуре с использованием системы растворителей 0.1%-ная муравьиная кислота - ацетонитрил: 15% ацетонитрила в течение 1 мин, градиент от 15 до 100% ацетонитрила в течение 11 мин, ацетонитрил в течение 4 мин. Скорость потока элюента 24 мл/мин, детекция на длине волны 200 нм. Время удерживания (tR) гербарумина I составило 4.5 мин.Further purification of gerbarumin I was carried out on a Puriflash PF-15C18HP / 20G reverse phase (RP) column (20 g, sorbent particle diameter 15 μm, Interchim, France) using a Sepacore medium pressure preparative chromatography system (
Figure 00000005
, Switzerland) with a UV / VID detector. Sample of fraction 5 was adsorbed onto 2 g of RP sorbent (Silica gel 60 silanazied, particle diameter 63-200 μm, Merck, Germany) and introduced into the dry-loading pre-column with a volume of 6 ml. The metabolites were eluted at room temperature using a solvent system of 0.1% formic acid - acetonitrile: 15% acetonitrile for 1 min, a gradient of 15 to 100% acetonitrile for 11 min, acetonitrile for 4 min. The flow rate of the eluent 24 ml / min, detection at a wavelength of 200 nm. The retention time (t R ) of gerbarumine I was 4.5 minutes.

Финальную очистку фитотоксинов проводили при помощи препаративной ВЭЖХ на колонке XBridge Prep С18 250×19 мм с диаметром частиц 5 мкм (Waters, США) Химия частиц этой колонки аналогична сорбенту аналитической колонки Acquity UPLC ВЕН С18 Хроматографирование проводили при комнатной температуре и скорости подачи элюента (вода-ацетонитрил 30:70) 24 мл/мин. Объем вводимой пробы 1 мл (примерно 50 мг сухого образца растворяли в 300 мкл ацетонитрила и добавляли 700 мкл воды). Метаболиты детектировали на длинах волн УФ-детектора 200 и 234 нм. В этих условиях tR гербарумина I - 9 мин, tR стагонолида А - 12 мин. Контроль содержания этих фитотоксинов в хроматографических фракциях осуществляли вышеописанным методом СВЭЖХ/ДМД.The final purification of phytotoxins was carried out using preparative HPLC on an XBridge Prep C18 250 × 19 mm column with a particle diameter of 5 μm (Waters, USA). The particle chemistry of this column was similar to the sorbent of the Acquity UPLC BEN C18 analytical column. Chromatography was performed at room temperature and the eluent feed rate (water -acetonitrile 30:70) 24 ml / min. The volume of injected sample is 1 ml (approximately 50 mg of a dry sample was dissolved in 300 μl of acetonitrile and 700 μl of water was added). Metabolites were detected at wavelengths of the UV detector 200 and 234 nm. Under these conditions, t R of gerbarumin I - 9 min, t R of stagonolide A - 12 min. The control of the content of these phytotoxins in the chromatographic fractions was carried out as described above by HPLC / DMD.

Выход стагонолида А составил около 30 мг/л, гербарумина I - 50 мг/л, что соответствует данным, приведенным в таблице I для 6-суточной культуры S. cirsii Г-51 ВИЗР.The output of stagonolide A was about 30 mg / l, gerbarumin I - 50 mg / l, which corresponds to the data shown in table I for a 6-day culture of S. cirsii G-51 VIZR.

Пример 3. Получение гербарумина I при помощи твердофазного культивирования S. cirsii Г-51 ВИЗРExample 3. Obtaining gerbarumin I using solid-phase cultivation of S. cirsii G-51 VIZR

В качестве твердого субстрата была использована автоклавированная пшенная крупа Для приготовления субстрата 150 г крупы помещали в 1500-мл микробиологические матрасы и добавляли 100 мл деионизированной воды. Субстрат стерилизовали автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин. В качестве посевного материала для твердофазного культивирования использовали двухнедельные колонии S. cirsii Г-51 ВИЗР, полученные на картофельно-глюкозном агаре (КГА) Штамм культивировали в течение 3 недель в комнатных условиях. Матрасы с растущей твердофазной культурой S. cirsii Г-51 ВИЗР встряхивали каждые 3 дня для предотвращения комкования субстратаAutoclaved millet groats were used as a solid substrate. To prepare the substrate, 150 g of groats were placed in 1500 ml microbiological mattresses and 100 ml of deionized water was added. The substrate was autoclaved at 121 ° C for 15 minutes. Two-week-old colonies of S. cirsii G-51 VIZR obtained on potato-glucose agar (KGA) were used as seed for solid-phase cultivation. The strain was cultured for 3 weeks at room conditions. Mattresses with a growing solid-phase culture of S. cirsii G-51 VIZR were shaken every 3 days to prevent clumping of the substrate

Колонизированный грибом твердый субстрат высушивали в ламинарном боксе потоком стерильного воздуха. Полученный материал измельчали и двукратно экстрагировали 50%-ным водным ацетоном (по объему) по 10 минут в ультразвуковой ванне. Полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр, ацетон отгоняли при помощи ротационного испарителя при температуре водяной бани 40°С. Метаболиты S. cirsii Г-51 ВИЗР переэкстрагировали из оставшейся после выпаривания ацетона водной вытяжки хлористым метиленом Хлористометиленовый экстракт обезвоживали с помощью безводного Na2SO4, после чего растворитель отгоняли при помощи ротационного испарителя при температуре водяной бани 40°С. Сухой остаток взвешивали, масса хлористометиленового экстракта составила 3.2 г.The solid substrate colonized by the fungus was dried in a laminar box with a stream of sterile air. The resulting material was crushed and extracted twice with 50% aqueous acetone (by volume) for 10 minutes in an ultrasonic bath. The obtained extract was filtered through a paper filter, acetone was distilled off using a rotary evaporator at a temperature of a water bath of 40 ° C. Metabolites of S. cirsii G-51 VIZR were re-extracted from the aqueous extract remaining after evaporation of acetone with methylene chloride. The methylene chloride extract was dehydrated with anhydrous Na 2 SO 4 , after which the solvent was distilled off using a rotary evaporator at a temperature of a water bath of 40 ° С. The dry residue was weighed, the mass of the chloromethylene extract was 3.2 g.

Далее проводили первичное разделение экстракта при помощи колоночной хроматографии на силикагеле Silica gel 60 (Merck, Германия) с размером частиц 63-200 мкм. Элюирование осуществляли по методу ступенчатого градиента системами с содержанием этилацетатата от 0 до 100% (по объему). По результатам разделения получили 7 фракций ХМ_А - ХМ_G. Элюаты упаривали при помощи ротационного вакуумного испарителя при температуре водяной бани 40°С. В результате разделения фракции ХМ_В (1 г) методом препаративной ВЭЖХ на колонке С18 XBridge Prep C 18 19×250 мм (Waters, США), как описано в предыдущем примере, был получен гербарумин I (672 мг).Next, the primary separation of the extract was carried out using column chromatography on silica gel Silica gel 60 (Merck, Germany) with a particle size of 63-200 μm. Elution was carried out according to the method of stepwise gradient systems with an ethyl acetate content of from 0 to 100% (by volume). Based on the results of the separation, 7 fractions XM_A - XM_G were obtained. The eluates were evaporated using a rotary vacuum evaporator at a temperature of a water bath of 40 ° C. Herbarumin I (672 mg) was obtained by separation of the XM_B fraction (1 g) by preparative HPLC on a C18 XBridge Prep C 18 19 × 250 mm column (Waters, USA) as described in the previous example.

Выход гербарумина I составил 462.4 мг/кг субстрата. Сравнить полученный выходе продуктивностью штамма-прототипа P. herbarum ТОХ-01020 не представляется возможным, так как твердофазное культивирование этого штамма не проводилось. Стагонолид А в культуре штамма S. cirsii Г-51 ВИЗР при таком способе культивирования не обнаружен.The yield of gerbarumin I was 462.4 mg / kg of substrate. It is not possible to compare the yield obtained with the productivity of the prototype strain P. herbarum TOX-01020, since there was no solid-phase cultivation of this strain. Stagonolide A was not found in the culture of the strain S. cirsii G-51 VIZR with this cultivation method.

Пример 4. Идентификация и спектр биологической активности стагонолида А и гербарумина IExample 4. Identification and spectrum of biological activity of stagonolide A and gerbarumin I

Для подтверждения структуры выделенных соединений использовали ВЭЖХ-МС/МС и анализ протонных и углеродных спектров ЯМР. Для получения масс-спектров использовалась хроматографическая система TSQ Quantum Access™ (Thermo Scientific, США), снабженная диодно-матричным быстросканирующим и масс-спектрометрическим (тройной квадруполь) детекторами. Условия хроматографирования. колонка Zorbax CB-C18 (Agilent Tech., США), зернение 1.8 мкм, размеры колонки 2.1×150 мм, градиент 10-100% ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоте, скорость потока элюента 250 мкл/мин, температура колонки 35°С, диапазон сканирования диодно-матричного детектора 200-800 нм, тип ионизации HESI, диапазон сканирования 50-1000 m/z. Для растворения образцов веществ использовался метанол. Для записи спектров ЯМР использовали прибор Avance III Ultra-Shield Plus (Bruker, Германия) Для растворения образцов веществ использовался дейтерированый хлороформ Протонные спектры записывали при частоте 400 МГц, углеродные - при 100 МГц.HPLC-MS / MS and proton and carbon NMR spectra were used to confirm the structure of the isolated compounds. To obtain mass spectra, we used the TSQ Quantum Access ™ chromatographic system (Thermo Scientific, USA) equipped with diode-matrix fast-scanning and mass spectrometric (triple quadrupole) detectors. Chromatography conditions. Zorbax CB-C18 column (Agilent Tech., USA), grain size 1.8 μm, column dimensions 2.1 × 150 mm, gradient 10-100% acetonitrile in 0.1% formic acid, eluent flow rate 250 μl / min, column temperature 35 ° C, the scanning range of the diode array detector is 200-800 nm, the ionization type is HESI, the scanning range is 50-1000 m / z. Methanol was used to dissolve samples of substances. NMR spectra were recorded using an Avance III Ultra-Shield Plus instrument (Bruker, Germany). Deuterated chloroform was used to dissolve samples of substances. Proton spectra were recorded at a frequency of 400 MHz, carbon spectra were recorded at 100 MHz.

В масс-спектре полученного нами образца стагонолида А присутствовали пики m/z 227.11 [М+Н, 100%]+ и 209.12 [М+Н-H2O, 25%]+, в масс-спектре гербарумина I - m/z 229.11 [М+Н, 10%]+ и 211.12 [М+Н-H2O, 100%]+, 193.15 [М+Н -2H2O, 25%]+. Масс-спектры демонстрируют наличие одной гидроксильной группы у стагонолида А и двух у гербарумина I. Протонный и углеродный спектры ЯМР стагонолида А и гербарумина I были идентичны опубликованным (Rivero-Cruz et al., 2000 [3]; Yuzikhin et al., 2007 [4]). В полученных углеродных спектрах DEPT обоих веществ присутствовали сигналы пяти СН2-групп (3 сигнала лактонного кольца и 2 сигнала n-пропильной группы).In the mass spectrum of the stagonolide A sample we obtained, there were peaks m / z 227.11 [M + H, 100%] + and 209.12 [M + H-H 2 O, 25%] + , in the mass spectrum of gerbarumin I - m / z 229.11 [M + H, 10%] + and 211.12 [M + H-H 2 O, 100%] + , 193.15 [M + H-2H 2 O, 25%] + . Mass spectra demonstrate the presence of one hydroxyl group in stagonolide A and two in herbarumine I. The proton and carbon NMR spectra of stagonolide A and gerbarumin I were identical to those published (Rivero-Cruz et al., 2000 [3]; Yuzikhin et al., 2007 [ four]). The obtained DEPT carbon spectra of both substances contained signals of five CH 2 groups (3 signals of the lactone ring and 2 signals of the n-propyl group).

Для оценки фитотоксического действия экстрактов и индивидуальных соединений использовали метод надколотых листовых дисков осота полевого (Берестецкий и др., 2010 [8]). Анализируемый образец растворяли сначала в небольшом количестве этанола, затем доводили водой до концентрации 5 мг/мл. Конечная концентрация этанола в растворе составляла 5% (по объему). Из листьев среднего яруса 3-5-недельных растений осота пробочным сверлом вырезали диски I см в диаметре. Диски помещали во влажную камеру, надкалывали в центре препаровальной иглой и наносили в область надкола 10 мкл раствора. Диаметр некроза на листовых дисках осота учитывали через 48 ч инкубации при температуре 24°С и переменном искусственном освещении (12 ч в день). Стагонолид А и гербарумин I оказались примерно в равной степени токсичны в отношении осота полевого и бодяка полевого. Гербарумин I проявил более высокую фитотоксическую активность в отношении пырея ползучего, чем стагонолид А на 5 сутки после обработки (таблица 4)To assess the phytotoxic effect of extracts and individual compounds, the method of chipped leaf disks of field sow thistle was used (Berestetskii et al., 2010 [8]). The analyzed sample was first dissolved in a small amount of ethanol, then adjusted with water to a concentration of 5 mg / ml. The final concentration of ethanol in the solution was 5% (v / v). From leaves of the middle tier of 3-5-week-old sow thistles, disks of 1 cm in diameter were cut with a cork drill. The disks were placed in a humid chamber, punctured in the center with a dissecting needle, and 10 μl of solution was applied to the puncture region. The diameter of necrosis on leaf discs of sow thistle was taken into account after 48 h of incubation at a temperature of 24 ° C and variable artificial lighting (12 h per day). Stagonolide A and gerbarumin I were found to be approximately equally toxic to field thistle and field thistle. Gerbarumin I showed higher phytotoxic activity against wheatgrass creeping than stagonolid A on the 5th day after treatment (table 4)

Figure 00000006
Figure 00000006

Данные представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение»Data are presented as mean ± standard deviation

Таким образом, штамм гриба S. cirsii Г-51 ВИЗР предложен как продуцент гербарумина I и стагонолида А. Продуктивность штамма позволяет получить гербарумин I в количестве 116 мг/л при культивировании в течение 7 суток на жидкой питательной среде в ферментере, что более чем в 150 раз превышает продуктивность прототипа - штамма Phoma herbarum ТОХ-01020. Кроме того, S. cirsii Г-51 ВИЗР образует гербарумин I при культивировании на твердой питательной среде с выходом 460 мг/кг субстрата. При глубинном культивировании в течение 5-ти суток этот гриб образует также стагонолид А с выходом более 100 мг/л, что более чем в 2 раза превышает выход этого вещества при использовании прототипа - штамма S. cirsii VIZR 1.41 (С-163)Thus, the strain of fungus S. cirsii G-51 VIZR was proposed as a producer of gerbarumin I and stagonol A. The productivity of the strain allows one to obtain gerbarumin I in the amount of 116 mg / l when cultivated for 7 days on a liquid nutrient medium in a fermenter, which 150 times the productivity of the prototype strain Phoma herbarum TOX-01020. In addition, S. cirsii G-51 VIZR forms gerbarumin I when cultured on solid nutrient medium with a yield of 460 mg / kg of substrate. When deep cultured for 5 days, this fungus also forms stagonolide A with a yield of more than 100 mg / l, which is more than 2 times the yield of this substance when using the prototype strain S. cirsii VIZR 1.41 (C-163)

ЛитератураLiterature

1. Берестецкий А.О. Фитотоксины грибов: от фундаментальных исследований - к практическому использованию (Обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. т. 44, N 5, с. 501-514.1. Berestetskiy A.O. Mushroom phytotoxins: from basic research to practical use (Review) // Applied Biochemistry and Microbiology. 2008.Vol. 44, No. 5, p. 501-514.

2. Берестецкий А.О. Перспективы разработки биологических и биорациональных гербицидов // Вестник защиты растений 2017. Т. 91, N 1. С. 5-12.2. Berestetsky A.O. Prospects for the development of biological and biorational herbicides // Bulletin of Plant Protection 2017. T. 91, N 1. P. 5-12.

3. Rivero-Cruz J.F., Garcia-Aguirre G., Cerda-Garcia-Rojas C.M., Mata R. Conformational Behavior and Absolute Stereostructure of Two Phytotoxic Nonenolides from the Fungus Phoma herbarum // Tetrahedron. - 2000. - V. 56. - P. 5337-5344.3. Rivero-Cruz J.F., Garcia-Aguirre G., Cerda-Garcia-Rojas C.M., Mata R. Conformational Behavior and Absolute Stereostructure of Two Phytotoxic Nonenolides from the Fungus Phoma herbarum // Tetrahedron. - 2000. - V. 56. - P. 5337-5344.

4 Yuzikhin О., Mitina G., and Berestetskiy A. Herbicidal potential of stagonolide, a new phytotoxic nonenolide from Stagonospora cirsii // J. Agric. Food Chem. 2007. Vol. 55. N 19. 7707-7711.4 Yuzikhin O., Mitina G., and Berestetskiy A. Herbicidal potential of stagonolide, a new phytotoxic nonenolide from Stagonospora cirsii // J. Agric. Food Chem. 2007. Vol. 55. N 19. 7707-7711.

5. Berestetskiy A., Dmitriev A., Mitina G., Lisker I., Andolfi A., Evidente A. Nonenolides and cytochalasins with phytotoxic activity against Cirsium arvense and Sonchus arvensis: A structure-activity relationships study // Phytochemistry 69 (2008) 953-960.5. Berestetskiy A., Dmitriev A., Mitina G., Lisker I., Andolfi A., Evidente A. Nonenolides and cytochalasins with phytotoxic activity against Cirsium arvense and Sonchus arvensis: A structure-activity relationships study // Phytochemistry 69 (2008 ) 953-960.

6 Davis J.J. 1919. Notes on parasitic fungi in Wisconsin. V. Transactions of the Wisconsin Academy of Science. 19(2):690-704.6 Davis J.J. 1919. Notes on parasitic fungi in Wisconsin. V. Transactions of the Wisconsin Academy of Science. 19 (2): 690-704.

7 Благовещенская Е.Ю. Микологические исследования: основы лабораторной техники. М.: Ленанд, 2017. 96 с.7 Blagoveshchenskaya E.Yu. Mycological studies: the basics of laboratory technology. M.: Lenand, 2017.96 s.

8 Берестецкий, А.О., Юзихин О.С., Каткова А.С., Добродумов А.В., Сивогривов Д.Е., Коломбет Л.В. Выделение, идентификация и характеристика фитотоксина, образуемого грибом Alternaria cirsinoxia // Прикладная биохимия и микробиология. - 2010. - Т. 41, №1. - С. 84-88.8 Berestetsky, A.O., Yuzikhin O.S., Katkova A.S., Dobrodumov A.V., Sivogrivov D.E., Colombet L.V. Isolation, identification and characterization of phytotoxin formed by Alternaria cirsinoxia fungus // Applied Biochemistry and Microbiology. - 2010. - T. 41, No. 1. - S. 84-88.

9. Sterner О. Isolation of microbial natural products. In: Natural Products Isolation. Sarker S.D., Nahar L. (Eds.) Methods in Molecular Biology, vol. 864, Springer Science + Business Media, LLC. 2012. P. 393-413.9. Sterner O. Isolation of microbial natural products. In: Natural Products Isolation. Sarker S.D., Nahar L. (Eds.) Methods in Molecular Biology, vol. 864, Springer Science + Business Media, LLC. 2012. P. 393-413.

Claims (1)

Штамм гриба Stagonospora cirsii Г-51 ВИЗР - продуцент гербарумина I и стагонолида А.The strain of the fungus Stagonospora cirsii G-51 VIZR - producer of Gerbarumin I and Stagonolide A.
RU2018147582A 2018-12-28 2018-12-28 Strain stagonospora cirsii g-51 vizr - producer of herbarumine i and stagonolide a RU2701817C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018147582A RU2701817C1 (en) 2018-12-28 2018-12-28 Strain stagonospora cirsii g-51 vizr - producer of herbarumine i and stagonolide a

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018147582A RU2701817C1 (en) 2018-12-28 2018-12-28 Strain stagonospora cirsii g-51 vizr - producer of herbarumine i and stagonolide a

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2701817C1 true RU2701817C1 (en) 2019-10-01

Family

ID=68170906

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018147582A RU2701817C1 (en) 2018-12-28 2018-12-28 Strain stagonospora cirsii g-51 vizr - producer of herbarumine i and stagonolide a

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2701817C1 (en)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2515899C1 (en) * 2013-05-07 2014-05-20 Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Российской академии сельскохозяйственных наук STRAIN OF FUNGUS Stagonospora cirsii Davis HAVING HERBICIDAL ACTIVITY AGAINST CANADA THISTLE

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2515899C1 (en) * 2013-05-07 2014-05-20 Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Российской академии сельскохозяйственных наук STRAIN OF FUNGUS Stagonospora cirsii Davis HAVING HERBICIDAL ACTIVITY AGAINST CANADA THISTLE

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RIVERO-CRUZ J.F. ET AL. Conformational Behavior and Absolute Stereostructure of Two Phytotoxic Nonenolides from the Fungus Phoma herbarum. Tetrahedron 56 (2000), pp. 5337-5344. *
Берестецкий А.О. Фитотоксины грибов: от фундаментальных исследований - к практическому использованию (обзор). Прикладная биохимия и микробиология, 2008, том 44, номер 5, с. 501-514. *
САБАШУК Ю.А. И ДР. Изучение влияния условий глубинного культивирования на выход фитотоксических экзометаболитов, образуемых Stagonospora cirsii S-47. Материалы научной конференции "Традиции и Инновации", посвященной 189-й годовщине образования Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). 30 ноября - 1 декабря 2017 г. - СПб.: 2017. - 288 с., с.139. *
САБАШУК Ю.А. И ДР. Изучение влияния условий глубинного культивирования на выход фитотоксических экзометаболитов, образуемых Stagonospora cirsii S-47. Материалы научной конференции "Традиции и Инновации", посвященной 189-й годовщине образования Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). 30 ноября - 1 декабря 2017 г. - СПб.: 2017. - 288 с., с.139. RIVERO-CRUZ J.F. ET AL. Conformational Behavior and Absolute Stereostructure of Two Phytotoxic Nonenolides from the Fungus Phoma herbarum. Tetrahedron 56 (2000), pp. 5337-5344. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kai et al. Volatiles of bacterial antagonists inhibit mycelial growth of the plant pathogen Rhizoctonia solani
Zhang et al. Antifungal metabolites produced by Chaetomium globosum No. 04, an endophytic fungus isolated from Ginkgo biloba
CN111454869B (en) Marine streptomyces and application thereof
CN103937678B (en) One strain ocean shell penicillium sp, its derivative quinolinones compound and preparation thereof and application
He et al. Sesquiterpenyl epoxy-cyclohexenoids and their signaling functions in nematode-trapping fungus Arthrobotrys oligospora
CN103740606A (en) Streptomyces phytohabitans, method for producing new antibiotics Novonestmycin from Streptomyces phytohabitans, and application of Novonestmycin
CN113005048B (en) Streptomyces nigricans CYS22, metabolite thereof and application thereof
RU2701817C1 (en) Strain stagonospora cirsii g-51 vizr - producer of herbarumine i and stagonolide a
CN109400444B (en) Sesquiterpenoids for inhibiting plant pathogenic fungi and preparation method thereof
CN114196583B (en) Streptomyces thermophilus, synergistic biological agent containing same and application thereof
CN107417559B (en) A kind of sesquiterpenoids and its preparation method and application
CN102757443B (en) Sulfur-substituted podophyllum derivative and bioconversion, separation and purification method thereof
Berestetskiy et al. Development of chromatography techniques for analysis and preparative isolation of phytotoxic metabolites produced by Stagonospora cirsii
CN109265461B (en) Paenibacillus kribbensis metabolite and application thereof in biocontrol
CN102234669B (en) Biotransformation and purification method of 4-(2,3,5,6-tetramethylpyrazine-1-group)-4'-demethylepipodophyllotoxin
Piska et al. Terpenoid as antibacterial produced by endophyte Fusarium oxysporum LBKURCC41 from Dahlia variabilis tuber
RU2420568C2 (en) Strain and biosynthesis method of producing antibiotic mitomycin
CN110642823A (en) Pyran derivative and preparation method and application thereof
KR20050119800A (en) Xylaria sp. ah001 strain producing griseofulvin, formulation for controlling plant diseases containing same and method for controlling plant diseases using same
RU2596928C1 (en) STRAIN Paraphoma sp. PRODUCER OF FEOSFERID A
CN112694406B (en) Preparation method and application of two dimeric hexyl itaconic acid derivatives
CN114164132B (en) Achromobacter and application thereof as well as method for preparing phenazine-1-carboxylic acid and phenazine-1-formamide
CN106967622A (en) One plant of paclitaxel produced aspergillus flavus BP6T2 and its application
CN102993030B (en) Benzyne compound and preparation method thereof, as well as application in control of rice pathogens
Mostafa et al. NOVEL ROLE OF 6-N-PENTYL-6H-PYRAN-2-ONE PRODUCED BY Trichoderma harzianum IN HYDROPONIC SYSTEM