KR20050119800A - Xylaria sp. ah001 strain producing griseofulvin, formulation for controlling plant diseases containing same and method for controlling plant diseases using same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 식물병에 대해 길항적인 활성을 갖는 그리세오풀빈 (griseofulvin) 또는 이의 생산능을 갖는 자일라리아(Xylaria) 속 AH001 균주를 포함하는 식물병 방제용 제제, 상기 미생물 제제를 이용하여 식물병을 생물학적으로 방제하는 방법, 상기 그리세오풀빈 또는 디클로로그리세오풀빈(dichlorogriseofulvin)을 생산하는 신규한 자일라리아(Xylaria) 속 AH001 균주, 상기 균주로부터 그리세오풀빈 또는 디클로로그리세오풀빈을 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 그리세오풀빈 및 이의 생산능을 갖는 자일라리아 속 AH001 균주는 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 푸자리움 시들음병, 고추 탄저병 또는 사과나무 점무늬낙엽병과 같은 식물병에 대해 강한 길항작용을 나타내므로 식물병 방제에 유용하게 이용할 수 있다.The invention plant diseases using the antagonistic draw Seo pulbin (griseofulvin) or character Ilaria formulation, the microbial agent for controlling plant diseases comprising the (Xylaria) in AH001 strain having its producing ability has an activity for controlling plant diseases To a biological control method, a novel Xylaria genus AH001 strain that produces the griseofulvin or dichlorogriseofulvin, a method of producing griseofulvin or dichlorogriseofulvin from the strain In relation to the present invention, the griseofulvin and the genus AH001 strains having a production capacity thereof include rice blast, rice leaf blight, wheat red rust, barley flour, pulp wilting disease, pepper anthracnose or apple tree spot deciduous disease. It exhibits strong antagonism against plant diseases and can be usefully used for plant disease control.

Description

그리세오풀빈을 생산하는 자일라리아 속 AH001 균주, 이를 포함하는 식물병 방제용 제제 및 이를 이용하여 식물병을 방제하는 방법{XYLARIA SP. AH001 STRAIN PRODUCING GRISEOFULVIN, FORMULATION FOR CONTROLLING PLANT DISEASES CONTAINING SAME AND METHOD FOR CONTROLLING PLANT DISEASES USING SAME} Xylaria genus AH001 strain that produces griofulvin, a plant disease control agent comprising the same and a method for controlling plant disease using the same XYLARIA SP. AH001 STRAIN PRODUCING GRISEOFULVIN, FORMULATION FOR CONTROLLING PLANT DISEASES CONTAINING SAME AND METHOD FOR CONTROLLING PLANT DISEASES USING SAME}

본 발명은 식물병에 대해 길항적인 활성을 갖는 그리세오풀빈(griseofulvin) 또는 이의 생산능을 갖는 자일라리아(Xylaria) 속 AH001 균주를 포함하는 식물병 방제용 제제, 상기 제제를 이용하여 식물병을 생물학적으로 방제하는 방법, 상기 그리세오풀빈 또는 디클로로그리세오풀빈(dichlorogriseofulvin)을 생산하는 신규한 자일라리아(Xylaria) 속 AH001 균주 및 상기 균주로부터 그리세오풀빈 또는 디클로로그리세오풀빈을 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention is a so Seo pulbin (griseofulvin) or chair having a counter-producing ability Ilaria (Xylaria) in plant disease using the agent, the agent for controlling plant diseases comprising the AH001 strain having antagonistic activity for controlling plant diseases how to control the biological and the draw Seo pulbin or dichloro draw novel character producing Seo pulbin (dichlorogriseofulvin) Ilaria (Xylaria) in AH001 strain and a method for so producing Seo pulbin or dichloro draw Seo pulbin from the strain will be.

그리세오풀빈은 곰팡이가 생산하는 대표적인 항균활성을 지닌 항생물질로서 특히 피부병원균에 대하여 널리 이용되고 있다. 또한 그리세오풀빈은 동물의약 및 식물병에 대하여 효과가 있으며, 식물병 중에는 특히 보트라이티스(Botrytis)속 균이 유발하는 식물병에 효과가 있다고 알려져 있다 (Yamaguchi, Modern selective fungicides-properties, applications, mechanisms of action, pp.415-429(1995)). 그리세오풀빈은 많은 종의 페니실리움(Penicillium)속 균들에 의하여 생산되며, 곰팡이 균사의 심한 왜화현상(stunting), 과도한 가지 생성(excessive branching), 비정상적인 비대(abnormal swelling) 및 균사의 비틀어짐(twisting of hyphae) 등을 유기한다. 이 항균물질은 많은 균사체 곰팡이의 생장을 억제하나 효모, 방선균 및 난균강(Oomycetes) 등에 속하는 균에는 효과가 없는 것으로 알려져 있다.Griseofulvin is an antibiotic with a representative antimicrobial activity produced by the fungus, and is particularly widely used against skin pathogens. In addition, griseofulvin is effective against veterinary medicine and plant diseases, and is known to be effective against plant diseases caused by Botrytis bacteria (Yamaguchi, Modern selective fungicides-properties, applications, mechanisms of action , pp. 415-429 (1995). Griseofulvin is produced by many species of the genus Penicillium , which causes severe stunting, excessive branching, abnormal swelling, and twisting of mycelia. twisting of hyphae). This antimicrobial substance inhibits the growth of many mycelial fungi, but it is known to be ineffective against bacteria belonging to yeast, actinomycetes and Oomycetes.

그리세오풀빈은 화학적으로 합성하여 제조할 수 있으나(Lednicer and Mitscher, 1977, The Organic Chemistry of Drug Synthesis, pp. 313-317), 관련된 중간 반응들이 너무 많아 실제로 상업적으로 이용하기에는 경제성이 낮은 관계로, 현재 그리세오풀빈의 상업적 생산은 페니실리움속 균주에 의한 발효를 통하여 이루어지고 있는 실정이다(Venkata Dasu and Panda, 1999, Bioprocess Engineering 21:489-495). 그리세오풀빈을 생산하는 것으로 알려진 균에는 페니실리움 그리세오풀빈(P. griseofulvin), 페니실리움 파튤륨(P. patulum), 페니실리움 유티캐(P. urticae), 페니실리움 나이그리칸스(P. nigricans), 페니실리움 스클레로티게눔(P. sclerotigenum)(Mantle et al., 1984, J. Gen. Microbiol. 130:1293-1298; Yoshihiro et al., 1978, Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai Koen Yoshishu 21:152-158), 아스퍼질러스 버시콜로(Aspergillus versicolor)(David and Paul, 1976, Phytochemistry 15:1037-1039) 및 스트렙토마이세스 알보론거스(Streptomyces albolongus)(Terekhova et al., 1992, Antibiotiki I Khimioterapita 37:19-21) 등이 있다. 이들 중에서 주로 페니실리움속 균의 돌연변이를 통한 다량 생산균주 개발 및 발효공정 개발 등을 통하여 상업적으로 경제성이 있도록 그리세오풀빈을 생산하게 되었다. 따라서 저렴하게 그리세오풀빈을 생산하기 위하여 새로운 균주를 선발하는 것은 상업적으로나 학문적으로 매우 중요하다.Griseofulvin can be prepared by chemical synthesis (Lednicer and Mitscher, 1977, The Organic Chemistry of Drug Synthesis, pp. 313-317), but there are so many intermediate reactions involved that it is not economically viable for commercial use. At present, the commercial production of Griseofulvin is carried out through fermentation with penicillium strains (Venkata Dasu and Panda, 1999, Bioprocess Engineering 21: 489-495). So, the chamber Penny bacteria are known to produce very Seo Seo pulbin Solarium pulbin (P. griseofulvin), Penny Room Solarium wave tyulryum (P. patulum), Penny Room Solarium yuti cache (P. urticae), Penny Room Solarium age so kanseu ( P. nigricans ), Penicillium sclerotigenum (Mantle et al., 1984, J. Gen. Microbiol. 130: 1293-1298; Yoshihiro et al., 1978, Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai Koen Yoshishu 21: 152-158), Aspergillus versicolor (David and Paul, 1976, Phytochemistry 15: 1037-1039) and Streptomyces albolongus ( Terekhova et al., 1992, Antibiotiki I Khimioterapita 37: 19-21). Among them, griseofulvin was produced to be commercially economical through the development of large-scale production strains and fermentation process through mutations of the genus Penicillium. Therefore, it is very important commercially and academically to select new strains to produce glyseofulvin at low cost.

이에 본 발명자들은 식물 특히 나무로부터 분리한 식물내생곰팡이가 생성하는 신물질에 대한 연구를 진행하던 중 한 균주의 배양액이 각종 식물병원균에 대하여 높은 항균활성을 갖는다는 사실을 발견하였고, 이를 동정한 결과 항균물질은 그리세오풀빈으로 밝혀졌으며, 이를 생산하는 균주는 이제까지 그리세오풀빈의 생산균주로서 보고된 바 없었던 자이라리아(Xylaria) 속 균주라는 사실을 발견하였다. 또한, 이 균주의 배양액이 보트라이티스 시네레아(Botrytis cinerea)에 의한 잿빛곰팡이병 이외에 다른 식물병인 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 푸자리움 시들음병, 고추 탄저병 또는 사과나무 점무늬낙엽병 등 여러 가지 식물병에 대해 길항작용이 있다는 사실을 발견하였다.Therefore, the present inventors found that the culture medium of one strain has high antimicrobial activity against various phytopathogens while studying the new material produced by endogenous fungi isolated from plants, especially trees. The substance was found to be griseofulvin, and the strain producing it was found to be a strain of genus Xylaria , which has never been reported as a production strain of griseofulvin . In addition, the culture medium of this strain is plant diseases other than ash fungus caused by Botrytis cinerea , rice blast, rice leaf blight, wheat red rust, barley powdery mildew, pulp wilting disease, pepper anthrax or apple tree spots. It has been found that there are antagonisms against various plant diseases such as deciduous diseases.

본 발명의 목적은 그리세오풀빈 또는 이를 생산하는 자일라리아 속 균주를 포함하는 식물병 방제용 제제를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide an agent for controlling plant diseases, which comprises glyofulvin or a strain of genus Xylaria producing the same.

본 발명의 다른 목적은 상기 제제를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for controlling plant diseases using the agent.

본 발명의 또 다른 목적은 그리세오풀빈 또는 디클로로그리세오풀빈 생산능을 갖는 자일라리아 속 균주를 제공하는 것이다. It is another object of the present invention to provide a strain of genus Xylaria having gseleofulvin or dichlorogriseofulvin production capacity.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 하기 화학식 1의 그리세오풀빈, 이의 생산능을 갖는 자일라리아 속 AH001 균주(KCTC 10629BP) 또는 상기 균주로부터 유래된 물질을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 제제를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is for the control of plant diseases containing glyseofulvin of the formula (1), Xylaria genus AH001 strain (KCTC 10629BP) having a production capacity or a substance derived from the strain as an active ingredient Provide formulations.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 제제를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공한다. In order to achieve the above another object, the present invention provides a method for controlling plant diseases using the agent.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 자일라리아 속 AH001 균주(KCTC 10629BP)로부터 그리세오풀빈 또는 하기 화학식 2의 디클로로그리세오풀빈을 생산하는 방법을 제공한다.In order to achieve the above another object, the present invention provides a method for producing glyopoolbin or dichloroglyopulbin of the formula (2) from the genus AH001 strain (KCTC 10629BP) of Xylaria.

본 발명에서 분리한 균주는 잣나무 줄기로부터 분리된 것으로, 균주의 형태적 특성, 5.8S rRNA 유전자(ITS1-5.8S-ITS2) 서열 분석결과 자일라리아 속 균주로서 확인되었는 바, 이를 자일라리아 속 AH001으로 명명하고 2004년 5월 10일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 10629BP호로서 기탁하였다.The strain isolated in the present invention was isolated from the pine trunk, the morphological characteristics of the strain, 5.8S rRNA gene (ITS1-5.8S-ITS2) sequence analysis was confirmed as a strain of genus Xylaria, which is the genus Xylaria It was named AH001 and deposited on May 10, 2004 as a deposit number No. KCTC 10629BP to Gene Bank of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology.

본 발명의 자일라리아 속 AH001 균주는 다음과 같은 형태학적 및 생화학적 특징을 갖는다.The Xylaria genus AH001 strain of the present invention has the following morphological and biochemical characteristics.

즉, 자일라리아 속 AH001 균주는 감자추출물-덱스트로스 한천배지(potato dextrose agar) 상에서 노란색의 공중 균사를 많이 생성하며, 시간이 지나감에 따라 배지 뒷면의 색은 갈색을 나타내게 된다. 또한 감자한천배지에서 오랫동안 배양할 경우 수직으로 긴 방망이 모양의 자좌(stromata)를 생성한다. 균주의 정확한 동정을 위하여 5.8S rRNA 유전자(ITS1-5.8S-ITS2)의 염기서열(서열번호: 1)을 분석한 결과 진뱅크(GeneBank)에 등록된 자일라리아 코누다메(Xylaria cornu-damae) AF163031과 90%이상의 유사성을 나타내었다.That is, AH001 strain of genus Xylaria produces a lot of yellow aerial hyphae on potato extract-dextrose agar medium, and the color of the back side of the medium becomes brown as time passes. In addition, long-term incubation in potato agar medium produces long vertical bat-shaped stromatas. Xylaria cornu-damae registered in GeneBank as a result of analyzing the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the 5.8S rRNA gene (ITS1-5.8S-ITS2) for accurate identification of the strain ) And at least 90% similarity with AF163031.

이러한 특성을 갖는 자일라리아 속 AH001 균주로부터 그리세오풀빈 및 디클로로그리세오풀빈을 생산할 수 있는데, 균주의 배양에는 감자추출물-덱스트로스 액체배지(potato dextrose broth; PD), 맥아추출물-펩톤-덱스트로스 액체배지(malt extract peptone dextrose broth; MPD), 맥아추출물-효모추출물 액체 배지(malt and yeast extract broth; MY), 글루코스-효모추출물-폴리펩톤 액체배지(YpSs broth; YpSs) 등 곰팡이의 배양을 위해 사용되는 통상의 배지들을 사용할 수 있으며, 특히 글루코스-효모추출물-폴리펩톤 배지가 바람직하다. 이들 배지 중 적합한 배지에 자일라리아 속 AH001 균주를 접종하고 3 내지 21 일, 바람직하게는 12 내지 18 일간 배양함으로써 다량의 그리세오풀빈 및 디클로로그리세오풀빈을 생산할 수 있다.Griseofulvin and dichlorogriseofulvin can be produced from the Xylaria genus AH001 strain having these characteristics. The cultures of the strains include potato extract-dextrose broth (PD), malt extract-peptone-dextrose. For the cultivation of fungi such as malt extract peptone dextrose broth (MPD), malt and yeast extract broth (MY), glucose-yeast extract-polypeptone liquid medium (YpSs broth (YpSs) Conventional media used can be used, with glucose-yeast extract-polypeptone media particularly preferred. A large amount of griseofulvin and dichlorogriseofulvin can be produced by inoculating a suitable strain of the genus AH001 in these medium and incubating for 3 to 21 days, preferably 12 to 18 days.

상기 자일라리아 속 AH001 균주, 및 이로부터 분리된 그리세오풀빈은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 푸자리움 시들음병, 고추 탄저병 또는 사과나무 점무늬낙엽병에 대해 강한 길항작용을 나타낸다.The Xylaria genus AH001 strain, and the griseofulvin isolated therefrom have a strong antagonistic action against rice blast, rice leaf blight, wheat red rust, barley powdery mildew, fusidium wilting disease, chili anthracnose or apple tree spotted deciduous disease. Indicates.

본 발명의 자일라리아 속 AH001 균주는 균주 자체, 또는 균주의 배양액, 추출물 또는 포자 단독으로 담체와 혼합하여 분말, 펠렛, 과립 또는 용액 등으로 제형화하여 식물병 방제용 제제로서 사용할 수 있으며, 상기 담체로는 물, 화이트 카르본, 카올린 등을 사용할 수 있다.Xylaria genus AH001 strain of the present invention can be used as an agent for controlling plant diseases by formulating into a powder, pellets, granules or solutions by mixing the carrier itself, or the culture solution, extract or spores of the strain alone. As the carrier, water, white carbon, kaolin, or the like can be used.

제형화된 제제는 식물이 생장하고 있는 토양 또는 성장 중인 식물 표면에 처리함으로써 식물병에 의한 식물 성장의 억제 및 이로 인한 고사를 방제할 수 있다.Formulated formulations can control the soil on which plants are growing or the surface of growing plants to control inhibition of plant growth by plant diseases and thereby death.

본 발명의 자일라리아 속 AH001 균주는 대상식물에 대해 105 cells/㎖ 내지 1011 cells/㎖, 바람직하게는 106 cells/㎖ 내지 108 cells/㎖의 양으로 처리될 수 있으며, 상기 자일라리아 속 AH001 균주로부터 분리된 그리세오풀빈은 대상식물에 대해 100 ㎍/㎖ 내지 1000 ㎍/㎖, 바람직하게는 250 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖의 양으로 처리될 수 있다.Xylaria AH001 strain of the present invention can be treated in an amount of 10 5 cells / ml to 10 11 cells / ml, preferably 10 6 cells / ml to 10 8 cells / ml to the target plant, Griseofulvin isolated from the strain of Illaria genus AH001 can be treated in an amount of 100 μg / ml to 1000 μg / ml, preferably 250 μg / ml to 500 μg / ml for the subject plant.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예 1: 자일라리아속 AH001 균주의 분리Example 1 Isolation of Xylaria AH001 Strains

국내에 자생하고 있는 전나무(Abies holophyiia)로부터 건강한 가지와 줄기 부위를 채집하고, 각각 1 ㎝ 정도의 크기로 자른 다음 96% 에탄올에 1분, 3.25% 차염화나트륨(NaOCl)에 3분간 침지시킨 후 다시 96% 에탄올로 30초간 표면 살균하였다. 1차 표면 살균한 시료를 다시 알코올 램프를 이용하여 화염 살균한 다음 시료를 50 ㎎/ℓ 클로람페니콜(입수처: 미국 시그마사)이 첨가된 옥수수가루-맥아추출물-효모추출물 한천배지(cornmeal malt extract agar medium: 17.0 g 옥수수가루, 20.0 g 맥아추출물, 2.0 g 효모추출물, 1.0 ℓ증류수)에 치상하고, 25℃ 항온조건 하에서 균 분리를 실시하였다. 분리한 균들은 다시 감자한천배지(potato dextrose agar; 입수처: 미국 벡톤과 디킨슨사) 상에서 단 균사 분리를 실시하여 총 9개의 곰팡이를 분리하였다, 이들 균주의 장기 보관을 위하여 감자한천배지에서 7일간 배양한 균주의 선단부를 떼어내고 멸균 증류수에 넣은 다음 실온에 보관하거나, 또한 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO) 용액에 넣은 다음 -70℃에 보관하였다.Healthy branches and stems are collected from Abies holophyiia native to Korea, cut into 1 cm each, and then immersed in 96% ethanol for 1 minute and 3.25% sodium chloride (NaOCl) for 3 minutes. Surface sterilization with 96% ethanol for 30 seconds. The first surface sterilized sample was flame sterilized again using an alcohol lamp, and the sample was then treated with cornmeal malt extract-yeast extract agar medium to which 50 mg / L chloramphenicol (available from Sigma, USA) was added. medium: 17.0 g corn flour, 20.0 g malt extract, 2.0 g yeast extract, 1.0 L distilled water) and the bacteria were separated under 25 ℃ constant temperature conditions. The isolates were isolated from single mycelia on a potato agar medium (Becton and Dickinson, USA) to isolate a total of nine fungi. For the long-term storage of these strains, seven fungi were isolated on potato agar medium. The tip of the cultured strain was removed and placed in sterile distilled water and then stored at room temperature, or further placed in dimethylsulfoxide (dimethylsulfoxide, DMSO) solution and then stored at -70 ° C.

실시예 2: 분리한 균주들의 생체내(Example 2: In vivo of isolated strains in vivoin vivo ) 항균활성 조사 Antimicrobial Activity

상기 실시예 1에서 분리된 9개 균주들의 6가지 식물병에 대한 방제활성을 조사하기 위하여 다음과 같이 액체배양을 실시하였다. 멸균한 200 ㎖ 감자추출물-덱스트로스 액체배지(potato dextrose broth(PDB), 입수처: 미국 벡톤과 디킨슨사)에 감자추출물-덱스트로스 한천배지에서 배양된 균주의 선단부위를 코르크 절단기(cork borer, 지름 8 ㎜)로 떼어낸 다음 조각 4개씩을 접종하여 25℃, 150 rpm으로 10일간 진탕 배양하였다. 배양액을 10,000×g에서 15분간 원심 분리한 후 30 ㎖의 상층액에 트윈 20을 250 ㎍/㎖수준으로 첨가한 시료를 샘플로서 사용하였다 .In order to investigate the control activity against the six plant diseases of the nine strains isolated in Example 1 was carried out liquid culture as follows. The tip of the strain cultured in potato extract-dextrose agar medium in sterile 200 ml potato extract-dextrose broth (PDB), obtained from Becton and Dickinson, USA 8 mm in diameter), and then inoculated into 4 pieces and shaken at 25 ° C. and 150 rpm for 10 days. The culture solution was centrifuged at 10,000 x g for 15 minutes, and a sample in which Tween 20 was added at a level of 250 µg / ml to 30 ml of supernatant was used as a sample.

항균활성이 있는 균주를 선발하기 위해, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병 및 보리 흰가루병의 식물병에 대하여 상기 9개 균주 배양 시료의 생체내 항균활성을 검정하였다. 벼(Oryza sativa), 토마토(Lycopersicon esculentum), 보리(Hordeum sativum) 및 밀(Triticum aestivum)을 지름 4.5 ㎝ 플라스틱 폿트에 원예용 상토 또는 수도용 상토를 70% 정도 담고 온실(25±5℃)에서 1주에서 3주정도 키웠다.In order to select strains with antimicrobial activity, the antimicrobial activity of the nine strain culture samples was assayed against plant diseases of rice blast, rice leaf blight, tomato gray mold, tomato blight, wheat rust and barley powdery mildew. It was. Rice ( Oryza sativa ), tomato ( Lycopersicon esculentum ), barley ( Hordeum sativum ) and wheat ( Triticum aestivum ) in 4.5 cm diameter plastic pots contain about 70% of horticultural or tap water soils in a greenhouse (25 ± 5 ℃). I grew about three weeks in a week.

벼 도열병은 2엽기 유묘에 벼 도열병균(Magnaporthe grisea; 입수처: 한국화학연구원) 포자현탁액 (5×105 포자/㎖)을 분무하여 접종한 후 25℃ 습실상에서 하루 동안 발병을 유도한 다음, 25℃ 항온실에서 5일간 두었다. 벼 잎집무늬마름병은 3엽기 유묘에 벼 잎집무늬마름병균(Thanatephorus cucumeris; 입수처: 한국화학연구원)이 7일 동안 배양된 배지(밀기울 90 g, 왕겨 15 g, 증류수 100 ㎖)를 접종하고 25℃ 습실상에서 4일간 처리한 다음, 25℃ 항온실에서 4일간 배양하였다. 토마토 역병은 2엽기 토마토 유묘에 토마토 역병균(Phytophthora infestans; 입수처: 강릉대학교)의 유주자낭 현탁액(105 유주자낭/㎖)에서 나출된 유주자 현탁액을 분무접종한 후 20℃ 습실상에서 발병을 유도하였다.Rice blast is a two-leafed seedling with Magnaporthe grisea (obtained from Korea Research Institute of Chemical Technology). After inoculation by spraying a spore suspension (5 × 10 5 spores / ml), the disease was induced for one day in a 25 ° C. wet room, and then placed in a 25 ° C. thermostat for 5 days. Rice leaf blight blight was inoculated with 3 leaf seedlings inoculated with medium ( Branberry 90 g, rice husk 15 g, distilled water 100 ml) incubated for 7 days with three leafy seedlings of Thanatephorus cucumeris ( source : Korea Research Institute of Chemical Technology). After 4 days of treatment in a wet room, it was incubated for 4 days in a 25 ℃ constant temperature room. Tomato late blight was detected in two-stage tomato seedlings of Phytophthora infestans (Gangneung National University). After inoculation of the distilled suspension, which was extracted from the distilled sac suspension (10 5 sachets / ml), the onset was induced in a 20 ° C wet room.

한편, 토마토 잿빛곰팡이병은 토마토 2엽기 유묘에 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea; 입수처: 한국화학연구원) 포자 현탁액(106 포자/㎖)을 처리한 후에 습실상에서 발병시켰다. 밀 붉은녹병은 1엽기 유묘에 활물 기생균인 녹병균(Puccinia recondita; 입수처: 한국화학연구원)의 포자를 트윈 20 용액(250 ㎍/㎖)에 0.67 g 포자/ℓ 수준으로 현탁한 후 포자현탁액을 분무처리하여 하루동안 20℃ 습실상에서 발병을 유도한 후 항온실로 옮겨 배양하였다. 마지막으로 보리 흰가루병은 보리 유묘 1엽기에 숙주식물에서 계대 배양된 보리 흰가루병균(Blumeria graminis f. sp. hordei; 입수처: 한국화학연구원) 포자를 접종하고 20℃ 항온실에서 발병시켰다. 대조군으로는 1%의 DMSO를 혼합하고 있는 트윈 20 용액(250 ㎍/㎖) 30 ㎖을 사용하였다.On the other hand, tomato gray mold disease was developed in a wet room after treatment of the spore suspension (10 6 spores / ml) of tomato fungi ( Botrytis cinerea ; obtained from Korea Research Institute of Chemistry) on tomato seedlings. Wheat rust is sprayed with spore suspension after suspending spores of Puccinia recondita ( Puccinia recondita ; source: Korea Research Institute of Chemistry), a twenty seedling seedling, at a level of 0.67 g spores / L in Tween 20 solution (250 ㎍ / ml). After treatment, the disease was induced in a 20 ° C. wet room for one day, and then transferred to a constant temperature room and cultured. Lastly, barley powdery mildew was inoculated with spores of Blumeria graminis f. Sp.hordei (obtained from Korea Research Institute of Chemical Technology) that were passaged in host plants at the first stage of barley seedlings. As a control, 30 ml of Tween 20 solution (250 µg / ml) mixed with 1% DMSO was used.

벼 도열병, 밀 붉은녹병 및 보리 흰가루병은 7일 후에, 벼 잎집무늬마름병은 8일 후에, 그리고 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병은 각각 3일과 4일 후에 병반면적율을 조사하였다. 분리한 9개의 균주들 중에서 AH001이라 명명한 균주가 가장 강한 항균활성을 보였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.After 7 days for rice blast, wheat rust and wheat flour, 8 days for rice leaf blight, and 3 days and 4 days for tomato gray mold and tomato late blight, the disease area ratios were examined. Among the nine isolates, the strain named AH001 showed the strongest antimicrobial activity, and the results are shown in Table 1 below.

식물병Plant disease 벼 도열병Rice Blast 벼 잎집무늬마름병Rice leaf blight 토마토잿빛곰팡이병Tomato gray mold 토마토역병Tomato plague 밀붉은녹병Wheat Red Rust 보리흰가루병Wheat flour 방제가(%)Control Price (%) 9999 9090 9797 1010 9999 9696 방제가(%) = (무처리 대조군 발병도 - 처리군 발병도) ÷무처리 대조군 발병도Control Value (%) = (Untreated Control Incidence-Treated Group Incidence) ÷ Untreated Control Incidence

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 자일라리아 속 AH001 균주는 6가지 식물병 중에서 토마토 역병을 제외한 나머지 5가지 식물병인 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 밀 붉은녹병 및 보리 흰가루병에 대하여 높은 방제활성을 나타내었다.As shown in Table 1, the AH001 strain of the genus Xylaria against the other five plant diseases except rice blight, rice leaf blight, tomato ash mold, wheat red rust and wheat powdery mildew among six plant diseases High control activity was shown.

실시예 3: 자일라리아 속 AH001 균주의 동정Example 3: Identification of AH001 Strains of Genus Xylaria

실시예 1에서 분리한 9가지 균주 중 AH001 균주의 동정은 여러 가지 형태적 특징 조사 및 5.8S rRNA 유전자(ITS1-5.8S-ITS2)의 염기서열 분석을 이용하여 수행하였다.The identification of the AH001 strain among the nine strains isolated in Example 1 was performed using various morphological characterization and sequencing of the 5.8S rRNA gene (ITS1-5.8S-ITS2).

(1) 배양적 및 형태적 특징(1) Cultural and Morphological Characteristics

감자한천배지에서 배양된 AH001 균주는 노란색의 균사를 가지며(도 1) 배지 뒷면의 색은 시간이 지남에 따라 갈색으로 변하였다. 배양시간이 지난 후 균체 위에서 수직으로 긴 방망이 모양의 자좌(stromata)가 생성되었다. AH001 strains cultured in potato agar medium had yellow mycelia (FIG. 1) and the color of the back side of the medium turned brown over time. After the incubation time, a vertical bat-shaped stromata was formed on the cells.

(2) 5.8S rRNA 유전자(ITS1-5.8S-ITS2) 염기서열 분석(2) nucleotide sequence analysis of 5.8S rRNA gene (ITS1-5.8S-ITS2)

균주의 정확한 동정을 위하여 AH001 균주를 셀로판지가 깔린 감자한천배지 위에 접종하여 25℃에서 4일간 배양한 후 균사체로부터 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA로부터 ITS4와 5'-프라이머(White et al., 1990, PCR protocols: a guide to methods and application, pp.315-322)를 이용하여 핵의 리보솜 DNA(nuclear rDNA)의 ITS1-5.8S-ITS2를 증폭한 후 순도를 점검한 다음 ABI3700 자동 DNA 염기서열 분석기(ABI3700 automated DNA sequencer, 입수처: 미국 어플라이드 바이오시스템사)를 이용하여 염기서열을 결정하였다. ITS1-5.8S-ITS2의 염기서열(서열번호: 1) 분석 결과 진뱅크(GeneBank)의 자일라리아 코누다메(Xylaria cornu-damae) AF163031과 90%이상의 유사성을 보여 자일라리아속 균주로 동정되었다. 도 2는 자일라리아 속 AH001 균주의 핵리보좀 ITS1-5.8S-ITS2 염기서열의 분석을 통한 자일라리아 속 AH001 균주의 계통발생학적인 계보를 나타낸 것이다.For accurate identification of the strain, the AH001 strain was inoculated on a potato agar medium coated with cellophane paper, incubated at 25 ° C. for 4 days, and DNA was extracted from the mycelium. From ITS4 and 5'-primers (White et al., 1990, PCR protocols: a guide to methods and application, pp.315-322) from extracted DNA, ITS1-5.8S- of nuclear ribosomal DNA (nuclear rDNA) After amplification of ITS2, the purity was checked, and the nucleotide sequence was determined by using an ABI3700 automated DNA sequencer (Applied Biosystems, Inc.). Nucleotide sequence of ITS1-5.8S-ITS2 (SEQ ID NO: 1) showed more than 90% similarity with GeneBank's Xylaria cornu-damae AF163031 and was identified as a genus of Xylaria . Figure 2 shows the phylogenetic lineage of Xylaria AH001 strain through analysis of the nuclear ribosomal ITS1-5.8S-ITS2 sequence of the genus Xylaria AH001.

상기와 같이 동정된 자일라리아 속 균주 AH001은 한국생명공학연구원 유전자은행에 2004년 5월 10일자로 기탁번호 제 KCTC 10629BP호로 기탁하였다.As identified above, the genus Xylaria strain AH001 was deposited with KCTC 10629BP dated May 10, 2004 to the Korea Biotechnology Research Institute Gene Bank.

실시예 4: 항균물질의 분리 및 정제Example 4 Isolation and Purification of Antimicrobial Substances

14 ℓ 감자즙액배지에 감자한천배지에서 자라고 있는 균주의 선단부위를 코르크 절단기(지름 8 ㎜)로 떼어낸 다음 감자즙액배지 200 ㎖당 4개씩 접종하고 25℃, 150 rpm에서 10일간 진탕 배양하였다. 배양액을 10,000×g에서 15분간 원심 분리한 후 상층액만을 취하여 동량의 에틸아세테이트로 2회 추출한 다음 40℃에서 감압, 농축하였다. 물층과 에틸아세테이트 추출물의 상기 6가지 식물병에 대한 항균활성을 조사한 결과 에틸아세테이트 추출물이 항균활성을 나타내었다. 이에 따라, 에틸아세테이트 추출물로부터 활성물질을 분리하기 위하여 에틸아세테이트 추출물 10 ㎖을 용매[클로로포름:메탄올, 95:5 (v:v)]로 평형화된 실리카겔(70∼230 메쉬, 200 g; 입수처: 독일 머크사)이 충진된 컬럼(3.6×60 ㎝)을 이용하여 TLC(용매: 클로로포름:메탄올 용매(95:5, 9:1 및 10:1, v:v))를 수행하였다. 그 결과, 세 개의 분획 F1, F2 및 F3을 얻었으며, 이 분획을 500 ㎍/㎖ 농도로 생체내 항균활성을 조사한 결과 F2(600 mg) 분획에서 활성을 보였다. F2 분획의 물질이 단일 물질인지 확인하기 위하여 TLC(20×20 ㎝, 두께 0.25 ㎜, Kiesel gel 60 F254; 입수처: 머크사)에 분석시료를 점적하여 분석을 실시하였다. 그 결과, 클로로포름:메탄올(9:1, v:v) 용매를 이용하여 TLC 분석을 수행한 경우에는 단일물질로서 나타나는 한편, 헥산:에틸아세테이트:메탄올(60:40:1, v:v:v) 용매 비율로 하여 TLC 분석을 수행한 경우에는 2 가지 물질로 나타났다. 따라서, F2(600 ㎎) 분획을 분취용 TLC 플레이트(20×20 ㎝, 두께 0.5 ㎜, Kiesel gel 60 F254; 입수처: 머크사) 및 헥산:에틸아세테이트:메탄올(50:50:2, v:v:v) 용매를 이용하여 두 가지 물질을 순수 분리하였다. 그 결과, 비극성 물질과 극성 물질이 각각 40 ㎎과 350 ㎎씩 순수하게 분리되었다.The tip portions of the strains grown on potato agar medium in 14 L potato juice medium were removed with a cork cutter (8 mm in diameter), and then inoculated four per 200 ml of potato juice medium and incubated at 25 ° C. and 150 rpm for 10 days. The culture solution was centrifuged at 10,000 × g for 15 minutes, and only the supernatant was extracted with twice the same amount of ethyl acetate, and then concentrated under reduced pressure at 40 ° C. Investigation of the antimicrobial activity of the water layer and ethyl acetate extracts against the six plant diseases showed that the ethyl acetate extract showed antimicrobial activity. Thus, in order to separate the active substance from the ethyl acetate extract, 10 ml of ethyl acetate extract was equilibrated with a solvent [chloroform: methanol, 95: 5 (v: v)] to silica gel (70-230 mesh, 200 g; TLC (solvent: chloroform: methanol solvent (95: 5, 9: 1 and 10: 1, v: v)) was performed using a column packed with Merck, Germany (3.6 × 60 cm). As a result, three fractions F1, F2 and F3 were obtained, and the fractions showed activity in the F2 (600 mg) fraction as a result of examining the antimicrobial activity in vivo at the concentration of 500 µg / ml. In order to confirm that the material of the F2 fraction was a single substance, an analysis sample was added dropwise to TLC (20 × 20 cm, 0.25 mm thickness, Kiesel gel 60 F254; Merck). As a result, when TLC analysis was performed using a chloroform: methanol (9: 1, v: v) solvent, it appeared as a single substance, while hexane: ethyl acetate: methanol (60: 40: 1, v: v: v When TLC analysis was performed with the solvent ratio, two substances appeared. Thus, the F2 (600 mg) fraction was collected in a preparative TLC plate (20 × 20 cm, thickness 0.5 mm, Kiesel gel 60 F254 obtained from Merck) and hexane: ethyl acetate: methanol (50: 50: 2, v: v: v) The two materials were purely separated using a solvent. As a result, 40 mg and 350 mg of nonpolar and polar substances were separated purely.

실시예 5: 그리세오풀빈 및 디클로로그리세오풀빈의 구조 결정Example 5 Structure Determination of Griseofulvin and Dichlorogriseofulvin

상기 실시예 4에서 분리 정제된 두 활성물질을 질량분석기(JEOL JMS-DX303; 입수처:일본전자사)를 이용하여 질량분석을 실시한 결과, 두 물질의 분자량은 각각 352 Da(분자식 C17H17ClO6) 및 318 Da(분자식 C17H18O 6)로서 나타났으며, 이들을 전자 충돌 질량분석법(electron impact-Mass spectroscopy: EI-MS)으로 분석하여 그 결과를 각각 도 3 및 도 4에 나타내었다.The two active materials separated and purified in Example 4 were subjected to mass spectrometry using a mass spectrometer (JEOL JMS-DX303; obtained from Nippon Electronics Co., Ltd.). As a result, the molecular weights of the two substances were 352 Da (molecular formula C 17 H 17). ClO 6 ) and 318 Da (molecular formula C 17 H 18 O 6 ), which were analyzed by electron impact mass spectroscopy (EI-MS) and the results are shown in FIGS. 3 and 4, respectively. It was.

또한, 두 가지의 활성물질의 구조를 결정하기 위하여 각 20 mg을 완전 건조하여 0.5 ㎖의 CDCl3에 녹인 후 5 mm NMR 튜브에 넣고 NMR 분석(Bruker-AMX 500(500 MHz))을 수행하였으며, 1H-NMR은 500 MHz로, 13C-NMR은 125 MHz로 측정하였다. 1 H-13C COSY 스펙트럼을 통하여 탄소와 수소를 연결시키고, 1H-1H COSY 스펙트럼을 통하여 탄소골격을 연결시킨 결과는 표 2에 나타내었다.In addition, to determine the structure of the two active substances, each 20 mg was completely dried, dissolved in 0.5 ml of CDCl 3 and placed in a 5 mm NMR tube and subjected to NMR analysis (Bruker-AMX 500 (500 MHz)), 1 H-NMR was measured at 500 MHz and 13 C-NMR at 125 MHz. Table 1 shows the results of connecting carbon and hydrogen through the 1 H- 13 C COZY spectrum and connecting the carbon skeleton through the 1 H- 1 H COZY spectrum.

이에 따라 두 가지 물질은 각각 그리세오풀빈과 디클로로그리세오풀빈으로 결정되었으며, 두 물질의 구조식은 각각 화학식 1 및 2와 같다.Accordingly, the two substances were determined to be griseofulvin and dichlorogriseofulvin, respectively, and the structural formulas of the two substances are represented by Chemical Formulas 1 and 2, respectively.

화학식 1Formula 1

화학식 2Formula 2

실시예 6: 그리세오풀빈 및 디클로로그리세오풀빈의 시험관내(Example 6 In Vitro of Griseofulvin and Dichlorogriseofulvin in vitroin vitro ) 항균활성 검증) Antibacterial activity verification

상기 실시예 5에서 확인된 그리세오풀빈 및 디클로로그리세오풀빈의 식물병에 대한 시험관내 항균활성을 측정하기 위해, 두 항균물질을 포함하고 있는 고체배지 상에서 벼 도열병균(Magnaporthe grisea; 입수처: 한국화학연구원), 푸자리움 시들음병균(Fusarium oxysporum; 입수처: 한국화학연구원), 고추 역병균(Phytophthora capsici; 입수처: 충남대학교), 고추 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides; 입수처: 한국화학연구원), 토마토 역병균(Phytophthora infestans; 입수처: 강릉대학교), 사과 점무늬낙엽병균(Alternaria mali; 입수처: (주)경농), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea; 입수처: 한국화학연구원) 및 벼 잎집무늬마름병균(Corticium sasaki; 입수처: 한국화학연구원)의 8가지 식물병원균의 균사생육 정도를 조사하였다. 토마토 역병균과 고추 역병균은 V-8 쥬스한천배지를 이용하였고, 나머지 6가지 식물병원균은 감자한천배지를 이용하였다. 각각의 항균 배지를 멸균한 후 굳기 전에 DMSO에 용해한 항균물질을 배지에 가하여 물질을 최종농도가 200, 66.7, 22.2, 7.4, 2.5 및 0.82 ㎍/㎖이 되도록 하였다. 무처리군에는 DMSO 1%를 첨가하였다. 배지 한 가운데에 각 균의 균사조각을 치상한 후 토마토 역병균과 토마토 잿빛곰팡이병균은 20℃에서 배양하였고, 나머지 균들은 25℃에서 배양하였다. 2일 내지 6일 동안 배양 후 균사 생육 길이를 측정하여 50% 균사 생육억제 농도를 결정하였으며, 그 결과는 표 3에 나타내었다.In vitro for the plant diseases of griseofulvin and dichlorogriseofulvin identified in Example 5 above To measure the antimicrobial activity, Magnaporthe grisea (obtained from Korea Research Institute of Chemical Technology) on a solid medium containing two antimicrobial substances, Fusarium oxysporum (obtained from Korea Research Institute of Chemical Technology) , phytophthora capsici (obtained from Chungnam National University), Colletotrichum gloeosporioides (obtained from Korea Research Institute of Chemical Technology), Phytophthora infestans (obtained from Kangnung National University), apples, Alternaria mali (obtained from Kyung-Nong), Botrytis cinerea (from Korea Chemical Research Institute) and rice leaf blight The mycelial growth of eight plant pathogens of Corticium sasaki (Korea Chemical Research Institute) was investigated. Tomato blight and pepper blight were used for V-8 juice agar, and the other six phytopathogens were potato agar. After sterilization of each antimicrobial medium, the antimicrobial substance dissolved in DMSO before solidification was added to the medium so that the final concentration was 200, 66.7, 22.2, 7.4, 2.5 and 0.82 μg / ml. DMSO 1% was added to the untreated group. After killing the mycelia of each bacterium in the middle of the medium, tomato late blight and tomato gray fungus were incubated at 20 ° C, and the rest of the bacteria were incubated at 25 ° C. After incubation for 2 to 6 days, the mycelial growth was measured to determine 50% mycelial growth inhibition concentration, and the results are shown in Table 3.

식물병원균Plant pathogen 50% 균사 생육농도(㎍/㎖)50% mycelial growth concentration (㎍ / ㎖) 그리세오풀빈Griseofulvin 디클로로그리세오풀빈Dichlorogriseofulvin 벼 도열병균Rice Bacteria 1.71.7 >200> 200 푸자리움 시들음병균Futurium wilt 3030 >200> 200 고추 역병균Chilli Plague >200> 200 >200> 200 토마토 역병균Tomato blight >200> 200 >200> 200 고추 탄저병균Pepper anthrax 1.71.7 >200> 200 사과나무 점무늬낙엽병균Apple spotted deciduous bacterium 1818 >200> 200 토마토 잿빛곰팡이병균Tomato gray mold 5.05.0 >200> 200 벼 잎집무늬마름병Rice leaf blight 1111 >200> 200

상기 표 3에서 보듯이, 그리세오풀빈은 디클로로그리세오풀빈보다 전반적으로 항균활성이 훨씬 높은 것으로 나타났다. 그리세오풀빈의 경우 토마토 역병균이나 고추 역병균과 같이 난균강(Oomycetes)에 속하는 식물병원진균들에는 항균활성이 거의 없는 반면에 다른 진균에 대해서는 높은 항균활성을 보였다. 특히 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides)과 벼 도열병균(Magnaporthe grisea)에 대해서는 50% 균사생육억제농도가 1.7 ㎍/㎖이었으며, 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)에 대해서는 5.0 ㎍/㎖로 나타났다.As shown in Table 3, griseofulvin was shown to have a much higher antibacterial activity than dichlorogriseofulvin. In the case of griseofulvin, phytopathogenic fungi belonging to Oomycetes, such as tomato and fungal bacterium, showed little antimicrobial activity while high antibacterial activity against other fungi. In particular, 50% mycelial growth inhibitory concentration was 1.7 ㎍ / ml for Colletotrichum gloeosporioides and Magnaporthe grisea , and 5.0 ㎍ / ml for Botrytis cinerea .

실시예 7: 그리세오풀빈 및 디클로로그리세오풀빈의 생체내(Example 7 In Vivo of Griseofulvin and Dichlorogriseofulvin in vivoin vivo ) 항균활성Antibacterial activity

그리세오풀빈 및 디클로로그리세오풀빈의 식물병에 대한 항균활성을 상기 실시예 2와 동일한 방법을 실시하여 관찰하고 그 결과를 표 4에 나타내었다. The antimicrobial activity of griseofulvin and dichlorogriseofulvin against plant diseases was observed in the same manner as in Example 2, and the results are shown in Table 4.

상기 표 4에서 보는 바와 같이, 디클로로그리세오풀빈을 150 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때 벼 잎집무늬마름병에 대하여 70%, 보리 흰가루병에 대하여 93%의 방제효과를 나타내었으며, 저농도인 50 ㎍/㎖의 디클로로그리세오풀빈 처리 구에서는 50% 이하의 대체로 낮은 활성을 보였다. 한편, 그리세오풀빈은 150 ㎍/㎖로 처리하였을 경우 토마토 역병을 제외한 모든 식물병에 대해 60% 이상의 높은 방제효과를 보였으며, 낮은 농도(50 ㎍/㎖)로 처리한 경우에도 우수한 방제효과를 나타내었다. 특히 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병 및 벼 잎집무늬마름병에 대해서는 매우 높은 활성을 보였다.As shown in Table 4, the treatment of dichlorogriseofulvin at 150 ㎍ / ㎖ concentration showed 70% against rice leaf blight blight, 93% against barley powdery mildew, low concentration 50 ㎍ / ㎖ The dichloroglyopulbin treatment of showed a generally low activity of less than 50%. On the other hand, when treated with 150 ㎍ / ㎖, griseofulvin showed a high control effect of more than 60% for all plant diseases except tomato late blight, and even when treated at a low concentration (50 ㎍ / ㎖) Indicated. In particular, it showed very high activity against rice blast, wheat red rust, barley flour and rice leaf blight.

실시예 8: 배지 및 배양기간에 따른 자일라리아 속 AH001 균주의 활성물질 생성Example 8 Production of Active Substances of AH001 Strains of Genus Xylaria According to Medium and Culture Period

자일라리아 속 AH001 균주가 생성하는 두 가지 항균물질의 최대 생성조건을 결정하기 위하여 배지의 종류와 배양기간을 달리하여 생산량을 조사하였다. 배지로는 감자즙액배지, 맥아추출물-펩톤-덱스트로스배지(MPD; 20 g 맥아추출물, 20 g 덱스트로스, 1 g 펩톤, 1.0 ℓ 증류수), 맥아와 효모추출물배지(MY; 3 g 맥아추출물, 0.5 g KH2PO4, 2 g 효모추출물, 0.5 g MgSO4·7H2O, 1.0 ℓ 증류수) 및 글루코스-효모추출물-폴리펩톤배지 (YpSs; 20 g 글루코스, 2 g 효모추출물, 5 g 폴리펩톤, 0.5 g MgSO4, 1 g KH2PO4, 1.0 ℓ증류수)를 사용하였다. 각각의 배지 200 ㎖을 500 ㎖ 삼각플라스크에 넣은 다음 멸균 후 감자한천배지에서 배양된 균주의 선단부위를 코르크 절단기(지름 8 ㎜)로 떼어내어 조각 4개씩을 접종하였다. 25℃, 150 rpm에서 진탕 배양하면서 3일, 6일, 9일, 12일, 15일, 18일 및 21일째의 배양액 2 ㎖씩을 각 바이알에 옮겼다. 동량의 에틸에테르로 2회 추출하고 질소가스로 건조시킨 후 0.5 ㎖의 에틸아세테이트로 재용해한 다음 가스크로마토그래프-질량분석기(gas chromatograph-mass spectrometer; 입수처: 일본 시마쯔사)를 이용하여 선택적 이온 모니토링(selected ion monitoring, SIM) 모드로 정량분석을 실시하였다. 컬럼은 Hicap CBP20-M25-025 모세관컬럼을 이용하였고, 주입기 온도와 인터페이스 온도는 각각 280℃ 및 250℃로 조절하였다. 컬럼온도는 초기 200℃에서 15분간 지속하다가 분당 8℃로 온도를 올린 후 최종온도 280℃에서 15분간 지속하였다. 그리세오풀빈의 목적 이온(target ion)은 m/z 352으로 하였으며, 디클로로그리세오풀빈의 목적 이온은 m/z 318으로 설정하였다.In order to determine the maximum production conditions of two antimicrobial substances produced by Xylaria AH001 strains, the yields were investigated by varying the media type and culture period. The medium includes potato juice medium, malt extract-peptone-dextrose medium (MPD; 20 g malt extract, 20 g dextrose, 1 g peptone, 1.0 L distilled water), malt and yeast extract medium (MY; 3 g malt extract, 0.5 g KH 2 PO 4, 2 g yeast extract, 0.5 g MgSO 4 · 7H 2 O, 1.0 L distilled water) and glucose-yeast extract-polypeptone medium (YpSs; 20 g glucose, 2 g yeast extract, 5 g polypeptone , 0.5 g MgSO 4 , 1 g KH 2 PO 4 , 1.0 L distilled water) was used. 200 ml of each medium was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask, and after sterilization, the tip of the strain cultured in potato agar medium was removed with a cork cutter (8 mm in diameter) to inoculate four pieces. 2 ml of the culture solution on days 3, 6, 9, 12, 15, 18 and 21 were transferred to each vial with shaking culture at 25 ° C. and 150 rpm. Extracted twice with the same amount of ethyl ether, dried with nitrogen gas, redissolved with 0.5 ml of ethyl acetate, and then selectively ionized using a gas chromatograph-mass spectrometer. Quantitative analysis was performed in a selected ion monitoring (SIM) mode. The column was Hicap CBP20-M25-025 capillary column, the injector temperature and the interface temperature was adjusted to 280 ℃ and 250 ℃, respectively. The column temperature was continued for 15 minutes at the initial 200 ℃, after raising the temperature to 8 ℃ per minute and lasted for 15 minutes at the final temperature of 280 ℃. The target ion of griseofulvin was set to m / z 352, and the target ion of dichlorogriseofulvin was set to m / z 318.

그 결과, 사용된 4가지 배지 중 YpSs 배지에서 가장 많은 양의 디클로로그리세오풀빈과 그리세오풀빈이 생성되었다. 도 5는 그리세오풀빈의 4가지 배지에서의 배양시간에 따른 생성량을 나타내는 것으로 배양 15일째에 최대의 생성량(800 ㎍/㎖)을 나타내었다. 배양 6일째부터 생성하기 시작하여 9일째 되는 날은 급격히 많은 양의 대사산물이 생성됨을 알 수 있다. 한편, MPD 배지 및 감자즙액배지에서도 소량의 활성물질이 생산되었는데, 이들 배지에서는 YpSs 배지와는 달리 배양 기간이 21일을 경과하여도 생성량이 지속적으로 증가하는 것으로 나타났다. 디클로로그리세오풀빈도 이와 매우 유사한 양상으로 생성되었으며, YpSs배지에서 배양 15일째에 최대의 생성량(579 ㎍/㎖)을 나타내었다.As a result, the highest amounts of dichlorogriseofulvin and griseofulvin were produced in the YpSs medium among the four media used. Figure 5 shows the amount of production according to the incubation time in four medium of the griseofulvin showed the maximum production amount (800 ㎍ / ㎖) at 15 days of culture. It can be seen that the production starts from the 6th day of culture and on the 9th day, a large amount of metabolites are produced rapidly. On the other hand, a small amount of active material was also produced in MPD medium and potato juice medium, unlike the YpSs medium, the production was continuously increased even after 21 days of incubation period. Dichlorogriseofulvin was also produced in a very similar fashion and showed the maximum production (579 μg / ml) at 15 days of culture in YpSs medium.

이상 살펴본 바와 같이, 그리세오풀빈 및 이의 생산능을 갖는 자일라리아속 AH001 균주는 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 푸자리움 시들음병, 고추 탄저병 또는 사과나무 점무늬낙엽병과 같은 식물병에 대해 강한 길항작용을 나타내므로 이를 식물병 방제에 유용하게 이용할 수 있다. As described above, the griseofulvin and the Xylaria AH001 strain having its production capacity are plant diseases such as rice blast, rice leaf blight, wheat red rust, barley flour, pulp wilting disease, pepper anthrax, or apple tree spot deciduous disease. It exhibits strong antagonistic activity against and can be usefully used for controlling plant diseases.

도 1은 감자추출물-덱스트로스 한천배지에서 배양된 자일라리아(Xylaria) 속 AH001 균주의 사진이다.1 is a photograph of AH001 strain of genus Xylaria cultured in potato extract-dextrose agar medium.

도 2는 자일라리아 속 AH001 균주의 핵 리보좀 5.8S rRNA 유전자의 염기서열의 분석을 통한 자일라리아 속 AH001 균주의 계통발생학적인 계보를 나타낸 것이다.Figure 2 shows the phylogenetic lineage of Xylaria AH001 strain through analysis of the nucleotide sequence of nuclear ribosomal 5.8S rRNA gene of the genus Xylaria AH001.

도 3은 자일라리아속 AH001 균주로부터 분리한 그리세오풀빈의 전자충돌 질량스펙트럼 분석결과이다.Figure 3 is an electron collision mass spectrum analysis result of the griseofulvin isolated from Xylaria AH001 strain.

도 4는 자일라리아속 AH001 균주로부터 분리한 디클로로그리세오풀빈의 전자충돌 질량스펙트럼 분석결과이다.Figure 4 is an electron collision mass spectrum analysis of dichlorogriseofulvin isolated from Xylaria AH001 strain.

도 5는 자일라리아속 AH001 균주로부터 배지에 따른 그리세오풀빈의 생성 정도를 나타낸 그래프이다.Figure 5 is a graph showing the degree of production of griseopulin according to the medium from the genus Xylaria AH001.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> XYLARIA SP. AH001 STRAIN PRODUCING GRISEOFULVIN, FORMULATION FOR CONTROLLING PLANT DISEASES CONTAINING SAME AND METHOD FOR CONTROLLING PLANT DISEASES USING SAME <130> FPD/200405-0020 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 643 <212> DNA <213> XYLARIA SP. AH001 ITS1-5.8S-ITS2 <400> 1 gttcctattg agcagagtac tactccaacc catgtgacat acctattgtt gcctcggcag 60 gtcgtagact gctgggaaag ggccttcccc tagcttggga ggccctaccc gggagccgcg 120 ggtaagcctg ccgatggccc gcaaaaactc tgtttagcac tgaaattctg aatcataact 180 aaataagtta aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc 240 gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac 300 attgcgccca ttagtattct agtgggcatg cctgttcgag cgtcatttca acccttaagc 360 ccttgttgct tagtgttggg agactacgtt ccttagcgta gctcctcaaa gttagtggca 420 gagtcagttc aaactctagg tgtagtaaat ttcttctcgc ctctgtggtt gggctgcccc 480 tcgccgtaaa acacccctaa tttttaaagg ttgacctcgg atcaggtagg aatacccgct 540 gaacttaagc atatcaataa ggcggaggaa aagaaccctc tgggtttgct ctactcaaga 600 cgggtgaatt gggtatagct ttatgcgggg aataatggca gga 643<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> XYLARIA SP. AH001 STRAIN PRODUCING GRISEOFULVIN, FORMULATION FOR CONTROLLING PLANT DISEASES CONTAINING SAME AND METHOD FOR CONTROLLING PLANT DISEASES USING SAME <130> FPD / 200405-0020 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 643 <212> DNA <213> XYLARIA SP. AH001 ITS1-5.8S-ITS2 <400> 1 gttcctattg agcagagtac tactccaacc catgtgacat acctattgtt gcctcggcag 60 gtcgtagact gctgggaaag ggccttcccc tagcttggga ggccctaccc gggagccgcg 120 ggtaagcctg ccgatggccc gcaaaaactc tgtttagcac tgaaattctg aatcataact 180 aaataagtta aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc 240 gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac 300 attgcgccca ttagtattct agtgggcatg cctgttcgag cgtcatttca acccttaagc 360 ccttgttgct tagtgttggg agactacgtt ccttagcgta gctcctcaaa gttagtggca 420 gagtcagttc aaactctagg tgtagtaaat ttcttctcgc ctctgtggtt gggctgcccc 480 tcgccgtaaa acacccctaa tttttaaagg ttgacctcgg atcaggtagg aatacccgct 540 gaacttaagc atatcaataa ggcggaggaa aagaaccctc tgggtttgct ctactcaaga 600 cgggtgaatt gggtatagct ttatgcgggg aataatggca gga 643

Claims (9)

그리세오풀빈, 이의 생산능을 갖는 자일라리아속 AH001 (KCTC 10629BP) 균주 또는 이 균주로부터 유래된 물질을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 제제.Griseofulvin, Xylaria genus AH001 (KCTC 10629BP) strain having its production capacity or a plant-derived agent containing a substance derived from the strain as an active ingredient. 제 1 항에 있어서,The method of claim 1, 상기 그리세오풀빈이 자일라리아 (Xylaria) 속 AH001 (KCTC 10629BP) 균주로부터 생산된 것임을 특징으로 하는 제제.Formulation according to claim Seo draw the full bin chair Ilaria (Xylaria) in AH001 (KCTC 10629BP) that produced from the strain. 제 1 항에 있어서, The method of claim 1, 상기 자일라리아 속 AH001 균주로부터 유래된 물질이 균주의 배양액, 추출물 또는 포자인 것을 특징으로 하는 제제.Formulation characterized in that the material derived from the strain Xylaria AH001 is a culture, extract or spores of the strain. 제 1 항에 있어서,The method of claim 1, 식물병이 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 푸자리움 시들음병, 고추 탄저병 또는 사과나무 점무늬낙엽병인 것을 특징으로 하는 제제.An agent characterized in that the plant disease is rice blast, rice leaf blight, wheat red rust, wheat powdery mildew, fusidium wilting disease, pepper anthrax or apple tree spotted deciduous disease. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 제제를 이용하여 식물병을 방제하는 방법.A method of controlling plant diseases using the agent of any one of claims 1 to 4. 제 5 항에 있어서, The method of claim 5, 식물병이 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 푸자리움 시들음병, 고추 탄저병 또는 사과나무 점무늬낙엽병인 것을 특징으로 하는 방법. The plant disease is rice blast, rice leaf blight, wheat red rust, wheat powdery mildew, fusidium wilting disease, pepper anthrax or apple tree spotted deciduous disease. 그리세오풀빈 또는 디클로로그리세오풀빈 생산능을 갖는 자일라리아(Xylaria) 속 AH001(KCTC 10629BP) 균주.AH001 (KCTC 10629BP) strain of the genus Xylaria , which has the ability to produce griseofulvin or dichlorogriseofulvin. 자일라리아(Xylaria) 속 AH001(KCTC 10629BP) 균주를 배양하는 것을 포함하는 그리세오풀빈 또는 디클로로그리세오풀빈의 생산 방법.Here Ilaria (Xylaria) in AH001 (KCTC 10629BP) or draw Seo pulbin dichloro method of production so Seo pulbin which comprises culturing the strain. 제 8 항에 있어서,The method of claim 8, 자일라리아 속 AH001 균주를 감자추출물-덱스트로스 액체배지(potato dextrose broth; PD), 맥아추출물-펩톤-덱스트로스 액체배지(malt extract peptone dextrose broth; MPD), 맥아추출물-효모추출물 액체 배지(malt and yeast extract broth; MY) 또는 글루코스-효모추출물-폴리펩톤 액체배지(YpSs broth; YpSs)에서 3 내지 21 일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.Xylaria AH001 strains were prepared from potato extract-dextrose broth (PD), malt extract-peptone-dextrose broth (MPD), malt extract-yeast extract liquid medium (malt). and yeast extract broth; MY) or glucose-yeast extract-polypeptone liquid medium (YpSs broth; YpSs) for 3 to 21 days.
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