RU2696872C1

RU2696872C1 - Способ прогнозирования неблагоприятного исхода при немелкоклеточном раке легкого

Info

Publication number: RU2696872C1
Application number: RU2019110861A
Authority: RU
Inventors: Елена Сергеевна Колегова; Елена Евгеньевна Шашова; Дмитрий Николаевич Костромицкий; Алексей Юрьевич Добродеев; Ирина Викторовна Кондакова
Priority date: 2019-04-11
Filing date: 2019-04-11
Publication date: 2019-08-07

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для оценки риска развития неблагоприятного исхода у больных немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ). Способ включает исследование ткани первичной опухоли, взятой во время операционного вмешательства, в которой определяют химотрипсинподобную (ХПА) и каспазаподобную (КПА) активность протеасом. При ХПА выше 48,8*10³ Ед/мг белка и КПА выше 31,2*10³ Ед/мг белка прогнозируют высокую вероятность развития неблагоприятного исхода. Использование изобретения позволяет повысить точность прогнозирования, с высокой чувствительностью и специфичностью предположить возможный исход заболевания у больных НМРЛ и рассчитать риск развития неблагоприятного исхода после радикальной операции. 1 табл., 3 ил., 2 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, конкретно, к онкологии и может быть использовано для оценки риска развития неблагоприятного исхода у больных НМРЛ после радикальной операции.

Рак легкого в структуре общей онкологической заболеваемости у мужчин занимает 1-е место и составляет 25%, доля рака легкого среди женского населения - 4,3%. Рак легкого относится к новообразованиям с высоким уровнем летальности - более 20% от всех умерших от злокачественных новообразований [1]. Несмотря на внедрение новых методов лечения, основанных на комбинировании радикального оперативного вмешательства с лучевой и/или лекарственной противоопухолевой терапией, пятилетняя выживаемость больных НМРЛ не превышает 55% [2]. В связи с этим в последние годы активно разрабатываются диагностические подходы, направленные на выявление признаков прогрессирования заболевания. Помимо проведения стандартных клинико-инструментальных исследований, существенную помощь при прогнозировании исхода у больных НМРЛ оказывают молекулярные маркеры, определяемые в крови или ткани.

Наиболее близким к предлагаемому способу прогноза неблагоприятного исхода заболевания у больных НМРЛ является способ, выбранный за прототип (RU 2519647 С2), основанный на мультиплексном детектировании методом ELISA активационных состояний компонентов путей передачи сигналов в раковых клетках, включающих Her3 (ErbB3). Метод, взятый за прототип, позволяет спрогнозировать исход болезни у субъекта, страдающего раком легких; осуществить выбор подходящего противоракового лекарственного средства; спрогнозировать реакцию опухоли на лечение противораковым лекарственным средством. Предложенный метод осуществляется следующим образом: проводится выделение клеток опухоли легких после введения противоракового лекарственного средства или до инкубации с противораковым лекарственным средством; лизирование выделенных клеток для получения клеточного экстракта; детектирование активационного состояния одного или более анализируемых веществ в клеточном экстракте методом анализа, включающем несколько серийных разведений захватывающих антител, специфичных к одному или более анализируемых веществ, при этом захватывающие антитела фиксируются на твердой подложке; и прогнозирование исхода болезни у субъекта, получающего это противораковое лекарственное средство, путем сравнения активационного состояния, обнаруженного у одного или более анализируемых веществ, со стандартным активационным профилем, полученным в отсутствие противоракового лекарственного средства.

Недостатком метода, выбранного за прототип, при использовании его для прогнозирования исхода НМРЛ является:

- отсутствие данных о чувствительности и специфичности;

- при его осуществлении не учитываются клинические характеристики пациента, а оцениваются только метаболические компоненты;

- область применения способа ограничена, что обусловлено тем, что способ применяют только пациентам, которым проводили специализированное лечение.

Новая техническая задача - повышение точности и достоверности способа за счет применения новых высокочувствительных, высокоспецифичных и более универсальных прогностических критериев для оценки исхода заболевания у больных НМРЛ.

Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования неблагоприятного исхода немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) путем биохимического исследования биологического материала пациентов, исследуют ткань первичной опухоли, взятую во время операционного вмешательства, в ней определяют химотрипсинподобную (ХПА) и каспазаподобную (КПА) активность протеасом и при ХПА выше 48,8*10³ Ед/мг белка и КПА выше 31,2*10³ Ед/мг белка прогнозируют высокую вероятность развития неблагоприятного исхода.

Способ осуществляют следующим образом: для прогнозирования развития неблагоприятного исхода НМРЛ проводят флюориметрическое определение ХПА и КПА протеасом в опухолевой ткани. Для этого в течение 1-2 часов после операции из операционного материала берут образец опухолевой ткани, очищают от участков некроза, кровоизлияний и помещают в жидкий азот. Образец ткани до определения активности протеасом хранят не более 3 месяцев при температуре -80°С и размораживают не более 1 раза для исследования маркеров. Перед определением активности протеасом из замороженной опухолевой ткани готовят осветленный гомогенат. Для этого ткань гомогенизируют до порошкообразного состояния с использованием ультразвукового, гомогенизатора, затем ресуспендируют в 50 мМ трис-HCl буфере (рН=7,5), содержащем 2 мМ АТФ, 5 мМ хлорид магния, 1 мМ дитиотреитол, 1 мМ ЭДТА и 100 мМ хлорид натрия. Гомогенат центрифугируют 60 минут при 10000g и 4°С.

Активность протеасом определяют в осветленном гомогенате опухолевой ткани по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC для ХПА и Cbz-LLG-AMC для КПА [3]. Реакционная смесь для определения активности протеасом должна содержать 20 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 1 мМ дитиотрейтола, 30 мкМ Cbz-LLG-AMC, 5 мМ MgCl2 и 1 мМ АТФ. Реакцию проводят при 37°С в течение 20 мин. Образовавшийся продукт регистрируют на флуориметре при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. За единицу активности протеасом принимают количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль субстрата в течение 1 мин. Для оценки активности примесных протеаз применяют специфический ингибитор протеасом - MG132 (Sigma). Удельную активность протеасом выражают в единицах активности на 1 мг белка. Содержание белка определяют по методу Лоури [4]. При значении ХПА выше 48,8*10³ Ед/мг белка и КПА выше 31,2*10³ Ед/мг белка прогнозируют высокую вероятность развития неблагоприятного исхода, при этом, при увеличении ХПА на каждую 1*10³ Ед/мг белка риск неблагоприятного исхода увеличивается в 1,5 раза; при увеличении КПА на каждую 1*10³ Ед/мг белка риск неблагоприятного исхода увеличивается в 2,2 раза.

Такой подход к оценке прогноза в отношении риска развития неблагоприятного исхода при НМРЛ обусловлен рядом предпосылок:

Возникновение и развитие злокачественных новообразований связано с активацией пролиферации, ингибированием процесса апоптоза, нарушением клеточного цикла, а также стимуляции выработки факторов роста, что в свою очередь связано с функционированием протеасомной системы, поскольку эффективная регуляция количества и функции многих белков, зависит и от процессов, связанных с их деградацией [5]. Протеасомная система принимает участие в разрушении многих регуляторных белков, в том числе молекул путей передачи сигналов от ростовых факторов и, частично, самих рецепторов ростовых факторов, осуществляет протеолиз белков, превращает неактивные белки-предшественники в активные, участвует в презентации комплекса гистосовместимости I типа, регулирует транскрипцию генов [6].

При НМРЛ, как и при любом патологическом процессе, протеолитические системы играют важную роль, т.к. осуществляют регуляцию ключевых процессов в клетке. На клеточной культуре НМРЛ подтверждено участие протеасом в деградации Вах и Bim белков при регуляции апоптоза [7]. Методами сравнительной геномной гибридизации и микрочиповыми исследованиями показана важная роль субъединицы каталитического ядра протеасомы в регуляции клеточного цикла клеток рака легкого [8].

В ряде исследований продемонстрировано участие протеасомной системы в развитии опухолей различных локализаций [9; 10]. Показано, что дисбаланс в функционировании протеасомной системы способствует формированию опухолевой прогрессии в отдаленные сроки при опухолях эндометрия и молочной железы [11; 12].

Предлагаемые маркеры подобраны на основании исследования связи активности протеасом с неблагоприятным исходом при НМРЛ у больных в течение 2х лет после операции. Общее количество пациентов, включенных в анализ, составило 36 человек. Стадия заболевания T_2-3N_0-2M₀, возраст больных от 44 до 77 лет (средний возраст 58,9±1,1 лет). У всех больных диагноз был морфологически верифицирован. Все пациенты получали комбинированное лечение: на первом этапе выполнялось радикальное оперативное вмешательство, затем адьювантная химиотерапия по показаниям. Неоадъювантное лечение не проводилось. В анализируемой выборке в течение 2-летнего периода после операции 78% пациентов были живы, а у 22% пациентов был зарегистрирован летальный (неблагоприятный) исход. Опухолевая ткань легкого забиралась из операционного материала в течении 1-2 часов после операции и замораживалась в жидком азоте. Затем в опухолевой ткани определялась ХПА и КПА протеасом.

Прогностическая значимость признаков в отношении общей выживаемости у больных НМРЛ оценена с использованием обобщенного критерия Гехана-Вилкоксона (для ХПА χ²=5,603, р=0,005; для КПА χ²=3,176, р=0,053). Кривые кумулятивной выживаемости строились по методу Каплана-Майера (рисунок 1-2). Выживаемость больных определялась с помощью динамического (актуариального) метода. Расчет выживаемости проводился на второй год после окончания лечения с учетом выбывших из-под наблюдения больных и умерших от сопутствующих не онкологических заболеваний. Продолжительность жизни исчисляли с момента операции. Проверка специфичности и чувствительности показателей, показавших статистически значимый результат в отношении общей выживаемости, осуществлялась с помощью ROC-анализа (рисунок 3, таблица 1).

Для ХПА протеасом чувствительность 80%, специфичность 90%. Для КПА протеасом чувствительность 83%, специфичность 88%. Для определения относительного риска влияния активности протеасом на исход заболевания оценивалась переменная Меры риска при построении таблиц сопряженности (для ХПА Относительный риск=1,5, р=0,015; для КПА Относительный риск=2,2, р=0,033).

Клинические примеры.

Пример 1. Больной К., 58 лет. Центральный рак нижнедолевого бронха левого легкого с переходом на главный бронх. Стадия IIIA, T₃N₂M₀. Гистология - умереннодифференцированный неороговевающий плоскоклеточный рак с метастазами в 6 медиастинальных лимфоузлов. Выполнена операция - Расширенно-комбинированная левосторонняя пневмонэктомия с интраперикардиальной обработкой сосудов, резекцией перикарда, адвентиции пищевода, медиастинальной лимфодиссекцией D3. В течение 1-2 часов после проведения радикального хирургического вмешательства из операционного материала был взят образец опухолевой ткани, в которой исследованы ХПА и КПА протеасом согласно предлагаемому способу. Химотрипсинподобная активность протеасом в опухолевой ткани составила 126,0*10³ Ед/мг белка, каспазаподобная активность протеасом - 44,1*10³ Ед/мг белка, что соответствовало неблагоприятному прогнозу в отношении общей выживаемости пациента. Проведено 5 курсов адъювантной химиотерапии по схеме Цисплатин/Этопозод. При контрольном обследовании через 21 месяц выявлено прогрессирование - метастатическое поражение печени, забрюшинных лимфатических узлов, обоих надпочечников. От проведения курсов паллиативной химиотерапии пациент отказался. Спустя 8 месяцев после контрольного обследования и 29 месяцев после операции наступила смерть пациента.

Пример 2. Больной В., 48 лет. Периферический рак верхней доли левого легкого. Стадия ША, T₃N₂M₀. Гистология - высокодифференцированная аденокарцинома с 7 метастазами в средостенные лимфоузлы. Выполнена операция - Расширенно-комбинированная левосторонняя пневмонэктомия с резекцией перикарда, левого блуждающего нерва, медиастинальная лимфаденэктомия D3. В течение 1-2 часов после проведения радикального хирургического вмешательства из операционного материала был взят образец опухолевой ткани, в которой исследованы ХПА и КПА протеасом. согласно предлагаемому способу Химотрипсинподобная активность протеасом в опухолевой ткани составила 32,5*10³ Ед/мг белка, каспазаподобная активность протеасом - 12,2*10³ Ед/мг белка, что соответствовало благоприятному прогнозу в отношении общей выживаемости пациента в отдаленном периоде. Проведено 6 курсов послеоперационной химиотерапии по схеме Цисплатин/Этопозид. При контрольном исследовании спустя 38 месяцев пациент жив.

Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью предполагать возможный исход заболевания у больных НМРЛ и использовать его для расчета риска развития неблагоприятного исхода у больных НМРЛ после радикальной операции.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания:

1. Злокачественные новообразования в России в 2016 году (заболеваемость и смертность) / Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава Россию. - 2018. - 250 с.

2. Postmus, Р. Е., Kerr K. М., Oudkerk М. et al. Early and locally advanced non-small-cell lung cancer (NSCLC): ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up // Ann. Oncol. - 2017. - Vol. 28, Suppl. 4. - P. iv1-iv21.

3. Ben-Shahar S., Komlosh A., Nadav E. et al. 26S Proteasome-mediated Production of an Authentic Major Histocompatibility Class I-restricted Epitope from an Intact Protein Substrate // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274(31). - P. 2196-2197.

4. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Randall R.J. Protein measurement with the folin reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.

5. van Kasteren S.I., Overkleeft H., Ovaa H. et al. Chemical biology of antigen presentation by MHC molecules // Curr. Opin. Immunol. - 2014. - Vol. 26. - P. 21-31.

6. Бунеева O.A., Медведев A.E. Убиквитин-независимая деградация белков в протеасомах // Биомедицинская химия. - 2018. - Т. 64, №2. - С. 134-148.

7. Geng Y., Zhou Y., Wu S. et al. Sulforaphane Induced Apoptosis via Promotion of Mitochondrial Fusion and ERK1/2-Mediated 26S Proteasome Degradation of Novel Pro-survival Bim and Upregulation of Bax in Human Non-Small Cell Lung Cancer Cells // J. Cancer. - 2017. - Vol. 8(13). - P. 2456-2470.

8. Kakumu Т., Sato M., Goto D. et al. Identification of proteasomal catalytic subunit PSMA6 as a therapeutic target for lung cancer // Cancer Sci. - 2017. - Vol. 108(4). - P. 732-743.

9. Кондакова И.В., Спирина Л.В., Коваль В.Д. и др. Химотрипсинподобная активность и субъединичный состав протеасом в злокачественных опухолях человека // Молекулярная биология. - 2014. - Т. 48, №3. - С. 444-451.

10. Ding F., Xiao Н., Wang М. et al. The role of the ubiquitin-proteasome pathway in cancer development and treatment // Front. Biosci. (Landmark Ed). - 2014. - Vol. 19. - P. 886-895.

11. Спирина Л.В., Кондакова И.В., Коваль В.Д. и др. Активность протеасом и их субъединичный состав в ткани рака эндометрия: связь с клинико-морфологическими параметрами // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153, №4. - С. 491-494.

12. Шашова Е.Е., Тарабановская Н.А., Бондарь Л.Н. Связь показателей протеасомной системы с прогнозом прогрессирования различных молекулярных подтипов рака молочной железы // Бюллетень сибирской медицины. - 2018. - Т. 17, №3. - С. 180- 187.

Приложение

Фигура 1 - Показатели 2х-летней общей выживаемости в зависимости от уровня химотрипсинподобной активности (ХПА) протеасом в опухолевой ткани при немелкоклеточном раке легкого

Фигура 2 - Показатели 2х-летней общей выживаемости в зависимости от уровня каспазаподобной активности (КПА) протеасом в опухолевой ткани при немелкоклеточном раке легкого

Фигура 3 - ROC-кривые для определения оценки качества бинарной классификации уровня химотрипсинподобной (ХПА) и каспазаподобной (КПА) активности протеасом в отношении развития неблагоприятного исхода

Таблица 1 - Значимость химотрипсинподобной (ХПА) и каспазаподобной (КПА) активности протеасом в опухолевой ткани в отношении развития неблагоприятного исхода

Claims

Способ прогнозирования неблагоприятного исхода немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) путем биохимического исследования биологического материала пациентов, отличающийся тем, что исследуют ткань первичной опухоли, взятую во время операционного вмешательства, в которой определяют химотрипсинподобную (ХПА) и каспазаподобную (КПА) активность протеасом, и при ХПА выше 48,8*10³ Ед/мг белка и КПА выше 31,2*10³ Ед/мг белка прогнозируют высокую вероятность развития неблагоприятного исхода.