RU2694617C1 - Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции - Google Patents
Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2694617C1 RU2694617C1 RU2018116549A RU2018116549A RU2694617C1 RU 2694617 C1 RU2694617 C1 RU 2694617C1 RU 2018116549 A RU2018116549 A RU 2018116549A RU 2018116549 A RU2018116549 A RU 2018116549A RU 2694617 C1 RU2694617 C1 RU 2694617C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- cattle
- seq
- pcr
- leukemia
- Prior art date
Links
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 24
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 title abstract description 23
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title abstract description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 18
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 8
- 108700026241 pX Genes Proteins 0.000 claims description 5
- 101150027303 tax gene Proteins 0.000 claims description 5
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 claims 1
- 101150088264 pol gene Proteins 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 241000714266 Bovine leukemia virus Species 0.000 description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 10
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 7
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 7
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 6
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 6
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 6
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 244000309466 calf Species 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 244000144980 herd Species 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 206010025280 Lymphocytosis Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101001016849 Mus musculus Heat shock protein HSP 90-alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000985444 Mus musculus Heat shock protein HSP 90-beta Proteins 0.000 description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000025036 lymphosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241001600407 Aphis <genus> Species 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283699 Bos indicus Species 0.000 description 1
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 description 1
- 241001148106 Brucella melitensis Species 0.000 description 1
- 241001148111 Brucella suis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241001647378 Chlamydia psittaci Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241001663879 Deltaretrovirus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000582786 Monoplex Species 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000013616 RNA primer Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 description 1
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010052104 Viral Regulatory and Accessory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000719 anti-leukaemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229940056450 brucella abortus Drugs 0.000 description 1
- 229940038698 brucella melitensis Drugs 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005551 perinatal transmission Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000011886 postmortem examination Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012932 thermodynamic analysis Methods 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной генетики и ветеринарии. Предложен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в формате мультиплекс, включающий наборы генно-инженерных конструкций (олигонуклеотидные праймеры и флюоресцентные зонды) для одновременного раннего выявления фрагментов провирусного генома. Изобретение может быть использовано для диагностики лейкоза животных. 11 табл., 4 пр.
Description
Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики вирусных болезней животных, научных исследований в ветеринарии, диагностическому способу обнаружения вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) в тканях и секретах животных с использованием молекулярно-биологического метода.
В комплексе мероприятий по оздоровлению стад от лейкоза крупного рогатого скота (КРС) ведущее место принадлежит диагностике.
Проблема своевременной эффективной диагностики лейкоза КРС в связи с крайне неблагополучной эпизоотической ситуацией по данному заболеванию и отсутствием средств специфической профилактики, стоит по-прежнему остро.
При проведении оздоровительных мероприятий в хозяйствах с высоким уровнем инфицированности, выращивание свободного от вируса молодняка с последующей заменой им маточного поголовья для формирования здорового поголовья является основным направлением работы. Совершенствование методов прижизненной диагностики лейкоза КРС у молодняка КРС на самых ранних стадиях инфекционного процесса становится более актуальным. Циркуляция в организме телят пассивно приобретенных колостральных антител усложняет задачу своевременной постановки диагноза серологическими методами, что делает прямую диагностику инфекции в возрасте 0-6 месяцев наиболее эффективной и приводит к сокращению сроков противолейкозных мероприятий.
Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) является представителем дельтаретровирусов семейства Retroviridae и индуцирует злокачественное лимфопролиферативное заболевание - энзоотический лейкоз.
Среди болезней животных лейкоз КРС представляет одну из наиболее сложных проблем ветеринарной медицины. Несмотря на определенные усилия в борьбе против этого заболевания в России, лейкоз прочно занимает первое место среди инфекционных болезней КРС. В последние годы на него приходится более 50% учитываемых случаев инфекционной патологии.
По статистике у инфицированных коров рождается не более 3-5% инфицированного потомства, однако, перинатальная передача при наличии отягчающих условий (например, контаминация кормов плесневыми грибами, факторы патогенности микроорганизмов, нарушающих плацентарный барьер) может достигать практически 30%.
При отсутствии клинических признаков (например, увеличение лимфатических узлов) у инфицированных коров уровень В-лимфоцитов может быть повышенным (Panei C.J. et al., 2013). Это свидетельствует о том, что наличие таких животных с иммунологической дисрегуляцией ведет к экономическим потерям вследствие снижения молочной продуктивности (Nekouei О. et al., 2016), репродуктивной способности (Bartlett Р.С. et al., 2013), высокой пораженности заболеванием (Sandev N. et al., 2004). Приблизительно у 1/3 животных развивается персистентный лимфоцитоз - доброкачественная форма с пролиферацией не трансформированных лимфоцитов. У менее 5% животных в возрасте обычно старше 4-5 лет развивается злокачественная В-клеточная лимфома после длительного латентного периода (Ferrer J.F. et al., 1978).
ВЛКРС циркулирует в мире повсеместно (данные OIE по состоянию на март 2017, Polat et al., 2017). Успешный опыт искоренения данной ретровирусной инфекции на государственном уровне характерен для некоторых стран западной Европы (Германия, Финляндия, Швейцария, Эстония, Нидерланды, Польша) (Nuotio L. et al.,2003; Acaite J. et al., 2007; Kautzsch S. et al., 1990; Maresca C. et al., 2015; Gottschau A. et al., 1990; Stark K.D. et al., 1996; More S.J. et al., 2017), которые остаются свободными от лейкоза крупного рогатого скота. Однако, страны восточной Европы (Украина, Хорватия) (Balic D. et al., 2012; Rola-Luszczak M. et al., 2013; Zhao X.R. et al., 2007; Sandev N. et al.,2015; EPAHW, 2015) и остальные страны западной Европы (Италия, Португалия, Белоруссия, Латвия, Греция, Румыния, Болгария), остаются неблагополучными по заболеванию (OIE, 2009). По состоянию на декабрь 2013 Австралия (99,7% молочных стад) и с 2008 года Новая Зеландия были свободными от ВЛКРС при проведении оздоровительных мероприятий с 1983 и 1996 годов, соответственно (EPAHW,2015; Chethanond U-S. et al., 1999). В США и Канаде инфицированность крупного рогатого скота наиболее высокая и достигает 83,9% и 89%, соответственно (APHIS, 2007; United states department of agriculture, 2008; VanLeeuwen J.A. et al., 2001, 2005; Nekouei O.A. et al., 2015). В Бразилии уровень инфицированности находится в диапазоне от 17,1% до 60,8% (Samara S.I. et al., 1997; 
J.L. et al.,1998; Camargos M.F. et al., 2002, 2007); в Аргентине - от 77,4% до 90,9% (Polat М. et al., 2016; Monti G. et al., 2005; Trono K.G. et al., 2001); в Чили, Боливии, Перу, Венесуэле, Уругвае, Парагвае и Колумбии - от 19,8% до 54,7% (Polat М. et al., 2016; Felmer R. et al., 2005;
C. et al., 1978; Moratorio G. et al., 2010; Rama G. et al., 2011; Alfonso R. et al., 1998; 
D.Y. et al., 2011; Benavides B. et al., 2013). В Китае инфицированность достигает 49,1% (Yang Y. et al.,2016), в Японии - 78% (Murakami К. et al.,2013), в Таиланде - до 58,7% (Lee E. et al., 2016), в Корее - 86,8% (Lee Е. et al.,2015). Менее 6% инфицированных животных выявляется в Монголии (3,9%) (Ochirkhuu N. et al., 2016), Камбодже (5,3%) (Meas S. et al., 2000), Тайване (5,8%) (Wang C.T. et al., 1991). Менее 10% инфицированности крупного рогатого скота обнаружено в Филиппинах (от 4,8% до 9,7%) (Polat М. et al., 2015) и в Мьянме (9,1%) (Polat М. et al., 2016). Для Израиля характерна инфицированность ВЛКРС на уровне 5% (Trainin Z. et al., 2005), для Саудовской Аравии - 20,2% (Hafez S.M. et al., 1990), для Турции - 48,3% (Burgu I. et al., 2005).
В настоящее время возросла актуальность проблемы передачи ВЛКРС с молоком, в связи с увеличением инфицированности крупного рогатого скота, принадлежащего частным владельцам и употреблением в пищу молока, не прошедшего пастеризацию («парного молока»). Учитывая научные факты повсеместного распространения ВЛКРС и, особенно, в странах с неблагоприятной эпизоотической ситуацией по лейкозу крупного рогатого скота (например, в США, России), потребление молока, мяса и других побочных продуктов от инфицированных животных, постоянное воздействие на вирус со стороны иммунного ответа, в конечном счете, приводит к выявлению провируса в человеческом геноме (Ochoa-Cruz A. et al., 2006; Buehring G.C. et al., 2007, 2014, 2015; Nikbakht G. et al., 2010; Mesa G. et al., 2013; Villalobos A. et al., 2016; Lawson J.S. et al., 2017), РНК-транскриптов в клетках крови человека (Сырцев А.В. и др., 2015)), в геноме экспериментальных гетерологичных[ животных (Гулюкин М.И. и др., 2015), что связано с потенциальным риском преодоления вирусом лейкоза крупного рогатого скота межвидовых барьеров.
В естественных условиях ВЛКРС может передаваться крупному рогатому скоту, зебу, буйволам, овцам. Зарегистрирован случай носительства антител к ВЛКРС у шведских лосей (Burny A. et al., 1985; Dimitrov Р et al., 2012; Hirsch V.M. et al., 1995; Wolfe N.D. et al., 2005).
Передача ВЛКРС восприимчивому крупному рогатому скоту может осуществляться через кровь, а также всеми секретами и экскретами при попадании в них лимфоцитов, зараженных вирусом (Valikhov A.F. et al., 1983).
Механизм передачи ВЛКРС обусловлен биологической приспособленностью возбудителя инфекции паразитировать в клетках и превращать эти клетки в злокачественные. Вирус инфицирует различные популяции иммунных клеток (CD5+/CD5" IgM+ В-лимфоциты, CD2+/CD3+/CD4+/CD8+ и γ/δ Т-лимфоциты, моноциты, гранулоциты периферической крови и лимфоидной ткани) (Aida Y. et al., 1993). Сегодня существует независимый механизм передачи отдельных ретровирусных частиц в направлении клеточного контакта типа «клетка-клетка» (cell-to-cell), который представляет собой вирусную транспортировку из инфицированных в неинфицированные клетки с привлечением тонких мостиков типа филоподий. Распространение ретровирусов при физическом взаимодействии клеток друг с другом на 2-3 порядка более эффективнее. Детали данного механизма в значительной степени неизвестны, но считается, что передача происходит через обширные поверхности контакта, так называемые вирусологические или инфекционные синапсы (Nathan М. et al., 2007; Jing Jin et al., 2009).
Репликационная стратегия вируса в организме хозяина реализуется двумя отдельными друг от друга процессами: в первом случае инфекционный цикл представляет собой связывание вирионов с клетками-мишенями, высвобождением одноцепочечной вирусной РНК, обратной транскрипцией и интеграцией в форме провируса в геном хозяина; во втором случае вирусная стратегия размножения связана с управлением клеточной пролиферацией при помощи вирусного регуляторного белка Tax, в результате чего продуцируется группа инфицированных клеточных популяций, состоящих из отдельных клонов (Gillet et al, 2007).
Основными методами диагностики ВЛКРС инфекции являются серологические -реакция диффузной преципитации (РДП) и иммуноферментный анализ (ИФА), основанные на выявлении в биоматериале от животных антител против антигенов вируса на ранних стадиях заболевания. Для диагностики инфекции используют также гематологические методики на более поздних стадиях заболевания для выявления больных животных; клинические; патоморфологические методики - при посмертном исследовании; метод биопробы.
Серологическая диагностика имеет некоторые ограничения, связанные с низкой чувствительностью, не возможностью дифференцировать материнские антитела от инфекционных в первые периоды жизни теленка в возрасте 0-6 месяцев. Это делает прямую диагностику инфекции, нацеленную на выявление генома возбудителя крайне актуальной.
При применении полимеразной цепной реакции (ПЦР) как прямого высокочувствительного и высокоспецифичного молекулярно-биологического способа, становится возможным быстро идентифицировать фрагменты и достоверно обнаруживать единичные копии провирусной ДНК ВЛКРС (М. Jimba, et al., 2010) на самых ранних этапах инфекционного процесса (через 1-2 недели после заражения).
ПЦР в реальном времени - метод молекулярной биологии, основанный на принципе метода ПЦР. Используемый вариант ПЦР в реальном времени основан на количественной детекции флуоресцентного сигнала, который увеличивается пропорционально количеству ПЦР-продукта, что позволяет определить количество искомой молекулы ДНК. Результат ПЦР в реальном времени регистрируется в процессе реакции в каждый момент времени.
Для молекулярно-эпизоотологического анализа исследуются генетические последовательности области поверхностного гликопротеида gp51 ВЛКРС, что связано со значительной изменчивостью этого участка генома вируса. На сегодняшний день в мире выявлено 10 генетических вариантов ВЛКРС на основе гена env [Rodriguez S.M. et al., 2009; Шаева и соавт., 2012; Вафин P.P. и соавт., 2013; Polat М. et al., 2016; 
М. et al., 2013; Lee et al., 2016, Pluta A. et al.,2017].
Известен способ дифференциации варианта tax гена вируса лейкоза крупного рогатого скота с использованием праймеров, способных выявить полную последовательность tax гена ВЛКРС с целью дальнейшего выявления мутаций в кодируемых этим геном аминокислотных последовательностях и определения вариантов tax гена ВЛКРС. В известном способе используют следующие праймеры: Btax2: 5' AG ТСТ AGA GCT GAC GTC ТСТ GTC TG 3'; Btax3: 5' АСС TCG AGA TGG САА GTG TTG TTG GTT GG 3' [1].
В настоящее время также известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции, включающий прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры для выявления фрагмента гена 
провируса лейкоза крупного рогатого скота с электрофоретическим определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности, отличающийся тем, что использует в качестве праймеров олигонуклеотиды следующей структурой - PF2: 5'-TGA ACG GAC AAA TGG ACT GCT C-3'; PR2: 5'-CCG АСА GAG AGC GAG GAG AG-3', которые имеют следующие характеристики: отсутствие самокоплементарных участков внутри каждого праймера и между прямым и обратным, температура плавления составляет 66°С для обоих олигонуклеотидов, GC состав - 50% для PF2 и 65% для PR2 и фланкируют область консервативного гена вируса лейкоза крупного рогатого скота размером 438 пар нуклеотидов высококонсервативного гена провируса лейкоза крупного рогатого скота [2]. Прототип.
Поскольку, даже хорошо подобранная пара праймеров может давать нежелательные продукты амплификации, использование способа с регистрацией накопления только лишь целевых/искомых фрагментов ДНК является более надежным экспериментальным подходом (Ребриков Д.В. и др., 2014). Для этого был разработан олигонуклеотидный зонд с флуоресцентной меткой, что позволяет достоверно регистрировать накопление фрагмента ДНК строго определенной последовательности, сокращен размер ампликона до 110 нуклеотидов в случае гена и выбран участок размером 76 нуклеотидов в случае гена tax, за счет чего повышены консерватизм выбранных участков и, в целом, специфичность и чувствительность методики. Все разработанные конструкции олигонуклеотидов не имеют самокомплементарных участков. Выбор варианта ПЦР в режиме реального времени снижает риск контаминации за счет исключения стадии детекции продуктов амплификации методом электрофореза, при котором необходимо производить вскрытие пробирок. При ПЦР-РВ детекция продуктов амплификации проводят непосредственно во время прохождения реакции, пока пробирки находятся в приборе.
Результаты наших исследований и данные литературы показали, что внутри подгруппы ВЛКРС для генов расхождения в нуклеотидных последовательностях составляют менее 6%, что свидетельствует о высокой степени консерватизма штаммов вируса из различных географических регионов мира (N. Gillet et al., 2007). Анализ генетического полиморфизма участков генов ВЛКРС, циркулирующего на территории некоторых регионов РФ, с применением способа, указанного в прототипе, позволил установить, что целевой фрагмент консервативного гена менее всего подвержен влиянию генетического полиморфизма. Вариабельность изученного участка гена ВЛКРС не превышала 3%.
Мессенджер tax/rex, расположенный в регионе X генома ВЛКРС, обнаруживается в цитоплазме на ранней стадии, предшествующей накоплению других мРНК (Haas L., et al., 1992), последовательности которого высоко консервативны между разными изолятами ВЛКРС с менее чем 5%-ой степенью вариации (Choi Е.А., et al., 2005).
В задачу исследований входило - разработать олигонуклеотидные праймеры и зонды P-RT-f_m; P-RT-r_m; P-RT-z_m () и T/R-Fl_m; T/R-Rl_m; T/R-zl_m (tax) для амплификации участков двух целевых генов со структурой, представленной в таблице 1 и имеющих следующие характеристики (Таблица 2): температура плавления находится в диапазоне 52-58°С; GC-состав - 48-65%; фланкируют фрагменты высоконсервативного гена размером 110 нуклеотидов и гена tax, выявляемого на самых ранних стадиях инфекции, размером 76 нуклеотидов, вариабельность которых не превышет 3% и 5%, соответственно; комплементарность выбранным областям генома ВЛКРС, отсутствие палиндромных участков.
Предложенный способ заключается в одновременном использовании двух наборов сконструированных олигонуклеотидов, каждый из которых состоит из двух праймеров и одного зонда, комплементарных высоконсервативной области целевого гена и фрагменту целевого гена tax - одного из первых вирусных транскриптов, обнаруживаемых на ранних стадиях данной медленной инфекции, для выявления в тканях и секретах животных (кровь, молозиво, суспензии культур клеток) провирусной ДНК возбудителя при проведении диагностики лейкоза КРС на ранних стадиях заболевания методом ПЦР-РВ.
Вариант ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) позволяет сократить время проведения анализа и риск появления ложноположительных результатов (снизить риск контаминации). В результате гибридизации происходит нарастание интенсивности флуоресценции, что позволяет регистрировать накопление специфических продуктов амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала по двум каналам FAM (), ROX (tax), в результате чего детекция продуктов амплификации целевых участков генома ВЛКРС осуществляется непосредственно в ходе прохождения реакции с помощью прибора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме реального времени в формате мультиплекс.
Синтез олигонуклеотидов проводят стандартным способом. Целевой продукт представляет собой концентрированный водный раствор или лиофильно высушенный препарат. В паспорте для каждого олигонуклеотида указывают концентрации (ое/мл, пмоль/мл) и количество (ОЕ).
Экстракцию, очистку, элюцию НК, получение кДНК методом обратной транскрипции проводят с использованием стандартных приемов.
В процессе конструирования дизайна олигонуклеотидов - анализа структуры и термодинамического анализа - основными параметрами являются следующие: степень гомологии, отсутствие самокоплементарных (палиндромных) участков внутри праймеров, процентное содержание гуанина и цитозина (GC-состав) (допустимо 40-60%), длина олигонуклеотида (допустимо 18-24 нуклеотидов) и комплементарность друг другу, близость значений температур плавления (Тпл) (допустимо различие в 3-6°С). При этом используют программу OLIGO DNA/RNA primer analysis, v.4.0 (W. Rychlik, 1989), эмпирически определяют наиболее оптимальное сочетание прямого, обратного праймеров и зонда для эффективного прохождения ПЦР.
Дополнительно в качестве внутреннего контроля прохождения ПЦР анализа возможно использование олигонуклеотидов, разработанных на регион Bola-DRA генома КРС ([3] - M. Jimba, et al.,2010), с предварительной модификацией и оптимизацией. Для данных олигонуклеотидов диапазоны характеристик следующие: Тпл - 55-56°С, GC-состава - 57-67%, длины - 18-21 нуклеотид; самокомплементарные участки отсутствуют.
Для верификации результатов исследований используют стандартный набор для выявления лейкоза крупного рогатого скота (КРС) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени отечественного производства.
Сущность изобретения поясняется таблицами и рисунками, в которых отображается следующая информация:
Пример 1.
При проверке специфичности олигонуклеотидов выявляют наличие 100 % идентичности со всеми известными полногеномными штаммами ВЛКРС (BLAST, ресурс NCBI). Анализ структуры и термодинамических параметров разработанных олигонуклеотидов представлены в таблице 2.
Оценивают консерватизм выбранных целевых участков генома возбудителя, ограниченных разработанными олигонуклеотидами. Выявленная степень дивергенции составила 1,8 % для участка гена и 3,9% для фрагмента гена tax.
Проводят расчет рабочей концентрации (пмоль/мкл) олигонуклеотидов для добавления их в реакционную смесь и дальнейшей оптимизации условий проведения ПЦР. Рабочая концентрация праймеров составляла 10 пмоль/мкл, зондов - 3 пмоль/мкл.
Полученные характеристики разработанных олигонуклеотидов свидетельствуют о возможности использования их для проведения молекулярно-генетической диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР-РВ.
Пример 2.
В качестве контрольных образцов (КО) используют: а) отрицательный контроль этапа выделения (ОКО) - вместо ДНК-пробы вносят в пробирку 100 мкл дистиллированной воды; б) отрицательный контроль этапа ПЦР (К-) - вместо ДНК-пробы вносят в пробирку 5 мкл дистиллированной воды; в) положительный контроль этапа ПЦР (ПКО) - вносят в пробирку 5 мкл ДНК ВЛКРС (ДНК выделяют из монослоя вируспродуцирующей культуры клеток FLK-BLV).
Подбор программы амплификации, температуры отжига проводят эмпирическим способом с учетом приближения близких температур плавления при разработке дизайна праймеров и зондов сначала в формате моноплекс, затем для всех используемых олигонуклеотидов к единому значению в формате мультиплекс. При отработке условий проведения реакции амплификации выбрана оптимизированная программа, включающая «слепые» циклы и снижена температура отжига до 52°С для повышения чувствительности способа выявления провирусной ДНК ВЛКРС (Таблица 4).
Рассчитывают минимальные концентрации (пмоль/мкл) олигонуклеотидов, количества компонентов и общий объем реакционной смеси, включая объем ДНК-пробы сначала в формате моноплекс, затем проводят испытания в формате мультиплекс. Используют рабочие концентрации праймеров - 10 пмоль/мкл, зондов - 3 пмоль/мкл, дНТФ - 10 мМ, полимераза 5 единиц, 5х ПЦР-буфер (15мМ MgCl2).
Амплификацию осуществляют на флуоресцентном ПЦР-детекторе для проведения полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с планшетным форматом реакционного модуля путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала по соответствующим каналам. ПЦР проводят в общем объеме 25 мкл: 20 мкл реакционной смеси и 5 мкл ДНК пробы.
Соответствие детектируемых участков геномов и каналов флуоресцентной детекции представлено в таблице 3.
Обработку данных проводят по следующим параметрам для каналов FAM, JOE, ROX, задаваемым в приборе: корректировка наклона кривой флюоресценции, пороговый уровень, оптимизация сигнала (диапазон оптического окна). Для этого в меню программы используют режим анализа с помощью двух методов: 1) установленных точек - устанавливает базовую линию и пороговое значение, затем выводится линия порогового значения, при этом используется несколько точек (рекомендовано от 2 до 8) на флуоресцентной кривой, соответствующей образцу, находящихся выше базовой линии в экспоненциальной фазе. Место пересечения прямой линии, построенной по установленным точкам, с пороговой линией является значением порогового цикла - Ct; 2) максимума 2-ой производной, при котором автоматически рассчитывается значение второй производной для каждой точки на флуоресцентной кривой и определяется максимальное значение как значение порогового цикла - Ct.
Результаты анализа работы праймеров и зондов оценивают по усредненным значениям следующих критериев: для ненормированных кривых по каналам FAM, JOE, ROX - фоновый уровень флюоресценции (Fcp), конечный уровень флюоресценции 
разгорание 
для нормированных кривых - конечный уровень флюоресценции 
пороговый цикл (Ctср) (Таблица 5). При учете результатов прохождения ПЦР-РВ в первую очередь оценивают контрольные образцы. Результат считается достоверным только в случае адекватного прохождения положительных и отрицательных контролей ПЦР-анализа согласно таблице 6.
После прохождения реакции амплификации интерпретируют результаты прохождения ПЦР-РВ в пробирках с контрольными образцами.
Интерпретация результатов реакции всех используемых контрольных образцов ПЦР-РВ с применением предложенного способа выявления провирусной ДНК ВЛКРС соответствовала критериям согласно таблице 6.
В соответствии с адекватным прохождением реакции амплификации в пробирках с КО приступают к оценке результатов анализа исследуемых образцов. Интерпретируют результаты детекции ДНК ВЛКРС согласно описанным в таблице 7 критериям.
При исследовании 632 образцов ДНК, выделенных из крови животных в возрасте до 3 месяцев, выявлено 43 положительных пробы, т.е. провирусная ДНК ВЛКРС обнаруживается у 7,3% телят-вирусоносителей.
По итогам проведения верификации получено 100 % совпадение результатов ПЦР-РВ.
Данные результаты подтверждают возможность использования разработанных олигонуклеотидов для выявления вирусоносителей среди телят методом ПЦР-РВ.
Пример 3.
Диагностические характеристики (специфичность и чувствительность) разработанного способа испытывают на различных контингентах инфицированных ВЛКРС животных: естественно инфицированном крупном рогатом скоте (532 образцов крови молодых животных в возрасте 0 дней до 3 месяцев), экспериментально инфицированных животных разных видов (образцы крови от 254 кроликов, 18 козлят, 15 крупного рогатого скота, 49 лошадей и 24 собак, образцы молозива от коровы-донора) в динамике развития инфекционного процесса.
Полученные результаты реакции амплификации при проверке диагностических характеристик представлены в таблицах 8,9.
В процессе испытания диагностической чувствительности проводят ПЦР-РВ анализ 314 проб ДНК, выделенной из крови молодых животных возрасте 7-30 дней. По полученным данным выявлено несколько групп животных: ПЦР+/ РИД+ - в 7 случаях, ПЦР+/РИД- - в 15 случаях, ПЦР-/РИД+ - не выявлено, ПЦР-/РИД- - в 292 случаях. С помощью предложенного способа выявления провирусной ДНК ВЛКРС показано, что уровень перинатальной инфицированности в 3,14 раза выше, чем при серологическом исследовании молодняка до приема молозива методом РДП и подтверждено превышение относительной чувствительности ПЦР по сравнению с серологической диагностикой перинатальной передачи ретровирусной инфекции.
При изучении диагностической специфичности (доля негативных результатов теста в группе здоровых животных) из 292 животных с отрицательными результатами анализа методом РДП по результатам ПЦР с использованием предложенного способа выявления провирусной ДНК ВЛКРС получено: негативных результатов - 292, позитивных - 0.
При тестировании данных образцов с использованием предложенного способа детекции провирусной ДНК ВЛКРС не специфических реакций не выявлено.
При анализе проб молозива выявлено наличие как ДНК провируса, так и вирусную РНК (последовательности ВЛКРС в пробах кДНК).
По результатам исследований выявлены высокие диагностические характеристики разработанного способа детекции провирусной ДНК ВЛКРС методом ПЦР-РВ.
Пример 4.
Результаты реакции амплификации при проверке аналитических характеристик представлены в таблицах 10, 11.
Аналитическую специфичность испытывают с применением культуральных (28 образцов суспензий клеток культур (СКЛ, ПКЛ, FLK)), вакцинных штаммов вирусов и бактерий, поддерживаемых на базе ВИЭВ: «ТНЛ» вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, «NADL» вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, Chlamydophila psittaci (лиофилизированный препарат антигена из серологического набора); лептоспир, бруцелл: Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis, вируса гриппа H1N1 (лиофилизированный препарат антигена из серологического набора).
Аналитическую чувствительность анализируют при исследовании десятикратных разведений суспензии культуры клеток, продуцирующей штамм FLK-BLV и генно-инженерной конструкции - плазмиды 
разработанной ранее на базе ВИЭВ, с известной концентрацией (таблица 10); аналитическую специфичность - при проведении анализа генетического материала культуральных штаммов микроорганизмов, перечисленных в таблице 11.
Полученные результаты исследований свидетельствуют о высоких аналитических характеристиках (специфичность и чувствительность) разработанного способа детекции провирусной ДНК ВЛКРС методом ПЦР-РВ в короткие сроки и на ранних стадиях ретровирусной инфекции крупного рогатого скота.
При сравнении результатов ПЦР анализа различных видов биологического материала установлено, что разработанный способ позволяет выявлять ДНК провируса ВЛКРС в цельной крови, полученной от инфицированных животных - крупного и мелкого рогатого скота, кроликов, молозиве КРС, суспензии клетов вируспродуцирующей культуры.
При применении предлагаемого способа диагностики ВЛКРС выявление уровня перинатальной инфицированности в 3,14 раза выше, чем при серологическом исследовании молодняка до приема молозива. Подтверждено превышение относительной чувствительности ПЦР по сравнению с серологической диагностикой перинатальной передачи ретровирусной инфекции. Отсутствие иммуноглобулинов сыворотки крови приводит к быстрой контаминации биоматериала и образованию колоний микроорганизмов в геле агара, что препятствует правильному учету результатов реакции диффузной преципитации и снижает чувствительность метода РДП. Помимо этого, необходимость взятия материала у новорожденных телят до приема молозива создает дополнительные трудности в работе зооветеринарного персонала.
Техническим результатом, на достижение которого направлено данное изобретение, является достоверный, высокочувствительный и высокоспецифичный способ выявления фрагментов провирусного генома ВЛКРС в биологическом материале в короткие сроки на ранних стадиях лейкозной инфекции.
Апробация данного способа с положительными результатами и регулярной воспроизводимостью этих результатов проведена на 1159 пробах ДНК, полученных из крови животных ряда хозяйств Московской области в период 2013-2018 гг. в лабораторных условиях на базе ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.
Предложенный способ найдет широкое применение как при диагностике ВЛКРС на ранних стадиях заболевания для формирования свободного от ретровирусной инфекции стада в животноводческих хозяйствах страны в качестве эффективного инструмента контроля биологических рисков, так и при проведении научных исследований для обнаружения генетического материала вируса лейкоза КРС методом ПЦР-РВ.
Источники информации:
1. Патент-US 6646116 В1, 11.11.2003, С07/Н 21/04.
2. Патент - RU 2445370 С1, 20.03.2012. C12Q 1/68. Прототип.
3. Выявление нового (8-го) генотипа ВЛКРС в различных регионах мира / P.P. Вафин, Н.З. Хазипов, А.Ю. Шаева [и др.] // Фундаментальные исследования. - 2013. - N 10. - Ч. 7. -с. 1467-1471.
4. Идентификация нового генотипа ВЛКРС / А.Ю. Шаева, З.Р. Гараева, [и др.] // Ученые записки КГАВМ. - 2012. - Т. 211. - С. 192-197.
5. Межвидовая передача вируса лейкоза крупного рогатого скота в эксперименте / Гулюкин М.И., Козырева Н.Г., Иванова Л.А. [и др.] // Вопросы вирусологии. - 2015. - Т. 60. -N 5. - C. 32-37.
6. Пилотные исследования по обнаружению RNA-транскриптов bovine leukemia virus у доноров крови человека / Сырцев А.В., Алимов А.А., Галецкий С.А. [и др.] // Успехи молекулярной онкологии: сб. тр. IV всерос. конф. «Молекулярная онкология: итоги и перспективы». - М., 2015. - Т. 2. - N 4. - С. 25-26.
7. ПЦР в реальном времени [Электронный ресурс] / Д. В. Ребриков [и др.]; под ред. д. б. н. Д. В. Ребрикова. - 6-е изд. (эл.). - Электрон, текстовые дан.
8. A bovine leukemia virus, a versatile agent with various pathogenic effects in various animal species / Burny A., Brack C, Cleuter V., et al. // Cancer Res. - 1985. - V. 45 (9, suppl.). - P. 4578-82.
9. A new genotype of bovine leukemia virus in South America identified by NGS-based whole genome sequencing and molecular evolutionary genetic analysis / M. Polat, S.-n. Takeshima, K. Hosomichi, et al. // Retrovirology J. - 2016. - V. 13:4. - 23 p. URL: http://retrovirology.biomedcentral.com/ai1icles/ l0.H86/sl2977-0l6-0239-z.pdf.
10. Aida Y. Phenotype and ontogeny of cells carrying a tumor-associated antigen that is expressed on bovine leukemia virusinduced lymphosarcoma / Aida Y., Okada K., Amanuma H. // Cancer Res. - 1993. - V. 53. - P. 429-37.
11. Assembly of the Murine Leukemia Virus Is Directed towards Sites of Cell-Cell Contact / J. Jin, N.M. Sherer, G. Heidecker, et al. // PLoS Biology. - 2009. - V.7 (7) URL: https://doi.org/10.1371 /journal.pbio.1000163.
12. BLV-CoCoMo-qPCR: Quantitation of bovine leukemia virus proviral load using the CoCoMo algorithm / Jimba M., Takeshima S.N., Matoba K., Endoh D., Aida Y. // Retrovirology. - 2010. - V. 2. - V. 30 №7. - P.91. URL: https://doi:10.1186/1742-4690-7-91.
13. Bovine leukemia virus and cow longevity in Michigan dairy herds / Bartlett P.C., Norby В., Byrem T.M., et al. // J. Dairy Sci. - 2013. - V. 96. - P. 1591-7.
14. Bovine leukemia virus can be classified into seven genotypes: evidence for the existence of two novel clades / S.M. Rodriguez, M.D. Golemba, R.H. Campos, et al. // J. of Gen. Virol. - 2009. -V. 90. - P. 2788-2797.
15. Bovine leukemia virus DNA in human breast tissue / Buehring G.C., Shen H.M., Jensen H.M., et al. // Emerg. Infect. Dis. - 2014. - V. 20 (5). - P. 772-782. URL: https://doi:10.3201/eid2005.131298.
16. Bovine Leukemia Virus Gene Segment Detected in Human Breast Tissue / Mesa G., Ulloa J.C., Uribe A.M., Gutierrez M.F. // Open J. Med. Microbiol. - 2013. - V.3 (1). - P. 84-90.
17. Bovine leukemia virus infection is significantly associated with risk of breast cancer / Buehring G.C., Shen H.M., Jensen H.M., Block G. // Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. - 2007. - V. 48. - P. 1747.
18. Bovine leukemia virus linked to breast cancer in Australian women and identified before breast cancer development / Buehring G.C., Shen H., Schwartz D.A., Lawson J.S. // PLoS One. - 2017. - 12: e0179367. URL: https://doi:10.1371/journal.pone.0179367.
19. Choi E.A. Mutational analysis of bovine leukemia virus Rex: identification of a dominant-negative inhibitor / Choi E.A., Hope T.J. // J. Virol. - 2005. - V. 79. - P. 7172-7181.
20. Emergence of unique primate T-lymphotropic viruses among central African bushmeat hunters / Wolfe N.D., Heneine W., Carr J.K., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - V. 102 (22). - P. 7994-9.
21. Estimation of bovine leukemia virus (BLV) proviral load harbored by lymphocyte subpopulations in BLV-infected cattle at the subclinical stage of enzootic bovine leucosis using BLV-CoCoMo-qPCR / Panei C.J., Takeshima S.N., Omori T. et al. // BMC Vet. Res. - 2013 - V. 9: 95. URL: https://doi.org/10.1186/1746-6148-9-95.
22. Exposure to bovine leukemia virus is associated with breast cancer: a case-control study / Buehring G.C., Shen H.M., Jensen H.M., et al. // PLoS One. - 2015. - V. 10: e0134304. URL: https://doi:10.1371/iournal.pone.0134304.
23. Haas L. Bovine leukemia virus gene expression in vivo / Haas L., Divers Т., Casey J.W. // J. Virol. - 1992. - V. 66. - P. 6223-6225.
24. Influence of enzootic bovine leucosis virus upon the incidence of subclinical mastitis in cows at a different stage of infection / Sandev N., Koleva M., Binev R., Ilieva D., et al. // Veterinarski Archiv. - 2004. - V. 76. - P. 411-6.
25. Lifetime effects of infection with bovine leukemia virus on longevity and milk production of dairy cows / Nekouei O., VanLeeuwen J., Stryhn H., et al. // Prev.Vet.Med. - 2016. - V. 133. - P. 1-9.
26. Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus: prospects for novel anti-retroviral therapies in human / Gillet N., Florins A., Boxus M. et al. // Retrovirology. - 2007. - V. 4. - P. 18-50.
27. Molecular characterization of bovine leukemia virus from Moldovan dairy cattle /А. Pluta, M. 
P. 
et al. // Arch. Virol. - 2017. - V. 162 (6). - P. 1563-1576.
28. Molecular epidemiological and serological studies of bovine leukemia virus (BLV) infection in Thailand cattle / Lee E., Kim E.J., Ratthanophart J et al. // Infect. Genet. Evol. - 2016. - V. 41. - P. 245-254.
29. Oncogenic viruses and Breast Cancer: Mouse Mammary Tumor virus (MMTv), Bovine Leukemia virus (BLv), Human Papilloma virus (HPv), and Epstein-Barr virus (eBv) / J.S. Lawson, B. Salmons, W.K. Glenn // Frontiers in Oncology. - 2018. - V. 8. URL: https://doi.org/10.3389/fonc.2018.00001.
30. Pathological features of experimental bovine leukaemia viral (BLV) infection in rats and rabbits / Dimitrov P., Simeonov K., Todorova K., et al. // Bull. Vet. Inst. Pulawy. - 2012. - V. 56. - P. 115-20.
31. Persistent lymphocytosis in cattle: its cause, nature and relation to lymphosarcoma / Ferrer J.F., Marshak R.R., Abt D.A., et al. // Ann. Rech.Vet. - 1978. - V. 9. - P. 851-7.
32. Polat M. Epidemiology and genetic diversity of bovine leukemia virus /М. Polat, S.-n. Takeshima, Y. Aida// Virol. J. - 2017. - V. 14: 209. URL: https://doi.org/10.1186/s12985-017-0876-4.
33. Phylogeny and natural history of the primate Antiviruses, SIV and HIV / Hirsch V.M., Dapolito G., Goeken R., Campbell B.J. // Curr. Opin. Genet. Dev. - 1995. - V. 5. - P. 798-806.
34. Retroviruses can establish filopodial bridges for efficient cell-to-cell transmission / Sherer N. M., Lehmann M. J., Jimenez-Soto L.F., et al. // Nat. Cell Biol. - 2007. - V. 9 (3), - P. 310-5. URL: https://doi:10.1038/ncb1544.
35. The molecular characterization of bovine leukaemia virus isolates from Eastern Europe and Siberia and its impact on phylogeny / 
M., Pluta A., Olech M., et al. // PLoS ONE: electronic recource. - 2013. - V.8 (3). URL: http://joumals.plos.org/plosone/article?id==10.1371/iournal.pone. 0058705.
36. Valikhov A.F., Immunological and virologic examination of milk, blood and sperm form cattle infected with onkornavirus. Leukoses of farm animals / Valikhov A.F., Burba L.G., Shishkov V.P. // In: Materials of the Soviet and Netherlands symposium. Proceedings of the All-Russian Research Institute of Experimental Veterinary Medicine. Y.R. Kovalenko. [Materialy Sovetsko-Niderlandskogo simpoziuma. Trudy Vserossiyskogo 
instituta 
veterinarii im. Ya.R. Kovalenko]. Moscow. - 1983. - V. 59. - P. 71-2. (in Russian).
Claims (1)
- Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в формате мультиплекс, включающий наборы генно-инженерных конструкций (олигонуклеотидные праймеры и флюоресцентные зонды) для одновременного раннего выявления фрагментов провирусного генома: высококонсервативного гена pol провируса лейкоза крупного рогатого скота, отличающийся тем, что в качестве олигонуклеотидных праймеров берут конструкции - SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 и олигонуклеотидный зонд SEQ ID NO: 3, которые фланкируют менее вариабельную в 2,8 раза область высококонсервативного гена pol вируса лейкоза КРС размером 110 нуклеотидов, а также фрагмент провирусного гена tax размером 76 нуклеотидов при использовании олигонуклеотидов с соответствующей структурой: праймеров SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 и зонда SEQ ID NO: 6, ограничивающих слабо вариабельную со степенью дивергенции 3,9% область провирусного гена tax.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018116549A RU2694617C1 (ru) | 2018-05-04 | 2018-05-04 | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018116549A RU2694617C1 (ru) | 2018-05-04 | 2018-05-04 | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2694617C1 true RU2694617C1 (ru) | 2019-07-16 |
Family
ID=67309337
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018116549A RU2694617C1 (ru) | 2018-05-04 | 2018-05-04 | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2694617C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5770428A (en) * | 1993-02-17 | 1998-06-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site |
| RU2445370C1 (ru) * | 2010-10-28 | 2012-03-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции |
| RU2615465C2 (ru) * | 2015-07-31 | 2017-04-04 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова" | Диагностическая система для выявления днк провирусов лейкоза и иммунодефицита крупного рогатого скота методом мультиплексной полимеразной цепной реакции |
-
2018
- 2018-05-04 RU RU2018116549A patent/RU2694617C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5770428A (en) * | 1993-02-17 | 1998-06-23 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Chimeric retrovial expression vectors and particles containing a simple retroviral long terminal repeat, BLV or HIV coding regions and cis-acting regulatory sequences, and an RNA translational enhancer with internal ribsome entry site |
| RU2445370C1 (ru) * | 2010-10-28 | 2012-03-20 | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции |
| RU2615465C2 (ru) * | 2015-07-31 | 2017-04-04 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова" | Диагностическая система для выявления днк провирусов лейкоза и иммунодефицита крупного рогатого скота методом мультиплексной полимеразной цепной реакции |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| КОВАЛЮК Н.В. Методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Российская академия сельскохозяйственных наук Государственное научное учреждение Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства. Краснодар. 2012. УДК 636.2.08231:575. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Watanuki et al. | Visualizing bovine leukemia virus (BLV)-infected cells and measuring BLV proviral loads in the milk of BLV seropositive dams | |
| US20060160087A1 (en) | Monitoring and treatment of amyotrophic lateral sclerosis | |
| Abdessemed et al. | Population and biological preconditions for the cattle retroviruses' expansion | |
| Pham et al. | Detection of avian leukosis virus in albumen of chicken eggs using reverse transcription polymerase chain reaction | |
| Fadly et al. | Isolation and characterization of an adventitious avian leukosis virus isolated from commercial Marek's disease vaccines | |
| Biezus et al. | Progressive and regressive infection with feline leukemia virus (FeLV) in cats in southern Brazil: Prevalence, risk factors associated, clinical and hematologic alterations | |
| RU2694617C1 (ru) | Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции | |
| Yatsentyuk et al. | The first study on the occurrence of bovine herpesviruses in the wild fauna of the Moscow region, Russia | |
| Benavides et al. | Molecular analysis of a fragment of bovine leukemia virus env gene by Nested-PCR in dairy cows from Pasto, Nariño | |
| Sharav et al. | Detection and molecular characterization of equine infectious anemia virus in Mongolian horses | |
| Kim et al. | Rapid detection of deformed wing virus in honeybee using ultra-rapid qPCR and a DNA-chip | |
| Petropavlovskiy et al. | Epizootiological and genetic characterization of the bovine leukemia virus in the Russian federation-evaluation of bovine leukemia virus in Russia | |
| KR102091280B1 (ko) | Lamp를 이용한 닭빈혈 바이러스 검출용 프라이머 및 그 용도 | |
| Machnik et al. | Porcine endogenous retrovirus (PERV) infection of HEK-293 cell line alters expression of human endogenous retrovirus (HERV-W) sequences | |
| Cruz et al. | Caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV) detection in semen of endangered goat breeds by nested polymerase chain reaction | |
| Ochirkhuu et al. | Molecular epidemiological survey and genetic characterization of ovine gammaherpesvirus-2 in Mongolian livestock | |
| Gonzales et al. | Concordance of competitive enzyme linked immunosorbent assay and nested-polymerase chain reaction in the detection of caprine arthritis-encephalitis virus | |
| KR101617142B1 (ko) | 개선된 검출 정확성을 제공해 줄 수 있는 핵산검사 기반의 조류 인플루엔자 바이러스 검출 키트 | |
| Watanabe et al. | Delayed-onset enzootic bovine leukosis possibly caused by superinfection with bovine leukemia virus mutated in the pol gene | |
| RU2787048C1 (ru) | Способ детекции ДНК вируса герпеса КРС 6 типа в биологическом материале крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени | |
| Devi et al. | PCR-based diagnosis of surra in equines targeting RoTat 1.2 VSG gene | |
| Ataseven et al. | Partial sequence of the gB gene of equid herpesvirus type 1 isolates associated with abortion in Turkey | |
| RU2644233C2 (ru) | Способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота | |
| RU2728342C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов и способ выявления пестивируса Н крупного рогатого скота | |
| Tajbakhsh et al. | Molecular prevalence for bovine immunodeficiency virus infection in Iranian cattle population |